Наиболее подробно эти закономерности изложены в монографии И. Г. Акоева и Н. Н. Мотлоха «Биофизический анализ предпатологических и предлейкозных состояний» [1984]. Ниже конспективно изложены материалы из этой монографии.

 

Нарушения клеточного цикла пролиферирующих тканей

Развитие предпатологических и патологических состояний в той или иной форме связано с изменениями нормального соотношения процессов клеточного размножения и специализации (дифференцировки). Нарушение регуляции этих процессов предшествует и развитию опухолей.

Функция дифференцировки присуща всем живым клеткам. При развитии и совершенствовании многоклеточных организмов клетки дифференцируются с целью обеспечения выполнения в интересах целого организма так называемых специфических функций, т. е. тех функций, в прямых или косвенных результатах которых нуждаются другие клетки организма, прежде всего клетки иных типов дифференцировки. В настоящее время считается доказанным, что ядро дифференцированной клетки в значительной мере сохраняет мультипотентность, т. е. способность давать информацию, необходимую для развития всех потенциально возможных функций клетки. Процесс дифференцировки, вероятно, происходит главным образом через регулируемую извне репрессию—дерепрессию последовательно сменяющихся ведущих генов, т. е. эпигенетическим путем, а не за счет главенствования необратимых изменений генетического аппарата. Этот во многом не решенный вопрос общебиологической значимости имеет самое непосредственное отношение и к проблеме опухолевой трансформации.

Такой эпигенетический характер регуляции предполагает, что процесс дифференцировки клетки, исходно развертываемый на основе наследственного материала, через посредство внутриклеточных медиаторов должен управляться внеклеточными факторами, или репрессорами, будь то ионный состав среды, наличие в ней определенных химических соединений, контактных механических взаимодействий и др. Правильный запуск любого очередного этапа дифференцировки клетки вообще невозможен без адекватной реализации обратной связи структурных генов с внеядерной и внеклеточной средой (в их широком понимании) для предшествующего этапа.

Существует определенный антагонизм между функциональной и митотической активностью, между процессами дифференцировки и пролиферации. На тканевом уровне, как и на уровне клеточных популяций, обратная зависимость между степенью дифференцировки и пролиферативной активностью остается в целом верной.

Известно важное обстоятельство, вытекающее из указанной закономерности: по мере дифференцировки снижается реализуемая способность клеток к делению. Достигнув некоторой пороговой степени дифференцировки, клетки могут вообще перестать делиться и продолжают далее дифференцироваться без митозов, как это происходит у млекопитающих с корковыми нейронами и миоцитами. Потеря способности клеток к делению часто есть следствие дифференцировки клетки, заключающееся в утрате еще одной клеточной функции.

Применение различных способов получения синхронно делящихся клеточных популяций и метода радиоавтографии привело к обнаружению морфологически неявно различимых периодов клеточного онтогенеза. Эти периоды, обозначенные как G1 (пресинтетический — до основного синтеза ДНК), S (синтетический — идет синтез ДНК) и G2 (постсинтетический, или премитотический, — подготовка к делению клетки), совместно с митозом в представленной последовательности составляют митотический цикл.

Величина пролиферативной активности определяется не только количеством делящихся клеток, но и скоростью их продвижения по периодам митотического цикла. Для большинства растущих клеточных линий и тканевых культур интервал между делениями, или длительность цикла, составляет 10—30 ч. Наибольшее количество экспериментальных работ проведено на культивируемых клетках Hela. Время генерации этих клеток около 24 ч. В среднем они находятся 15—16 ч в период G1, 6—7 ч — в стадии синтеза ДНК (S-период), 2 ч — в периоде G2 и митозе.

Большинство исследователей пришли к убеждению, что для различных клеточных типов изменения продолжительности митотического цикла в основном происходят за счет вариаций его начального, пресинтетического G1-периода. Его длительность меняется от неуловимо малых значений до нескольких суток и более.

Клетки могут находиться в двух альтернативных состояниях — в митотической активности или покое. В последние годы к покоящимся принято относить клетки, которые неопределенно долгое время могут не размножаться и при этом полностью сохранять как жизнеспособность, так и способность к пролиферации (т. е. к делению) независимо от степени своей специфической функциональной нагрузки. Покоящиеся клетки всего лишь часть непролиферирующей фракции клеточной популяции.

Выход клетки в состояние пролиферативного покоя не является необратимым. В определенных физиологических или патологических ситуациях клетки могут вернуться в митотический цикл. Однако по мере пребывания клетки в состоянии покоя ее метаболизм становится все более консервативным и требуется все больше усилий и времени, чтобы инвертировать его на пути деления.

Во время продвижения клеток по циклу от одного митоза до другого встречается важнейшая критическая фаза в периоде G1, в которой осуществляется выбор клеткой дальнейшей судьбы — идти к делению или к дифференцировке. Она находится в середине или в завершающей части периода G1. В целом по мере клеточной дифференцировки в пределах сформированных органов в течение эмбриогенеза и в ходе постнатального онтогенеза темп репродукции клеток постепенно уменьшается. При этом продолжительность каждой последующей генерации клеток, как правило, возрастает (например, в ходе дифференцировки клеток миелоидного ряда — с 25 до 604 ч), а пролиферативный пул и матричная активность ДНК снижаются. Вместе с тем в любой стадии развития существуют промежуточные, бластные элементы с интенсивной пролиферацией и коротким циклом: нейробласты, миобласты, эритробласты и др. Между возрастом животного и средней продолжительностью цикла существует определенная зависимость. Так, пролиферативный пул, рассчитанный для зачатка печени, составил 64,1%. С возрастом эта величина уменьшается, составляя у новорожденных крыс около 39%, через 21 сут от рождения — 15, через 51 сут — около 3%.

Максимальный пролиферативный пул при регенерации равен 69,3%. Эта величина близка к величине пула в зачатке печени эмбрионов, равной 64,1%. В соответствии с этим эмбриональная и регенерирующая печень имеет схожие короткие времена средней продолжительности митотического цикла, которые близки к этому показателю для быстро делящихся клеток других эмбриональных тканей, злокачественных опухолей, клеток нормальной слизистой оболочки кишечника. Следует подчеркнуть, что и кинетика процессов пролиферации в зачатке печени и при ее регенерации в зрелом организме также имеет значительное сходство.

 

Изменения клеточного цикла после воздействия радиации

Многочисленными исследованиями установлено значительное нарушение митотического цикла клеток при воздействии на них разнообразных факторов. Наиболее полно изучено действие ионизирующих излучений. Первоначальная задержка клеточного деления и соответствующее удлинение митотического цикла при воздействии радиации сменяются в дальнейшем сокращением продолжительности митотического цикла.

Имеется большое число исследований, направленных на изучение реакций отдельных периодов клеточного цикла на воздействие радиации. Для разных линий клеток получены различные данные. Обобщение этих данных, проведенное во многих работах, показало, что для большинства изученных клеток в культуре митоз и конец периода G1 (переход в период S) наиболее чувствительны к действию радиации, а период S — наиболее устойчив. Задержка деления клеток наиболее значительна, если облучение осуществляли во время митоза, и мала для клеток, облученных в период S. Однако имеются линии клеток, где соотношение задержек периодов клеточного цикла иное.

Обращено внимание также на то, что реакция клеток на облучение в различные периоды клеточного цикла прямо противоположна, если сравнивать задержку деления клеток и их гибель: чем больше задержка деления, тем меньше гибель клеток. Так, клетки, облученные в периоде S, могут иметь высокую выживаемость потому, что они на длительный срок задерживают свое деление. В этот удлиненный период до деления клетки могут успеть отрепарировать возникшие в них повреждения. Обращено внимание на то, что радиозащитное средство цистеамин не оказывает защитного эффекта при воздействии радиации в период G1 в отличие от облучений во время других периодов клеточного цикла.

Данные о влиянии радиации на митотический цикл клеток опухолей in vivo противоречивы, что объясняют различным временем проведения исследований после облучения. Работая на тех же клетках четырехсуточной асцитной фибросаркомы, обнаружили сначала удлинение митотического цикла (в 2 раза через 20 ч после облучения), а затем укорочение (через 48 ч). Если исследовать клеточный цикл асцитной карциномы Эрлиха сразу после облучения, то наблюдается увеличение продолжительности периодов G1 и G2 в 2 раза; продолжительность митоза не изменена.

Значительно меньше данных об изменении стадии митотического цикла in vivo у млекопитающих при действии радиации. Прежде всего выяснилось, что периоды G1 и G2 наиболее сильно реагируют на воздействие радиации, а периоды М и S — мало. При усилении пролиферативной активности тканей организма сокращения продолжительности митотического цикла в основном происходят за счет периода G1.

В опытах на собаках, подвергавшихся длительному слабому хроническому воздействию, показано, что средняя продолжительность генерационного цикла миелоидных элементов может сокращаться в 2 раза за счет сокращения всех периодов интерфазы. В эритроидном ростке (эритробласты) в этот период сокращение генеративного цикла не было столь значительным и происходило только за счет укорочения периода G1.

При одновременном исследовании митотического цикла у клеток кишечника и костного мозга установлено, что изменения продолжительности цикла клеток кишечника были менее выраженными. По-видимому, это является отражением того факта, что клетки кишечника делятся чаще, чем бластные клетки костного мозга. Возможности к сокращению интерфазы клеток кишечника меньше, чем у клеток костного мозга. Имеется взаимосвязь между нормальной продолжительностью митотического цикла клеток и чувствительностью их к хроническому облучению — чем короче интерфаза митотического цикла, тем чувствительнее клетки к радиации. Это обусловлено продолжительностью периода G1.

Дальнейший наш анализ возможной роли периода G1 в определении устойчивости к радиации показал много интересного. Широко распространенный феномен приостановки клеточного деления в пролиферирующих тканях (первоначальная реакция) относится к более общей реакции биологических систем в ответ на повреждение. Происходит временное ингибирование многих функций, не необходимых для репарации (восстановления) повреждений, и отдаление по времени переходов в другие функциональные состояния, когда эти невосстановленные повреждения могут проявиться неблагоприятным для биологической системы эффектом. Такое однотипное поведение биологических систем наблюдается на разных уровнях: организм, физиологическая система, клеточная система, ткань.

Продолжительность возможных задержек периодов клеточного цикла зависит не только от характера ткани, к которой клетки относятся. Так, в эпителии роговицы глаза мышей в период G1 возникают более продолжительные задержки, чем в эпителии кишечника, в расчете на единицу дозы нейтронного излучения: для эпителия роговицы — 17 мин на 0,01 Гр, а для эпителия кишечника — только 4 мин на 0,01 Гр. Продолжительность митотического цикла клеток эпителия роговицы в норме в 6,5 раза больше, чем у клеток эпителия кишечника. К тому же клетки эпителия роговицы способны блокировать митотический цикл в периоде G1 на значительно большие сроки, чем это возможно для эпителия кишечника. Установлено, что способность к удлинению продолжительности интерфазы (в основном в периоде G1) митотического цикла является одним из основных условий эффективного завершения репарации лучевых повреждений. Существует определенная пропорциональность продолжительности блоковых задержек периодов интерфазы митотического цикла и интенсивности повреждения.

Четкие доказательства последовательности выхода клеток из блоков различных периодов интерфазы митотического цикла, зависимость продолжительности их от дозы облучения, относительное значение блоковых задержек были получены в нашей лаборатории В. Г. Тяжеловой и др. Основной результат аналитических исследований представлен в виде пространственной трехкоординатной картины дозовых кривых митотической активности, позволяющих извлекать ряд интересных закономерностей. Всего выделено пять пиков митотической активности. Экстраполяция дозовых зависимостей к нулевой дозе характеризует нормальную продолжительность периодов митотического цикла: G1 — 8 ч, S — 8, G2 — 1 и М — 1 ч при суммарной длительности цикла 18 ч. Это соответствует данным, полученным другим путем для эпителия кишечника крыс. Длительность блока в данном эксперименте учитывается через максимум митотической активности, который здесь представляет собой сумму нормальной длительности периода и блоковой задержки. Первые три пика соответствуют первому послеблоковому делению клеток. Выход клеток из блоков происходит в естественной последовательности. Раньше клетки выходят из блоков тех периодов, которые в момент облучения были ближе по ходу естественного созревания клеток к периоду митоза. Первая кривая характеризует выход из блока G2M, вторая — из блока SG2, третья — из блока G1S.

С увеличением дозы облучения длительность всех периодов интерфазы митотического цикла растет, но не беспредельно. Она стремится к некоторому пределу. С одной стороны, удлинение периодов интерфазы необходимо для репарации увеличенного объема повреждений с увеличением дозы облучения, с другой — клетка, по-видимому, не может находиться неограниченное время в каком-либо одном периоде интерфазы и задерживать естественный для нее процесс созревания. Для каждого периода развития клетки характерно преобладание одних структурнофункциональных процессов и ингибирование других. В этом причина ограничения продолжительности блоковых задержек периодов интерфазы митотического цикла.

При этом скорость достижения указанного предела для разных периодов неодинакова. Она последовательно уменьшается для блоков G2M, SG2 и G1S. Длительность периодов с учетом блоковых задержек после облучения максимальна для G1, меньше для S и еще меньше для стадии G2. В то же время относительные изменения периодов (в процентах от нормальной продолжительности стадии) иные: максимальное для G2, менее сильное для G1 и слабое для периода S.

Сравнительный анализ площадей, охватываемых кривыми митотической активности, дал возможность при некоторых допущениях (число клеток пропорционально площади) оценить относительное число выживающих клеток, облученных в определенном периоде митотического цикла, и построить дозовые кривые выживаемости. Клетки, облученные в периоде S, не погибали, пока доза облучения не превысила ~5 Гр, Даже после облучения в дозе 9 Гр еще выживало не менее половины клеток. Кривая выживаемости для клеток, облученных в периоде G2, имеет небольшое плечо, затем число выживающих клеток снижалось и достигало примерно 50% в районе дозы облучения 5 Гр. Поведение клеток, облученных в стадии G1, существенно отличалось. Гибель клеток происходила при любой дозе и достигала примерно 50% при облучении в дозе порядка 3,5 Гр, а при облучении в дозе 9 Гр оставалось в живых лишь около 20% клеток. Наибольшие различия обнаруживаются при сравнении доз облучения, вызывающих небольшой процент гибели. Так, для того чтобы получить примерно одинаковую 80%-ную выживаемость клеток, необходимо облучать клетки в периоде S в дозе около 7,5 Гр, в периоде G2 — в дозе около 2,5 Гр и в периоде G2 — в дозе 0,5—1,0 Гр.

Хотя эти выводы были получены на основе анализа ограниченного материала (эпителий тонкого кишечника крыс при воздействии на них радиации с мощностью дозы около 0,4 Гр/мин), они позволяют делать более общие выводы, так как не противоречат отрывочным данным других авторов.

Итак, проводя дальнейшие сопоставления полученных выводов для эпителия кишечника крыс, необходимо обратить внимание на следующее.

1. Период S среди других периодов интерфазы митотического цикла обладает наибольшей устойчивостью к радиации и имеет на кривой выживаемости плечо, свидетельствующее об огромных возможностях репарационных процессов, характерных для этой стадии. Однако при воздействии радиации период S имеет наименьшее относительное увеличение своей продолжительности за счет блоковых задержек и по достижении предельно возможной длительности блоковой задержки начинается гибель клеток. При этом кривая уменьшения выживаемости при дальнейшем увеличении дозы облучения имеет наибольший наклон. При ускорении процессов деления клеток период S относится к наименее укорачиваемому.

2. Период G1 отличается наибольшей чувствительностью к радиации и не имеет на кривой выживаемости плеча, которое свидетельствовало бы о сколько-нибудь заметных возможностях репарационных процессов, характерных для этого периода. Однако период G1 при действии радиации имеет наибольшее абсолютное увеличение своей продолжительности и не имеет ограничений в этом (по крайней мере, до дозы 9 Гр нет такого ограничения). Гибель клеток отмечена даже при дозах менее 1 Гр. При ускорении процессов деления период G1 наиболее вариабелен и может весьма существенно укорачиваться. В случае сокращения генеративного цикла это происходит в основном за счет периода G1.

3. Период G2 наиболее короткий в норме, и увеличение его при воздействии радиации также небольшое, хотя в процентном отношении и является наибольшим. Этот период быстрее других выходит на предел возможного увеличения своей продолжительности. По количеству клеток, погибающих после облучения в периоде G2, он занимает промежуточное положение между периодами S и G1. Изменения длительности этого периода не отражаются существенно на общей продолжительности митотического цикла.

Интересные данные получены Ямагучи и Табачником при исследовании кинетики клеток эпидермиса кожи морских свинок в норме и после локального воздействия бета-радиации. Основные исследования проводились в период 12—14 сут после облучения, когда вслед за клеточной депопуляцией развивалась активная пролиферация и отмечался наиболее высокий митотический индекс. Результаты исследований приведены ниже. Указана продолжительность всего цикла и отдельных его периодов в часах.

Полученные данные вновь подтвердили, что длительность периодов М и S наиболее неизменяема, в то время как длительность периода G1 была наиболее измененной, она оказалась сокращенной примерно в 20 раз. Доля G1 в митотическом цикле у этих клеток составляет 83 %. Для базальных клеток эпидермиса в норме характерен очень длительный период G1, составляющий до 80—85% всей продолжительности клеточного цикла. По-видимому, это связано с главной особенностью кожи — постоянным контактом с изменениями окружающей среды и необходимостью противостоять вредным ее воздействиям.

 

Изменения клеточного цикла в предопухолевых состояниях и в опухолях

При канцерогенезе на первый план всегда выступают количественные изменения пропорции дифференцирующихся и размножающихся клеток, связанные с уменьшением доли дифференцирующихся клеток среди дочерних генераций.

Интенсивность пролиферации злокачественной ткани часто превышает нормальную этих же тканей. Это различие, однако, не относится к числу абсолютных критериев. Известно достаточное количество примеров обратных взаимоотношений, когда скорость деления злокачественных клеток снижена по сравнению с исходными нормальными значениями. К тому же в массе опухолевой ткани могут существовать и длительно не пролиферирующие клетки, пребывающие в состояниях покоя или дифференцировки.

Опухоли чаще всего возникают в местах длительной и (или) интенсивной физиологической или репаративной (раневой) регенерации, сопровождаемой увеличением клеточной массы. Между канцерогенезом и предшествующей ему длительной и (или) интенсивной пролиферацией существует, как правило, положительная корреляция.

Однако после завершения малигнизации пролиферативная активность может быть разной. Важная пролиферативная характеристика гетерогенности популяции — коэффициент вариации длительности митотического цикла составляющих ее клеток. Вариабельность длительности цикла и отдельных его периодов увеличена для клеток в ходе предопухолевой активной пролиферации и в злокачественных опухолях.

Нормальные обновляющиеся ткани, обладающие очень высокой митотической активностью, имеют минимальный резерв ее дальнейшего увеличения. Поэтому стимулы, направленные на дальнейшее увеличение интенсивности деления клеток этих тканей, в процессе канцерогенеза могут вести к срыву компенсаторного резерва, который находится и в норме «на пределе», и в результате к концу канцерогенеза — к уменьшению скорости деления. В тканях, в которых скорость нормального размножения клеток далека от максимальной, величина компенсаторного резерва пролиферативной активности может оказаться достаточно высокой. Поэтому в этих тканях неэкстремальные стимулы к интенсификации клеточного деления вызывают в них прямой эффект усиления митотической активности, сохраняющейся и после окончания канцерогенеза. Время генерации пролиферирующих лейкозных бластов обычно значительно меньше, чем ранних кроветворных предшественников, т. е. они размножаются быстрее и с укороченным митотическим циклом.

Вероятность опухолевой трансформации наиболее велика для клеток активно пролиферирующих тканей. Возникновение процесса трансформации клеток, по нашему мнению, можно рассматривать как результат естественной метаболической перестройки клетки в ответ на внешние для нее воздействия и условия, вызывающие длительную и непрерывную стимуляцию клеточного деления, происходящего при сокращении митотического цикла клеток и особенно периода G1.

 

Биохимические и биофизические изменения, связанные с усилением пролиферативной активности

Имеется большое количество книг и обзоров, рассматривающих биохимические процессы в тканях и популяциях клеток со стимулированной пролиферацией. Существуют общие закономерности, свидетельствующие об одинаковой направленности большинства биохимических изменений в эмбриональных, регенерирующих и опухолевых тканях по сравнению с нормальной тканью, хотя встречаются и отдельные исключения.

Пролиферирующие активно делящиеся клетки обычно отличаются усиленным расходованием липидов, ускоренным гликолизом, нуклеосинтезом и протеосинтезом, повышением активности пентозофосфатного шунта. В таких клетках, как правило, соотношение циклаз смещается в сторону гуанилатциклаз, соотношение циклонуклеотидов — в сторону цГМФ над цАМФ. Соответственно увеличивается активность цГМФ-зависимых протеинкиназ и уменьшается активность цАМФ-зависимых протеинкиназ. В митохондриях увеличивается активность АТФаз и снижается активность АТФ-синтетаз, накапливаются ионы Ga2+ и уменьшается содержание ионов Mg2+. Активность НАДФ-зависимых дегидрогеназ повышается, а НАД-зависимых — падает. В цитоплазме уменьшается соотношение белковых SH- и S—S-групп, а в ядре и ядрышке — увеличивается. В отношении небелковых SH- и S—S-групп картина обратная.

При длительном усилении пролиферативной активности ткани и снижении степени дифференцировки составляющих ее клеток однозначно увеличивается активность систем, определяющих основные биологические характеристики делящихся клеток и являющихся более древними в эволюционном плане. Одновременно или несколько позже в таких случаях снижается активность эволюционно более молодых систем, связанных с ведущими признаками дифференцированного состояния клетки.

Эта закономерность общая для всех ускоренно размножающихся клеток, включая и клетки злокачественных опухолей. Не обнаружено никаких специфических опухолевых ферментов или каких-либо белков, липидов, гликолипидов или других химических соединений, которые не были бы свойственны нормальным клеткам на различных этапах их жизненного пути.

При длительном состоянии ускоренной пролиферации любых клеток происходит определенная редукция клеточного метаболизма. Так, Уоррен и Бак отметили, что злокачественные, активно пролиферирующие клетки содержат больше гликолипидов с короткими углеводными цепями, чем нормальные (из-за сниженного содержания сиаловой кислоты), но меньше гликолипидов с длинными цепями. Такие клетки в силу укорочения митотического цикла не успевают завершать синтез углеводных компонентов своих гликолипидов. Уменьшено среди белков и гликопротеидов поверхности клеток количество фибронектина и коллагена, неспецифических и адгезивных гликопротеидов как при стимуляции пролиферации в норме, так и при опухолевом росте. Подобные аномалии могут нести к снижению чувствительности клеток к контактному угнетению митотической активности и к изменению иммунной специфичности гликопротеинов клеточной поверхности.

При длительном состоянии ускоренной пролиферации в существующих в норме последовательностях реакции, преимущественно имеющих специализированное значение, возможно также выпадение промежуточных звеньев. Оно начинается со снижения активности и содержания фермента, а затем приводит к исчезновению последнего. Соответственно происходит упрощение состава метаболитов и укорочение метаболического пути.

Клетка в связи с ускоренным размножением как бы освобождается от уже ненужных метаболических реакций. Некоторые специализированные ферменты, принимающие участие в функции нормальных тканей (аргипаза, каталаза, цитохромоксидаза, цитохром с, эстераза и др.), в опухолях отсутствуют, или их активность очень низка. Иными словами, нарушается или утрачивается специфический ферментный профиль. Например, в митохондриях с увеличением скорости роста гепатом Морриса появляется дефицит моноаминооксидазы на внешней мембране, аденилатциклазы в межмембранном пространстве и глутаматдегидрогеназы в матриксе. Аналогичные данные получены и для нормальной печени, регенерирующей после частичной гепатэктомии. Некоторые опухоли имеют митохондрии с недостатком одного или двух компонентов дыхательной цепи с дефицитом ферментов клеток крови.

При редукции метаболизма в ускоренно размножающихся клетках в реакциях катаболизма (распада) происходит снижение эффективности работы метаболической цепи в целом. В реакциях анаболических (синтеза) в условиях энергетического дефицита может происходить неполное завершение последовательности реакций и(или) переход к «крупноблочному строительству», т. е. утилизации высокомолекулярных недорасщепленных субстратов. Сокращение этапов синтетических процессов наиболее вероятно в условиях обостренной конкуренции за макроэргические соединения, выработка которых может затрудняться падением общей продуктивности митохондриального окислительного фосфорилирования при редукции митохондриального аппарата либо при внутритканевой гипоксии в далеко зашедших пролиферативных состояниях.

Так, есть некоторые экспериментальные доказательства возможности использования активно делящейся клеткой крупных блоков для синтеза ДНК. Например, в опухолевых клетках по сравнению с нормальными в десятки раз более активны ферментные системы, направляющие биосинтез нуклеотидов на энергетически выгодные пути утилизации готовых пуриновых и пиримидиновых оснований без предварительного их синтеза. Такой механизм может обеспечить клетке повышенную скорость обновления нуклеиновых кислот независимо от наличия простых предшественников энергоемкого синтеза азотистых оснований (из глицина, аспартата, глутамина, формиата, рибозы).

В то же время «крупноблочное строительство» может уменьшить эффективность репарации ДНК и увеличить накопление в ней ошибок. В быстро пролиферирующих тканях и опухолях низка активность не только деполимераз нуклеиновых кислот, но и ряда катаболических ферментов пиримидинового, пуринового и аминокислотного обмена. Создаются условия для снижения субстратной специфичности ферментов. Известны случаи замещения аминокислот в полипептидных цепях в процессе их синтеза, вероятность которых с усилением пролиферации нормальных клеток, как мы предполагаем, может повышаться.

Такие же замены аминокислот часто делают ферменты более чувствительными к тепловой денатурации. При этом доля термолабильной фракции белков возрастает. С другой стороны, термолабильная фракция ферментов обладает сниженной субстратной специфичностью и реагирует с аналогами субстратов с большей эффективностью, чем нормальные ферменты катализа.

Немногочисленные биофизические данные также свидетельствуют о существенной роли нарушений содержания элементов кальция, хлора, меди, йода, железа, магния, марганца, фосфора, калия, натрия, цинка и соотношений их концентраций в процессах пролиферации в дифференцировки и опухолевой трансформации.

По мнению ряда ученых, ключевая роль в этом процессе принадлежит ионам Mg2+. Удаление Mg2+ из среды инкубации сказывалось в торможении синтеза ДНК, а снижение концентрации Са2+ действовало на синтез только при одновременном четырехкратном уменьшении содержания Mg2+. Предполагается, что роль кальция в регуляции деления клеток опосредована магнием.

В настоящее время наибольшее признание имеет точка зрения, согласно которой модификация ферментов, участвующих в обмене циклических мононуклеотидов, и внутриклеточная концентрация последних являются одними из ранних реакций, связанных со стимулированием пролиферации или дифференцировки.

В различных нормальных и опухолевых клеточных популяциях и тканях отмечается общая направленность изменения циклазных систем при увеличении содержания пролиферирующих и дисдифференцированных клеток. Это увеличение отношений цГМФ/цАМФ, гуанилатциклаза/аденилатциклаза, цГМФ-зависимые протеинкиназы/цАМФ-зависимые протеинкиназы.

В нормальных дифференцированных тканях взрослых животных активность аденилатциклазной системы, как правило, существенно превышает активность гуанилатциклазной. С увеличением пролиферативной и особенно дисдифференцированной компонент клеток эти соотношения начинают возрастать в сторону гуанилатциклазной системы.

В связи с этим широко распространено мнение, что цАМФ участвует в фосфорилировании белков, отвечающих за специализированную функцию дифференцированной клетки, а цГМФ — за фосфорилирование белков, участвующих в пролиферации.

Для гепатом Морриса отмечена корреляция перечисленных изменений циклазных систем со скоростью роста. Интересны также данные о том, что гуанилатциклаза печени может стимулироваться некоторыми химическими канцерогенами.

Так называемые связанные сульфгидрильные (SH-) и дисульфидные (S—S-) группы находятся в белках благодаря наличию в них серосодержащих взаимопревращающихся аминокислот цистеина (SH-) и цистина (S—S-), а свободные группы (если не учитывать SH-группы свободных аминокислот) принадлежат в основном глутатиону.

Отмечено, что общеклеточный сдвиг равновесия групп SH↔SS влево стимулирует деление клеток, а смещение вправо — задерживает. В целом в клетках животных, растений и микроорганизмов для прохождения митоза необходима относительно высокая концентрация SH-групп.

Таким образом, в ряде случаев прослеживается положительная корреляция между общим содержанием SH-групп в клетках и интенсивностью их пролиферации. Существенный вклад в это увеличение, по-видимому, вносит и синтез de novo глутатиона.

Есть ряд данных, указывающих, что внутритканевое содержание убихинонов, токоферолов, некоторых стероидных гормонов, фосфолипидов и SH-содержащих белков при усиленной пролиферативной активности возрастает в нормальных и злокачественных клетках.

Концентрация водородных ионов (pH) внутри и вне клетки является фактором, регулирующим направленность и интенсивность множества внутриклеточных процессов.

Как в нормальных, так и в малигнизированных тканях в состоянии активной пролиферации нередко регистрируется снижение pH. Это особенно характерно для тех случаев, когда ускоренная пролиферация сопровождалась гипоксией и дисфункцией митохондриального аппарата, что способствует внутриклеточной аккумуляции метаболических кислот, например молочной кислоты. Измерения pH в раковых тканях показали, что они в среднем на 0.5 единиц pH имеют более кислую реакцию, чем нормальные ткани, хотя в отдельных случаях pH снижается на 1—2 единицы. Если нормальные клетки имеют внутриклеточный pH около 7,4, а раковые в обычных условиях ~7,0, то с усилением потребления последними глюкозы pH может достигать 5,8—6,0.

С интенсификацией клеточного деления и соответственно снижением степени дифференцировки клеток, как правило, уменьшаются электропроводность, теплопроводность, мембранный потенциал покоя, ионселективность плазматической мембраны, степень кальцификации, механическая прочность мембран, степень адгезии (прилипания) в системах «клетка+клетка», «клетка+подложка», контактное торможение деления, антиокислительная активность липидов, вязкость цитозоля и повышаются перекисное окисление липидов, способность белков и ДНК к денатурации, неспецифическая проницаемость мембран, подвижность органических молекул в мембране, электрофоретическая подвижность, диффузия веществ внутри клетки, гидрофильность мембран (степень гидратации), степень текучести, «разжижения» мембран.

Среди перечисленных характеристик нет ни одной, которую можно было бы строго доказательно отнести к специфическим признакам опухолевого роста. Все эти изменения обусловлены повышенной интенсивностью клеточной пролиферации. В условиях нормальной пролиферации они обратимы. Изменения не являются ведущими в опухолевой трансформации и в малигнизации, а служат функциональным отражением или сопутствующим фоном реакций исполнительного аппарата клетки в ответ на регулирующие пролиферацию сигналы и изменения окружающей ее среды.

То же самое можно сказать и в отношении морфологических изменений. Изменения, выявляемые различными методами световой и электронной микроскопии, обычно тем глубже, чем выше уровень пролиферативной активности и степень нарушения дифференцировки. При длительной интенсивной пролиферации повышается количество аномалий клеточного деления как в нормальных, так и в опухолевых тканях. Электронная плотность клеток и части их органелл (митохондрии, ядерного матрикса, цитозоля) обычно снижается в состоянии активной пролиферации. Объем ядра, ядрышек и ядерно-цитоплазматическое отношение часто значительно увеличиваются. Возрастает количество пор в ядерной мембране. Понижена степень конденсации хроматина. Расширяются эндоплазматические цистерны. Соответственно уменьшается число связанных рибосом и увеличивается количество свободных рибосом. Размеры полисом сокращаются. Пониженное содержание гранулярной сети в эмбриональных, регенерирующих и других тканях с интенсивным делением клеток отражает тот закономерный факт, что их клетки заняты собственным воспроизводством в большей степени, чем выполнением специализированных функций для удовлетворения внеклеточного функционального запроса в данный момент.

Это же обстоятельство объясняет снижение количества и размеров секреторных пузырьков и гранул, а также иногда наблюдаемую частичную редукцию секреторных структур аппарата Гольджи. Запасы резервных полимеров, капель липидов и особенно гранул гликогена в животных клетках резко истощаются. Эти морфологические наблюдения совпадают с биохимическими данными о существенной стимуляции гликолиза и липолиза при недостаточности соответствующих анаболических процессов.

В среднем может быть увеличено количество и размеры некоторых цитоплазматических включений: липофусциновых гранул, миэлиновых фигур, Бизаровых телец и т. д. Предполагается, в частности, что липофусциновые гранулы (каротиноксисомы) могут способствовать активации реликтовых путей поддержания энергетического и окислительного обмена в условиях ограничения функции митохондрий и развивающейся в связи с этим клеточной гипоксии. Известно появление так называемой токсической зернистости нейтрофилов при состояниях, сопровождающихся при токсических отравлениях лейкопенией с последующей стимуляцией лейкопоэза. Увеличение числа дегенеративных клеток характерно для абортивного подъема числа лейкоцитов при лучевой болезни, когда наблюдается первый пик регенерации лейкопоэза и предполагается укороченным митотический цикл бластных клеток. Тельца Бизара появляются в предлейкозный период, когда обычна гиперплазия эритроидного ростка костного мозга.

Претерпевают изменения и митохондрии: матрикс светлеет, часто объем их возрастает, количество крист уменьшается, содержание осмиофильных гранул повышается. Последнее обстоятельство имеет биохимическое подтверждение в увеличении количества внутримитохондриального кальция, что характерно как для регенерирующих, так и для опухолевых тканей. Относительно быстро истощается компенсаторный резерв окислительного фосфорилирования и становится невозможным его эффективное функционирование в связи с низким напряжением кислорода и по другим причинам. Митохондрии клеток быстро пролиферирующих тканей по сравнению с неделящимися более чувствительны к повреждению в различных неблагоприятных для клетки условиях.

Уменьшается степень связи клеток в ткани, о чем свидетельствует увеличение размеров межклеточных пространств, снижение числа и размеров щелевых мостиков и других структур межклеточных контактов. Сокращение межклеточных контактов совпадает с изложенными биофизическими данными. В далеко зашедших случаях хронической ускоренной пролиферации может происходить потеря контактного торможения деления клеток.

Важно обратить внимание на то, что в клетках, длительное время ускоренно размножающихся, уменьшается число специализированных выростов и выпячиваний плазматической мембраны, содержащих различные рецепторные комплексы на гормоны белковой природы, антигены, гормональные регуляторы и др. Этот признак является морфологическим отражением утраты клеткой многих поверхностных глюко- и протеоконъюгатов, падения чувствительности делящейся клетки к внешним регуляторным влияниям. Происходит относительная «регуляторная глухота», снижение чувствительности ко многим гормонам белковой природы, действующим на уровне внешней стороны плазматической мембраны.

Средняя картина морфологической перестройки клетки в связи с длительной интенсификацией деления характеризуется сокращением количества и объема мембранных структур, выполняющих специализированные функции в интересах целого организма, и одновременно усилением структур, непосредственно связанных с функцией деления. Клетка морфологически упрощается и становится более похожей на независимо существующий одноклеточный организм (рис. 5).

Все изложенное приближает изначально дифференцированную зрелую клетку к ее эволюционно более древним предкам. Сокращение общей площади мембран клетки сочетается с биохимическими и биофизическими данными о нарушении интегральных функций мембран и связанных с ними структур и первичных регуляторных процессов.

Рис. 5. Цитологическая перестройка «идеальной» животной клетки при переходе от состояния «покоя» (специфической функции в дифференцированном состоянии) к пролиферации (снижению специфической функции и дисдифференцировке)

1 — ядро; 2 — ядрышко; 3 — хроматин; 4 — митохондрии; 5 — лизосомы; 6 — микротельца; 7 — секреторные пузырьки; 8 — агранулярный эндоплазматический ретикулум; 9 — гранулярный эндоплазматический ретикулум; 10 — гранулы гликогена; 11 — капли липидов; 12 — свободные рибосомы; 13 — связанные рибосомы; 14 — полисомы; 15 — гранулы неорганических веществ; 16 — центриоль; 17 — микроворсинки; 18 — межклеточные контакты; 19 — межклеточные пространства; 20 — базальная мембрана

Способность к пролиферации — древнейшее свойство клеточного уровня организации биологических систем. Специфические функции клетки, возникшие в ходе дифференцировки у многоклеточных организмов, относятся к более поздним эволюционным приобретениям. Эти функции связаны с разделением обязанностей и специализацией отдельных клеток в интересах целого организма.

Переход клетки и ткани от выполнения специализированной функции в системе целостного организма, т. е. от дифференцированного состояния, к снижению дифференцировки и усилению пролиферации означает переход на эволюционно более древние и более устойчивые пути метаболизма. Обнаружение в активно или длительно пролиферирующих тканях каких-либо эмбриональных свойств (ферментов, антител и т. п.) следует рассматривать как проявление эволюционно-древних признаков.

 

Ошибки синтеза белка при усилении пролиферативной активности ткани

В процессе канцерогенеза могут появляться не характерные для данной нормальной ткани белки, изменяться спектры изоферментов и антигенов, что и используется для ранней диагностики опухолевых заболеваний. Однако указанные изменения оказались не строго специфичными, поскольку аналогичные белки, их модификации и аналогичные изменения спектров изоферментов и антигенов характерны как для периода эмбрионального развития, так и для периодов длительной и значительной активации размножения клеток нормальной ткани.

Так, открытие в свое время α-фетопротеина как специфического ракового белка оказалось ошибочным. Позднее он был обнаружен и в нормальных тканях в случаях стимулированной пролиферации.

В этих случаях также изменяется соотношение изоформ белков, что отражается в изменении, например, спектра гемоглобинов и спектра изоферментов. Изменяется и антигенная характеристика белков. Важно, что имеются общие особенности всех указанных изменений.

1. Эти изменения приводят к качественному подобию спектров изоформ белка нормальной ткани в состоянии активной пролиферации и нормальной регенерирующей ткани к спектрам изоформ белка эмбриональной и активно растущей злокачественной ткани. Такое же подобие наблюдается и по спектру антигенов.

2. Указанные изменения в нормальной ткани возникают вслед за стимуляцией пролиферативной активности и исчезают, как только пролиферативная активность нормализуется. Это не зависит от типа ткани.

3. Указанные изменения происходят и при воздействиях физических факторов на организм человека и животных, но только в тех случаях и в то время, когда происходит усиление пролиферативной активности ткани. Новые белки в этом случае, как правило, не появляются, но может происходить их модификация.

Следовательно, во всех указанных случаях можно говорить прежде всего о генетической регуляции, о процессах репрессии — дерепрессии определенных локусов генома в зависимости от состояния клетки, об однотипности и неспецифичности процессов генной регуляции для разных тканей организма и при воздействии разных факторов, вызывающих состояние активной пролиферации ткани. Указанные изменения не требуют возникновения мутации, т. е. изменений в структурных генах. Необходимые процессы генной регуляции синтеза белка описаны достаточно подробно во многих руководствах, и на них мы останавливаться не будем.

Однако механизмы возможной связи между изменением пролиферативной активности и изменением изоформ белков не ясны. В связи с изложенным следует рассмотреть ошибки рибосомального синтеза, не связанные и связанные с генетической регуляцией. Особое внимание было обращено на тот факт, что закономерные ошибки рибосомального синтеза белка обнаруживаются и в опытах in vitro в бесклеточной среде при отсутствии генной регуляции.

Наиболее распространенное мнение о механизме работы рибосомы предполагает, что рибосома, состоящая из двух неравных субчастиц, ползет по матричной РНК от 5'-конца к 3'-концу, считывает информацию об аминокислотной последовательности и присоединяет соответствующие аминокислоты в полипептидную цепь. При этом малая субчастица рибосомы осуществляет контакт с мРНК. Полипептидная цепь собирается на особых центрах большой субчастицы. При этом механизм сборки полипептида, динамика процесса остаются неясными.

А. С. Спирин и Л. П. Гаврилова предложили свою схему строения рибосомы, которая лучше соответствует наблюдаемым фактам, вскрывает движущие силы и механизм работы рибосомы. В основу положено разделение функций между субчастицами: большой отведена роль полимерного носителя, удерживающего последовательно наращиваемый пептид, а малой субчастице — роль «подносчика» аминокислот. Обе субчастицы соединены подвижным шарниром и связаны с одной и той же матрицей. Выделен рабочий цикл рибосомы, состоящий из пяти «шагов». Сначала «подносчик» связывается с мРНК, отодвигается от носителя (рибосома открывается) и вылавливает из цитоплазмы аминоацилтранспортную РНК, соответствующую очередному кодону матрицы. Пока рибосома открыта, совершается перебор соответствия кодонов антикодонам и, следовательно, правильного выбора очередной аминокислоты. Когда аминокислота выбрана, рибосома закрывается и приводит аатРНК в контакт с наращиваемым полипептидом и очередная аминокислота (точнее, ее остаток) занимает свое место в цепи, а освобожденная тРНК уходит в цитоплазму и находит себе новую молекулу этой же аминокислоты. Периодическое размыкание и смыкание рибосомальных субчастиц является приводным механизмом, обеспечивающим все перемещения тРНК, мРНК и аминокислот в процессе синтеза пептидной цепи.

Каждому кодону мРНК соответствует антикодон на аатРНК. Каждый кодон состоит из триплета нуклеотидов (разные сочетания урацила, аденина, цитозина и гуанина). Каждая из 20 аминокислот имеет характерные только для нее кодоны (табл. 3). Например, тирозин кодируется следующими кодонами: УАУ (урацил—аденин—урацил) и УАЦ (урацил—аденин—цитозин). Метионин кодируется одним кодоном, в то время как ряд других аминокислот — большим числом, например шестью кодонами (лейцин, серин, аргинин). Для каждой аминокислоты все кодирующие ее кодоны равнозначны.

Рибосомальный синтез белка оказался чрезвычайно устойчивым к непосредственному действию радиации. Однако его интенсивность очень чувствительна к регуляторным влияниям организма.

В соответствии с предложенным А. С. Спириным механизмом работы рибосомы стали в определенной мере понятны и молекулярные механизмы известных давно ошибок рибосомального синтеза белка, зависящие от самой рибосомы.

Известно, что противобактериальное действие ряда аминоглюкозидных антибиотиков (стрептомицин, канамицин, неомицин и др.) связывается со способностью их вызывать ошибки кодирования рибосомального синтеза белка, и это было показано экспериментально на бесклеточных системах.

В работах А. С. Спирина и его коллег было изучено влияние указанных антибиотиков на цикл работы рибосомы и показано, что все они ускоряли стабилизацию ассоциированных субчастиц рибосомы. Кроме того, установлено, что бивалентные ионы магния, кальция, марганца и ряд некоторых агентов также увеличивали (ускоряли) стабилизацию (т. е. смыкание) субчастиц рибосомы. Так, изменение концентрации магния на 1 мМ существенно (примерно на 10%) изменяло вероятность нахождения рибосомальных субчастиц в связанном состоянии (т. е. в сомкнутом). Наоборот, одновалентные катионы натрия, калия и других уменьшали вероятность нахождения субчастиц рибосомы в сомкнутом состоянии. Увеличение концентрации их в бесклеточной среде примерно на 10 мМ уменьшало долю связанных субчастиц на 10—20%.

Все факторы, которые ускоряли стабилизацию субчастиц рибосомы, способствовали увеличению ошибок кодирования рибосомального синтеза белка. Это было особенно четко показано в экспериментах с бактериальными рибосомами в бесклеточной среде на примере использования полиуридиновой матрицы, кодирующей аминокислоту фенилаланина.

Вместо фенилаланина рибосома в небольшом проценте случаев включала в полипептидную цепь лейцин и изолейцин и значительно реже серин, тирозин и валин. Однако при добавлении в среду, например, стрептомицина и ионов магния ложное кодирование, определявшееся по отношению включенного в полипептидную цепь лейцина к фенилаланину, увеличивалось с 5 до 32%, т. е. в 6 раз. Особенно сильно влияние ионов магния и натрия. Так, по кривым зависимости числа ошибок включения лейцина видно, что изменение концентрации Mg с 1,0 до 2,0 мМ увеличило ошибки более чем в 3 раза (до 17%).

В терминах модели А. С. Спирина повышенная вероятность сомкнутого состояния рибосомы должна приводить к повышению ложного кодирования. Все факторы, ускоряющие стабилизацию сомкнутого состояния рибосомы, должны увеличивать ошибочное включение аминокислот в пептидную цепь. Среди них изучено влияние ионов магния, кальция, марганца и некоторых других. Противоположным действием обладают ионы натрия, калия и другие одновалентные катионы.

Таблица 3. Аминокислотный код (указаны нуклеотиды кодонов и соответствующие им аминокислоты)

Таблица 4. Принципиально возможные ошибки чтения кодонов, обнаруженные в экспериментах in vitro в бесклеточной среде на синтетических матрицах

Следовательно, изменение ионной среды рибосомы значительно влияет на частоту аминокислотных замен при синтезе белка. Важно также, что сочетание разных ионов может взаимно усиливать или ослаблять это влияние. Кроме ионов, спонтанный уровень ошибок включения аминокислот в пептидную цепь могут изменять сдвиги pH, температура, этанол и другие изменения в среде, окружающей рибосому.

Выяснено, что при таких ошибках в пептидную цепь включаются не случайные аминокислоты, а ближайшие по кодовой специфичности. Так, в экспериментах вместо фенилаланина чаще всего включается на полиуридиновой матрице УУУ лейцин, кодируемый кодонами ЦУУ, УУА, УУГ и др. (табл. 4). Это ошибка в прочтении одного из нуклеотидов. Реже всключались изолейцин (АУУ), серин (УЦУ), тирозин (УАУ) и валин (ГУУ), хотя в этих случаях была также ошибка лишь по одному нуклеотиду. Более частое замещение на лейцин связано с тем, что из всех теоретически возможных однонуклеотидных замен в кодоне УУУ три варианта приходятся на лейцин и по одному варианту на изолейцин, тирозин, валин и цистеин. Остальные аминокислоты могут включаться вместо фенилаланина только в случае замен двух нуклеотидов в кодоне и при нарушении в последовательности их узнавания, что встречается очень редко.

Описаны случаи нарушений по типу сдвига рамки чтения, когда нуклеотиды в кодоне читаются те же, но в иной последовательности. Например, на матрице ЦАУ ЦАУ ЦАУ (гистидин) считывание может начаться со второго или третьего нуклеотида. Тогда вместо гистидина включается изолейцин (АУЦ) или серин (УЦА).

Рис. 6. Схема, поясняющая возможные механизмы увеличения ошибок рибосомального синтеза белка при ускоренном ритме клеточного деления и отсутствии нарушений во всех звеньях аппарата синтеза белка

Главным условием правильного узнавания кодона является достаточное время экспонирования кодона, т. е. длительность периода разомкнутого состояния субчастиц рибосомы. Чем короче время экспонирования кодона, тем меньше времени на узнавание кодона, осуществляемое путем перебора антикодонов на аминоацилтранспортных РНК по законам стохастики, и тем больше вероятность ошибочного подбора антикодона и включения ошибочной, но близкой по кодовой специфичности аминокислоты (рис. 6).

Изложенные особенности работы рибосомы были выявлены в модельных опытах на рибосомном ассоциате субчастиц в условиях так называемой бесфакторной трансляции. В условиях, более приближенных к естественной работе рибосомы, процесс сборки пептидной цепи на искусственной матрице ускоряется и количество ошибок возрастает.

Общепринято суждение о том, что закономерности, полученные на модельных бесклеточных системах, справедливы и для процесса синтеза белка в живой клетке.

Гемоглобин эмбрионального типа, или фетальный HbF, человека содержит по сравнению с основной формой гемоглобина HbA больше изолейцина (кодоны АУУ, АУЦ и АУА) и меньше валина (ГУУ, ГУЦ, ГУА) и пролина (ЦЦУ, ЦЦЦ, ЦЦА), по данным В. Штейна и соавторов. Далее представим, что часть основного гемоглобина HbA превращается в гемоглобин HbF за счет замен указанных аминокислот в тех условиях, в которых содержание его снижается, а минорного, наоборот, повышается. Простой анализ, выполненный нами, показал, что тогда замену аминокислот в данном случае можно представить по принципу рибосомальных ошибок синтеза глобина, так как вместо валина может включаться изолейцин (у них второй и третий нуклеотиды соответственно одинаковые) и вместо пролина — также изолейцин (у них в трех кодонах одинаковые третьи нуклеотиды).

После облучения кроликов в дозе 8,5 Гр, по данным Б. Ф. Сухомлинова, состав аминокислот гемоглобина изменился, уменьшилось количество цистеина (УГУ, УГЦ) и фенилаланина (УУУ, УУЦ) при увеличении аспарагиновой кислоты (ААУ, ААЦ) и гистидина (ЦАУ, ЦАЦ) — при отсутствии заметных изменений в содержании других аминокислот. В этом случае каждая пара кодонов у всех четырех аминокислот имеет одинаковые третьи нуклеотиды и, следовательно, у них имеется также определенная близость кодовой специфичности. Замена этих аминокислот могла произойти по принципу ложного кодирования.

У собак на 15-е сутки после облучения в дозе 3,8 Гр минорный гемоглобин HbA1 увеличивался с 7,5 до 26%, а основной гемоглобин HbA упал с 86,5 до 65—68%. У минорного гемоглобина по сравнению с основным меньше содержание серина (кодоны УЦА, УЦГ, АГУ, АГЦ) и лейцина (УУА, УУГ) и увеличено содержание цистеина (УГУ, УГЦ), глутамина (ГАА), валина (ГУУ, ГУЦ), аргинина (ЦГУ, ЦГЦ) при отсутствии заметных изменений со стороны других аминокислот. Анализ кодонов этих аминокислот нам показал, что замена серина на цистеин и аргинин возможна, так как у них есть общие второй и третий нуклеотиды (ГЦ), серина на валин — по сдвигу рамки чтения (УЦГ на ГУЦ), лейцина на валин — тоже по сдвигу рамки чтения (УУГ на ГУУ), серина и лейцина на глутамин, валин и аргинин — по общности третьего нуклеотида (А).

В указанном эксперименте на собаках прослежена динамика спектра гемоглобинов при одновременном исследовании красной крови. Наибольшее изменение в соотношении указанных двух фракций гемоглобина отмечалось в период 7—46 сут после облучения. Ранее 7 сут исследования, к сожалению, не проводились. Доля HbA с 86,5% упала до 65—68%, а доля HbA1 увеличилась с 7,5 до 24—27%. Доля других минорных фракций гемоглобина M1 и М2 в этот период была также увеличена. Снижение числа эритроцитов и гемоглобина в крови стало заметным с 12-х суток после облучения и было наибольшим на 20-е и 30-е сутки. У одной из старых собак, которая к моменту обследования имела выраженную анемию и увеличенную селезенку, через 8 лет после облучения почти весь гемоглобин был заменен на HbA1.

Состояние костного мозга у них не исследовалось, но в наших экспериментах, описанных выше, были собаки, облученные примерно в такой же дозе, у которых анализировали и состояние костно-мозгового гемопоэза. У них отмечены изменения, позволяющие говорить об ускорении пролиферации и созревании эритробластов в период наблюдавшихся изменений в спектро гемоглобинов. Оно часто сопровождается укорочением клеточного цикла эритробластов в основном за счет сокращения стадии G1, во время которой идет массовый рибосомальный синтез белка. У эритробластов, потерявших способность к делению, может происходить ускорение созревания и укорочение времени на завершение процесса гемоглобинизации нормобластов.

В специальных экспериментах на анемизированных крысах было показано сокращение времени пребывания на каждой стадии дифференцировки бластных клеток красного ряда: проэритробластов — в 1,27 раза, базофильных эритробластов — в 1,45 раза, полихроматофильных эритробластов — в 1,8 раза, ортохромных эритробластов — в 2,1 раза, ретикулоцитов — в 2,6 раза. Наибольшее сокращение времени созревания клеток было для тех стадий дифференцировки, на которых идет накопление гемоглобина и, следовательно, рибосомальный синтез молекул белка глобина, а ускорение рибосомального синтеза белка может быть связано с укорочением времени на один рибосомальный цикл с ошибочным включением в пептидную цепь глобина аминокислот с близкой кодовой специфичностью.

Если изложенное верно, то с улучшением состояния красной крови и выполняемой ею главной дыхательной функции снимается напряжение эритропоэза, восстанавливается нормальная продолжительность клеточных циклов и периодов созревания, нормализуется продолжительность рибосомального цикла, падает ошибочное включение аминокислот в молекулу глобина, восстанавливается нормальный спектр гемоглобинов.

Действительно, у указанных собак по мере улучшения красной крови восстанавливается нормальный спектр гемоглобинов. Наиболее интересные данные о спектре гемоглобинов человека связаны с появлением гемоглобина эмбрионального типа — фетального гемоглобина — при всех заболеваниях, при которых выявлено или предполагается напряжение эритропоэза. Достоверное повышение фетального гемоглобина выявлено у людей, подвергшихся хроническому воздействию свинца, ДДТ, при хронической желтухе, при различных заболеваниях крови — анемиях, лейкозах. Увеличение фетального гемоглобина — распространенная реакция на внешние химические и физические воздействия. Наконец, увеличение выделения в кровь эритропоэтина сопровождается изменением спектра гемоглобина. Эритропоэтин, как известно, ускоряет пролиферацию и дифференцировку клеток эритроидного ряда.

Изучено соотношение активностей двух форм лактатдегидрогеназы — ЛДГ5 и ЛДГ1 — в зависимости от стимуляции пролиферативной активности и синтеза белка в селезенке облученных мышей. Действительно, при стимуляции указанных процессов закономерно преобладала активность ЛДГ5 над активностью ЛДГ1.

Имеются более детальные данные о биохимических различиях непосредственно ЛДГ1 (чистая Н-форма) и ЛДГ5 (чистая М-форма) у свиньи. Поскольку с увеличением пролиферативной активности ткани увеличивается содержание ЛДГ5 и уменьшается содержание ЛДГ1, необходимо анализировать возможность замен тех аминокислот, которых больше в ЛДГ1 и меньше в ЛДГ5 и наоборот. В ЛДГ1 больше глутамина, треонина, серина, валина, аспарагина и фенилаланина. В ЛДГ5, наоборот, больше гистидина, лизина, аргинина, глицина и изолейцина. Предполагали, что увеличение содержания ЛДГ5 идет за счет ошибочных замен глутамина, треонина, серина, валила, аспарагина и фенилаланина, характерных для ЛДГ1, на гистидин, лизин, аргинин, глицин, изолейцин, характерные для ЛДГ5. Возможность таких замен по принципу ошибочного чтения одного из нуклеотидов кодона или по принципу сдвига рамки чтения представлена в табл. 5. Анализ показал принципиальную возможность всех указанных замен аминокислот, если усиление пролиферативной активности будет сокращать продолжительность рибосомального цикла.

Таблица 5. Возможные замены характерных аминокислот ЛДГ1 на характерные аминокислоты ЛДГ5 и их механизм (анализ данных работы Вахсмита и соавторов)

Сравнивали аминокислотный состав ЛДГ1 и ЛДГ5 у человека. Наиболее заметные отличия: ЛДГ1 — увеличено содержание аланина, валина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты и метионина; ЛДГ5 — увеличено содержание аргинина, глицина, тирозина. В случае закономерных переходов от ЛДГ1 к ЛДГ5 должно уменьшаться содержание первых аминокислот и увеличиваться содержание вторых. Все они могли заменяться по принципу неправильного чтения одного из нуклеотидов кодона или по сдвигу рамки чтения (см. табл. 5).

Анализ конкретных замен в аминокислотной последовательности двух изоформ белка, связанных с изменением пролиферативной активности тканей, провели на примере сопоставления различий в аминокислотной последовательности двух изоферментов — ЛДГ1 и ЛДГ5 у цыплят и свиней.

В табл. 6 приведены только различия в аминокислотной последовательности М- и Н-форм ЛДГ у цыплят. Указаны порядковые номера аминокислот в пептидной цепи и избранные триплеты характерных для них кодонов. Из 85 различий в 70 случаях (82%) предполагаемая замена аминокислоты при переходе от Н4-формы к М4-форме могла происходить по принципу изменения одного из нуклеотидов триплета (чаще всего по первому нуклеотиду кодона — 61 случай) или по сдвигу рамки чтения (9 случаев). В 12 случаях необходима замена двух нуклеотидов триплета. Это данные в пользу возможного объяснения различий между двумя изоформами белка, характерными для разных состояний пролиферативной активности тканей, механизмами ошибочного чтения кодонов.

Однако в трех случаях — замена аланина на лизин (ГЦУ и ААА), серина на глутамин (УЦУ и ГАА) и глицинина на метионин (ГГУ и АУГ) — такое объяснение не подходит. В этих случаях единственно возможное объяснение замен связано с генетической регуляцией, с репрессией одних локусов генома и депрессией других при изменении пролиферативной активности тканей. Удивляет малый процент таких случаев (3,5%).

Таблица 6. Различия в аминокислотной последовательности М- и Н-форм ЛДГ у цыплят (выписка из работы Торфа и соавторов)

К абсолютному большинству случаев замен аминокислот, как указано выше, вероятно, применимы закономерности, работающие в простейших модельных системах во внеклеточных условиях и вне генетической регуляции.

Далее необходимо проверить соответствие указанных замен аминокислот большей вероятности триплетов определенных кислот при равновероятном ошибочном чтении каждого из нуклеотидов триплета по указанным принципам. Рассмотрим этот вопрос сначала на примере изолейцина, имеющего три кодона (АУУ, АУЦ и АУА). При замене одного из нуклеотидов триплета каждого кодона или при сдвиге рамки чтения их принципиально возможны 33 модификации и, следовательно, вероятность одной модификации составляет 0,33. Ожидаемая вероятность замен изолейцина на другие аминокислоты была следующей: 0,15 — лейцин, 0,09 — валин, метионин, треонин, серин и аспарагиновая кислота, 0,06 — фенилаланин, 0,03 — лизин, аргинин, тирозин и гистидин. Реально при переходе ЛДГ1 в ЛДГ5 изолейцин заменялся на лейцин в двух случаях и на валин — также в двух случаях. Других замен не было. Следовательно, во всех четырех случаях действительно изолейцин заменялся на те аминокислоты, которые и были предсказаны исходя из законов стохастики перебора аминокислот.

Другой пример. Шестикодонный лейцин по принципу ошибки чтения одного из нуклеотидов или сдвига рамки чтения теоретически может иметь 66 модификаций и вследствие этого заменяться на 14 других аминокислот. Вероятность одной замены равна 0,015. Наиболее часто эта модификация теоретически должна приводить к образованию кодонов четырех аминокислот: валина, фенилаланина, изолейцина и пролина. Каждая из этих аминокислот имеет ожидаемую вероятность заменить лейцин, равную 0,076 и 0,106. Остальные десять аминокислот имеют значительно более низкую вероятность. В реальных условиях при переходе от ЛДГ1 к ЛДГ5 лейцин заменялся 10 раз, из них действительно — 8 раз на предсказанные аминокислоты: валин, фенилаланин и изолейцин. Аналогичные закономерности прослежены для валина, аланина, треонина и тирозина.

Следовательно, для многих заменяемых в М-форме ЛДГ цыпленка аминокислот (при переходе к Н-форме) отмечается преимущественный захват тех аминокислот, которые при равновероятном и равнозначном распределении имеют более высокую ожидаемую вероятность заменить аминокислоту в пептидной цепи. Эти примеры показывают, что действительно при усилении пролиферативной активности ткани сдвиг в изоферментном составе ЛДГ цыпленка, обусловленный изменением соотношения М- и Н-форм белка, в значительной мере может происходить по принципу случайной замены одного из нуклеотидов или сдвига рамки чтения.

Аналогичные результаты были получены при анализе данных Ивентоффа и соавторов об аминокислотной последовательности М- и Н-форм фермента. К сожалению, мы не нашли аналогичных материалов для других видов животных и других ферментов для утверждения об общебиологическом значении обнаруженных явлений. Необходимо продолжение такого анализа по мере накопления новых данных.

Тем не менее проведенный анализ позволяет с определенным основанием считать возможным для клеток млекопитающих тот механизм замен аминокислот в изоформах белка, который был обнаружен в простейших бесклеточных системах и который работает вне генетической регуляции и зависит от пролиферативной активности ткани. Обоснованием такого заключения является следующее.

1. Основное количество (72% и более) замен аминокислот в пептидной цепи М- и Н-форм ЛДГ соответствует механизму неправильного чтения одного из нуклеотидов триплета кодонов аминокислот.

2. Существенное (в несколько раз) преобладание изменений первого нуклеотида триплетов кодонов над изменениями третьего нуклеотида.

3. Существенное преобладание (в несколько раз) однонуклеотидных изменений триплетов над двухнуклеотидными и сдвигом рамки чтения.

4. Стохастический характер ошибочно включаемых аминокислот, близких по специфичности, т. е. чаще включаются те аминокислоты, которые имеют более высокую ожидаемую вероятность их ошибочного включения при равновероятном и равнозначном изменении одного из нуклеотидов триплета кодонов или сдвиге рамки чтения.

5. Хорошее соответствие сдвигов спектра изоформ белков усилению пролиферативной активности тканей и усилению синтеза белка, т. е. сдвиг соотношений изоформ белка возникает во всех случаях стимуляции этих процессов и восстанавливается, как только снимается стимуляционный сигнал к пролиферации.

6. Зависимость частоты ошибочного включения аминокислот в пептидную цепь в экспериментальной бесклеточной системе (т. е. вне генетической регуляции) от влияния на рибосому ионного гомеостаза, pH и других условий, изменяющих продолжительность одного цикла работы рибосомы и продолжительность времени экспонирования кодонов (см. рис. 6).

7. Зависимость изменений внутриклеточных факторов (ионный гомеостаз, pH и др.), способных влиять на рибосому, от скорости пролиферативной активности тканей.

Однако следует сказать, что результаты приведенного выше анализа изменений аминокислотной последовательности изоформ ЛДГ цыплят и свиней выявили факты, не объяснимые механизмами, описанными для бесклеточных модельных систем.

Указанные случаи можно объяснить, по-видимому, только действием генетической регуляции, изменением процессов экспрессии отдельных локусов генома в связи с изменением ионного гомеостаза и pH в процессе усиления пролиферативной активности ткани.

Каково соотношение различных механизмов (генетических и негенетических) замен в аминокислотной последовательности различных изоформ белков — это вопрос предстоящих исследований. Для нас важно, что независимо от механизма таких замен сама возможность изменения изоформ белков в зависимости от состояния рибосомального окружения (и, следовательно, от пролиферативной активности ткани) дает возможность понять некоторые молекулярные основы несущественных изменений белков, модифицирующих ряд характеристик (спектр изоформ, антигенный спектр, термолабильность и т. д.).

Основное внимание нами уделено аминокислотным изменениям белков, происходящим в процессе самого рибосомального синтеза пептидной цепи при сохранении в пределах норм и неизменными всех остальных звеньев сложной последовательности производства функционирующего белка (от процесса транскрипции необходимой информации с ДНК об аминокислотной последовательности до исполнения молекулой белка присущей ей функции).

Между тем нарушения в структуре белка могут происходить в результате изменений в любом звене этой цепи событий. В табл. 7 представлены основные звенья этой цепи.

Таблица 7. Основные звенья цепи процессов производства функционирующего белка

Характер модификации структуры белка будет разным в зависимости от звена, внесшего изменения в белок. В случае изменений на уровне структурных генов возникает мутация, следствием которой будет необратимая замена аминокислоты в структуре белка. Однако весь приведенный экспериментальный материал показал, что таких стойких и необратимых модификаций белка для рассмотренных условий (когда нет еще генетических заболеваний) среди массовых процессов обнаружить не удается, хотя они и не исключены полностью.

Обращают на себя внимание массовые процессы временной и вполне закономерной модификации белков, связанной с заменой одних аминокислот на другие в зависимости от состояния пролиферативной активности ткани, что приводит к определенному изменению спектра изоформ белков. Как показано в этом разделе, такие изменения могут происходить по двум причинам:

1) вследствие изменения генетической регуляции процессов экспрессии определенных локусов генома под влиянием эпигеномных изменений, возникающих в связи с биохимическими и биофизическими изменениями в ближайшем окружении ДНК (этот вопрос более подробно рассмотрен ниже). Последнее может быть вызвано интенсификацией клеточного размножения;

2) вследствие ошибок рибосомального синтеза белка, т. е. ошибочного включения и пептидную цепь аминокислот, близких по своей кодовой специфичности, под влиянием биохимических и биофизических изменении в ближайшем рибосомальном окружении. Последнее может ускорять рибосомальный цикл, что может быть вызвано и усилением пролиферативной активности ткани.

Внешние влияния на процессы транскрипции ДНК, созревания иРНК и транспорт иРНК из ядра в цитоплазму могут искажать информацию, закодированную в последовательности нуклеотидов, изменять их химическую структуру и приводить к различного рода нарушениям синтеза белка. По-видимому, чаще всего это приводит к прерыванию или прекращению синтеза белка с данной молекулы иРНК. Важно, что это не приводит к массовому синтезу аномального белка, хотя в очень ограниченных количествах, вероятно, возможен синтез модифицированного белка, если изменение нуклеотида будет связано только с его заменой на другой нормальный нуклеотид. Переход ткани в состояние активной пролиферации с последующими биохимическими и биофизическими изменениями будет способствовать увеличению вероятности таких процессов.

Существует еще один период формирования молекулы белка, во время которого также возможны модификации его структуры. Это так называемые посттрансляционные изменения структуры белка. Для таких изменений важную роль играют особенности аминокислот и место их локализации в молекуле.

С этой целью мы провели анализ частоты замен аминокислот в зависимости от их основных особенностей (полярности, характера заряда, числа кодонов, массового числа и др.). Эти данные относятся к уже указанным выше материалам по ЛДГ цыплят и свиней. Частота замен для разных аминокислот была неодинаковой (от 0 до 54—67%) и не зависела от абсолютного количества данной аминокислоты в молекуле фермента. Не зависела она и от полярности или от характера заряда, от массы молекулы или числа кодонов. Частота замен не зависела и от того, какими группами обусловлены полярность и заряд аминокислоты. Например, цистеин, имеющий SH-группу, заменялся у цыплят в 28% случаев, а у свиней совсем не заменялся. Указанные замены не зависели от места расположений аминокислотного остатка во вторичной структуре молекулы фермента, от того, в наружной или внутренней части молекулы он находился, в активном центре или в боковой ветви. Это указывает, что посттрансляционные замены аминокислот при изменении спектра изоферментов не играли существенной роли. Причину замен следует искать или в ошибках работы самой рибосомы, или в поступлении в рибосому измененной информации, вносимой РНК, или в обоих процессах одновременно.

Мы приводили данные, полученные при анализе аминокислотной последовательности в двух изоферментах ЛДГ, соотношение количеств которых очень закономерно сдвигается в ту или иную сторону в зависимости от пролиферативной активности ткани. Ряд этих данных косвенно свидетельствует о возможном участии (наряду с механизмом генетической регуляции) в изменении аминокислотного состава белка и рибосомального механизма ошибочного включения аминокислот, зависящего в основном только от продолжительности экспонирования кодонов.

Новые косвенные доказательства в пользу существования рибосомального механизма ошибочного включения аминокислот в полипептидную цепь мы увидели и в соотношении замен аминокислот в двух изоформах ЛДГ в пределах пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов или в переходе от одной группы нуклеотидов к другой. Известно, что генетически обусловленные замены легче осуществляются путем замены одного пуринового нуклеотида на другой пуриновый нуклеотид (аденин↔гуанин) или одного пиримидинового нуклеотида на другой пиримидиновый нуклеотид [цитозин↔тимидин (урацил)] и значительно труднее замена пурина на пиримидин. Наш анализ изложенных выше данных показал, что при переходе от ЛДГ1 к ЛДГ5 цыплят замены аминокислот соответствовали нуклеотидам внутри групп А↔Г и Ц↔У в 27 случаях (32%) и переходам АГ↔ЦУ в 61 случае (69%). Для ЛДГ свиней примерно такая же картина: внутри А↔Г и Ц↔У в 20 случаях (25%) и переход АГ↔ЦУ в 60 случаях (75%). Эти данные также говорят в пользу механизма, не связанного с генетической регуляцией.

Однако проявляемые в определенные временные отрезки модификации белка могут быть связаны и со сдвигами в генетической регуляции, обусловленными изменением локального гомеостаза в окружении молекулы ДНК и возникающей ее нестабильностью. Процессы репрессии-депрессии определенных локусов генома изменяются. Среди возможных механизмов генетических изменений не мутационной природы М. М. Виленчик называет нарушения суперструктуры ДНК, увеличение степени метилирования ДНК, некоторые энзиматические изменения метаболизма и ионного гомеостаза. Локальный гомеостаз и значительные изменения клеточного метаболизма происходят, как уже было показано, при ускоренном клеточном размножении.

Для нас важно было обратить внимание на то, что длительное усиление пролиферативной активности тканей и связанные с этим биохимические и биофизические изменения могут независимо от их механизма закономерно изменять структуру белка таким образом, что он в общем не теряет своих основных специфических свойств, но может модифицировать их в определенной мере и переходит в иную изоформу или антигенную группу. Вследствие этого любые клеточные структуры, имеющие в своем составе модифицированные белки, будут в какой-то степени изменять и свои свойства. Такие несущественные нарушения структуры могут объяснить многие из биофизических изменений, характерных для состояний активной пролиферации и для случаев снижения эффективности межсистемных связей, о которых говорилось и которые будут более детально рассмотрены далее. Изложенный механизм ошибок синтеза белка позволяет понять и один из возможных механизмов влияния пищи, в частности зависимого от нее фонда свободных аминокислот в рибосомальном окружении в период сокращения времени экспонирования кодонов. При равной вероятности близких по кодоновой специфичности аминокислот ошибочно включиться в пептидную цепь белка может прежде всего та аминокислота, концентрация которой была выше.

Таким образом, при усилении пролиферативной активности ткани изменяется качественный и количественный состав изоферментных и антигенных спектров белков во многих метаболических последовательностях. Нарушения изоферментного спектра при стимуляции пролиферации в опухолях удобно рассматривать на примере гепатом Морриса, от минимально отклоненных по сравнению с нормальной печенью до наименее дифференцированных, со скоростью пролиферации, сравнимой с таковой для нормальной регенерирующей печени. Оказалось, что степень нарушения изоферментного спектра хорошо коррелирует со скоростью роста опухоли, т. е. со скоростью клеточного размножения. С увеличением скорости роста опухоли и уменьшением степени дифференцировки клеток гепатомы отмечаются прогрессирующая потеря активности специфических ферментов зрелой печени и замещение их эмбриональными или непеченочными, характерными для других тканей. Происходят определенная редукция и упрощение метаболизма.

Наиболее ценные с практической точки зрения результаты получены при исследовании изоферментов лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Состав изоферментов ЛДГ тканей позвоночных животных изменяется в эмбриогенезе, постнатальном онтогенезе, при злокачественном росте, действии некоторых метаболитов и гормонов. Для нас важно с практической точки зрения, что изменения спектра ЛДГ (увеличение М-форм и снижение Н-форм) обнаруживаются еще до развития признаков злокачественной трансформации, выявляемых цитологически и гистологически.

Клиницисты показали, что такие изменения характерны для предпатологических стадий, предшествующих развитию ряда злокачественных заболеваний.

В целом имеющиеся данные позволяют считать, что все перечисленные изменения белков, метаболизма и морфологии клеток вторичны и являются только результатом длительной интенсификации клеточного размножения без специфических черт, разграничивающих нормальные и злокачественные ткани.