Современные яды: Дозы, действие, последствия

Колок Алан

Глава 14

Низкодозированные химические канцерогены

 

 

В то же самое время, когда Фрэнсис Келси защищала США от повторения европейской талидомидовой трагедии, в стране остро стояла еще одна проблема: как регулировать использование химических пищевых добавок? В первой половине ХХ в. к пище добавлялось совсем немного функциональных ингредиентов. Однако после Второй мировой войны в области переработки пищи произошла революция, сравнимая с революцией в производстве лекарств и пестицидов. Американский образ жизни становился все более урбанизированным, и общество требовало продовольственных товаров унифицированного качества, безопасности и удобства. Эта потребность вкупе с новыми научными достижениями привела к появлению большого разнообразия переработанных пищевых продуктов, а также к использованию достаточно внушительного числа пищевых добавок.

В середине 1950-х гг., с началом расцвета рынка пищевых добавок и возникновением в связи с этим вполне оправданного беспокойства, нью-йоркский конгрессмен Джим Делэйни инициировал двухлетнюю исследовательскую программу по использованию химических веществ в пищевой промышленности. Результатом исследования стал «Отчет Комитета Делэйни». В отчете было отражено резкое увеличение как количества используемых добавок, так и их объема. Далее в отчете отмечалось, что из 704 веществ, используемых в то время в качестве пищевых добавок, лишь немногим более чем для половины (428) была должным образом установлена безопасность употребления, и таким образом для остальных, опасность, которую они представляют для общественного здоровья, не оценена и неизвестна. Все это никак не могло успокоить обычного человека, который прочел бы данный отчет.

Отчет Комитета получил достаточную политическую поддержку, чтобы стать основой для разработки законодательных мер. В результате в 1958 г. была принята «Поправка о пищевых добавках» к «Закону о продовольственных, лекарственных и косметических товарах» 1938 г. Поправка требовала проверки химических пищевых добавок на безопасность перед использованием и представления производителем доказательств такой безопасности. Поправка была полезна как инструмент контроля безопасности пищевых продуктов и приобрела особую славу благодаря одному конкретному абзацу, получившему название «принципа Делэйни»: «Ни одна добавка не может считаться безопасной, если было установлено, что она может вызывать рак при употреблении в пищу человеком или лабораторными животными, или если в результате надлежащих тестов на безопасность было установлено, что она может вызывать рак у человека или животных». Принцип Делэйни появляется в трех разных частях поправки: в разделе о пищевых добавках, в разделе о ветеринарных препаратах, обнаруживаемых в мясе, и в разделе о пищевых красителях. Четвертый раздел, посвященный устранению сохраняющихся в пищевых продуктах остатков пестицидов, был исключен из поправки в 1996 г.

Принцип Делэйни практически незамедлительно стал объектом критики, так как применял неколичественные стандарты к количественной задаче. К моменту принятия поправки канцерогенность была точно доказана лишь для четырех факторов: угольной пыли, радиации, табачного дыма и бета-нафтиламина. В последующие 20 лет проблема с принципом Делэйни становилась все острее благодаря двум достижениям. Первым было значительное расширение масштабов тестирования безопасности продуктов. Чтобы сделать количественный вывод о потенциальной канцерогенности вещества, его нужно было скармливать в больших дозах лабораторным животным (крысам или мышам), а затем экстраполировать результаты на низкие дозы, которые мог получить человек при употреблении переработанных пищевых продуктов. По мере того как все больше пищевых добавок поступало на рынок, проводилось все больше тестов. Вторым достижением стало совершенствование аналитических методов, позволяющих обнаруживать определенные вещества в пищевых продуктах. С 1958 по 1980 г. точность обнаружения различных веществ повысилась в 100–10 000 раз в зависимости от особенностей конкретного вещества.

В результате этого стал очевиден целый ряд сложностей. В продуктах, которые десятилетиями считались безопасными, были обнаружены малые количества канцерогенных веществ. Многие из них ранее уже тестировались и были признаны безопасными, но теперь оказалось, что они нарушают принцип Делэйни. Чтобы избежать хаоса, в поправку о пищевых добавках было включено такое определение, как «в целом признано безопасным». Если вещество ранее уже тестировалось и было признано безопасным, то оно не подлежало запрету – даже если содержало следы канцерогенов.

Термин «в целом признано безопасным» может казаться произвольным, однако на самом деле это не так. Прелесть тестирования веществ на грызунах состоит в том, что в результате можно получить очень точное определение зависимости реакции от дозы, которое позволяет установить возможность развития рака. Путем математической экстраполяции на основании опухолей, развивающихся у крыс, которых кормили большими дозами пищевых добавок, можно сделать выводы о возможности развития рака при воздействии низких доз у человека. В принцип Делэйни была включена оговорка, так называемый de minimus. Чтобы вещество было признано «в целом безопасным», у него не обязательно должны полностью отсутствовать канцерогенные свойства; по определению вероятность заболеть раком при употреблении данного вещества в пищу на протяжении человеческой жизни должна составлять менее одной миллионной. Таким образом, de minimus и концепция «признанной безопасности» дали возможность обходить принцип Делэйни, количественно ограничивая понятие канцерогенности, несмотря на то что формально буква закона при этом нарушалась. Закон был серьезной попыткой установить заслон на пути попадания канцерогенных веществ в пищу, однако в конечном итоге законодатели вернулись к старой доброй кривой зависимости реакции от дозы. Однако и с ней не все было гладко.

Классический пример затруднительного положения в этой области – случай с искусственными подсластителями цикламатом и сахарином. Сахарин попал под законодательный микроскоп вскоре после своего первого синтеза в 1878 г. Харви Вашингтон Уайли, тот самый, что стал автором закона 1906 г., получившего его имя, хотел запретить сахарин, однако склонный к полноте президент Теодор Рузвельт употреблял сахарин долгие годы, борясь с лишним весом. Эти двое схлестнулись не на шутку. Уайли заявил президенту, что сахарин – это «продукт сжигания угля, который совершенно лишен питательной ценности и крайне вреден для здоровья». На это Рузвельт резко ответил, что «любой, кто скажет, что сахарин вреден для здоровья, – просто идиот». Вскоре после этого политическая карьера Уайли завершилась, а сахарин остался на рынке. В 1958 г. он был признан «безусловно безопасным».

В 1937 г., спустя 59 лет после первого синтеза сахарина, был синтезирован цикламат, который в 1950 г. поступил в массовое производство. Несмотря на то что вещество присутствовало на рынке всего восемь лет, после принятия поправки Делэйни оно получило статус «безопасного». Сахарин и цикламат часто использовались вместе в смеси 1 часть сахарина на 10 частей цикламата, который нейтрализовал горьковатый привкус сахарина. В конце 1960-х гг. цикламат стал объектом ряда исследований, поставивших под сомнение его безопасность. Последним ударом стали результаты эксперимента, который выявил наличие взаимосвязи употребления сахарин-цикламатной смеси и рака мочевого пузыря у крыс. В 1970 г. цикламат был запрещен к употреблению на основании принципа Делэйни. Однако дальнейшие исследования не подтвердили влияния цикламата на развитие рака мочевого пузыря, и в 1984 г. Управление по контролю за пищевыми продуктами и лекарствами попросило Академию наук заново рассмотреть данный вопрос. По результатам тщательного анализа имеющихся данных с цикламата было снято обвинение в канцерогенности, но он сохранил статус «ко-канцерогена», то есть вещества, стимулирующего действие других канцерогенов. Несмотря на рекомендацию Академии наук, Управление отказалось снять запрет, и цикламат запрещен к продаже по сей день.

Судьба сахарина была совершенно иной. После запрета цикламата в 1970 г. сахарин остался единственным доступным на рынке искусственным подсластителем. Управление попросило Академию наук провести повторное исследование безопасности сахарина, и хотя Академия вновь подтвердила его безопасность, ей было рекомендовано продолжить изучение данного вопроса. Дополнительные исследования показали связь сахарина с развитием рака мочевого пузыря. Тем не менее доказательства были не вполне однозначны. Эксперименты проводились семью различными лабораторными группами, и только две из них обнаружили опухоли у крыс. Более того, дозировка, при которой у животных мог возникнуть рак, была очень высокой, для человека сопоставимой с 870 банками газированной воды в день. Разумеется, это немыслимо большие количества, однако на данном примере можно увидеть, как законодательные органы интерпретируют кривую зависимости реакции от дозы. В экспериментах были использованы очень большие действующие дозы вещества, проведена статистическая экстраполяция для «нормального» уровня и вычислена количественная вероятность того, что потребление в разумных пределах может вести к развитию рака. В контексте ежедневного потребления такие дозы, конечно же, выглядят нелепыми, однако именно так кривая зависимости используется в законодательных актах.

Сахарин можно было бы запретить на основании поправки Делэйни точно так же, как был запрещен цикламат, за запрет выступал и тогдашний глава Управления Чарльз Эдвард. Однако после удаления с рынка цикламата сахарин остался единственным доступным искусственным подсластителем. В американском обществе развилась любовь к искусственным подсластителям, и политики поняли, что полный запрет вызовет слишком сильный резонанс. На время был выработан компромисс: на продуктах, содержащих сахарин, появились этикетки с предупреждением: «Вызывает рак у лабораторных животных». Однако дальнейшие исследования показали, что рак мочевого пузыря у грызунов имеет иную этиологию, чем у человека, и в 2000 г. предупредительные надписи исчезли.

 

Возникновение и развитие рака и эффект низких доз

Как уже говорилось в главе 10, один из путей химического канцерогенеза – это формирование и неправильная репарация ДНК-аддуктов, ведущие к генетическим мутациям и в конечном итоге к образованию опухолей. Мутировавшая клетка становится доступной действию химических веществ, стимулирующих развитие опухолей. В некоторых случаях инициация и дальнейшее развитие опухолевого роста вызываются одним и тем же веществом, но зачастую это бывают два разных вещества.

Для понимания активности химических канцерогенов необходимо изучение живых клеток, взятых у раковых пациентов. На раннем этапе такие исследования были затруднены, поскольку культуру клеток удавалось поддерживать не более нескольких месяцев. Клетки какое-то время процветали и размножались, но затем старели и погибали. Не имея бессмертной клеточной модели, ученые направили свои усилия на выращивание новых клеток, взятых от разных пациентов, но эти культуры были настолько генетически разнообразны, что было очень сложно получить обобщенные данные по какому-либо из типов рака.

Эти трудности ограничивали исследования химических канцерогенов до тех пор, пока не были получены бессмертные культуры клеток. Бессмертная культура клеток – это культура, клетки которой подверглись такой мутации, что гены, ответственные за биологический процесс старения, были «отключены». Поэтому такие клеточные линии при должном уходе не погибают. Технологии, позволившие получать и поддерживать такие культуры, были отработаны в начале 1970-х гг. Одна из известных бессмертных культур была получена в Мичиганском раковом фонде от женщины с раком груди – сестры Кэтрин Фрэнсис Мэллон, монахини из Детройтского района. Эта линия получила название MCF-7 и отличается высокой рецепторной чувствительностью к эстрогену, то есть обычный эстроген – 17-бета-эстрадиол – вызывает в ней клеточную пролиферацию.

Развитие этой и других клеточных культур дало возможность для проведения разнообразных исследований, направленных на выяснение механизмов опухолевого роста, управляемого эстрогенами. В 1975 г. ученые продемонстрировали, что антиэстроген тамоксифен подавляет рост клеток MCF-7. Это открытие было очень важным: тамоксифен, конкурирующий с эстрадиолом за присоединение к эстрогеновым рецепторам, впоследствии стал стандартным компонентом терапии практически для всех случаев рецептороположительного к эстрогену рака. Однако не было понятно, как именно эстрогены вызывают рост опухолей и является ли сам стероид канцерогенным.

С середины 1970-х гг. и в 1980-е гг. главным вопросом, который пытались разрешить ученые, был механизм развития опухолей под влиянием эстрогена. Результаты проводимых исследований были зачастую противоречивыми. В некоторых лабораториях эстроген вызывал пролиферацию клеток MCF-7, в то время как в других этого не наблюдалось. Этим противоречиям нашлось поразительное объяснение: выяснилось, что в тех лабораториях, где эстроген не вел к клеточному росту, культура клеток еще до экспериментального воздействия подвергалась стимуляции эстрогеноподобным веществом. Некоторые используемые в лабораториях среды для выращивания культур клеток содержат феноловый красный, вещество, способное присоединяться к эстрогеновым рецепторам и стимулировать клеточную пролиферацию. Если в среде не было фенолового красного, роль эстрогена в пролиферации была очевидна. Но если он был там, даже в малых концентрациях, эстроген не мог стимулировать клеточный рост, так как эта миссия уже была выполнена вмешавшимся не в свое дело феноловым красным.

Токсичность фенолового красного не описывается стандартной кривой зависимости реакции от дозы. В больших дозах он токсичен и убивает как клетки, реагирующие на эстроген, так и все остальные. В более низкой концентрации феноловый красный не убивает клетки, а наоборот, работает как стимулятор роста, заставляя клетки, реагирующие на эстроген, делиться. Это действие может казаться безобидным, однако в случае клеток MCF-7 это вовсе не так, потому что эти клетки являются канцерогенными, то есть могут производить опухоли, и, следовательно, феноловый красный действует как инициатор рака. Реакция все равно может быть токсичной (если не для самих клеток, то для пациента в целом), однако воздействие на клетки меняется со смертельного на стимулирующее рост. В значительно меньших дозах действие фенолового красного как инициатора роста опухолей ослабляется, так как концентрация вещества недостаточна для того, чтобы адекватно стимулировать клеточный рост.

Выявленное воздействие фенолового красного на рост клеток MCF-7 оказалось для ученых сюрпризом, однако в дальнейшем были получены и другие результаты, свидетельствующие о том, что подобное влияние на рост клеток инородных веществ – вовсе не уникальный случай. Например, в одном из методов анализа веществ на эстрогенность использовалась растущая культура MCF-7 в присутствии сыворотки человеческой крови, очищенной от стероидов. Рост клеток в такой среде подавлен, поэтому в культуру добавляется эстроген, чтобы снять ингибирование и обеспечить рост. Когда этот метод был применен в лаборатории Аны Сото в Университете Тафта, ученым не удалось воспроизвести результаты. При тщательном анализе состава среды, в которой росли клетки, обнаружилось присутствие инородного эстрогеноподобного вещества, п-нонилфенола, который выделялся из пластика, из которого были изготовлены лабораторные пробирки. Из-за того что п-нонилфенол стимулировал клеточный рост, культуры, в которых должно было наблюдаться ингибирование (негативный контроль), демонстрировали неожиданный рост.

Два приведенных выше примера иллюстрируют важные качества стероидных рецепторов – пугающее отсутствие точности. Исследования показывают, что с ними способно связываться большое количество разнообразных веществ. К стероидным рецепторам способны присоединяться и вызывать эстрогенный эффект даже ионы кадмия, несмотря на свой малый размер. Отчасти это можно объяснить эволюционным происхождением. Стероидные рецепторы принадлежат к более крупной группе ядерных рецепторов. Идентифицировано уже более 300 вариантов рецепторов этой группы, многие из которых являются «сиротскими», то есть не имеют известных природных эндогенных лигандов. Эти рецепторы связаны с синтезом ферментов цитохрома P450, участвующих в биотрансформации экзогенных химических веществ из жирорастворимых в водорастворимые для более эффективного выведения из организма (см. главу 5). Стероидные рецепторы относятся к группе, которая может реагировать на самые разные вещества, снижая их токсичность. Учитывая, что рецепторы эстрогена также принадлежат к этой группе, в их неразборчивости в принципе нет ничего удивительного.

Второе свойство рецепторов к стероидным гормонам также вносит вклад в их способность реагировать на гормональные сигналы в очень низких концентрациях. Гормоны, подобные 17-бета-эстрадиолу, циркулируют в крови и связываются с клеточными рецепторами в очень малых концентрациях. Так, например, нормальная концентрация глюкозы в крови составляет примерно одну часть на тысячу, или один грамм на литр, а стероидов – примерно в миллион раз ниже, не более нескольких частей на миллиард. Эндокринная система в ходе эволюции «научилась» усиливать эти чрезвычайно тонкие сигналы путем создания рецепторов, обладающих высокой чувствительностью к молекулам действующих веществ.

Очень важно, что отношения между концентрацией стероидов в крови, занятостью рецепторов и биологическим эффектом не линейны. При очень низкой дозировке увеличение концентрации стероидов не ведет к значительному увеличению процента связанных со стероидами рецепторов, скорость этого увеличения может даже снижаться. Но это еще не все. Во многих случаях связывания лиганда с рецепторами наблюдается прямая зависимость биологического эффекта от связывания, так что при самом высоком проценте связанных рецепторов (приближающемся к 100) эффект наиболее силен. Однако в случае со стероидами все оказывается не так: эффект, приближающийся к максимальному, наблюдается при проценте связанных рецепторов гораздо ниже 100. Это явление получило название теории запасных рецепторов, так как биологический ответ максимален при небольшом числе рецепторов, улавливающих стероидный сигнал.

Эта способность усиливать очень тонкие химические сигналы имеет свою цену, так как действие связанных с репродуктивным процессом стероидных гормонов на организм далеко не во всех случаях благоприятно. Уже в 1930-е гг. было известно, что у грызунов, подвергающихся воздействию повышенного уровня главного женского полового гормона – эстрогена, возникает рак матки. Однако до недавнего времени механизм связи стероидов с раком был неясен. Прояснение роли эстрогена как инициатора опухолевого роста стало возможным только с развитием методики выращивания бессмертных культур, как мы уже говорили ранее. За последние 50 лет мы стали гораздо лучше понимать влияние химических веществ на человека и окружающую среду. Вещества, обладающие явной и острой токсичностью, известны человеку давно, но теперь сфера токсикологии включает в себя и малозаметные эффекты, вызываемые низкодозированным, но при этом хроническим воздействием. Теперь ученые рассматривают не только летальные случаи, но и менее очевидные последствия, например канцерогенез и аномалии развития плода. Иногда, как в случае с талидомидом, промежуток времени между первоначальным воздействием и проявлением последствий невелик. Но в других случаях, о чем мы поговорим в последующих главах, химические вещества могут наносить удар по внутренним органам, заметить последствия которого оказывается не так легко.