Микроскопы показали, что бактерии существуют. Но простое разглядывание этих существ дает лишь ограниченную информацию. Совершенно различные бактерии зачастую кажутся с виду очень похожими. Чтобы понять, с какими разновидностями бактерий мы имеем дело, как они живут и что способны делать, требуются новые способы разглядывания. Нужно заглянуть внутрь клеток или по крайней мере изучить материал, извлеченный из них. Наука, развиваясь бок о бок с технологией, учится по-новому видеть изучаемые объекты. За последние два десятка лет ученые многое узнали о нашем микробиоме.
До этого в микробиологии человека существовала одна досадная проблема. Ученые знали, что в нас обитает множество микробов, особенно в кишечнике. Однако большинство из них сопротивлялось попыткам перенести их в лабораторию. Их убивало присутствие кислорода, либо им требовалось для выживания какое-то таинственное вещество, которое никак не удавалось выявить.
Проблему, можно сказать, обнаружили и проигнорировали – как в науках о человеке, так и в микробиологии как таковой. В середине 1980-х на нее вновь обратили внимание. Джеймс Стейли из Вашингтонского университета назвал ее «великой аномалией подсчета микробов в чашке Петри». Вместе с коллегой он напомнил научной общественности, что количество бактерий, видимое под микроскопом, к примеру, в свежеотобранном образце почвы, тысячекратно превышает количество бактерий из того же образца, которое удается заставить расти на чашке Петри. Дав обзор других методов оценки микробного разнообразия, появившихся в начале 1930-х годов, Стейли и его соавтор призвали специалистов как можно внимательнее относиться к описанию всего набора изучаемых разновидностей микробов. Однако их обзор, ориентированный на микробиологов, касался в основном лишь водных и почвенных экосистем. Специалистам же по медицинской микробиологии приходилось иметь дело с другими (весьма многочисленными) научными работами, касающимися относительно небольшого набора патогенов. При таком различии в подходах науке удивительно ловко удавалось проявлять избирательное отношение к предметам исследования, при котором известные расхождения или аномалии остаются неизученными.
Теперь дело обстоит иначе. В наши дни все сходятся во мнении, что человеческий микробиом – штука сложная и важная. И нам уже мало изучения лишь тех видов, которые легко вырастить в культуре. Придумываются все новые способы изучения более капризных микробов. Такие методы как раз и позволили Дэвиду Релману добавить множество новых видов в каталог бактерий, найденных во рту при первом, сравнительно простом, анализе.
Видеть невидимое
Исследователи микробиома имеют дело не с самыми мелкими объектами. Это прерогатива физиков – изучение частиц и взаимодействий, совершенно недоступных нашим органам чувств и потому вызывающих понятную озадаченность. Но и микробиомная наука по сути делает видимыми те вещи, о которых мы никогда бы иначе не узнали. И каждый раз, когда ученые видят нечто новое, рождается целый ряд гипотез насчет того, что же найдено и что оно делает. Эти гипотезы в свою очередь требуют новых видов экспериментов. Начиная с рубежа веков, над этим успели потрудиться многие изобретательные умы. Вот вам краткий рассказ об инструментарии исследователей микробиома и о том, чего удалось достичь при помощи этих инструментов.
Новый мир первым делом следует нанести на карту. Эти работы активно ведутся. Микробиология сейчас переживает ту же стадию, что и науки о живом в период, когда писком моды считалась естественная история (естествознание). В течение нескольких веков биология сводилась к присваиванию организмам названий, классификации животных, записыванию их повадок и особенностей поведения.
На этом уровне биологи добыли массу данных. Современные технологии отлично умеют хранить и обрабатывать информацию. Ключевая технология здесь – ДНК-секвенирование, позволяющее узнать порядок следования нуклеотидных оснований («химических букв») в каждой нити ДНК; они-то и кодируют хранящуюся в ней генетическую информацию. Скорость развития этого метода превосходит скорость развития любых других технологий в истории. Часто отмечают, что рост производительности компьютеров за последние полвека (обычно выражаемое как количество процессоров в одной микросхеме) следует так называемому закону Мура. Гордон Мур, один из основателей компании Intel, в 1965 году предположил, что число транзисторов в интегральной микросхеме удваивается каждые 2 года и в дальнейшем растет теми же темпами. Пока его «закон» соблюдается. Результат – резкое увеличение вычислительной мощи компьютеров и резкое падение их стоимости.
Но секвенсоры ДНК развиваются куда стремительнее компьютерных чипов. Разработчики проекта «Геном человека» рассчитывали, что процесс секвенирования ДНК будет непрерывно ускорятся, однако действительность превзошла самые смелые ожидания.
На то, чтобы полностью (более или менее точно) расшифровать человеческий геном с его 3 миллиардами пар нуклеотидных оснований ушло 13 лет, и на всю эту гигантскую работу затратили почти 4 миллиарда долларов. Сегодня производители обычных ДНК-секвенсоров предлагают устройства, проделывающие ту же работу за один день и всего за тысячу долларов.
Основное продвижение на этом пути приходится на сравнительно недавнее время. В американском Национальном институте исследований человеческого генома построили логарифмический график, отражающий зависимость стоимости ДНК-секвенирования от времени, и сравнили его с аналогичным графиком для закона Мура. Уменьшающаяся стоимость процессора отражается на таком графике прямой линией с небольшим отклонением от горизонтали. Стоимость же ДНК-анализа начинает падать быстрее, чем муровская стоимость, уже в 2007 году, а затем ее скорость падения все больше растет (это продолжается до сих пор). Исходная расшифровка мегабазы (1 миллиона оснований) ДНК-последовательности стоила чуть меньше 10 тысяч долларов в 2001 году, нырнула под тысячедолларовую планку в 2004 году, а в 2014 году обходится… всего в полцента.
Быстрое, дешевое, надежное секвенирование – технология, коренным образом меняющая положение в науке. Количество архивируемой информации, которую получают из цепочек ДНК, растет с невообразимой скоростью. Хороший современный секвенсор, продающийся уже полностью подготовленным для работы в лаборатории, при идеальных условиях способен выявлять до 100 миллиардов пар нуклеотидных оснований в сутки. По оценкам специалистов, за 2013 год лабораториям всего мира удалось расшифровать 15 петабаз, то есть тысячу миллионов миллионов букв ДНК.
Что ж, ДНК-секвенирование стало весьма доступным методом. И все равно в каждом конкретном исследовании встречаются трудности, вынуждающие ученых идти на те или иные компромиссы.
Секвенирование отдельного генома в наши дни – рутинная работа, успех которой зависит главным образом от тщательности подготовки образцов, которые закладываются в секвенсор. ДНК должна быть чистой, то есть происходить от одного организма.
Если речь идет о ваших собственных клетках, особых проблем не возникает, достаточно поскрести пальцем внутри щеки. В проекте «Геном человека» у добровольцев брали пробы крови. Человеческая ДНК обладает сравнительно крупными размерами, поэтому ее после извлечения расщепляли с помощью ферментов на более «удобоваримые» куски (примерно по сотне тысяч нуклеотидных пар в каждом), а затем их «клонировали» – воспроизводили при помощи послушных лабораторных бактерий, которые, благодаря своему быстрому росту, давали большое количество искусственной бактериальной хромосомы (ИБХ) ДНК. Затем эти ИБХ извлекались из бактерий для секвенирования.
Геномы бактерий меньше, но их труднее получить в чистом виде. С теми бактериями, которые удается выращивать в виде культуры, можно разобраться достаточно легко. Прочие же так и остаются в виде непонятной смеси, содержащей неизвестно сколько различных организмов, каждый из которых добавляет в общую сумму очень небольшое количество ДНК.
Эту трудность можно обойти, прибегнув к так называемому внекультурному анализу. Он объединяет в себе растущие возможности ДНК-секвенирования с ширящимся знанием биологии бактериальной жизни. Возьмите пробу микрожизни откуда угодно: это может быть ведро морской воды, пригоршня почвы или (как раз для наших целей) кучка человеческих экскрементов. Там вы, помимо всего прочего, обнаружите массу бактерий, вирусов и (возможно) других, более крупных организмов. Не трудитесь отделять их друг от друга. Просто извлеките все ДНК, расщепите их на удобные для анализа куски и затем проведите общее секвенирование.
Появление геномики, действующей в промышленных масштабах, предоставляет ученым доступ к постоянно расширяющейся базе данных ДНК-последовательностей. А поскольку вся эта информация хранится в электронной форме (а не только в самой ДНК), компьютеры могут легко анализировать ее, сравнивая новые образцы ДНК с теми, что уже имеются в хранилище данных. Порой они находят ряд тех же букв, следующих в том же порядке; иными словами, выявляется полное совпадение данных. Иногда это часть гена, чья функция нам уже известна (зачастую она состоит в том, чтобы руководить синтезом определенного белка). Иногда этот фрагмент чуть отличается от какого-то существующего гена. Иногда он похож на ген, но содержит неизвестный компонент. Так, фрагменты ДНК, отвечающие за кодирование белков, заключают в себе особые сигналы, показывающие, где клеточная аппаратура для чтения ДНК должна прекращать работу, а где должна снова ее начинать. При тщательно продуманной интерпретации такое секвенирование «всего, что попало в ведро» способно многое поведать о населении ведра.
Впрочем, пока все равно не так-то просто осмыслить, что же присутствует в ключевых областях человеческого микробиома. Толстая кишка человека – вероятно, самая богатая и разнообразная экосистема на планете. Выделите из нее все гены, и вы обнаружите множество таких, которых никто никогда раньше не видел. Однако подобное массовое секвенирование отделяет ген от организма, которому он принадлежит; поэтому нельзя сказать, какие разновидности бактерий (или других существ) присутствуют в данном месте.
Биологи подчас пренебрегают этими подробностями, чтобы хотя бы понять, сколько различных видов имеется в образце. Для этого они сосредотачивают внимание лишь на одном определенном гене каждой бактерии. Подход действенный: у разных бактерий этот ген почти один и тот же, если не считать небольших его участков, где наблюдаются существенные отличия. Этот ген отвечает за формирование участка РНК, молекулярной кузины ДНК, а РНК входит в состав незаменимой наномашины – рибосомы, получающей генетическое послание от участка ДНК и на основе этой инструкции собирающей аминокислоты в белковую молекулу.
Один из таких генов отвечает за 16S рРНК (рибосомную РНК, названную так по скорости седиментации – скорости, с которой она движется, если поместить суспензию с ней в центрифугу. Стандартная лабораторная методика разделения крупных фрагментов клеток).
16S рРНК приносит исследователям неоценимую пользу. Она имеется лишь у бактерий, поскольку эукариотические рибосомы устроены иначе. В клетке она присутствует в больших количествах, а значит, ее можно сравнительно легко оттуда извлекать. А 1500 нуклеотидных оснований, из которых она состоит, можно было секвенировать уже несколько лет назад.
Как анализировать гены – по одному, все одновременно или же вид за видом?
Последовательность 16S рРНК занимает важное место в новейшей истории биологии: этот фрагмент стал стандартным инструментом первой стадии анализа микробиома. Собственно, первые работы с 16S рРНК начались еще до того, как можно было секвенировать всю последовательность. Карл Вёзе, умерший в 2012 году, давно использовал ее для того, чтобы заново нарисовать всю карту жизни. Еще в 1970-е годы он начал сравнивать последовательности коротких фрагментов РНК – олигонуклеотидов – у различных бактерий. Выстраивая взаимосвязи между микроорганизмами и «генеалогическими деревьями» этих последовательностей, в конечном счете удалось кардинальным образом пересмотреть всю структуру жизни на Земле. Вёзе обнаружил существование третьего домена (надцарства) живых организмов (входящие в него существа теперь именуются археями), довольно сильно отличающегося от двух доменов, которые уже были известны, – бактерий и эукариот (существ более крупных, имеющих клеточное ядро). Археи, как и бактерии, являются прокариотами. Раньше ученые полагали, что все прокариоты – сравнительно близкие родственники. Но археи заметно отличаются от бактерий. Поначалу их считали существами экзотическими, обитающими лишь в самых необычных местах, но теперь-то нам известно, что археи есть повсюду, в том числе в нашем микробиоме.
Добавление нового подразделения в совокупность всех живых организмов заставило переписать учебники и утвердило секвенирование 16S рРНК в качестве одного из ключевых методов микробиологического анализа. Однако первые работы Вёзе основывались на секвенировании фрагментов РНК, полученных из чистых культур. Более современный 16S-анализ идет еще дальше, позволяя исследователям отбирать ДНК-последовательности, создающие 16S рРНК, из невероятной мешанины живых организмов.
Основная идея остается той же, однако на практике осуществить ее непросто. Работа состоит из нескольких стадий: клетки образца «вскрывают», из них извлекают ДНК, затем обнаруживают все 16S-гены при помощи ДНК-праймеров, распознающих участки в начале или в конце гена, совершенно одинаковые для всех видов. Затем ДНК-фрагменты, помеченные этими праймерами, проходят циклическую обработку. Метод, изобретенный в 1980-х и названный полимеразной цепной реакцией (ПЦР), позволяет быстро и многократно копировать небольшие количества ДНК. И наконец – собственно секвенирование.
Финальная стадия – сравнение изменчивых участков генетических последовательностей 16S с уже известными нам участками (можно сравнивать как один участок, так и несколько) – сегодня отдана компьютерным программам, имеющим базы данных ДНК, где содержатся десятки тысяч таких последовательностей. То, над чем некогда мучились бесчисленные аспиранты, теперь автоматизировано (как и большинство рутинных процедур современной молекулярной генетики). Можно прикрепить небольшие отрезки многих таких последовательностей к «биочипу» – ДНК-аналогу микросхемы – и проводить сравнение непосредственно в образце. То, что некогда требовало отдельной лаборатории и усилий высококвалифицированных специалистов, теперь проделывает машина, хотя исследователям все равно требуется знать конкретные детали тех стадий, что приводят к получению результатов. Кроме того, следует знать много тонкостей: как обрабатывать пробу, как извлекать ДНК, какие именно участки последовательностей сравнивать. Ген 16S содержит в себе 9 из важнейших гипервариабельных участков ДНК; их многочисленные различия неоднородно распределены среди бактериальных видов. Поэтому от того, какие участки вы изучаете, многое зависит. Современные методы ДНК-анализа, особенно способность «размножать» сверхмалые количества ДНК, снова и снова копируя эту молекулу, имеют оборотную сторону. Эти методы чувствительны к загрязняющим компонентам, заносимым в ходе анализа, не меньше, чем к компонентам пробы, присутствовавшим в ней изначально. Это большая помеха на пути развития микробиомных исследований. Так, тщательная проверка, выполненная в 2014 году, показала, что стандартные наборы для выделения ДНК, которыми пользуются сегодня многие специалисты, зачастую не являются стерильными (вопреки рекламе). Если исходный образец взят из области с низкой плотностью микробного населения, результаты могут легко искажаться из-за микробов, невольно вносимых исследователями в процессе работы.
Как пишет в связи с этим журнал Nature, такая подверженность риску загрязнения «лишь усиливает озабоченность научного сообщества тем, что технология секвенирования развивается столь быстро, что в некоторых случаях она даже обгоняет возможности ученых пользоваться ею». Однако хотя получаемые данные всегда несколько расплывчаты и неопределенны, 16S-анализ всё же сообщает нам об образце «диких» (не выращенных в культуре) бактерий то, что прежде не удавалось узнать из исследования мешанины всевозможных ДНК. И хотя этот метод используется сейчас весьма широко, он – лишь первый уровень анализа. Чтобы получить более ясную картину того, что содержится в образце, не ограничиваясь грубой оценкой структуры микробной популяции, следует глубже проникнуть в ДНК.
Теперь возможно и это. В таких случаях опять же исследуются фрагменты ДНК, выделенные из «цельного» (неразделенного) образца. При таком подходе систему настраивают на секвенирование всех кусочков ДНК, какие только удастся найти. Изначально это секвенирование (так называемый «метод дробовика») применялось к отдельному виду: ученые пытались собрать воедино геномную последовательность из всех попадающихся фрагментов (какие-то повторялись, какие-то встречались лишь один раз).
Теперь же технологии настолько развиты, что мы можем позволить себе грубый силовой подход. Неважно, сколько видов в нашем образце. Просто расщепите ДНК, секвенируйте все фрагменты и посмотрите, какой смысл можно выявить в получившейся гигантской библиотеке всевозможных перепутанных последовательностей.
Всем этим как раз и занимается метагеномика. Она дает информацию обо всем генетическом составе сообщества организмов, даже если вы не знаете, какие организмы в него входят. Опять-таки пределы точности такого анализа часто определяются тем, насколько биологи, химики и компьютерщики, работая вместе, способны отделить сигнал от шума. По сути они разбираются с тысячами пазлов, которые сваливают в одну коробку и затем хорошенько встряхивают, причем никто толком не знает, на что похожи исходные картинки.
Впрочем, метагеномика предоставляет весьма перспективный метод работы с образцами, которые раньше считались бесполезными для анализа. Чем больше полных геномных последовательностей будет расшифровано и внесено в непрерывно растущие базы данных, тем эффективнее будет этот метод. Если тот или иной микробиом кажется нам заслуживающим внимания, теперь мы можем узнать, что в нем содержится, во всех подробностях. Хватило бы бюджета!
От наблюдений к экспериментам
Далее наступает этап, который технология облегчает мало. Нам предстоит выяснить, что все это значит. Вероятно, тут уместна аналогия с переходом от естественной истории к более глубокому научному пониманию того, что же мы так долго описывали и классифицировали. Здесь требуется объединить теорию с новыми экспериментами, иначе метагеномика рискует подпасть под шуточное определение Сиднея Бреннера, одного из отцов-основателей современной молекулярной генетики, и стать «биологией с непонятными данными на входе, высокими расходами и нулевым выходом».
Как же избежать столь безрадостного итога? Биологией можно заниматься самыми разными способами, но в данном случае разумно выделить три главных подхода. Один из них сводится к тому, чтобы выяснить, как проводить контролируемые эксперименты над микробиомом. Понятно, что опыты на людях ставить непросто, даже если эти опыты вполне отвечают этическим требованиям. Значит, следует обратиться к микробиомам других видов. Микробиомы есть у всех, так что для сравнения можно использовать самые разные существа. Список соответствующих микробиомов, которые уже проанализированы, неуклонно растет.
Более четкое сравнение можно провести, используя подопытных животных, которые начинают свою жизнь без всякого микробиома, – снабдить их микробиомом, специально сконструированным для того, чтобы получить ответ на конкретный вопрос, интересующий экспериментатора. Основная модельная система здесь – безмикробные мыши. Впервые их вырастили в лаборатории еще полвека назад. С помощью кесарева сечения им помогают появиться на свет, а затем растят в стерильных условиях. Всю работу исследователи должны выполнять при помощи герметических рукавов с перчатками на концах. Это занятие, дорогостоящее и трудоемкое, почти вышло из употребления с зарождением новой волны микробиомных исследований. Саркис Мазманян из Калифорнийского технологического института, лауреат премии «Гений» фонда Мак-Артура (с этим гением мы еще встретимся в главе 7), рассказывает, что в 2002 году, начав исследовать влияние микробов на кишечник, он обнаружил, что в пределах досягаемости нет никого, кто знал бы, как выращивать безмикробных мышей. «Мне пришлось убедить одного лаборанта, ушедшего на пенсию, помочь мне устроить стерильные боксы и научить меня «санитарной инженерии». Вместо устройств из стали и стекла, которые он использовал в свое время (50 лет назад), мы сумели раздобыть чудесные модернизированные боксы с пластиковыми пузырями, содержащими по 4 клетки с мышами. После того как я несколько раз случайно занес в эти боксы грязь, я понял, почему исследователи так редко обращаются к безмикробным подопытным животным».
Спустя десяток лет удалось наладить поточное выращивание безмикробных мышей во многих лабораториях. Мыши с давних пор служат моделями для генетических и биохимических исследований; есть фирмы, поставляющие для лабораторных исследований стандартизированные их породы («линии»). Теперь для лабораторных нужд привлекаются и другие безмикробные существа, в том числе крысы и (последнее приобретение науки) рыба данио-рерио. Эти рыбки замечательны тем, что эмбрионы у них прозрачные, поэтому за их развитием наблюдать гораздо легче.
Впрочем, все эти модели – своего рода компромиссы. В чем-то люди походят на мышей и даже на рыб, но в чем-то, как нетрудно заметить, от них отличаются. Любые результаты, полученные при изучении этих существ, в лучшем случае лишь указывают на то, что может происходить у людей. Возможна ли какая-то более удачная модель, отражающая наши, человечьи, особенности? Во многих отношениях подходит свинья. Она ближе к человеку, чем мышь, по размерам, по характеристикам пищеварительной системы, по общему метаболизму и даже по микробиому. Но давайте признаемся себе: свинья никогда не будет подопытным животным в большом количестве лабораторий. Колин Хилл из университетского колледжа Корка – один из исследователей, предпринимавших попытки задействовать свинью в качестве экспериментального объекта. На конференции 2014 года он предупредил: «Взрослая свинья с диареей – весьма неприятный объект для всех участников эксперимента».
Живые животные, как и их микробиомы, – сложные объекты. Нелегко увидеть, что происходит внутри этих существ. Вот почему был разработан целый ряд способов экспериментально воспроизвести какое-то подобие части животного или же подобие микробиома. Например, клетки кишечника можно выращивать в культуре, побуждая их образовывать нечто напоминающее внутреннюю оболочку кишечника. Можно попытаться воссоздать микробную экосистему в лабораторном сосуде (или в серии сосудов). Затем можно брать пробы меняющегося населения таких биореакторов, измерять его характеристики, анализировать состав питательной жидкости и выделяемой бактериями смеси. И все это для того, чтобы получить хоть какое-то представление о функционировании системы.
Такой подход годится, если ваша цель – подобрать оптимальную смесь микробов, которая может заново заселить кишечник пациента, чей микробиом резко перешел в нежелательное состояние из-за какого-то неприятного расстройства вроде болезни Крона. Однако такой метод не удовлетворит тех, кто хочет спуститься на молекулярный уровень. Биологические процессы идут в клетках, но управляют этими процессами молекулы, большие и маленькие.
Насколько глубоко вы хотите проникнуть в эти молекулярные детали, зависит от того, какого рода объяснение вы ищете. Эксперименты разрабатывают для проверки гипотез, а те в свою очередь возникают на основе идей – важнейшего компонента всех наших хитроумных микробиомных исследований. Изучение суперорганизма вбирает идеи из всех областей биологии.
Некоторые идеи пришли из теорий о развитии жизни. По выражению великого теоретика Феодосия Добжанского, «биология приобретает смысл только в свете эволюции». Дарвиновский естественный отбор в его современном виде остается биологической «теорией всего». Но он годится скорее для объяснения того, почему биологические объекты так себя ведут, чем для объяснения того, как они действуют.
Ответ на последний вопрос зависит от того, что вы хотите понять и на каком уровне. Многое в биологических системах – человеческих и микробных – зависит от структуры молекул. Но тут же возникает проблема: молекул-то очень много. В принципе я согласен с одним ученым, который на обеде в перерыве конференции, посвященной микробиомам, заметил: «Конечно, мы толком не поймем, что творится хоть с какими-то из этих штук, пока не найдем этому молекулярное объяснение». Впрочем, на практике такой подход не всегда кажется полезным и плодотворным. Зачастую он сводится к бесконечным утверждениям по схеме «А взаимодействует с B, тем самым влияя на C, что провоцирует отклик со стороны D… и в итоге получается X». Впечатляет, когда вы можете распутать всю цепочку, но такой результат всё же представляет собой не столько объяснение, сколько описание. Однако если такое умозаключение показывает, что мы могли бы избежать вредного результата X путем воздействия на A, B, C или D, оно может послужить отправной точкой для дальнейших изысканий.
Мне совершенно не хочется вспоминать тысячи подобных формулировок; к тому же во многих действительно интересных случаях уйдет масса времени на то, чтобы составить такую цепочку. А значит, нам понадобятся идеи более высокого уровня, чтобы осмыслить причинно-следственные связи, возникающие при нашем взаимодействии с собственными микробиомами. Поэтому давайте обратимся хотя бы к некоторым результатам из мощного потока данных, получаемых с помощью новых методик.