Если бы мне нужно было выбрать одну работу, статью или результат эксперимента, которые повлияли на мое понимание жизни сильнее прочих, то я, без сомнения, выбрал бы из всех остальных вот эту: «Трансплантация генома бактерий: превращение одного вида в другой». Исследование, которое привело к статье 2007 года в Science, не только сформировало мой взгляд на жизнь, но также заложило фундамент для создания первой синтетической клетки. Пересадка генома не только указала путь выполнения потрясающей трансформации, но также помогла доказать, что ДНК – это программный носитель жизни.
В известном смысле наши опыты можно считать продолжением процесса, именуемого «пересадкой ядра», который был применен, в частности, командой во главе с Иэном Уилмутом в Институте Рослин возле Эдинбурга, в Шотландии, для создания Долли, клонированной овцы. Ядро из клетки молочной железы взрослой овцы со всей ДНК пересадили в яйцеклетку (предварительно лишенную собственного ядра), успешно вернув пересаженную ДНК в эмбриональное состояние. Последовавшее рождение Долли прогремело в 1997 году в заголовках прессы всего мира, потому что она была создана из взрослой клетки молочной железы (откуда и ее имя – намек на певицу Долли Партон с пышным бюстом). До рождения этого ягненка взять клетку взрослого организма и сделать клон считалось невозможным. Достижение Института Рослин опиралось на многие факторы, от изощренного знания клеточного цикла до технических решений вроде покрытия реконструируемого эмбриона оболочкой из защитного агара. Но Долли была далеко не первым клоном и даже не первой клонированной овцой.
История пересадки ядра на самом деле начинается в 1938 году со знаменитого и очень изобретательного немецкого эмбриолога Ханса Шпемана (1869–1941), который опубликовал результаты первых экспериментов по пересадке ядер. Шпеман был первопроходцем того, что он называл Entwicklungsmechanik – «механика развития», и был в 1935 году за свои опыты награжден Нобелевской премией. Совместно с Хильде Мангольд (1898–1924) он провел первые опыты по пересадке ядра на тритонах, оказавшихся идеальным экспериментальным объектом из-за своих крупных икринок, с которыми было удобно управляться. В 1938 году Шпеман опубликовал свою итоговую книгу «Эмбриональное развитие и индукция», в которой был описан эксперимент, проведенный при помощи умелого использования микроскопа, пинцета и тонкого волоска, вероятно, вырванного у его дочери Маргретте.
Шпеман сделал из волоска петлю, чтобы разделить под бинокуляром цитоплазму только что оплодотворенной икринки саламандры, придав эмбриону форму гантели. На одном конце гантели было ядро, содержащее ДНК; на другом – только заключенная в клеточную мембрану цитоплазма, в которой было всё, что содержится в клетке вне ядра. (Нелишне напомнить, что, хотя исходно Шпеман вдохновился работой Августа Вейсмана о наследственности, всё, что было тогда известно, это что тайна наследственности лежит в ядре.) После того как половинка с ядром поделилась четыре раза, став эмбрионом из 16 клеток, Шпеман развязал волосок и позволил одному из шестнадцати ядер пройти в отделенную цитоплазму в другой половине гантели, образуя новую клетку с исходным содержимым яйцеклетки и более зрелым ядром. Вновь затянув волосок, он разделил эмбрион надвое. Тем самым он продемонстрировал, что ядро, пройдя четыре деления, сохраняет способность превращаться в любой тип клеток. Таким способом Шпеман создал клон – генетически идентичную копию, которая была на несколько секунд моложе, чем другая.
Шпеман назвал этот процесс «двойникованием», и оно было отмечено в истории как первое клонирование животного, проведенное в лаборатории с помощью пересадки ядра. Он хотел пойти дальше и предложил «фантастический эксперимент» – проделать то же самое со взрослой клеткой. Но, как и многие до него, он был слишком ошеломлен и восхищен тайнами развития, чтобы поверить, что оно зависит лишь от физики и химии.
В следующем десятилетии задача Шпемана привлекла внимание Роберта Бриггса, исследователя из научно-исследовательского института при госпитале Ланкенау в Филадельфии (позже Институт онкологических исследований, а затем Онкологический центр Фокса Чейза), который изучал клеточное ядро. В 1952 году, работая с Томасом Кингом, он клонировал леопардовых лягушек, пересаживая ядро клетки. Эксперимент Бриггса и Кинга походил на то, что предлагал – и предвосхитил в своих опытах на саламандрах – Шпеман в 1938 году. Они пересадили ядро лягушачьего эмбриона ранней стадии в большую (миллиметровую) яйцеклетку обычной американской леопардовой лягушки. Полученные таким образом эмбрионы благополучно развились в головастиков. Но в ходе дальнейших экспериментов Бриггс и Кинг пришли к выводу, что по мере дифференцировки клеток потенциал развития уменьшается и получить клон из ядра взрослой клетки невозможно. Позже, в 1962 году, работавший в Оксфорде Джон Гёрдон заменил ядро яйцеклетки шпорцевой лягушки (Xenopus) на ядро зрелой специализированной клетки из кишечника головастика. Яйцеклетка развилась в клонированного головастика, а в последующих экспериментах удалось получить и взрослых лягушек. Его исследование, научившее нас, что ядро взрослой специализированной клетки можно вернуть в незрелую стадию, было удостоено Нобелевской премии по физиологии и медицине в 2012 году, через пятьдесят лет после его первопроходческих экспериментов.
То, что мы пытались сделать, в некоторых отношениях было намного сложнее, чем эти ранние эксперименты с пересадкой ядер, хотя они были, несомненно, весьма замечательными. Работа Шпемана была немного похожа на попытку перепрограммировать компьютер, ничего не зная о программировании, а просто скачивая что-то из интернета. В отличие от более сложных эукариотных клеток, у бактерии нет ядра – клеточной субструктуры, заключенной в мембрану. В бактериальной клетке геном плавает в густом цитоплазматическом супе вместе с прочими клеточными компонентами. Так что там просто нет клеточной органеллы, которую можно удалить хирургическим путем. С еще более сложной задачей мы столкнулись, когда хотели трансплантировать генетический материал одного вида в клетку другого, в то время как все предыдущие эксперименты с переносом ядра включали работу с одним видом, а то и с одним и тем же животным.
Когда мы начали думать над тем, как перевести синтетическую ДНК в бактерию и заменить ее собственную хромосому, то поняли, что надо разрабатывать новый метод трансплантации генома, поскольку нужно заменить весь геном вида-хозяина на вставленную голую ДНК нового вида без какого-либо смешения (рекомбинации) двух геномов. Отдельные гены молекулярщики уже десятки лет пересаживали привычно и без ограничений – например, вирусные и человеческие гены пересаживались в бактерии и дрожжи и работали там. Но насколько я знаю, никто не пытался пересадить полный геном, такая задача многим могла казаться невозможной.
Такая предвзятость часто ограничивает нашу способность испробовать новый подход или принять новые открытия. Например, микробиологи когда-то думали, что в бактериальных клетках может быть только одна хромосома. Но реальность оказалась намного интереснее – как я обнаружил в середине 1990-х, когда мы секвенировали геном возбудителя холеры, массовой и опасной болезни, которая каждый год поражает пять миллионов человек по всему миру, приводя к ста двадцати тысячам смертей. Разработанные нами алгоритмы для секвенирования дроблением, посредством которых компьютеры подбирали перекрывающиеся куски секвенируемой последовательности, имели специфическую особенность: они собирали геномные тексты только на основе перекрывающихся участков. У компьютеров не было априорного представления о том, сколько хромосом, плазмид или вирусов должно получиться, они только складывали подходящие фрагменты в математически обоснованном порядке. Когда мы собрали секвенированные фрагменты генома холеры, они явственно сложились в две независимые хромосомы – а не в одну, как полагало большинство. Когда мы сравнили эти две хромосомы друг с другом и с другими геномами, то обнаружили, что они очень сильно отличаются между собой.
Сделав такое открытие на холере, мы потом выявили немало видов микробов с несколькими хромосомами. Это поднимало вопрос: как эти виды обзавелись этими множественными хромосомами? Может, клетка просто случайно забрала дополнительную ДНК из лизированной клетки и новая хромосома образовалась, потому что она добавила своему новому дому какие-то важные для выживания способности? Или две древние клетки слились, образовав новый вид? У нас не было на это ответов, но меня эти идеи чрезвычайно привлекали. Большинство мыслило эволюцию видов как идущую за счет постепенного накопления единичных изменений оснований в последовательности ДНК в течение миллионов и миллиардов лет; тот или иной вид адаптируется к окружающей его среде, если случайные изменения предлагают преимущества для выживания. Мне показалось правдоподобным, что некоторые известные нам крупные эволюционные скачки происходили по крайней мере отчасти за счет приобретения дополнительной хромосомы, которая сразу добавила тысячи генов и множество новых признаков.
Теперь мы знаем, что многие продвинутые функции эукариотных клеток возникли в эволюции, когда ранние эукариотные клетки полностью вобрали в себя некоторые виды микробов, которые сначала жили с ними в симбиотических взаимоотношениях. Вероятно, самое важное событие такого рода произошло примерно два миллиарда лет назад, когда эукариотная клетка забрала к себе фотосинтезирующую бактериальную клетку, ставшую в итоге хлоропластом, в котором происходит фотосинтез у всех растений. Второй самый наглядный пример этого процесса, называемого эндосимбиоз, можно найти в «блоках питания» наших клеток – митохондриях, которые, как и хлоропласты, несут свои собственные гены и происходят от симбиотической бактерии, вероятно, сходной с современными риккетсиями.
Поскольку было ясно, что трансплантация геномов и целых клеток была существенной частью нашей эволюции, я был уверен, что мы сможем найти способ искусственной пересадки геномов. Для наших начальных экспериментов по трансплантации мы выбрали микоплазмы, потому что, в отличие от большинства бактерий, у них нет клеточной стенки (жесткого упругого наружного слоя), а есть лишь клеточная липидная мембрана, что упрощало внесение ДНК в клетку. Кроме того, мы уже многое знали о микоплазмах, включая последовательности их геномов и результаты работ по нокаутным генам. Я собрал новую трансплантационную команду вокруг двух ученых: Джона Гласса, который провел большую часть своей карьеры в фармацевтической компании Lilly pharmaceuticals, работая с микоплазмой, и примкнул к нам, когда компания закрыла свою антимикробную программу, и нового постдока из Франции Кароль Лартиг, у которой был опыт работы с различными видами микоплазм. Остальными ключевыми членами команды были Нина Альперович и Ремберт Пайпер.
Сначала мы хотели попытаться трансплантировать геном микоплазмы в E. coli, но хотя микоплазмы в своей ДНК используют те же четыре основания, что и все другие виды, у них кодон УГА кодирует триптофан, в то время как у прочих видов УГА – это стоп-кодон, который прекращает процесс синтеза белка. Поскольку E. coli прочла бы УГА как стоп-кодон, то получились бы урезанные белки, несовместимые с созданием жизнеспособной клетки. Нам пришлось для экспериментов с пересадкой использовать другой вид микоплазмы.
В свое время мы выбрали M. genitalium для секвенирования, анализа и последующего синтеза генома, поскольку он у нее чрезвычайно мал, а мы думали, что при создании синтетического генома узким местом будет наша способность воспроизвести его химическим путем. Но теперь бы нам пришлось пожалеть о таком решении по практическим соображениям: в лаборатории M. geni-talium очень медленно растет. В то время как E. coli делится на дочерние клетки каждые двадцать минут, M. geni-talium, чтобы сделать свою копию, требуется двенадцать часов. Это может показаться не слишком большой разницей, но при экспоненциальном росте это разница между получением результатов эксперимента через двадцать четыре часа – и через несколько недель. Поэтому для первых опытов по пересадке генома мы выбрали два разных быстрорастущих вида микоплазмы, M. mycoides и M. capricolum. Оба они – условные патогены коз и, возможно, распространились, когда эти животные были одомашнены, около 10 тысяч лет назад. Как возбудители серьезных болезней домашнего скота эти микробы часто выращиваются в лабораториях. Они все же не так торопливы, как E. coli: M. mycoides делится каждые шестьдесят минут, а M. capricolum – раз в сто минут.
Будучи геномной лабораторией, мы секвенировали геномы обоих видов, чтобы узнать, насколько они родственны друг другу. Мы нашли, что у M. mycoides в геноме 1 083 241 пара оснований, последовательность которых на три четверти (76,4 %) совпадает с несколько меньшим геномом M. capricolum, состоящим из 1 010 023 пар оснований. В соответствующих друг другу участках генома последовательности совпадают на 91,5 %. Оставшаяся четверть (24 %) генома M. mycoides не имеет соответствия в геноме родственного вида – она содержит последовательности, которые в геноме M. capricolum не обнаружены.
Основываясь на сходстве последовательностей ДНК, мы рассудили, что ключевые белки каждого вида, использующиеся для интерпретации генетических инструкций, будут достаточно биохимически совместимы, чтобы прочитать геном другого вида, и в то же время их можно будет легко отличить друг от друга. Мы также подумали, что геномные последовательности различаются достаточно, чтобы не рекомбинировать.
Когда дошло до выбора, чей геном пересаживать, а кто будет хозяином, мы выбрали M. mycoides в качестве донора генома и M. capricolum как реципиента: M. mycoides быстрее растет, геном у нее побольше, и это позволит легче заметить успешную пересадку. Была и еще одна техническая причина для такого решения. В своей предыдущей лаборатории Кароль Лартиг изучала особый участок ДНК – так называемый «ориджин», точку начала репликации. С этим участком связывается комплекс белков ORC, участвующий в репликации ДНК, и отсюда начинается процесс удвоения. Лартиг показала, что белки ORC M. capricolum способны узнать ориджин M. mycoides, а ORC M. mycoides не узнают ориджин M. capricolum. Таким образом, геном M. mycoides сможет удваиваться в M. capricolum – но не наоборот.
Выбрав из микоплазм донора и реципиента, мы ощутили уверенность, что наша экспериментальная система способна обеспечить наилучшие возможности для попытки трансплантации генома. Дальнейшие шаги требовали множество нудных экспериментов методом проб и ошибок и заводили нас в область неизвестного. Нам надо было разработать новые методы для выделения интактной хромосомы из одного вида и пересадки ее в другой вид, не повредив и не разрезав ДНК. Если мелкие куски ДНК легко поддаются манипуляциям без повреждений, то крупные, особенно целые хромосомы, состоящие из миллионов оснований, очень хрупки и легко повреждаются.
Нам также нужно было определиться с экспериментальным подходом в целом. Следовало ли нам удалить или разрушить геном capricolum перед тем, как мы подсадим в клетку новый от клетки mycoides? Этот процесс был бы эквивалентен энуклеации – этапу удаления ядра в эукариотных клетках, что относительно легко, так как можно просто высосать ядро микропипеткой из яйцеклетки-реципиента. Мы не знали, необходимо ли для наших целей разрушить или удалить геном клетки-реципиента прежде, чем добавить в нее новую ДНК. Как и того, что будет, если у нас в итоге в одной и той же клетке окажутся два генома.
Мы придумывали разные способы атаки на хозяйскую хромосому, включая применение радиации, чтобы уничтожить ее ДНК, рассуждая, что на ДНК низкие дозы радиации повлияют намного сильнее, чем на гораздо более мелкие молекулы белков. Мы также рассматривали использование рестриктаз, чтобы они расщепили ДНК в геноме клетки-реципиента. Но нас все время тревожило, что любой их этих подходов может оставить после себя фрагменты ДНК, которые затем могут рекомбинировать с пересаженной хромосомой, и тогда геном в клетке уже не будет чисто синтетическим. После широкого обсуждения Хэм Смит предложил идею попроще: ничего не делать, потому что, когда клетка-реципиент после трансплантации поделится, в одной из дочерних клеток может оказаться только пересаженная хромосома.
Казалось, что шансы невелики, но мы решили провести такой эксперимент. Однако сначала мы должны были ответить на некоторые ключевые вопросы и разработать способ изоляции хромосомы и манипулирования ею без повреждения ДНК. Чтобы защитить ДНК, мы решили изолировать хромосому в маленьких (100 микролитров) блоках агарозы, по консистенции похожих на желатин. Для начала мы поместили бактериальные клетки в жидкую агарозную смесь и вылили ее в формы, которые, охладившись на льду, застыли в маленькие пробки. К плотно упакованным бактериям мы могли добавить ферменты, чтобы вскрыть клетки, содержимое которых, включая хромосомы, вытекло бы в эти пробки. ДНК мы отделяли, промывая пробки протеазой, расщепляющей все белки и оставляющей невредимой ДНК. Потом мы поместили пробки с ДНК поверх геля в установке для электрофореза и включили электрическое поле, чтобы втянуть ДНК в гель. Из-за входящих в ее каркас фосфатных групп ДНК заряжена отрицательно и в электрическом поле будет двигаться в сторону положительного электрода. Варьируя перепад напряжения и плотность геля и применяя разные красители, мы могли установить размер хромосомы, долю белковой примеси, а если ДНК повреждена или порвана – то сделать из нее линейные молекулы, так как линейная ДНК движется через гель быстрее, чем кольцеобразная, а та, в свою очередь, – быстрее, чем сверхспирализованная.
Поэкспериментировав с высвобождением и электрофорезом геномов, мы обрели уверенность, что у нас есть способ изолировать хромосомы, определять, свободны ли они от белков (нам надо было знать, нужны ли какие-то белки для трансплантации), и оценивать, в каком они виде – двухцепочечные, кольцевые или сверхспирализованные. У прокариот и эукариот ДНК по-разному упаковывается, чтобы компактно размещаться в клетках или внутриклеточных структурах. В человеческих клетках ДНК намотана на белки, называемые гистонами, а у бактерий то же самое достигается сверхспирализацией, что, как подсказывает название, означает сворачивание спиралей в спирали. Большинство бактериальных геномов «отрицательно сверхспирализованы», то есть ДНК скручена в направлении, противоположном направлению закручивания двойной спирали. Некоторые предварительные эксперименты подсказали нам, что конформация ДНК имеет значение – в этих суперскрученных хромосомах она лучше всего подходит для пересадки.
Кароль Лартиг и ее команда испробовали много подходов и наконец остановились на процедуре, которая, хотя и была сложной, в итоге сработала. Мы узнали, что освобожденная от белков ДНК может быть успешно пересажена в клетки M. capricolum. Мы также обнаружили, что трансплантации помогают небольшие изменения в клетках-реципиентах. Например, выращивание клеток при pH 6,2 вместо 7,4 резко меняет форму клеток M. capricolum: обычно они яйцевидные, а при таком рН делаются длинными и тонкими. Эта стройность также делает их более проницаемыми – в основном за счет размягчения клеточной мембраны. Чтобы помочь новому геному попасть в клетки M. capricolum, мы использовали также химикат полиэтиленгликоль (ПЭГ), который не только делает мембрану более проницаемой, но и защищает ДНК при ее прохождении сквозь мембрану.
Мы обнаружили, что чистота, тип и источник ПЭГ были ключевыми факторами для успешной трансплантации. Открытие этого простого факта потребовало много нудной, повторяющейся и разочаровывающей работы, да еще с крайним вниманием к мелочам. Когда вы разрабатываете новую технологию, у вас нет рецептов, чтобы их списать, учебников, в которые можно заглянуть, или руководств, чтобы почитать и перенять те мелкие намеки и секреты, которые гарантируют успех. В конце концов вам приходится попробовать все и каждое сочетание условий и ингредиентов. Вы никогда не уверены, какой из многих факторов действительно имеет значение, как они работают друг с другом и друг против друга и так далее. Чтобы разобраться со всеми этими переменными, требуются тщательно продуманные попытки. Это главная часть экспериментальной работы, самая тяжкая и, если вы добились успеха, самая лучшая. На каждый эксперимент, который сработал, вероятно, были сотни проваленных. Проработка деталей в течение многих месяцев тяжелого труда, чтобы трансплантация генома могла превратиться из идеи в реальную, детализированную, действующую процедуру, была огромной заслугой Кароль Лартиг и ее команды.
Чтобы увеличить наши шансы на успех, мы перед трансплантацией добавили к геному M. mycoides две генные кассеты. Одна кассета была предназначена для отбора антибиотиком: когда мы добавим в культуру антибиотик, выживут только клетки, несущие этот защитный набор генов. Кроме того, чтобы воочию увидеть все клетки, в которых трансплантация генома прошла удачно, мы включили туда ген lacZ, кодирующий белок, который в присутствии химиката, именуемого X-gal, сделает клетки-реципиенты ярко-голубыми. Теперь мы знали, как будет выглядеть успех: голубые устойчивые к антибиотику колонии. Однако мы должны были быть уверены, что это именно то, чего мы хотим: синева могла означать и то, что lacZ и гены устойчивости к антибиотику перенесены в геном M. capricolum.
К несчастью, это не осталось лишь теоретической возможностью. Мы много раз пытались трансплантировать геном M. genitalium в клетки M. genitalium, и хотя мы часто получали голубые клетки, мы обнаруживали, что это всегда было из-за простой рекомбинации – lacZ и гены устойчивости действительно оказывались перенесены из почти идентичного пересаженного генома M. genitalium в геном клетки-реципиента M. genitalium.
Пересаженный геном был просто слишком близок по структуре последовательности к геному клетки-реципиента, поэтому их составные части могли смешиваться. Мы на горьком опыте научились не слишком возбуждаться при виде голубой колонии, пока успех не подтвержден должным образом.
Пересадив геном M. mycoides в клетки M. capricolum, наша команда в очередной раз добилась видимого успеха, опять получив голубые клетки. Вырастив одну голубую колонию, мы чистили и перепроверяли ее и, неделя за неделей, месяц за месяцем наращивали количество, пока в нашем распоряжении не оказались десятки колоний. Умудренные опытом, мы теперь придумали несколько экспериментов, чтобы проанализировать голубые клетки, получившиеся при трансплантации генома.
Наш первый анализ использовал ПЦР для амплификации последовательностей, которые, как мы знали, есть только в геноме M. mycoides. Таким же образом у нас было несколько последовательностей, которые встречаются только в геноме M. capricolum, и мы пытались их амплифицировать из голубых клеток. Мы начали ликовать только тогда, когда смогли обнаружить амплифицированные последовательности из пересаженного генома и ни одной – из клетки-реципиента. Небольшой шанс, что мы видим результаты рекомбинации геномов, все еще оставался, но по мере изучения новых и новых последовательностей эта вероятность все уменьшалась. Мы провели дополнительный электрофорез ДНК пересаженных клеток, который показал только фрагменты генома M. mycoides и ничего из генома M. capricolum.
Хотя данные этих непрямых методов весьма обнадеживали, решающей пробой должно было стать секвенирование ДНК из голубой колонии, позволяющее установить истинную природу генома. Мы выбрали две из наших голубых колоний и секвенировали 1300 библиотечных клонов из каждой, всего больше миллиона пар оснований. Мы по-настоящему взволновались, когда все последовательности совпали только с геномом M. mycoides, который и был пересажен в клетки-реципиенты.
На каждом этапе нашего анализа становилось все ясней и ясней, что наши клетки содержат только трансплантированный геном M. mycoides и что геном M. cap-ricolum был уничтожен или попал при делении в дочерние клетки, которые впоследствии были убиты антибиотиком в питательной среде. Но мы все еще не были удовлетворены. Не может ли этот результат все-таки оказаться артефактом? Не могло ли так случиться, что мы перенесли хотя бы одну невредимую клетку M. mycoides, которая размножилась и создала у нас иллюзию, что пересадили геном? Может быть, голубые колонии – не более чем результат контаминации? Нэйт Каплан был первым, кто научил меня старой мудрой мантре, что чрезвычайные утверждения требуют чрезвычайных же доказательств.
Следуя этому критическому подходу, мы ввели контроль для каждого эксперимента в цепочке, приведшей нас к этому результату, что позволяло исключить всякие артефакты. Хотя мы были уверены, что наша процедура по выделению ДНК убивала все до единой клетки M. mycoides, для гарантии в каждый эксперимент по пересадке мы включили два контрольных варианта: в одном трансплантации делались без реципиентных клеток M. capricolum, в другом у нас были клетки M. capricolum, но гелевые пробки не содержали ДНК M. mycoides. В этих вариантах никаких голубых колоний не наблюдалось, что давало уверенность, что наши препараты ДНК не были загрязнены клетками M. mycoides. Дополнительно нас обнадежило наблюдение, что число голубых колоний в каждом эксперименте прямо зависит от количества ДНК M. mycoides, добавленной к клеткам. Чем больше ДНК мы добавляли, тем больше возникало модифицированных колоний.
Так что же у нас в итоге получилось? Были ли это клетки M. capricolum, содержавшие только ДНК M. my-coides, включая добавленные lacZ и гены устойчивости к антибиотикам? Что изменилось вследствие трансплантации генома? Что за фенотип был у потомков клеток с трансплантированной ДНК? Мы подвергли голубые клетки комплексу аналитических процедур, чтобы выяснить, какие у них белки. Используя антитела, чрезвычайно чувствительные к белкам обоих «родительских» видов, мы выяснили, что находится на поверхности голубых клеток. К нашему приятному удивлению, антитела к белкам M. capricolum не связались с новыми клетками с трансплантированными геномами, а вот антитела к белкам M. mycoides связались.
Параллельно пробам с антителами мы провели гораздо более полный анализ, в котором белки всех трех типов клеток (реципиентные клетки M. capricolum, донорские M. mycoides и потомки клеток с пересаженным геномом) изучались по методу дифференциального двумерного (2D) электрофореза. Можно сказать, что это такой способ увидеть белковое содержимое клеток. Белки, выделенные из клеток, разделяются в одном направлении по своему размеру, а в другом – по электрическому заряду. Клеточные белки расползаются в стороны, и получается характерное распределение пятен, уникальное для каждого типа клеток. Такие паттерны 2D затем можно легко сравнивать друг с другом. Этот метод показал, что распределение белков из голубых клеток почти идентично таковому из донорских клеток M. mycoides и очень отличается от белкового паттерна M. capricolum.
Мы были потрясены этим результатом, но хотели большего. Мы секвенировали фрагменты белков из 90 разных пятен на 2D-геле, используя технологию, называемую масс-спектрометрией на основе матрично-поддерживаемой лазерно-десорбционной ионизации (MALDI). В этом процессе, который еще лет десять назад казался бы какой-то научной фантастикой, пятнышки сепарированных белков вытягивают лазером из геля, образуя восходящий поток заряженных молекул над каждым пятном, а потом подвергают стандартному методу масс-спектрометрии. Таким образом процедура MALDI может выявлять аминокислотную последовательность белкового фрагмента в гелевых пятнах.
Эти данные снабдили нас неопровержимым доказательством того, что в клетке были только такие белки, которые могут быть считаны с трансплантированного генома M. mycoides. Теперь мы абсолютно уверились, что у нас есть новый и оригинальный механизм изменения генетической идентичности клетки, помимо рекомбинации ДНК или естественных механизмов трансформации. Поскольку геном M. capricolum не кодирует процессов захвата ДНК, мы были вправе заключить, что пересадка новой хромосомы в клетки M. capricolum может быть только результатом нашей процедуры трансплантации генома через полиэтиленгликоль. Теперь мы знали, что у нас есть клетки, возникшие в результате намеренной трансплантации генома одного вида в клетку другого. Сделав это, мы в сущности превратили один вид в другой.
Наш успех имел много последствий. Самым важным было то, что теперь мы знали: если бы нам удалось синтезировать геном из четырех бутылей с химикатами, то уже можно было бы взять этот геном и перенести его в клетку-реципиент, где он запустит свои программы. Таким образом работа по трансплантации придала новый импульс нашим попыткам синтезировать ДНК какого-нибудь организма и затем на ее основе создать новую живую клетку.
Другим важным следствием первых пересадок генома стало то, что они дали новое, более глубокое понимание жизни. В ходе наших исследований выкристаллизовалось мое представление о жизни. ДНК – это программное обеспечение жизни, но если мы ее заменяем, тем самым мы меняем видовую принадлежность, а значит, и аппаратную часть клетки. Это был именно тот результат, обнаружения которого хорошей редукционистской наукой так боялись те, кто хотел бы доказать существование некой виталистической силы. Боялись потому, что он неизбежно означал бы попытку разобрать жизнь и само понятие живого на составные части, на простые элементы и базовые функции. Наши опыты почти не оставили места для взглядов виталистов или тех, кто хотел бы верить, что жизнь зависит от чего-то еще, кроме сложного сочетания химических реакций.
Эти эксперименты не оставили сомнений в том, что жизнь – это информационная система. Я видел впереди следующую цель. Я хотел внести в жизнь новую информацию: написать на своем компьютере программу, химическим синтезом воплотить ее в хромосому из ДНК, а затем пересадить эту рукотворную информацию в клетку. Я хотел привести нас в новую эру биологии, породив новую живую форму, которая бы описывалась и управлялась только информацией в ДНК, созданной в лаборатории. Это было бы окончательное доказательство синтезом.