4.1. Сепсис и иммунитет

Классификация сепсиса. Единой классификации сепсиса на сегодняшний день не существует. Проблема в том, что отсутствует единое определение сепсиса. До сих пор многие представляют сепсис как наличие в организме очага, из которого непрерывно или периодически в кровяное русло поступают патогенные возбудители. В результате этой экспансии возникают субъективные и объективные проявления болезни. Однако это определение оказалось мало продуктивным, прежде всего в практическом отношении. Похожая на бактериальный сепсис картина может возникнуть без наличия микробной инфекции, а в результате первично-неинфекционных причин, таких, как травма, хирургическая операция, воспаление, интоксикация и др. Поэтому первично неинфекционное заболевание, клиника которого практически не отличается от сепсиса в результате микробной инвазии, обозначают как синдром системного воспалительного ответа (ССВО). Считается, что связующим звеном между микробным сепсисом и немикробным ССВО является феномен транслокации бактерий и эндотоксина из естественных резервуаров (кишечник) в ходе общего воспалительного процесса. Учитывая эти соображения в качестве рабочей гипотезы, очевидно, можно принять следующую последовательность развития процесса: ССВО – сепсис – тяжелый сепсис – септический шок – синдром полиорганной недостаточности [142, 144, 237, 238]. Естественно, что этот приговор не окончательный, но данная классификация опирается на неоспоримые факты и за неимением лучшей имеет право на существование.

Послеоперационный сепсис (патогенез). Наиболее полно вышеприведенной классификации отвечает послеоперационный сепсис. Понятие «послеоперационный сепсис» не является классификационным, но скорее этиологическим, поскольку отражает прямую зависимость развития заболевания от тяжести хирургической травмы. Считается, что в патогенезе этого сепсиса, как и любого другого, тяжесть течения определяют 3 ведущих синдрома: эндогенная интоксикация, септический шок и иммунодефицит, причем последний из них по патогенетическому признаку здесь должен быть поставлен на первое место. Если первые 2 синдрома проявляются при развернутой клинике сепсиса, то синдром иммунной недостаточности формируется уже в ранние сроки или даже предшествует развитию инфекции, во многом предопределяя дальнейшую прогрессию эндотоксикоза и нарастание септико-шоковых проявлений [130]. Согласно мировой статистике, септический шок – одна из частых причин летальных исходов в хирургических отделениях интенсивной терапии и реанимации [7].

Финальной и одновременно фатальной стадией сепсиса является полиорганная недостаточность, развитие которой во времени можно представить следующим образом [342]. После травмы, хирургической операции или другого стрессорного воздействия под влиянием гуморальных факторов происходит активация основных фагоцитирующих клеток (полиморфноядерных лейкоцитов, моноцитов, макрофагов) и тромбоцитов. Активированные клетки начинают вырабатывать различного рода медиаторы, способные вызвать альтерацию эндотелия, увеличение сосудистой проницаемости и другие повреждения, что через 1–3 дня может проявиться в возникновении ранней органной недостаточности, которая у большинства больных легко купируется. Благодаря исследованиям последнего десятилетия стало очевидным, что развитие ранней органной недостаточности реализуется посредством запуска цитокиновой цепи, где ведущую роль играют провоспалительные цитокины (ИЛ-1, ИЛ-2, ИФН-γ, ИЛ-8, ФНО и др.). Эта группа цитокинов наряду с запуском воспалительной реакции как неспецифического механизма противоинфекционной защиты обеспечивает развитие специфического иммунного ответа и процессы репарации в поврежденных тканях. Недостаточность продукции провоспалительных цитокинов на фоне исходного иммунодефицита или их чрезмерное угнетение в результате включения механизмов негативного контроля системной воспалительной реакции (противовоспалительные цитокины, глюкокортикостероиды) приводят к осложненному течению хирургической инфекции [130]. У части пациентов, несмотря на сходство факторов риска и объема хирургической травмы, развивается септическое состояние; к сожалению, число таких больных из года в год растет. В послеоперационном периоде в течение 4—14 дней происходит присоединение инфекционного процесса: эндогенного (транслокация бактерий со слизистых и кожи) и (или) экзогенного (внедрение внутрибольничной инфекции) генеза.

Развивается системный воспалительный ответ инфекционного генеза, который с участием клеточных медиаторов достаточно быстро может привести к повреждению органов и в итоге к поздней органной недостаточности, которая практически всегда носит полисистемный характер.

«Пусковым» механизмом сепсиса считают стимуляцию клеток хозяина чрезмерным количеством бактерий и (или) их фрагментов. Для грамотрицательных бактерий наиболее активным и хорошо изученным фрагментом является эндотоксин, для грамположительных – комплекс пептидогликан – тейхоевая кислота.

Главным компонентом эндотоксина является липосахарид. Связываясь с CD14 рецептором плазматической мембраны, комплекс эндотоксин – липосахаридсвязывающий белок плазмы активирует ядерный фактор транскрипции NF-kB, который через соответствующие гены индуцирует синтез провоспалительных цитокинов и пептидов хемоаттрактантов в нейтрофилах, моноцитах/макрофагах, фибробластах, лимфоцитах и эпителиальных клетках, которые, в свою очередь, влияют на поведение этих клеток ауто-, пара– и эндокринным путем, приводя к осуществлению таких процессов, как хемотаксис, метаболическая активность, пролиферация, дифференцировка и запуск клеточного апоптоза [382].

Важно отметить способность эндотоксина к агломерации или опсонизации эндотелия сосудов. Неспецифическое связывание больших количеств эндотоксина с эндотелиальными клетками при активации комплемента, клеток крови (в первую очередь макрофагов и нейтрофилов) и гемокоагуляции может приводить к обширным повреждениям эндотелия, что является лимитирующим фактором развития полиорганной недостаточности – основной причины летальных исходов при сепсисе [7].

У таких больных высокий уровень провоспалительных цитокинов и других медиаторов вызывает «злокачественную» внутрисосудистую воспалительную реакцию и генерализованное увеличение микрососудистой проницаемости. Следствием этого являются уменьшение объема циркулирующей крови, развитие интерстициального отека легких, множественные микротромбы, нарушение внутриорганной микроциркуляции, что уменьшает доставку кислорода и питательных веществ к тканям, приводя к анаэробному метаболизму и клеточной дисфункции. Высокие концентрации ФНО, ИЛ-1, ИФН-γ и эндотоксина вызывают усиленный синтез NO в эндотелии, макрофагах, нейтрофилах, мозговых нейронах и др., что ведет к уменьшению сосудистого сопротивления и развитию гипотензии [296].

Избыточная стимуляция провоспалительными цитокинами Т– и В-лимфоцитов может привести к их апоптозу, т. е. запрограммированной клеточной гибели [316], и некрозу. Индукция клеточного апоптоза под действием ФНО и других цитокинов происходит в результате разобщения митохондриального фосфорилирования [338]. Во внешней мембране митохондрий специфические белки, связываясь друг с другом, образуют ионопроводящие каналы, что изменяет мембранный потенциал митохондрий (предвестник апоптоза) и создает возможность попадания митохондриального цитохрома С в цитоплазму, где он возбуждает каскад апоптозных протеаз (каспаз) [333, 338]. Липополисахарид грамотрицательных бактерий способен вызвать апоптоз альвеолярных макрофагов, что клинически проявляется деструктивными процессами в легочной ткани [448].

Таким образом, концентрация в крови бактерий и (или) их фрагментов может быть адекватной для работы иммунной системы, а может быть настолько чрезмерной, что приведет к перегрузке последней. Неадекватная, т. е. избыточная, антигенная нагрузка в первую очередь выводит из строя системы неспецифической защиты организма (фагоцитарная и система комплемента), возникает острое несоответствие возможностей фагоцитарной системы микробной нагрузке, что влечет за собой значительные нарушения функций клеточного и гуморального иммунитета, катастрофическое снижение способности организма сопротивляться инфекции [119].

Неспецифическая резистентность. В разгар сепсиса происходит значительное снижение активности фагоцитарных реакций [75] и угнетение системы комплемента [291], особенно выраженное при септическом шоке [65], когда выявляется снижение концентрации С3 и С4 его компонентов [291, 346]. В клинических наблюдениях показана связь некоторых синдромов сепсиса с продуктами реакции комплемента [291, 346]. Прогрессивное снижение пропердина, а также С3 и С5 компонентов комплемента сопровождается расстройствами гемодинамики и гемостаза [444]. Уменьшение уровня С3 компонента связывают со способностью бактериального эндотоксина высвобождать эластазу из нейтрофильных гранулоцитов [444]. Величина повышения концентрации фермента в крови является критерием тяжести септического процесса [444]. При развитии послеоперационного сепсиса уровень эластазы превышает норму более чем в 10 раз (2500 мкг/л), а по мере выздоровления постепенно снижается.

После хирургического вмешательства с гладким (неосложненным) послеоперационным периодом содержание эластазы в крови повышается в 2–3 раза с последующим его возвращением к норме в течение 3–4 недель [228]. В момент поступления в стационар обычно фиксируется некоторое снижение уровня комплемента (на 20–25 %) и лизоцима (на 10–12 %) [61, 75]. При выходе из септического шока благоприятным признаком считается возвращение показателей комплемента к норме. Считается, что в патогенезе сепсиса существенную роль играет не только классический путь активации комплемента, но и альтернативный, о чем свидетельствует снижение концентрации пропердина при эндотоксиновом шоке и его тесная корреляция с уровнем эндотоксина в крови [368].

Наиболее характерными изменениями белой формулы крови при развитии септического процесса являются лейкоцитоз с нейтрофильным сдвигом и резким «омоложением» пула лейкоцитов. Установлено, что чем выше лейкоцитоз, тем более выражена положительная реакция организма на инфекцию. Число лейкоцитов в периферической крови, особенно при стафилококковом сепсисе, может достигать 60–70 × 109/л. Сепсис, вызванный грамотрицательной флорой, протекает обычно при менее выраженной лейкоцитарной реакции. В случаях присоединения больничной инфекции обычно наблюдается снижение количества лейкоцитов в периферической крови, что оценивается как плохой прогностический признак. Наиболее значительное угнетение лейкоцитарной реакции отмечается при септическом шоке – 2 × 109/л. По данным [75], смертность при лейкоцитозе до 10 × 109/л достигает 75—100 %, а при его увеличении до 20–30 × 109/л равна 50–60 % и менее. Если в острой стадии процесса количество лейкоцитов снижено, то увеличение их – благоприятный симптом. Нарастание септического процесса приводит к нарушению функции нейтрофилов [409]. При экспериментальном сепсисе нарушается соотношение палочкоядерных и полиморфноядерных форм, выявляется нейтропения и снижение числа зрелых нейтрофилов. Снижение количества циркулирующих и резервных (в костном мозге, селезенке) нейтрофилов при сепсисе является неблагоприятным признаком [45]. Также неблагоприятным считается повышение уровня адгезии полиморфноядерных лейкоцитов у больных различными формами сепсиса [428]. При развитии сепсиса после травмы у больных отмечается снижение хемотаксиса лейкоцитов, что было обусловлено специфическим ингибитором и дефектом самих клеток [409]. Бактерицидная активность лейкоцитов крови при сепсисе резко уменьшается с 52,8 % (здоровые) до 10–20 % (больные) [75].

Клеточный иммунитет. При системном воспалительном ответе на инфекцию, т. е. при развитии сепсиса, регистрируют лимфопению, т. е. депрессию клеточного иммунитета. Максимум иммунодепрессии практически по всем параметрам иммунной системы наблюдается на 2-й день после оперативного вмешательства; в зависимости от характера операции и исходного состояния больного ее длительность колеблется от 7 до 28 дней [345]. В течение 7—14 дней после травмы, операции или другого стрессорного воздействия увеличена продукция ИЛ-10, что снижает устойчивость организма к инфекции [353]. Хирургическое вмешательство может по-разному действовать на реципрокно функционирующие Т-лимфоциты: активация функции Th2 ведет к хирургической инфекции; активация Th1 – к развитию септического шока [69, 438]. Особенно сильное снижение процентного и абсолютного содержания лимфоцитов в периферической крови обнаруживается в заключительной фазе сепсиса – стадии органных повреждений [164, 293].

Противоположную направленность имеет изменение содержания D-лимфоцитов и «нулевых» клеток. Это свидетельствует о нарушении дифференцировки клеток и об изменении их функциональных характеристик (нарушении пролиферации), что сопровождается снижением синтеза антител, замедлением синтеза медиаторов иммунитета, нарушением функции макрофагов [96, 347]. Глубина поражения иммунной системы, в частности иммунокомпетентных клеток, зависит от тяжести септического процесса. Чем он тяжелее, тем более выражен дефект иммунитета [125]. Так, после хирургической обработки очага и при благоприятном течении раневого процесса уровень Т-лимфоцитов повышается [164]. Содержание

В-лимфоцитов, по данным одних авторов, не изменено [173], а по данным других – снижено [75, 164]. Если не развивается иммунодефицитное состояние, то при сепсисе не наблюдается и значительных изменений со стороны Т– и В-лимфоцитов. У умерших больных процент абсолютного количества В-лимфоцитов и абсолютного числа лимфоцитов с рецепторами для непатогенного стафилококка снижен [8]. Показано также, что резкое угнетение пролиферативного ответа может служить предвестником развития сепсиса [347]. При благоприятном течении септического процесса отмечается повышение процентного содержания и абсолютного количества активированных Т– и В-лимфоцитов. Следовательно, данные литературы свидетельствуют о том, что развитие септических состояний сопровождается грубыми нарушениями в клеточном звене иммунного гомеостаза.

Гуморальный иммунитет. Существуют 2 типа гуморальных факторов иммунитета, имеющих лимфоцитарное происхождение: это цитокины и антитела (иммуноглобулины). Кроме Т-лимфоцитов, являющихся основными продуцентами цитокинов, их также могут производить нейтрофилы и моноциты. В последние 10 лет стало очевидным, что гипертермия, лейкоцитоз, гиперметаболизм, гипердинамический тип микроциркуляции опосредованы продуктами иммунных клеток организма, попадающих в кровь после взаимодействия этих клеток с микроорганизмами.

Хотя инфекция является одним из основных стимулов септической реакции, природа этой реакции не зависит от природы стимула: организм отвечает совершенно одинаково на инвазию грамположительной и грамотрицательной флоры, вирусов, медиаторов воспаления без наличия инфекционного процесса [116]. Экспериментальная инфузия фактора некроза опухоли (ФНО) [247], интерлейкинов – ИЛ-1, ИЛ-2 [275] и фактора активации тромбоцитов (ФАТ) [208] вызывает не только физиологические изменения, свойственные сепсису, но и серию нарушений функций органов. По современным представлениям синдром полиорганной недостаточности (ПОН) является следствием не неконтролируемой инфекции, а неконтролируемого генерализованного воспаления, т. е. его основным стимулом является не бурная пролиферация бактерий, а бурная реакция организма, причем часто в виде септического состояния, не сопровождающаяся наличием очага инфекции или септицемии [239].

Медиаторы класса цитокинов имеют решающее патофизиологическое значение у септических больных в критическом состоянии. В настоящее время обнаружено и описано более 100 цитокинов. Среди них только ФНО и ИЛ-1 являются наиболее значимыми в развитии септических реакций и ПОН [116].

Существует тесная двухсторонняя координация между иммунной и гипофизадреналовой системами с обоюдным регуляторным взаимодействием посредством монокинов и гормонов [216]. ИЛ-1 стимулирует выброс различных центральных и периферических гормонов, в том числе и кортикотропин-рилизинг фактора [226]. Многочисленные исследования роли ИЛ-1 в патофизиологии сепсиса свидетельствуют о том, что in vivo он вызывает смерть у адреналэктомированных крыс, гипотензию у кроликов, клеточную инфильтрацию ликвора, гипогликемию и протеолиз в периферической мускулатуре мышей [211]. В опытах in vitro показана роль ИЛ-1 в синтезе других медиаторов воспаления (ИЛ-6, ИЛ-8), простагландина-Е2, сывороточного амилоида, коллагеназы и др. [221, 275].

Столь же важной в патогенезе генерализованного воспаления и ПОН является роль ФНО. При инфузии крысам он стимулировал протеолиз в периферической мускулатуре за счет активации гипофизадреналовой системы по стрессорному механизму [356]. In vivo эндотоксин или большие дозы ФНО вызывают тяжелую токсическую реакцию и смерть: у собак регистрировали гипотензию, шок, интерстициальный отек легких, внутрисосудистый тромбоз, геморрагический некроз надпочечников и тубу-лярный некроз [251].

Выделены и описаны также ИЛ-2, 6, 8, 10, 12, однако их роль в патогенезе системного воспаления не столь очевидна. Экспериментальное внутривенное введение ИЛ-2 вызывает септические симптомы: лихорадку, тахикардию, снижение АД, сердечного индекса, транзиторную почечную недостаточность, однако не влияет на концентрацию ФНО [426]. Выдвинуты предположения о роли ИЛ-8 как активатора нейтрофилов и хемотаксиса [379], а концентрация ИЛ-6 отчетливо коррелирует с тяжестью исходного повреждения и состояния больного, оцененной по шкале АРАСНЕ-ΙΙ, в то время как для прочих цитокинов и их антагонистов такой связи не выявлено [379]. По некоторым данным, ИЛ-6 может ингибировать синтез ФНО [374].

В системной циркуляции можно выявить лишь немногие цитокины: ФНО, ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6 и фактор пролиферации предшественников гранулоцитов (ФППГ), но не в норме, а при тяжелых септических процессах. Другие цитокины никогда не выходят в циркуляцию и действуют только локально в микроокружении по месту выработки. Общим свойством цитокинов является то, что они не вырабатываются клетками «про запас», т. е. не депонируются в клетках в виде молекул-предшественников. Их синтез активируется только импульсно, по сигналу и начинается с транскрипции цитокиновой РНК с соответствующего гена. Информационная РНК цитокинов нестабильная и короткоживущая. Продукция их клеткой носит транзиторный характер. Вместе взятые, эти свойства объясняют общее предназначение цитокинов: их высочайшая биологическая активность проявляется оперативно по сигналу в том месте, где нужно, и не дольше, чем нужно. Естественно, что цитокин оказывает действие исключительно на клетки, на мембране которых экспрессирован рецептор, способный связать данный цитокин. Именно благодаря цитокинам осуществляется тесная и оперативная связь между системой иммунитета и всем остальным организмом [53].

Длительная циркуляция в крови провоспалительных цитокинов негативно сказывается на специфической защите от инфекции, которая формируется молекулами антител [7]. Антитела в количествах, превышающих необходимые, начинают появляться спустя 48–72 ч после первичного контакта с антигеном [186]. Функциональная активность В-системы иммунитета у больных сепсисом ниже, чем у здоровых [62]. При генерализованной инфекции в крови снижается содержание иммуноглобулинов класса М (до 42,3 %) и класса G (до 82,4 %) [75, 96], что согласуется с экспериментальными данными [447]. Развитие стафилококкового сепсиса у детей раннего возраста сопровождается серьезными нарушениями гуморального иммунитета. Некоторые авторы указывают на снижение содержания IgA, IgM и особенно IgG и на низкий уровень антитоксического иммунитета, коррелирующего с тяжестью течения заболевания [175, 450]. Но в литературе имеются данные, свидетельствующие и о снижении содержания IgG с одновременным повышением уровня IgM и IgA [91]. В отдельных случаях трактовка показателей естественного иммунитета затруднена из-за массивного применения антибактериальных препаратов [164, 198].

При синегнойном сепсисе установлена связь между уровнем титров антител против О-антигена синегнойной палочки и тяжестью клинической картины. При выздоровлении выявляется сравнительно высокий уровень гуморального иммунитета к возбудителю в сочетании с низким уровнем сенсибилизации организма в противоположность этим же показателям в начальной стадии заболевания [51].

Снижение содержания антител, особенно у больных сепсисом, и уменьшение количества антителообразующих клеток являются одной из причин развития иммунодепрессивного состояния [75].

Очевидно, самым надежным критерием правильности современных представлений о патогенезе сепсиса была бы доказанная эффективность его патогенетической коррекции. К стандартной стратегии терапии сепсиса относится раннее введение антибиотиков, хирургическое вмешательство для санирования очага инфекции, реанимационные мероприятия (диализ, гемосорбция, механическая вентиляция) и использование вазоактивных медикаментов. Неуклонный мировой рост частоты возникновения сепсиса в последнее десятилетие и высокая летальность привели к интенсивному поиску новых методов лечения. Разработка новых препаратов для терапии сепсиса велась исходя из предположения, что нейтрализация бактериальных токсинов или потенциально повреждающих медиаторов иммунной системы может остановить септический процесс или, по крайней мере, замедлить его. Эти новые виды терапии являются сугубо патогенетическими по определению и направлены против различных элементов гипервоспалительного каскада: эндотоксина и цитокинов, таких, как ФНО и ИЛ-1.

Основываясь на патогенетическом значении эндоксина в экспериментальных и клинических исследованиях, испытаны и продолжают испытываться многочисленные антиэндоксиновые терапевтические средства. Но до сих пор эти препараты не смогли занять свое место в клинической практике, поскольку в общей популяции септических больных никому из исследователей не удалось продемонстрировать достоверное снижение летальности [29]. Отсутствие эффективности антицитокиновой терапии, выявленное в рандомизированных мультицентрических клинических исследованиях [290], плюс негативные эффекты ФНО-антагонистов оставляют сомнения в полезности этого терапевтического подхода.

Однако антитоксическая и антивоспалительная терапия оказалась труднее, чем думали вначале. Причина этого наверняка заключается в том, что мы пока находимся в «эмбриональной фазе патофизиологического понимания сепсиса» [418].

В последней связи обнадеживающими представляются успехи цитокиновой терапии. К концу 1990-х годов сформировалось отчетливое представление о том, что характер биологического ответа организма на повреждение определяется не только выраженностью синдрома системной воспалительной реакции (SIRS), а прежде всего изменением баланса секреции и выброса в системный кровоток провоспалительных (ФНО, ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6 и др.) и противовоспалительных (ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-11 и др.) цитокинов. Это позволило [239] ввести в схему патогенеза сепсиса промежуточный этап – синдром компенсаторного противовоспалительного ответа (CARS) и понятие о септическом процессе как о динамическом взаимодействии SIRS и CARS с весьма серьезными клиническими последствиями: преобладание SIRS выражается в кардиоваскулярной компроментации (септический шок), органной дисфункции, апоптозе (программированная клеточная гибель); превалирование CARS ведет к иммуносупрессии, анергии и повышенной чувствительности к инфекции [109]. Поскольку возврат к здоровью определяется динамическим равновесием этих двух составляющих септического процесса, для устранения возникшего дисбаланса при персистирующем сепсисе логически и патогенетически оправданным представляется применение регуляторных цитокинов с противоположным знаком: на высоте SIRS – противовоспалительных, а на высоте CARS – провоспалительных [277].

В свете вышеизложенного важен десятилетний позитивный опыт использования в клинике провоспалительного цитокина ИЛ-2, дефицит которого выявляется уже в самом начале развития синдрома компенсаторного антиво-спалительного ответа и становится декомпенсированным по мере его углубления, приводящего, в конце концов, к состоянию «иммунопаралича», т. е. неспособности больного сепсисом противостоять микробной агрессии [87]. В условиях вторичной иммунной недостаточности, сопровождающей гнойно-воспалительные заболевания и наиболее выраженной при сепсисе, компенсация дефицита эндогенного ИЛ-2 введением ронколейкина оказывает иммунокорригирующий эффект и восстанавливает нарушенные взаимодействия между субпопуляциями иммунокомпетентных клеток, что в итоге нормализует баланс про– и противовоспалительных цитокинов.

К настоящему времени стали очевидными три стратегических направления применения препарата: 1) иммунопротекция – для предотвращения развития иммунной недостаточности (125 000–250 000 МЕ); 2) иммунокоррекция – для компенсации проявлений иммунной недостаточности, связанной с клеточным компонентом иммунореактивности (250 000–500 000 МЕ); 3) иммунореставрация – для воссоздания элементов иммунореактивности и восстановления морфологической и функциональной целостности иммунной системы (500 000 – 1 000 000 МЕ) [163].

Согласно [33], показателями эффективности цитокиновой терапии являются быстрая положительная динамика состояния больных, достоверное снижение интегрального показателя тяжести состояния по шкале SAPS, уменьшение фактической летальности и срока госпитализации.

Таким образом, уже сегодня с позиций современного знания лечение этого заболевания не кажется безнадежным, а дальнейший прогресс в расшифровке механизмов патогенеза сепсиса, несомненно, родит новые идеи, а значит, и новую стратегию коррекции иммунологических нарушений.

4.2. Стресс и иммунитет

Системный подход. В настоящее время накапливается все больше данных о том, что механизмы нейрогуморальной регуляции функций иммунной системы, с одной стороны, и способы реализации стресс-реакции, с другой, связаны с вовлечением одних и тех же структур. В регуляции функций иммунной системы участвуют гипоталамус, лимбическая система мозга, серотонинергическая система ядер среднемозгового шва, дофаминергические структуры нигростриарной системы, голубое пятно [279]. Иммуномодулирующий эффект дают нейропептиды, гормоны гипофиза и эндокринных желез [370, 371]. В реализации стресс-реакции участвуют катехоламин-, дофамин-, серотонинергические системы, нейрогормоны, нейропептиды, гормоны гипофиза, надпочечников и других эндокринных желез. В свою очередь иммунокомпетентные клетки обладают рецепторами к основным медиаторам стресса – катехоламинам [301], серотонину, кортикостероидам [287], ацетилхолину, эндорфину и энкефалинам, субстанции Р и ко многим естественным пептидам [225, 252]. Следовательно, стрессорные изменения функций иммунной системы могут опосредоваться нейромедиаторами и гормональными факторами, и, таким образом, иммунологические проявления стресса можно рассматривать как патологию нейроэндокринной регуляции иммуногенеза [260].

Установление факта, что мозг реагирует на иммунизацию и развитие иммунного ответа изменением функциональной активности определенных структур ЦНС [229], привело к необходимости выявления путей притока информации от иммунной системы к нервной. Вероятными гуморальными трансмиттерами такого рода информации могут быть АКТГ, синтезируемый клетками иммунной системы и попадающий через кровоток в мозг [25, 171], ИЛ-1 [85, 229, 234, 355], эндорфины макрофагального и лимфоцитарного происхождения, субстанция Р и соматостатин [404].

Существует гипотеза [229] об участии глюкокортикоидных гормонов в передаче информации от иммунной системы к нервной по принципу обратной связи. Гиперсекреция глюкокортикостероидов на пике иммунной реакции рассматривается как сигнал о завершении формирования иммунного ответа. Фактически авторы развивают представление о замкнутом круге нейрогуморальной регуляции иммунных процессов, в котором роль афферентного звена, осуществляющего связь активированных антигеном клеток со структурами ЦНС, регулирующими гормональные функции, выполняют монокины, в частности ИЛ-1. Повышение уровня кортикостероидов, вызываемое ИЛ-1, рассматривается как эфферентный регулирующий фактор.

Поскольку клетки иммунной системы имеют различное сродство к определенным антигенам, а активированные высокоаффинные лимфоциты продуцируют множество поликлональных лимфокинов, вовлекающих в реакцию и низкоаффинные клетки, не исключено, что антигенобусловленный выброс кортикостероидов может препятствовать клональной экспансии клеток, обладающих низким сродством к данному антигену. В конечном итоге это обеспечивает высокую специфичность иммунного ответа, что, очевидно, является результатом ингибирующего влияния гормонов коры надпочечников на продукцию Т-лимфоцитами ИЛ-2, который имеет отношение к клональной экспансии Т– и, возможно, В-клеток или на продукцию ИЛ-1 макрофагами [229].

С другой стороны, учитывая способность антигенов индуцировать в лимфоидных клетках синтез АКТГ, эндорфинов и некоторых других гормонов, влияющих через соответствующие рецепторы на функции иммуноцитов, [234, 391] попытались объединить иммунную и нейроэндокринную системы в саморегулирующуюся суперсистему, где роль эффекторов выполняют кортикотропин-рилизинг-фактор, АКТГ, кортикостероиды и другие гормоны, причем гормоносинтез в лимфоцитах рассматривается как этап, индуцирующий дальнейшее развитие нейроэндокринных сдвигов (в частности, повышение уровня глюкокортикостероидов в крови). Поскольку в ответ на различные антигены иммунокомпетентные клетки могут продуцировать разные гормоны, то специфические особенности изменения иммунного гомеостаза, по мнению авторов, являются функцией индуцирующего стимула [234, 260].

Таким образом, нейроэндокринная и иммунная системы способны к взаимной регуляции через общие гормоны и рецепторы.

In vivo важной функцией физиологических концентраций кортикостероидов является также индукция апоптоза отработавших лимфоцитов. Глюкокортикостероиды служат «исполнителями» так называемой «индуцированной активацией клеточной смерти лимфоцитов» – AICD (activation-induced cell death), которая является вариантом апоптоза периферических лимфоцитов, закономерной гибели однажды активированных клеток [429]. При нормальном иммунном ответе в ранние сроки от начала его развития происходит активация гипофизадреналовой системы. Показано, что Т-лимфоциты, распознавшие свой антиген (а не макрофаги или иные клетки), начинают активно продуцировать ФНО. Этот цитокин через циркуляцию достигает гипоталамуса, в котором есть специфические рецепторы для него (и еще, по-видимому, для ИЛ-1). Сигнал с этого рецептора стимулирует гормоносинтез в самом гипоталамусе (образование рилизинг-фактора), затем в гипофизе (генерация АКТГ) и, наконец, в надпочечниках (стероидогенез).

Строгие эксперименты показывают, что именно кортикостероиды вызывают апоптоз, т. е. физически элиминируют из организма активированные суперантигеном клоны лимфоцитов, и тем самым останавливают деструктивный компонент иммунного ответа. Если тот же антиген при тех же условиях вводят адреналэктомированным животным, то они умирают при явлениях разлитых воспалительных процессов, индуцированных цитокинами лимфоцитов, активированных антигеном. Системная гиперактивация иммунной системы потенциально летальна для организма. Анализ этих данных обосновывает применение кортикостероидных препаратов при септическом шоке.

Кроме индукции апоптоза кортикостероиды ограничивают пролиферацию лимфоцитов через снижение активности Th1 и соответственно продукции ими ИЛ-2 [295, 447], а также гамма-интерферона [281, 328]. Снижение уровня гамма-интерферона в свою очередь приводит к уменьшению активности макрофагов (в том числе процессинга и представления антигена) [281, 408], снижению активности натуральных киллеров, сдвигу функциональной дифференцировки Т-хелперов от Th1 в сторону Th2.

Таким образом, не исключено, что гипофизадрена-ловая система, ответственная за воспроизведение стрессорной реакции, лимитирует также и физиологическую супрессию иммунного ответа.

Экспериментальный подход. Среди лимфоцитотропных стрессреализующих факторов выделим гормоны коры надпочечников, которые, являясь классическими иммунодепрессантами, играют главную роль в подавлении специфической функции иммунокомпетентных клеток. Наиболее характерным метаболическим эффектом глюкокортикоидов является ингибирование синтеза ДНК [306, 391], которое, по-видимому, обусловливает все прочие биохимические, морфологические и функциональные изменения в лимфоидных клетках. Первичные сдвиги под влиянием гормонов, очевидно, происходят на уровне транскрипции, о чем свидетельствуют раннее ингибирование РНК-полимеразной активности, снижение относительного содержания одних нуклеотидных пар (цитидин-уридин) и увеличение других (аденингуанин) во вновь синтезированной РНК лимфоцитов [330]. Иммунодепрессантное действие стероидов используется в клинике. Они занимают важное место в лечении острого и хронического лимфолейкоза, диссеминированного лимфогранулематоза и других лимфом.

Стероидзависимое торможение гуморальных и клеточных иммунных реакций определяется способностью глюкокортикоидов угнетать процессы пролиферации. Показано, что кортикостероиды снижают ответ лимфоцитов на поликлональные митогены [412]. Этот эффект проявляется как при гормональной добавке к клеточной культуре, так и при тестировании способности к ответу на митогены клеток, взятых после введения гормонов в организм, и зависит от их дозы и времени аппликации по отношению к началу митогенной стимуляции [388]. Установлено, что наиболее чувствительными к гормонам являются начальные фазы процесса пролиферации [369, 388]. Для существенного подавления пролиферативного ответа в культуре обычно требуются концентрации гормонов, превышающие физиологические уровни.

Однако в определенных условиях эффективны и минимальные добавки. Так, при культивировании тимоцитов, полученных от адреналэктомированных мышей, т. е. свободных от эндогенных гормонов, 1–3 нмоль дексаметазона не влияли на вызванную Кон-А пролиферацию клеток в первые 6 ч культивирования, но ингибирующий эффект отчетливо проявляется через 24 ч и достигает максимума через 47 ч [227]. Гидрокортизон в концентрации 75 нмоль/л уменьшает включение 3Н-тимидина в присутствии Кон-А в смешанной культуре аутологических лимфоцитов [422]. Метилпреднизолон, введенный внутривенно человеку в дозе 1 мг/кг, вызывает подавление ответа лимфоцитов периферической крови на митогены с максимумом через 4–8 ч [433]. Процесс дифференцировки моноцитов в макрофаги в культуре моноцитов периферической крови человека также существенно угнетается при введении гидрокортизона в дозе 2,5 мкмоль/л [386].

Влияние глюкокортикостероидов на функциональную активность лимфоцитов во многом зависит от их способности подавлять образование ИЛ-1 и ИЛ-2, играющих важнейшую роль в реализации пролиферативных реакций. Известно, что ИЛ-1, синтезируемый активированными макрофагами и моноцитами, необходим для Т-клеточной генерации ИЛ-2, который, в свою очередь, лимитирует пролиферацию лимфоцитов [274]. In vitro гормоны коры надпочечников снижают продукцию ИЛ-1 макрофагами и угнетают их антигенпредставляющую функцию, а введение ИЛ-1 или макрофагальных клеток ослабляет или отменяет супрессивное действие кортикостероидов [408].

Глюкокортикоиды подавляют биосинтез ИЛ-2 лимфоцитами и пролиферативный ответ клеток селезенки мышей и лимфоцитов периферической крови человека, причем этот эффект может проявляться при физиологических концентрациях гормонов [295]. Добавление в культуры ИЛ-2 приводит к отмене этого торможения [262]. На этом основании предполагается, что гормоны снижают только образование, но не рецепцию ИЛ-2 на чувствительных к нему клетках [348]. Причиной торможения пролиферации лимфоцитов периферической крови человека в условиях дефицита ИЛ-2, вызванного фармакологическими дозами дексаметазона (от 100 нмоль/л до 1 мкмоль/л), является, по-видимому, недостаточный синтез РНК и задержка клеток в G1-фазе [231].

Хотя в сфере кортикостероидного влияния находится практически весь пул иммунокомпетентных клеток, лимфоциты многими рассматриваются как его основные мишени. На самом деле эта популяция чрезвычайно гетерогенна по чувствительности к глюкокортикоидам. Инъекции очень высоких доз гормонов (порядка 2,5—12,5 мг/мышь) оставляют резистентными часть лимфоцитов во всех лимфоидных органах: 5 % в тимусе, 20 % в селезенке, 80 % в костном мозгу [403]. Как Т-хелперы, так и Т-супрессо-ры, по-видимому, подвержены угнетающему влиянию, но чувствительность первых к фармакологическим дозам кортикостероидов неодинакова [234]. Некоторые авторы относят Т-супрессоры к наиболее чувствительным клеточным элементам, что подтверждается как данными культуральных экспериментов, так и при введении гормонов в организм или в условиях действия стрессорных факторов [209, 390]. Неодинаковая чувствительность разных клеточных популяций к глюкокортикостероидам может быть связана с различиями в количестве и аффинности их рецепторного аппарата [146] или особенностями гормональной регуляции клеточного метаболизма и мембранных механизмов, имеющих отношение к рецепции этих гормонов [157].

Гормоны коры надпочечников способны существенно изменять функции цитотоксических Т-лимфоцитов (НК – натуральные киллеры), осуществляющих лизис любых опухолевых клеток-мишеней аллогенной, ксеногенной или аутологической природы [282, 391], и изменять рецепторные функции иммунокомпетентных клеток, определяющие их взаимодействие с антигенами и другими иммунологически значимыми молекулами, что крайне важно для реализации иммунных процессов [146, 262, 433].

Проявление однотипных гормональнообусловленных сдвигов при стрессе прямо зависит от силы и экспозиции раздражения, т. е. от эффективной концентрации в крови эндогенных кортикостероидов. Так же как и при экзогенном гиперкортицизме, угнетение функции иммунной системы при стрессе связывают с подавлением активности Т-системы. В обоих случаях происходит уменьшение пула рециркулирующих Т-клеток, изменение удельного их количества, а значит, и соотношения: Т-клетки / В-клетки / макрофаги, что обусловливает снижение иммунологических процессов в целом. При длительном и выраженном стрессе подавлена пролиферативная активность Т-клеток.

Этот эффект наблюдали у людей и в экспериментах на животных при психоэмоциональном, болевом, травматическом, операционном и других видах стресса [347, 376]. Результирующая стрессиндуцированных изменений функциональной активности Т-лимфоцитов определяется степенью воздействия на основные субпопуляции этих клеток,т. е. функции Т-хелперов, Т-супрессоров и Т-киллеров. Как выяснилось, количество Т-хелперов при различных стрессорных ситуациях снижается [363] иногда на фоне повышения количества супрессоров и их активности [446], что приводит к снижению общей дееспособности Т-системы.

Однако при «физиологических» вариантах раздражения и в адаптивной фазе стресса происходит повышение количества Т-хелперов [339], что авторы считают нормальной реакцией на стресс. Одним из важных механизмов реализации стимулирующего влияния стресса на иммунологические процессы является подавление активности Т-супрессоров [183]. Согласно [254], эти клетки наиболее чувствительны к действию глюкокортикоидных гормонов. По мнению Б. А. Фролова [183], стрессорное угнетение активности супрессоров может приводить к нарушению регуляции функций иммунной системы, при котором повышение иммунологических реакций лежит в основе патологических процессов аллергического характера и аутоиммунных заболеваний [253, 410]. Частично стрессиндуцированные нарушения функций иммунной системы могут быть связаны и с изменениями активности В-клеток, а именно ингибированием процесса их пролиферации [363], снижением количества иммуноглобулинов в крови [104], понижением их продукции [278], уменьшением количества В-клеток в лимфоидных органах [297] и крови [413].

Судя по тому, какое огромное количество лимфоцитов ежедневно проходит через грудной проток, легко предположить, что бóльшая часть клеток лимфоидной системы постоянно рециркулирует. В течение 24-часового дренажа грудного протока крысы может быть собрано 109 лимфоцитов [134]. Эта величина почти равна общему числу лимфоцитов всех лимфатических узлов крысы. Однако даже длительный дренаж не обеспечивает элиминации всех лимфоцитов организма. Последнее свидетельствует о том, что помимо существования мобильного пула лимфоцитов имеется пул «оседлых» клеток. Поскольку при дренаже грудного протока в первую очередь происходит опустошение тимусзависимых зон лимфоидных органов, считают, что «оседлых» лимфоцитов больше среди В-клеток.

Прямые доказательства того, что В-клетки мигрируют медленнее Т-клеток, были получены в опытах с внутривенным введением чистых популяций Т– или В-клеток, меченных 3Н-уридином [411]. Постоянный обмен элементами между различными лимфоидными органами обеспечивает функционирование иммунной системы как единого целого. Это обусловливает высокие адаптивные возможности иммунитета, генерализацию иммунных реакций и иммунологической памяти с вовлечением всей системы, в каком бы месте тела ни возникло антигенное раздражение.

Факторы или механизмы, контролирующие способность лимфоцитов к рециркуляции, почти не изучены. Имеется ряд работ, свидетельствующих о важной роли гипофизадреналовой системы в процессах миграции и рециркуляции лимфоцитов. Введение крысам малых доз преднизолона (16 мкг/ч) или АКТГ (1 ЕД) снижало выход лимфоцитов в лимфу в 3 раза, не влияя на количество вытекающей из грудного протока лимфы [412]. У мышей гидрокортизон-ацетат в дозе 10–20 мг/кг вызывает угнетение миграции Т-лимфоцитов из тимуса и В-лимфоцитов из костного мозга [135].

В реакции лимфоидной системы на однократное и непродолжительное стрессорное раздражение различают 2 фазы. В первую фазу, которая длится 12 ч, в периферической крови наблюдается лимфопения, эозинопения и нейтрофилез, в тимусе и селезенке – снижение содержания клеток, в костном мозге – уменьшение количества зрелых нейтрофильных гранулоцитов, преходящее увеличение лимфоидных клеток («лимфоидный пик») и достоверный рост числа КОЕ [31]. К концу 1-х суток все неспецифические сдвиги нивелировались, и развивалась вторая фаза, где основные изменения наблюдались в лимфоидных органах. В костном мозге в этот период имела место активация эритроидного или гранулоцитарного ростков кроветворения с явлениями некоторой гиперплазии, и отмечалось снижение содержания лимфоидных клеток. В селезенке происходила нормализация числа лимфоцитов, а в тимусе продолжалась убыль клеток [31].

В течение 1–2 недель после однократного воздействия достаточно сильного стрессора система крови характеризуется повышенной резистентностью, когда повторное раздражение вызывает уже менее значительный ответ с использованием только легко мобилизуемых фондов зрелых клеток, без вовлечения в реакцию кроветворных органов [31].

Механизмы, регулирующие миграцию клеток при стрессе из лимфоидных органов, различны. Если убыль лимфоцитов в тимусе контролируется гормонами гипофизадреналовой системы, то их убыль в селезенке происходит без их участия. В специальных опытах было установлено, что уменьшение числа клеток в селезенке при стрессе предотвращается блокадой α-адренорецепторов. На основании этого было сделано заключение о том, что в ранний период стресс-реакции повышение тонуса симпатической нервной системы сопровождается возбуждением α-адренорецепторов в селезенке, что приводит к сокращению гладкой мускулатуры ее капсулы и выбросу в периферическую кровь большого числа Т– и В-лимфоцитов. По мнению П. Д. Горизонтова и др., поставляя в кровоток в ранний период стресс-реакции (6—12 ч) значительную долю различных типов лимфоидных клеток, селезенка играет роль органа «срочной помощи», в то время как тимус «отвечает» за восполнение пула Т-лимфоцитов, израсходованных в первую фазу стресса [31].

Одним из наиболее известных проявлений стресса является лимфопения. Сначала ее объясняли массовым разрушением лимфоцитов, затем блокированием их выхода из депо [50] и, наконец, выяснилось, что лимфопения в периферической крови развивается на фоне усиленного поступления иммунокомпетентных клеток из лимфоидных органов в кровоток [31]. Поскольку уровень лимфоцитов в периферической крови является результирующей двух процессов – поступления из мест пролиферации и ухода в места функционирования, сбалансированных при нормальном физиологическом состоянии организма, можно полагать, что лимфопения при стрессе является результатом усиленного выхода клеток из циркуляции.

Одним из мест, куда мигрируют лимфоциты крови при стрессе, является костный мозг. Этот процесс, очевидно, регулируется с помощью β-адренорецепторов симпатической нервной системы, поскольку применение β-блокаторов (обзидана) предотвращает поступление лимфоидных клеток в костный мозг при стрессе. Считается, что увеличение содержания лимфоидных клеток в костном мозгу в первую фазу стресс-реакции обогащает орган пластическими материалами и увеличивает его иммунокомпетентность [31].

При многократном воздействии стрессора реакция системы крови имеет определенные особенности. Изменения развиваются постепенно в течение трех периодов, соответствующих стадиям общего адаптационного синдрома. В первой стадии – тревоги, или иммобилизации, – уменьшается число иммунокомпетентных клеток в лимфоидных органах и содержание гранулоцитов и КОЕс в костном мозге. Изменения в периферической крови здесь не всегда выражены. Во второй стадии – резистентности – падение числа клеток прекращается. Наблюдается стабилизация сниженного уровня или даже некоторый рост их числа. В отдельных ростках фиксируются явления гиперплазии. В третью стадию – истощения – имеет место новое снижение содержания иммуноцитов в различных отделах лимфоидной системы и крови до уровня, нередко несовместимого с поддержанием жизни. Воспроизведение всех стадий, а также их продолжительность и выраженность стрессиндуцированного иммунодефицита зависят от силы, длительности и специфических особенностей действующего раздражителя [31].

Клинический подход. Для взаимной экстраполяции экспериментальных и клинических данных удобно использовать адекватную для обоих вариантов ситуацию с хирургической травмой. Объективность оценки иммунологических показателей при операционном стрессе диктуется следующими обстоятельствами: а) исследования проведены при плановых хирургических вмешательствах, поэтому подробно представлены исходные данные;

б) объем хирургической травмы можно количественно оценить; в) влияние сопутствующих воздействий сведено к минимуму.

В течение первых суток после хирургической травмы в циркулирующей крови отмечается снижение общего количества лимфоцитов, главным образом за счет Т-клеток, и увеличение нейтрофильных гранулоцитов [207, 222]. Влияние операционного стресса на способность лимфоцитов крови к морфологической трансформации и пролиферации в ответ на антигенный и митогенный стимулы исследовано на многих больных, подвергнутых большим или малым хирургическим вмешательствам. Практически во всех случаях операция сопровождается значительным и продолжительным падением синтеза ДНК in vitro и уменьшением числа клеток, трансформирующихся в бласты [402]. Торможение митогенного ответа лимфоцитов периферической крови в присутствии ФГА, Кон-А или ЛПС начинается уже через 2 ч, а возвращается к норме на 7—10-й день после операции.

При исследовании трансформации лимфоцитов на митогены до, через сутки, неделю и месяц после радикального хирургического лечения в общей группе из 35 обследованных больных не обнаружено значительных различий дооперационных и послеоперационных показателей. Пролиферация лимфоцитов была угнетена лишь у тех, кому произведены обширные полостные операции, у больных с массивной кровопотерей, получивших переливание крови, при продолжительности хирургического вмешательства более 2 ч. У 18 человек, составляющих данную группу, угнетение функциональной активности лимфоцитов коррелировало с величиной операционной травмы, не было связано с влиянием анестетиков и длилось на протяжении 4 недель [219].

Механизм подавления митогенного ответа лимфоцитов при операционном стрессе может быть связан с рядом одинаково возможных вариантов: а) иммуносупрессией за счет гиперсекреции глюкокортикоидных гормонов [16, 272, 365], б) активацией Т-супрессоров [182], в) наличием в сыворотке крови больных иммуносупрессирующих факторов [370], г) нарушением функции Т-клеток [54], д) появлением в циркуляции Т-клеток, слабо реагирующих на митогены, нарушением процессов кооперации клеток [354].

Взвесь мононуклеарных клеток периферической крови, исследованная через сутки после интраторакального хирургического вмешательства, имеет значительно меньшую активность в реакции зависимой от антител клеточной цитотоксичности (АЗКЦ – функция К-клеток), чем до операции [312]. Снижение цитолитической активности К-клеток крови сохранялось до 7–8 сут послеоперационного периода. Динамика уменьшения и восстановления активности натуральных киллеров (НК) у больных после грыжесечения такая же, как и у эффекторов АЗКЦ [365].

Таким образом, при хирургическом стрессе у человека происходит существенное угнетение реакций клеточного иммунитета. Восстановление показателей идет в следующей последовательности: раньше всего нормализуется количество циркулирующих лимфоцитов, затем восстанавливается реактивность на поликлональные митогены и уровень К-клеток и НК, т. е. клеточных эффекторов, имеющих прямое отношение к противоопухолевой резистентности организма.

Другой важный аспект, вытекающий из результатов исследований, – понятие о степени иммунологического риска. Первые 2–3 недели являются наиболее опасными в плане возможных послеоперационных инфекционных осложнений. Поэтому при проведении тяжелых операций, связанных со значительной травмой и кровопотерей, следует применять ряд патогенетических средств, предупреждающих или ограничивающих развитие стресс-реакции, или использовать препараты, направленные на восстановление сниженных функций иммунной системы.

Существует три принципиальных подхода к предупреждению отрицательных последствий влияния стресса на иммуногенез.

Первый из них основан на применении воздействий, ограничивающих возможность развития нефизиологических (патологических) форм стресса. Согласно [102], эндогенные антистрессорные механизмы существуют на разных уровнях организации регуляторных систем – от центрального (мозгового) до клеточного. Например, ограничение стрессиндуцированного подавления активности натуральных киллеров достигается введением таких тормозных метаболитов, как гамма-аминомасляная кислота и пептид дельтасна [103]. Восстановление угнетенного в результате стресса иммунного ответа наблюдается при применении глутаминовой кислоты [160]; эффективность субстанции Р в этих условиях характеризуется отсутствием атрофии тимуса, увеличением количества антителопродуцентов, нормализацией активности макрофагов перитонеального экссудата [181].

Вещества центрального и периферического адреноблокирующего действия, прерывающие развитие стрессорной реакции на уровне α– и β-адренергических систем, предотвращают клеточное опустошение селезенки и миграцию лимфоцитов в костный мозг [56]. Антистрессорным и одновременно иммунокорригирующим действием обладают нейропептиды. Так, опиоидные пептиды подавляют выделение катехоламинов в мозгу [235], мет-энкефалин ингибирует высвобождение АКТГ [381], а эндогенные опиоиды способствуют снижению гиперкортицизма [420]. Адаптация к стрессорным нагрузкам и гипоксии также нивелирует отрицательные последствия действия стресса на иммунную систему [105]. Очевидно, к числу подобных способов оптимизации стресса можно отнести аутотренинг и другие меры психотерапии, направленные на оптимизацию реакций организма на различные стрессорные ситуации.

Второй способ базируется на минимизации гуморальных составляющих уже возникшего стресса. Он предполагает использование препаратов, снижающих, компенсирующих или блокирующих катаболическое действие глюкокортикоидов, эффективно повышающих ингибированные стрессом иммунологические реакции. В этих целях успешно применяют и препараты, влияющие на метаболизм клеток, – аргинин [217], сукцинат [81] и токоферол [104].

Третий путь коррекции стрессиндуцированного иммунодефицита предполагает использование средств, адресованных непосредственно клеткам-мишеням иммунной системы, через прямое воздействие на иммуноциты или через стимуляцию интраиммунных механизмов регуляции с помощью интерферона, ИЛ-1, ИЛ-2, а также индукторов продукции этих медиаторов [285, 318]. Основанием для их применения служат данные о способности ИЛ-1 [291] и ИЛ-2 [63] восстанавливать иммунологическую реактивность, подавленную глюкокортикоидами, и факты, свидетельствующие о том, что механизм стрессовой депрессии активности НК связан с дефицитом эндогенного интерферона [273] или нарушением синтеза интерлейкина-2 [174]. Использование ронколейкина (рекомбинантный дрожжевой ИЛ-2 человека) при термической травме (ожоговая болезнь) приводит к увеличению общего количества лимфоцитов, Т-клеток, снижению супрессоров, циркулирующих иммунных комплексов, антителобляшкообразующих клеток, что позволяет более эффективно нормализовать показатели клеточного и гуморального иммунитета [116]. Согласно [268], введение ИЛ-2 перед операцией приводит к повышению функциональной активности Т-лимфоцитов и существенному увеличению экспрессии маркеров CD3 (Т-клеточный рецептор) и CD25 (рецептор ИЛ-2), что нивелировало иммуносупрессивные эффекты хирургического вмешательства и позволило избежать последующих осложнений.

В качестве профилактического средства ронколейкин был использован в фтизиопульмонологии для подготовки больных с прогрессирующим фиброзно-кавернозным туберкулезом к операции. Трехкратное введение препарата в дозе 1 млн МЕ с интервалом в 2 дня привело к норме различные показатели клеточного и гуморального иммунитета, влияя как на число, так и на функциональную активность зрелых Т-лимфоцитов (CD3), Т-хелперов (CD4), НК-клеток (CD16), Т-лимфоцитов с рецептором к ИЛ-2 (CD25) и др. Позитивные сдвиги в иммунном статусе больных сохранялись до момента операции. Обнадеживающие результаты получены при предоперационной подготовке больных для аортокоронарного шунтирования. Иммунотерапевтическое лечение ронколейкином больных с гастродуоденальными кровотечениями нивелирует признаки постгеморрагического иммунодефицита, что обеспечивает успешное проведение плановых операций. Применение ронколейкина у онкологических больных перед операцией способствовало устранению иммунодефицита, что позволило избежать послеоперационных осложнений и снизить вероятность метастазирования. Повторные курсы иммунокорригирующей терапии обеспечили стабилизацию процесса в течение 8 месяцев при стойкой нормализации показателей клеточного иммунитета [268].

Таким образом, взаимоотношения между стрессом и иммунитетом весьма сложны и многогранны. Они становятся все более ясными по мере углубления и расширения наших знаний о природе и механизмах стресса и иммунитета, но уже сейчас можно согласиться с представлением, что «стресс и иммунитет – общебиологические категории. Их общность определяется их единством: в ряде своих существенных проявлений они реализуются сочетанно и друг через друга. Иммунологические реакции индуцируются стрессорными воздействиями, а в комплексе процессов, осуществляющих весь сложный синдром стресса, определяющее значение принадлежит реакциям иммунитета» [90].

4.3. Тиамин и иммунитет

Влияние на иммунный статус. Судя по доступным источникам, роль тиамина в иммуногенезе до сих пор изучалась в трех направлениях: 1) воздействие на резистентность организма к инфекциям; 2) влияние на антителообразование; 3) способность витамина видоизменять реактивность организма к возбудителям.

Клиницисты давно заметили, что многие инфекционные заболевания сопровождаются развитием тиаминовой недостаточности [99]. Устранение витаминодефицита с помощью парентерального введения тиамина при ряде инфекций ускоряло процесс выздоровления больных [99]. В эксперименте также отмечено снижение резистентности В1-гиповитаминозных животных к вирусу гриппа PR-8 [315], вакцине из палочек Флекснера и сублетальным дозам палочки Борде-Жангу [37]. Витаминная нагрузка здесь оказывала благоприятный корригирующий эффект. Ежедневное парентеральное введение 0,5–1 мг витамина В1 в течение месяца способствовало повышению приобретенной устойчивости к туберкулезу у морских свинок после туберкулезной вакцинации [63]. У крыс тиамин в суточной дозе 5 мкг стимулировал развитие невосприимчивости к аскаридозу [37].

Показано, что тиамин может влиять как на неспецифические (фагоцитоз, активность комплемента и т. д.), так и специфические (синтез антител) факторы иммунитета.

У гиповитаминозных по В1 крыс фагоцитарная активность лейкоцитов in vitro снижена [137]. Введенный in vivo тиамин в дозе 5 мг/кг стимулировал фагоцитоз гранулоцитами дизентерийной палочки и снимал его торможение, вызванное применением соответствующих ингибиторов (тиопентал, диплацин, левомицетин, гидрокортизон и др.) [193]. Однако в литературе имеются сведения и об отсутствии влияния избытка или недостаточности тиамина в организме животных на активность фагоцитоза [259].

Результаты изучения влияния витамина В1 на активность комплемента тоже неоднозначны: одни авторы находят снижение его титра при пищевом В1– гиповитаминозе [441], другие это отрицают [214], равно как и стимулирующее действие тиамина при его дополнительном введении [36].

Аналогичная поляризация мнений существует и в вопросе о взаимосвязи различной обеспеченности организма тиамином с образованием антител. С одной стороны, есть данные, что В1-гиповитаминоз подавляет продукцию антител к пневмококковым инфекциям у мышей [443], у пациентов, иммунизированных Bacterium tularence [366], и у крыс к N. Muris [435]. Титры антител В1– гиповитаминозных мышей, зараженных живой дизентерийной культурой Флекснеровского типа, оказались значительно сниженными [37]. Недостаточность витамина В1 вызывала умеренное ослабление продукции гемагглютининов у крыс в ответ на введение человеческих эритроцитов [214] и эритроцитов барана [32]. С другой стороны, в опытах с «парным кормлением» показано, что исключение витамина В1 из пищи не сопровождается заметным изменением образования нейтрализующих антител у мышей, вакцинированных вирусом энцефалита [392].

Не было обнаружено влияние тиаминовой недостаточности на антителопродукцию у крыс, иммунизированных эритроцитами барана при сравнении с контролем на «авитаминозное голодание» [417]. В1-дефицитные крысы отвечали адекватным синтезом антител на иммунизацию дифтерийным анатоксином [214]. Пищевая недостаточность тиамина вызывала несущественную редукцию в способности образовывать агглютинины у крыс, иммунизированных вакциной, приготовленной из убитых культур Corinebacterium Kutscherl [451]. У контрольных и В1-гиповитаминозных крыс иммунный ответ на заражение вирусом гриппа PR-8 был одинаковым [214].

Характер влияния экзогенного тиамина на антителообразование, по данным разных авторов, неоднозначен. Одни считают, что тиамин, безусловно, активирует продукцию антител, другие не разделяют это представление или принимают его с оговорками. Десятидневное введение 300 и 1500 мкг тиамина per os стимулировало образование всех видов антител, особенно гемолизинов, у крыс, находившихся на казеиновой диете и подвергнутых внутрибрюшинной иммунизации эритроцитами барана, причем действие витамина проявлялось преимущественно во время продуктивной фазы иммуногенеза [32]. У крыс с аналогичной антигенной нагрузкой внутрибрюшинно введенный тиамин в дозе 400 мкг усиливал синтез антител и существенно ослаблял иммунодепрессивный эффект аналогов пуриновых оснований (6-меркаптопурина и азатиоприна) [82].

Под влиянием витамина В1 у детей нарастали титры лизоцима, антистрептолизинов и антистафилолизинов [249]. При 18-дневной экспозиции тиамин в дозах, равных суточной профилактической дозе для человека, повышал антителообразование у кроликов, иммунизированных культурой В. paracoli [140]. Отмечено стимулирующее влияние В1-гипервитаминоза на продукцию гемагглютининов у кроликов при иммунизации их дизентерийными антигенами [1]. В1– витаминизация усиливала образование антител у морских свинок, зараженных A. Lumbricoides [37]. Парентеральное введение тиамина в дозе 60 мкг приводило к более интенсивной наработке преципитинов у морских свинок, иммунизированных лошадиной сывороткой [37].

В противовес этому имеются данные о том, что введение животным в течение длительного времени избыточных количеств тиамина (по 2 мл 6 % раствора и 0,25 мл 2 % раствора) снижало функциональную активность важнейших механизмов естественного иммунитета (фагоцитоза нейтрофилов, бактерицидной активности сыворотки крови, пропердина и т. п.) у кроликов и мышей [117].

Кроме того, в ряде работ показан дифференцированный дозозависимый эффект тиамина на антителообразование. Так, установлено стимулирующее влияние витамина В1 в дозе 25 мкг и угнетающее в дозах 100 и 300 мкг на выработку антител у мышей, иммунизированных дифтерийной вакциной [89]. У крыс, иммунизированных эритроцитами барана, многократное введение тиамина из расчета 100 мкг на 100 г веса стимулировало накопление антителообразующих клеток в лимфоидных органах животных. Нагрузка большими дозами витамина (400 мкг на 100 г веса в день) тормозила образование этих клеток [83].

Как видно из приведенных примеров, данные, касающиеся влияния тиамина на продукцию иммунных антител, весьма противоречивы и явно недостаточны для тех или иных обобщений.

Механизмы иммуноактивности тиамина. Поскольку синтез антител – это синтез иммуноглобулинов, для которого необходимы те же условия, что и для синтеза белка вообще (наличие матриц ДНК и различных РНК, соответствующих ферментов, субстратов и энергии), иммуноактивность тиамина разные авторы обычно рассматривают с учетом этих биохимических составляющих иммуногенеза и строго в рамках коферментного механизма действия витамина.

Согласно [38], самые общие связи между обеспеченностью организма тиамином и иммуногенезом проявляются уже в том, что В1-авитаминоз сопровождается снижением аппетита и развитием алиментарного истощения, тяжесть которого зависит от степени недостаточности тиамина, а иммуногенез в целом и его парциальные реакции в частности весьма чувствительны к дефициту белка [139].

Нарушение бактерицидной активности макрофагов, полученных от авитаминозных животных [292], торможение у них антителогенеза при использовании корпускулярных антигенов [95], а также способность витамина активировать фагоцитоз у крыс в самых разных условиях (на фоне торможения ЦНС и синаптической передачи нервных импульсов, при гиперкортицизме, эпинефрэктомии, спленэктомии и т. п.) рассматриваются как совокупность фактов, свидетельствующих о прямом действии тиамина на иммунокомпетентные клетки [38].

Считается, что торможение образования антител в условиях В1-недостаточности может быть обусловлено выпадением функции тех ферментных систем, которые нуждаются в ТДФ. Общепринято, что ведущим биохимическим дефектом в картине В1-авитаминоза является снижение активности транскетолазы [126], которая обеспечивает пентозофосфатами синтез нуклеиновых кислот. В свете данных об усилении синтеза белка и нуклеиновых кислот в ходе иммуногенеза [184] и фактов, что коферментные формы витамина В1 способны in vivo усиливать синтез ДНК в крови человека, собаки и крысы, причем пропорционально концентрации ТДФ [332], делается вывод, что тиамин, очевидно, является неспецифическим стимулятором иммуногенеза. Отсюда угнетение или активация антителообразования якобы объясняется наличием функциональной связи между обеспеченностью организма тиамином и ДНК-РНК-зависимым синтезом иммунных белков [38].

Соответственно развитие атрофии тимуса [417] и лимфопении [292] у животных с прогрессирующим пищевым авитаминозом некоторые авторы напрямую связывают с угнетением тиаминзависимой пролиферации лимфоидной ткани [38], ссылаясь на то, что нагрузка здоровых животных витамином В1 стимулирует накопление антителообразующих клеток в лимфоидных органах [140].

Сильным аргументом в пользу коферментной версии иммуноактивности тиамина, в принципе, могли бы служить иммунодепрессантные эффекты его структурных аналогов, способных образовывать ложные коэнзимы, блокирующие витаминзависимые ферменты. Такие данные получены в отношении окситиамина, который начиная с 1941 г., когда он был впервые синтезирован из тиамина [162], и до недавнего времени считался классическим антивитамином. Окситиамин в дозе 400 мг/кг вызывает инволюцию тимуса [73] и угнетает продукцию антител у крыс во время индуктивной фазы первичного иммунного ответа на человеческий гамма-глобулин и эритроциты барана. Согласно [38], иммунодепрессантное действие окситиамина связано с вмешательством антивитамина в обмен нуклеиновых кислот и белков через снижение уровня фосфорилированных пентоз в лимфоидной ткани, поскольку ингибирование транскетолазы сопровождалось замедленным нарастанием содержания антигамма-глобулинов в крови у В1-авитаминозных животных.

Однако впоследствии оказалось, что окситиаминовые эффекты на самом деле являются сильным аргументом против коферментного механизма, поскольку могут быть воспроизведены оксипиримидином – небольшим фрагментом молекулы окситиамина без тиазоловой части, лимитирующей связывание антивитамина и антикофермента (соответственно витамина и кофермента) в активных центрах тиаминпирофосфокиназы и витаминзависимых ферментов [123]. Этим фрагментом может быть обусловлен весь спектр биологического действия ОТ и механизмы его опосредования. Дело в том, что при нормальных тканевых значениях pH = 7,0–7,2, оксипиримидин подвергается лактим-лактамной таутомерии [128], в результате которой превращается в одного из членов биологически активного семейства оксопиримидинов, а именно – монооксопиримидин. Диоксопиримидин – это урацил, 5-фторпроизводное которого является сильнейшим канцеростатиком – ингибитором синтеза нуклеиновых кислот [123]. Триоксопиримидин – это барбитуровая кислота, 5-этил-5-изоамилпроизводное которой – амитал-Na широко используется в митохондриологии как дыхательный яд [165]. Тетраоксопиримидин – это аллоксан, мощное диабетогенное средство [5]. Поскольку ОТ в тканях фактически существует как 5-тиазолилметил-производное оксопиримидина [128], он в какой-то мере может быть наделен всем букетом свойств этого семейства.

Действительно, имеются сведения, что ОТ угнетает синтез нуклеиновых кислот [185], in vitro действует как ингибитор дыхания [141], а in vivo вызывает диабет [11]. Согласно существующим представлениям, диабетогенное влияние аллоксана реализуется в β-клетках поджелудочной железы через снижение уровня восстановленных тиолов, необходимых для синтеза инсулина [343]. По-видимому, аналогичным действием обладает и ОТ, который достоверно снижает тканевое содержание быстрореагирующих SH-групп [141]. Введение ОТ in vivo интактным крысам (6 дней – по 4 мг/кг, на 7-й день – 200 мг/кг) сопровождалось падением уровня иммунореактивного инсулина в крови уже в первые 2 ч после завершающей нагрузки (с 19,4±3,5 ме/мл·10—3 в контроле до 11,2±0,8 ме/мл·10—3 в опыте; p<0,05) [21].

Идеология антикоферментного механизма лежит в основе многочисленных попыток вывести ОТ на орбиту практического использования в медицине. Перспективными считаются следующие области применения этого соединения: химиотерапия рака, где предполагается использовать цитостатическое действие ОТ [176], и коррекция аутоиммунной патологии – рассеянного склероза, где привлекают иммунодепрессантные эффекты ОТ [28].

Все эти эффекты, без сомнения, наличествующие в спектре биологического действия ОТ, по мнению авторов, реализуются следующим образом: первичное специфическое ингибирование ТК блокирует пентозофосфатный цикл, что приводит к прекращению поставки 5-фосфорибозилпирофосфата, необходимого для биосинтеза РНК (канцеростатическое и иммунодепрессантное действие). Однако можно легко показать, что вышеперечисленные сдвиги к антикоферментному механизму никакого отношения не имеют: канцеростатическим действием обладают ряд производных ОТ, которые не угнетают ТК [123]; иммунодепрессантное действие, т. е. инволюция вилочковой железы, имеющая место под влиянием ОТ [73], устраняется адреналэктомией [74], которая не реактивирует ТК [195].

Хотя in vivo и in vitro (в культуре клеток) ОТ может действовать как цитостатик, наподобие 5-фторурацила [123] или дыхательного яда [141], не исключается здесь и аллоксаноподобное действие [110]. Известно, что у аллоксандиабетических животных не удается перевить опухоли, а у животных-опухоленосителей введение аллоксана вызывает их обратное развитие [195]. Дело в том, что раковые клетки, содержащие на своей поверхности гораздо больше рецепторов инсулина, чем соматические [340], нуждаются в нем как в факторе роста [336]. Культуральные бессывороточные среды для пассажа раковых клеток обычно содержат инсулин [387]. В экспериментах на мышах Свисс и индийских песчанках показано, что диабет защищает их от опухолей печени и молочной железы, обусловленных канцерогенами [300].

Аналогичным образом обстоит дело и с аутоиммунной патологией. Увеличение клеточного пула активных лимфоцитов в крови зависит от триггерной роли инсулина, который инициирует переход G1 – S в их клеточном цикле [132]. Интересно, что лимфоциты экспрессируют на своей поверхности рецепторы к инсулину только при их активации [308]. В покоящихся клетках этих рецепторов либо вообще нет, либо их очень мало [308, 340]. Антигенная стимуляция (в том числе аутоантигенами) приводит к появлению гормональных рецепторов, что отражает процесс дифференциации клетки и свидетельствует о приобретении ею компетентности для ответа на стимулы, специфические для этих рецепторов [433].

Одной из характеристик вступления лимфоидных клеток в стадию покоя служит исчезновение рецепторов к инсулину. Инсулин предотвращает переход клетки в эту стадию [341]. Стимулирующий эффект инсулина проявляется прежде всего в отношении цитотоксических лимфоцитов [406], которые лимитируют аутоиммунный процесс. Гормон усиливает бластогенную реакцию на алло-антигены в смешанной культуре лимфоцитов [407]. Эти данные свидетельствуют о том, что инсулин является одним из ростовых факторов, поддерживающих лимфоидные клетки в состоянии высокой способности реагировать на антигенные стимулы [405]. У животных с хроническим аллоксановым диабетом описана атрофия вилочковой железы [397], где лимфоциты созревают и приобретают иммунокомпетентность. Следовательно, дефицит инсулина будет подавлять аутоиммунные реакции и, в частности, лимфоцитарную аутоагрессию в отношении нейронов головного мозга, что составляет патогенетическую основу рассеянного склероза.

В работах Н. Фабриса [178] отмечены иммунодефициты у молодых крыс с экспериментальным диабетом, вызванным удалением поджелудочной железы или введением аллоксана. Способность к синтезу антител в ответ на различные антигены у них сохранялась, тогда как клеточные иммунные ответы, такие, как реакция на фитогемагглютинин, реактивность смешанной культуры лимфоцитов и отторжение аллотрансплантата кожи были резко ослаблены. В лимфоидных тканях, особенно в тимусе и тимусзависимых областях, отмечалось уменьшение числа клеток. Кроме того, у этих животных было резко замедлено восстановление трансплантационного иммунитета, подавленного большими дозами кортизона. Активность иммунной системы у крыс с диабетом удавалось полностью восстановить инъекциями инсулина [178]. Многие метаболические эффекты ОТ снимаются адреналэктомией, что указывает на их опосредование действием стрессорных гормонов кортикостероидов и катехоламинов. Это касается активации фосфатаз, тиамин-пирофосфатазы, индуцирования вторичного гиповитаминоза B1 [139], инволюции вилочковой [74], щитовидной и половых желез [266]. Отсюда ясно, что стрессогенное действие ОТ необходимо учитывать при анализе перспектив его клинического использования. Для этого ОТ вводили крысам по схеме, имитирующей принятое в лечебной практике курсовое назначение препаратов: ежедневные подкожные инъекции по 12,5 мг/кг (эквивалент лечебной дозы [127]) через 3 ч и 100 мг/кг на ночь. Цель такого режима нагрузок состояла в том, чтобы поддерживать в организме животных на всем протяжении опыта эффективные концентрации ОТ. Результат опыта: через 8—10 сут у крыс появилась кровь в кале, а к концу второй недели эксперимента все животные погибли. На вскрытии обнаружены гипертрофия надпочечников, атрофия тимуса, многочисленные язвы желудочно-кишечного тракта, увеличение массы сердца. Следовательно, гибель животных наступила на фоне манифестации стресса и вероятной ее причиной была острая сердечная недостаточность [431].

Исходя из фактов противоположного влияния витамина и антивитамина на обмен веществ и механизмы его регуляции [127], легко предположить, что стрессогенное действие ОТ даже само по себе должно приводить к стероидозависимой иммуносупрессии, а обусловленные инсулином антистрессорные эффекты тиамина [430] – к иммунорегуляции.

Разноречивость приведенного материала не позволяет сделать акцентированное обобщение по иммуноактивности тиамина, но дает возможность обозначить приоритетные направления ее дальнейшего анализа. Отталкиваясь от фактов угнетения иммунных реакций у авитаминозных животных, сейчас более или менее определенно можно говорить только о вероятности иммуномодулирующего действия тиамина. Что касается причин иммуноактивности витамина В1, то имеющийся материал свидетельствует о большой проблематичности коферментного механизма влияния тиамина на иммуногенез in vivo (абсолютно несовместима с ним дозовая разнонаправленность эффектов), а это автоматически ставит вопрос о вероятности его опосредования.

Попытки объяснить иммуноактивность тиамина опосредующими влияниями предпринимались и ранее. Например, исходя из данных о снижении уровня ацетилхолина в нервной ткани В1-гиповитаминозных животных [27], некоторые авторы считают, что тиамин опосредованно через генерацию ацетил-КоА из углеводов участвует в синтезе ацетилхолина [38], который является активатором антителообразования [37]. Показано, что накопление ацетилхолина стимулирует пролиферацию иммунокомпетентных клеток [202], а блокада м-холинореактивной системы снижает интенсивность иммунной реакции [39]. Но данное мнение вряд ли можно признать корректным, поскольку, как и другие соединения, содержащие четвертичный азот, тиамин обладает ганглиоблокирующими свойствами.

В опытах с перфузией сердца показано, что тиамин является антагонистом ацетилхолина [223]. Этот антагонизм проявляется уже при относительно небольшой концентрации витамина В1 в перфузате (10—5 М) и возрастает при ее увеличении. Установлено, что в механизме антагонизма тиамина с ацетилхолином при их воздействии на сердце имеют место конкуренция за места связывания, угнетение синтеза медиатора и усиление его распада за счет активации холинэстеразы в сердце, причем решающую роль здесь играет тиаминовый блок н-холинорецеп-торов [361]. Следовательно, для ацетилхолинового механизма опосредования, по идее, больше подходит иммуносупрессорное, чем иммуностимулирующее, действие тиамина, а это уже противоречит большинству имеющихся фактов.

Учитывая вышеприведенные данные по окситиамину, наиболее перспективным направлением в плане расшифровки механизмов иммуноактивности тиамина может быть анализ его антистрессорных и инсулиногенных свойств.

5.1. Тиамин и стрессорная гипертрофия надпочечников

Феномен прижизненных флуктуаций размеров клеток и их ядер известен давно. Еще в 30-х годах ХХ в. В. Якоби выявил некую кратную функцию колебаний их объема. Подвергая вариационно-статистическому анализу большие массивы данных кариометрических исследований, он установил, что кривые распределения размеров ядер во многих случаях имеют несколько максимумов, абсолютные величины которых относятся друг к другу в пропорции 1:2:4:8 и т. д. На этом основании В. Якоби сделал вывод, что рост ядер, а следовательно, и клеток происходит путем многократного удвоения их объема [319, 320]. Так был сформулирован достаточно общий «закон ритмического роста клеток» или «закон ритмического удвоения объема ядер», отражающий, как оказалось позже, полиплоидизацию соматических клеток в процессе развития организма [321].

Однако вскоре выяснилось, что существуют и отклонения от этого закона, выражающиеся в иных пропорциях роста клеток, при которых вершины вариационных кривых занимают промежуточное положение между кратными максимумами, постулируемыми схемой Якоби [9, 79]. Поскольку подобные сдвиги кариограмм были зафиксированы при действии ультрафиолетовых лучей [442] и некоторых гормонов, Е. Вермель связал их с изменением функционального состояния клеток-мишеней.

Полемизируя с Е. Вермелем, В. Якоби пытался вначале объяснить обнаруженные оппонентами отклонения от ожидаемых величин объемов ядер наличием изменчивости ядер внутри одного класса [320], а позже тем, что изменения функционального состояния клеток все равно ведут к развитию полиплоидных клеточных элементов [321].

В свою очередь Г. Хертвиг предложил совершенно иной вариант объяснения, который заключается в том, что, по его мнению, в зависимости от функционального состояния клетки ее ядро может впитывать жидкость из цитоплазмы до тех пор, пока уже не объем, а поверхность ядра удвоится. Исходя из элементарных геометрических расчетов он показал, что при удвоении поверхности ядра его объем увеличится не в 2, а в  раза, что по отношению к двукратному объему ядер следующего класса составит: , т. е. в этом случае имеет место формирование промежуточного класса ядер с увеличением объема всего в 1,4 раза [311].

Эта идея нашла свое выражение и дальнейшее развитие в концепции о так называемом набухании и сморщивании ядер клеток при усилении и ослаблении их органоспецифической функции – выработка секретов и гормонов, нервная деятельность, мышечное сокращение и т. п. Согласно А. Беннингхофу, при усилении функциональной активности клеток белки их кариоплазмы подвергаются усиленному окислению и распаду, вследствие чего общее количество частиц в ядре возрастает, осмотическое давление повышается и объем ядра увеличивается на 30–40 % за счет насыщения кариоплазмы водой. Напротив, при угнетении жизнедеятельности клеток размеры частиц ядерных коллоидов увеличиваются, осмотическое давление внутри ядра падает, и ядро несколько уменьшается за счет отдачи воды в цитоплазму [224].

Если описанные флуктуации размеров ядра специализированной клетки носят функциональный характер и зависят от объема выполняемой ею работы, это означает, что они должны быть прямо связаны с функциональным циклом клетки (активность – покой), который определяется генетически детерминированными суточным и сезонным ритмами, а также частотой падающей на нее рабочей нагрузки. Действительно, уже давно известно, что у крыс и мышей ночью в период бодрствования ядра клеток печени [250], почек [335], коры надпочечников [385] и других тканей гораздо крупнее, чем днем, когда животные спят. Отмечены сезонные колебания величин ядер кортикоцитов у крыс [385] и морских свинок [263].

Исходя из того, что синхронизация суточных и сезонных биоритмов осуществляется стрессорными гормонами [17], которые выполняют роль своеобразного метронома биологических функций, можно было ожидать, что объем ядер клеток органов-мишеней должен ежечасно и сиюминутно лимитироваться напряженностью гормонального фона.

По данным Е. Тонуцци, активация гипофизадреналовой системы при моделировании стресса (голод, охлаждение, введение дифтерийного токсина и др.) приводит к резкому увеличению размера клеток пучковой зоны коры надпочечников и укрупнению их ядер. Угнетение этой системы путем экстирпации гипофиза дает противоположный эффект. У гипофизэктомированных животных аналогичные стрессорные раздражения уже не активируют адреналовые железы и соответственно не вызывают увеличения кортикоцитов и их ядер [423].

Сейчас твердо установлено, что острая стрессорная гипертрофия пучковой зоны коры надпочечников осуществляется за счет гипертрофии клеток, которая сопровождается ростом размера их ядер [424]. Увеличение объема ядер в большей степени коррелирует с нарастанием стероидогенеза, чем гипертрофия клеток, и поэтому используется в качестве морфологического маркера для оценки функционального состояния надпочечников [377]. У крыс при перегревании ядра кортикоцитов начинают увеличиваться уже через час после начала опыта, достигая максимума через 12 ч [337]. После однократной инъекции АКТГ гипертрофия ядер развивается через 6–9 ч [206].

Повышение функциональной активности коры надпочечников, как и других медленно обновляющихся органов, в которых отсутствует полиплоидия [190], приводит к увеличению среднего объема ядер кортикоцитов и к сдвигу вариационных кривых вправо [263, 385]. Согласно [71], распределение объема ядер по классам в пучковой зоне молодых и взрослых крыс на кариограммах представлено всегда одновершинными кривыми. Это свидетельствует о том, что все ядра клеток пучковой зоны являются диплоидными и что гипертрофия ядер с возрастом не сопровождается увеличением их плоидности. Одновершинный характер кривых распределения размера ядер в различных зонах коры надпочечников крыс и мышей описан многими авторами [314, 344]. Что касается полиплоидных кортикоцитов, то они обнаружены у коз [367] и белоногих хомячков [261].

В ряде работ, где проводилось прямое измерение уровня ДНК, была доказана диплоидность ядер кортикоцитов, причем введение АКТГ приводило к увеличению их размеров, но не изменяло характера плоидности [317, 389]. Развитие полиплоидных клеточных элементов в результате изменения их функционального состояния, что предполагал В. Якоби [321], здесь маловероятно, поскольку полиплоидия – это кратное увеличение полных наборов хромосом сверх диплоидного набора, а в принятых условиях обнаружена обратная зависимость между образованием стероидов и синтезом ДНК в надпочечниках крысы после стимуляции АКТГ [232]. Считается, что повышение внутриклеточной концентрации цАМФ под влиянием кортикотропина влечет за собой подавление синтеза ДНК и интенсификацию синтеза кортикостероидов [383].

Цитологические измерения в наших опытах производились в левом надпочечнике (правый использовался для электронномикроскопических исследований). В 10 часов утра сразу после декапитации крыс и извлечения надпочечников левый из них разрезали пополам, фрагменты маркировали и фиксировали в 10 % формалине. После спиртовой проводки, обезвоживания и заливки материала в парафин изготавливали гистологические срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином.

Кариометрия проводилась с помощью телевизионной измерительной системы для исследования биологических объектов, разработанной и изготовленной в НИИ физико-химических проблем при Белгосуниверситете, и компьютерной программы АСТА-5, основанной на принципе преобразования оптического изображения объекта с микроскопа в видеосигнал, который с помощью устройства ввода изображения оцифровывается и вводится в память ЭВМ для последующего выделения из него информации о геометрических параметрах объекта (периметр, диаметр, площадь, объем). В каждом наблюдении на дисплее обводились курсором 100 ядер кортикоцитов при увеличении объектива 20. Результаты компьютерной обработки исходной телеметрии ядер суммированы на рис. II-1, II-2, II-3.

Для изучения распределения спонгиоцитов с разным диаметром ядер нами условно выделено 5 групп клеток с 1 мкМ интервалом в размерах ядер. Таким образом к 1-й группе отнесены клетки с диаметром ядер до 4 мкМ включительно; ко 2-й – от 4 до 5 мкМ; к 3-й – от 5 до 6 мкМ; к 4-й – от 6 до 7 мкМ; к 5-й – клетки с ядром, превышающим 7 мкМ.

Итак, что же получилось? При моделировании иммобилизационного стресса по Г. Селье на высоте раздражения (экспозиция 24 ч) были выявлены типичные кариометрические признаки диплоидности кортикоцитов: одновершинность вариационных кривых объема ядер клеток пучковой и сетчатой зон коры надпочечников крыс и их сдвиг вправо относительно аналогичных кривых, построенных для контрольных животных (рис. II-1). Высота пиков увеличения размера ядер у иммобилизованных крыс была в 1,3–1,4 раза больше, чем у интактных животных. Как указывалось выше, такая пропорция увеличения размера, согласно геометрическим расчетам, свидетельствует об удвоении поверхности и характеризует активное функциональное состояние ядра [311]. По мнению О. Кириллова, в коре надпочечников, где все ядра являются диплоидными, функциональная гипертрофия представляет основную форму увеличения их объема [72].

Если стрессорное раздражение крыс проводилось на фоне введения тиамина (подкожные инъекции по 200 мг/кг за сутки до начала иммобилизации и за 2 ч до забоя животных), то, как видно из рис. II-1, ядра кортикоцитов укрупняются уже в значительно меньшей степени (увеличение всего в 1,15 раза по сравнению с контролем), а вариационные кривые их объема «дрейфуют» на кариограмме в обратную сторону, т. е. влево от кривых, характеризующих ситуацию при иммобилизационном стрессе данной экспозиции. Исходя из имеющихся в литературе данных о том, что изменение диаметра ядер в коре надпочечников, как правило, синхронизируется с изменением клеточных размеров [46], т. е. гипертрофия ядер является достоверным индикатором гипертрофии клеток [373], можно заключить, что витамин В1 уменьшает гипертрофию кортикоцитов при иммобилизационном стрессе.

Рис. II-1. Распределение групп спонгиоцитов пучковой зоны коры надпочечников крыс с разным диаметром ядер: 1 – до 4 мкМ; 2 – от 4 до 5 мкМ; 3 – от 5 до 6 мкМ; 4 – от 6 до 7 мкМ; 5 – выше 7 мкМ. А – контроль, Б – иммобилизационный стресс, В – тиамин + иммобилизационный стресс

Из данных, представленных на рис. II-2, следует, что степень гипертрофии ядер кортикоцитов в разные сроки опыта не была одинаковой. Прогрессивное укрупнение ядер имело место до 24 ч опыта, причем с большей скоростью нарастание их объема происходило в первой половине этого срока. В следующие сутки (между 24 и 48 ч) иммобилизации размер ядер уменьшался и вновь увеличивался к 72-му часу опыта. Волна гипертрофии ядер клеток коры надпочечников четко накладывается на фазы иммобилизационного стресса, обозначенные Г. Селье: до 12 ч – стадия тревоги, между 24 и 48 ч – стадия резистентности, после 48 ч – стадия истощения [411].

Рис. II-2. Динамика усредненных кариометрических параметров спонгиоцитов пучковой зоны коры надпочечников в различные сроки иммобилизационного стресса: 1 – диаметр ядер (в процентах к контролю), 2 – атипизм ядер (процент некруглых)

Динамика кариометрических сдвигов (рис. II-2) хорошо согласуется с динамикой 11-ОКС (рис. II-4) в процессе развертывания стрессорной реакции во времени. Это подтверждает известный тезис о том, что гипертрофия секреторных элементов коры надпочечников является мерой их функции [72]. Следовательно, можно согласиться с О. Кирилловым и в том, что фазовые колебания степени гипертрофии ядер при стрессе отражают фазовые колебания функциональной активности пучковой зоны [71].

Использованная нами компьютерная программа АСТА-5 на основании данных телеметрии ядра позволяла автоматически вычислять не только его основные кариометрические параметры, но и выявлять отклонения формы ядра от правильной окружности, т. е. признаки его атипии и полиморфизма. Фактически этот показатель, выраженный в процентах, отражает количество клеток с ядрами некруглой формы.

Как видно из рис. II-2, процент клеток с атипичными ядрами в пучковой зоне коры надпочечников имеет выраженную тенденцию к повышению в первые часы иммобилизационного стресса, которая устойчиво сохраняется до 12 ч и сходит на нет к концу первых суток опыта с тем, чтобы в последующие двое суток сформировать новую, уже гораздо более высокую волну с вершиной на 48 ч.

Рис. II-3. Влияние тиамина на динамику усредненных кариометрических параметров спонгиоцитов пучковой зоны коры надпочечников в различные сроки иммобилизационного стресса: 1 – диаметр ядер (в процентах к контролю), 2 – атипизм ядер (процент некруглых)

Зеркальный ход кривых 1, 2, представленных на рис. II-2, и их равноамплитудная реципрокная динамика, которая наиболее отчетливо проявляется начиная с 24 ч опыта, по всей вероятности, указывают на превращение гипертрофированных кортикоцитов с пузырько-видными ядрами в сморщенные клетки и наоборот. Действительно, колебания выбранного показателя ядерного атипизма во временной шкале опыта очевидно отражают динамику содержания компактных темных клеток с деформированным ядром в тех же гистологических препаратах, о чем свидетельствует практически полное совпадение кривых 2 на рис. II-2 и II-4 при их наложении друг на друга.

В принципе, судя по литературным данным [152], подобная метаморфоза возможна в рамках осуществления функционального клеточного цикла с периодической трансформацией крупных светлых клеток в мелкие темные и обратно, в зависимости от падающей на них рабочей нагрузки. Здесь смущают только два обстоятельства: первое – это генерализованный характер реакции на 24–48 – 72 ч опыта и второе – то, что она реализуется в фазу истощения стресса. Скорее всего эти обстоятельства обусловлены биологически целесообразным механизмом утомления кортикоцитов [22], защищающего их от функционального перераздражения и тотальной деструкции, путем массового выключения из секреторного акта. К утомлению секреторных элементов коры надпочечников, морфологическим маркером которого может быть максимальное набухание клеток и соответственно их ядер к 24 ч опыта (рис. II-2, кривая 1), очевидно, приводит фатальная активация стероидогенеза в конце фазы резистентности (рис. II-4).

Рис. II-4. Динамика содержания 11-ОКС в крови (1) и процент темных клеток (2) в пучковой зоне коры надпочечников крыс в различные сроки иммобилизационного стресса

Защитный эффект утомления демонстрируется приростом уровня 11-ОКС в крови (рис. II-4), а также увеличением размеров ядер к 72 ч опыта (рис. II-2, кривая 1), т. е. восстановлением пула более крупных (умеренно темных и светлых) кортикоцитов в пучковой зоне, за счет пропорционального уменьшения темных клеток (рис. II-4), объективным показателем трансформации которых является синхронное снижение количества атипичных ядер (рис. II-2, кривая 2).

Отмеченный выше феномен уменьшения гипертрофии ядер в клетках пучковой зоны коры надпочечников при стрессе под влиянием витамина В1 (рис. II-1) становится более отчетливым при отслеживании этого эффекта в динамике развития реакции напряжения. Из рис. II-3 видно, что кривая 1, отражающая колебания размеров ядер во временной шкале опыта, имеет несколько важных отличий от аналогичной кривой, полученной при иммобилизационном стрессе без применения тиамина (рис. II-2). В первой трети опыта (до 24 ч) ее амплитуда существенно ниже, чем у иммобилизованных крыс, во второй трети (24–48 ч) кривая имеет тенденцию к росту, в то время как у крыс, не получавших тиамин, кариометрические параметры ядер стремительно падают, и, наконец, в последней трети (48–72 ч), когда в группе сравнения ядра кортикоцитов снова укрупняются, здесь их размеры только еще начинают снижаться. Следовательно, тиамин не только уменьшает степень гипертрофии кортикоцитов, но и на сутки отодвигает наступление критической фазы развития иммобилизационного стресса.

Из сравнения рис. II-3 и II-4 видно, что полученные разными способами функциональные характеристики поведения кортикоцитов в принятых условиях опыта совпадают: динамика изменений объема их ядер отчетливо дублирует сдвиги в уровне 11-ОКС в крови и в обоих случаях амплитуда этих флуктуаций значительно меньше, чем у животных, не получавших тиамин (рис. II-2 и рис. II-4), что морфологически и биохимически подтверждает факт его антистрессорного влияния. Тиамин увеличивает в пучковой зоне пул темных клеток (рис. II-4) с атипичными ядрами (рис. II-3), который, очевидно, служит функциональным резервом коры надпочечников, что позволяет железам дольше выдерживать рабочие перегрузки в условиях иммобилизационного стресса, отодвигая наступление его критической фазы.

Большинство авторов, изучавших ультраструктуру спонгиоцитов в динамике истощающего стресса, как правило, анализируют сдвиги на уровне внутриклеточных структур, лимитирующих гормоносинтез. При этом набухание митохондрий, утрата их целостности и кристного материала, вакуолизация эндоплазматического ретикулума и последующее исчезновение его канальцев, изменение объемных плотностей соответствующих органелл и т. п. часто оцениваются как издержки функционального перенапряжения секреторных элементов, проявляющиеся деструкцией морфологического субстрата. Однако такие оценки не учитывают возможных колебаний количественных параметров или тонкого строения органелл в зависимости от особенностей их функционального состояния и гетерогенности пула клеток пучковой зоны. Совершенно различные по виду органеллы могут быть абсолютно нормальными компонентами внутренней среды спонгиоцитов, находящихся в разных фазах клеточного цикла. Поэтому здесь вряд ли можно говорить об дезинтеграции или деструкции инфраструктуры клеток, но и вообще не имеет смысла отслеживать какую-либо усредненную динамику ультраструктурных сдвигов тех или иных внутриклеточных органелл в процессе развития стрессорной реакции, так как, в лучшем случае, в принятых условиях можно получить информацию о преобладании того или иного типа клеток.

На рис. II-4 представлены результаты подсчета количества темных клеток в пучковой зоне коры надпочечников и измерения уровня 11-ОКС в крови крыс при моделировании истощающего иммобилизационного стресса по Г. Селье.

Четкая обратная корреляция (зеркальность) кривых начиная с 1-го часа иммобилизации, очевидно, отражает известную реципрокность функции (работы) и пластики (восстановления), поскольку темные клетки фактически выключаются из активного стероидогенеза [22].

Особенно интересен процесс формирования волны темных клеток пучково-сетчатой зоны коры надпочечников в терминальный период стресса (фаза истощения), где вначале после суточной иммобилизации они почти полностью исчезают из поля зрения, затем через двое суток начинают в нем доминировать, а к третьим суткам опыта их количество снова снижается до исходного уровня. Пикантность ситуации заключается в том, что фактически эта динамика явно противоречит основополагающему постулату концепции Г. Селье об истощении как логическом финале стресса. Действительно, какое может быть истощение при таком громадном росте функционального резерва секреторных элементов, каковым в коре

надпочечников являются темные клетки. Массовое появление темных клеток обычно связывают с дегидратацией тканей. Обезвоживание организма животных в динамике иммобилизационного стресса по Г. Селье является твердо установленным фактом [400].

Однако волновая динамика, т. е. подъем, а затем снижение содержания темных клеток в коре надпочечников на фоне прогрессирующей дегидратации в терминальной фазе стресса [22], заставляет искать другие объяснения этому феномену. Исходя из результатов электронномикроскопического исследования желез и типажирования спонгиоцитов по их ультраструктуре в принятых условиях, где к 24-му часу опыта выявлен значительный рост числа просветленных клеток, к 48-му часу – мозаичных и темных, а к 72-му часу – умеренно темных и светлых, можно предположить, что появление темных клеток обусловлено генерализацией процесса утомления секреторных элементов [22] в результате предшествующей мобилизации всех наличных функциональных ресурсов желез для обеспечения повторного всплеска стероидогенеза, который имел место к концу первых суток экспозиции стресса. Утомление – это защитный механизм, с помощью которого клетки коры надпочечников удерживаются на орбите жизненного цикла и тем самым предохраняются от тотального разрушения в условиях истощающих рабочих нагрузок [22]. Утомление – это преходящее функциональное состояние просветленных клеток, которые затем последовательно трансформируются в мозаичные – темные – умеренно темные и, наконец, светлые клетки, которые не только полностью восстанавливают исходную ультраструктуру, но и способны снова включаться в секреторный акт, что обеспечивает некоторый подъем уровня 11-ОКС в крови к 72-му часу опыта по сравнению с предыдущим сроком (рис. II-4).

Защитную роль утомления секреторных элементов коры надпочечников [22] логически трудно совместить с предагональным состоянием животных в терминальном периоде иммобилизационного стресса. Поэтому правомочность такой постановки вопроса необходимо было доказать адекватным гарантированным внеагональным экспериментом с предварительным утомлением спонгиоцитов и последующим наслоением на него стандартной истощающей нагрузки. Для моделирования подобного состояния мы использовали стрессогенные свойства витамина РР [20]. Ранее было показано, что активация гормонообразовательной функции коры надпочечников под влиянием никотинамида носит дозозависимый характер, по динамическим параметрам не отличается от аналогичного действия экзогенного АКТГ и реализуется по стрессорному механизму, что подтверждается ее отсутствием у гипофизэктомированных животных [20]. Исходя из этих данных, предполагалось, что, поддерживая постоянную рабочую нагрузку на надпочечники, систематическим введением достаточно большой дозы ниацина можно будет постепенно перевести спонгиоциты в режим утомления. Однако при анализе электронограмм надпочечников, полученных после однократного введения 200 мг/кг никотинамида, неожиданно выяснилось, что в пучково-сетчатой зоне явно нарастает содержание мозаичных клеток, которые наряду с просветленными являются морфологическими репликами состояния утомления. Это сразу минимизировало схему эксперимента, сведя ее до разовой нагрузки витамином РР.

Подсчет темных клеток выявил характерную динамику нарастания их количества в поле зрения с максимумом к 6-му часу и последующей его стабилизацией вплоть до 72 ч опыта (рис. II-5). Электронномикроскопически, начиная с 6-часовой экспозиции действия никотинамида, среди темных клеток преобладали мозаичные. Поскольку всплеск стероидогенеза в принятых условиях был относительно небольшим по амплитуде и непродолжительным по времени (максимум к 1-му часу и полная нормализация к 6 ч опыта), выявленное увеличение содержания темных клеток, которое в два раза превышает аналогичный подъем при гораздо более мощном иммобилизационном стрессе (рис. II-4), очевидно, должно объясняться не функциональным перераздражением секреторных элементов, а какими-то другими причинами, например метаболической перегрузкой спонгиоцитов при утилизации больших количеств никотинамида в железистой ткани [23].

Рис. II-5. Динамика содержания 11-ОКС (1) в крови и процент темных клеток (2) в пучковой зоне коры надпочечников крыс при однократном введении никотинамида

При воспроизведении у крыс истощающего стресса по схеме Г. Селье на фоне суточной экспозиции действия инъекции 200 мг/кг никотинамида выявлен четкий сдвиг вправо в динамике морфобиохимических проявлений его терминальной фазы. Состояние утомления секреторных элементов в коре надпочечников, связанное с исчезновением темных клеток и ростом числа просветленных, развивается не через 24 ч, как раньше (рис. II-4), а только через 48 ч. На сутки сдвинут и последующий всплеск количества темных клеток, где также преобладают мозаичные. Соответственно растянута во временной шкале опыта и динамика 11-ОКС в крови (рис. II-6).

В течение 72 ч истощающего стресса фактов гибели в группе животных, получивших накануне большую дозу витамина РР, не зафиксировано, в то время как в контрольной группе она составляла 50 %. Обусловленная никотинамидом отсрочка наступления фатальных событий в принятых условиях опыта свидетельствует о его защитной роли. Согласно представлениям Г. Селье о перекрестной адаптации, однократное применение стресс-реакции может предотвращать развитие некрозов миокарда и соответственно гибель животных [153]. По нашим данным, превентивная нагрузка животных большой дозой никотинамида (200 мг/кг), обладающего стрессогенным действием, существенно снижает развитие дистрофических процессов в морфофункциональном комплексе (капиллярное русло и эндокринная паренхима), обычно имеющих место при 72-часовой иммобилизации. Констатация защитного действия никотинамида, вызывающего массовое появление темных клеток, одновременно свидетельствует о том, что последние действительно представляют собой функциональный резерв секреторных элементов коры надпочечников, и означает, что они прошли полный цикл регенерации, который всегда реализуется через активацию генома и новообразование РНК – ДНК.

Рис. II-6. Влияние никотинамида на динамику содержания 11-ОКС в крови (1) и процент темных клеток (2) в пучковой зоне коры надпочечников крыс в различные сроки иммобилизационного стресса

Известно, что дозированным стрессом можно предотвратить развитие инфаркта миокарда [153], некроза переохлажденных тканей, аллергических реакций, адреналинового отека легких [86а]. Во всех случаях, когда действие добавочных неспецифических раздражителей (скипидар, формалин, электрический ток и др.) предшествовало влиянию патогенного раздражителя, наблюдалось резкое угнетение патологических процессов [86а, 153]. По мнению Г. Косицкого, неспецифический раздражитель определенной силы создает в центральной нервной системе очаг доминантного возбуждения, благодаря которому в большей или меньшей степени угнетаются остальные рефлекторные реакции организма, в том числе и рефлекторные компоненты всех указанных выше патологических процессов, что способствовало предупреждению их развития [86а].

Однако Г. Селье считает, что повышение резистентности и предотвращение развития патологических процессов в принятых условиях зависят от усиления генерации адаптивных гормонов в ситеме гипофиз – кора надпочечников, которые лимитируют устойчивость организма не только по отношению к действию этих же стрессоров (прямая резистентность), но и других патогенных раздражителей (перекрестная резистентность) [153]. Действительно, предварительное введение АКТГ повышает выживаемость животных и в значительной мере предотвращает деструктивные изменения секреторных элементов коры надпочечников при истощающем иммобилизационном стрессе [22]. Не вдаваясь в полемику между Г. Косицким и Г. Селье о том, чей вариант объяснения индуцированной резистентности предпочтительнее, в качестве исходной посылки примем оба (поскольку никотинамид обладает выраженным стрессогенным действием [23], то не исключено, что повышение устойчивости организма крыс к иммобилизации после массированной витаминной нагрузки может реализоваться либо через создание в центральной нервной системе очага доминантного возбуждения, либо через гуморальный механизм перекрестной адаптации) и попытаемся предложить еще один – антистрессорный.

Дело в том, что, применяя вместо никотинамида витамин В1 (инъекции по 200 мг/кг за 24 ч до начала опыта, затем через каждые сутки иммобилизации и последний раз – за 2 ч до забоя), обладающий антистрессорным действием (рис. II-7), можно добиться такого же полного выживания животных при 72-часовой экспозиции. Существенное ограничение тиамином стероидогенной реакции надпочечников при иммобилизационном стрессе автоматически снимает варианты объяснения повышения резистентности организма в принятых условиях, связанные с формированием превентивной доминанты [86а] или перекрестной адаптации [153]. Ранее было показано, что антистрессорные эффекты тиамина опосредуются инсулином, являющимся мощным стресслимитирующим фактором, который не только уравновешивает многочисленные метаболические эффекты стресс-гормонов, но и тормозит их образование в надпочечниках [18].

Рис. II-7. Влияние тиамина на динамику содержания 11-ОКС в крови (1) и процент темных клеток (2) в пучковой зоне коры надпочечников крыс в различные сроки иммобилизационного стресса

Тиамин активирует инсулинсинтетическую функцию поджелудочной железы, повышает уровень иммунореактивного инсулина в крови при стрессе и оказывает выраженное инсулиноподобное действие на обмен веществ, в том числе и в отношении процессов, являющихся маркерными на действие инсулина [22]. В свою очередь, инсулин, снижая соотношение цАМФ/цГМФ в секреторных элементах коры надпочечников, блокирует их органоспецифическую функцию и одновременно через описанный выше механизм переключения генетического триггера дифференцированных клеток активирует аутосинтетические гены, обеспечивающие постсекреторную реабилитацию, т. е. превращение светлых кортикоцитов в темные.

Обычно повышенный уровень иммунореактивного инсулина в крови в ответ на стрессорное раздражение несколько запаздывает по сравнению с «выходом» пика кортикостероидов и является непродолжительным [23]. Тиамин способствует временной синхронизации максимумов гормонообразования в коре надпочечников и инсулоцитах при стрессе [23], тем самым определяя синфазную динамику нарастания в первые часы иммобилизации 11-ОКС в крови и темных клеток в эндокринной паренхиме адреналовых желез (рис. II-7).

Из сравнения данных, представленных на рис. II-4, II-6 и II-7, видно, что через повышение уровня темных клеток тиамин, как и никотинамид, «отодвигает» наступление драматических событий в морфодинамике эндокринной паренхимы при иммобилизационном стрессе (сдвиг вправо по временной шкале опыта).

Зависимость защитного эффекта от глубины реакции напряжения, т. е. степени раздражения секреторных элементов коры надпочечников, и величины дозы вводимого витамина исследовалась на модели мощного болевого стресса. Венозный гемостаз, развивающийся в дистальном участке хвоста крысы после наложения мягкой проволочной лигатуры (не сдавливающей артерии), является сильнейшим раздражителем гипофизадреналовой системы. Об этом свидетельствует не только нарастающее во времени возбуждение животных, приводящее обычно к «отгрызанию» (ампутации) перевязанного участка хвоста, но и более чем четырехкратная активация стероидогенеза к 24-му часу опыта (рис. II-8). Чтобы вызвать сколько-нибудь ощутимое ограничение стероидогенной реакции в принятых условиях, нужны по крайней мере две последовательные инъекции тиамина по 4 мг/кг за 48 и 24 ч до забоя животных. При такой степени раздражения надпочечников разовой нагрузки витамином явно недостаточно. Защитная роль тиамина особенно отчетливо выявляется в условиях хронического эксперимента с неоднократным воспроизведением венозного гемостаза на все более проксимальных участках хвоста крысы. Из рис. II-9 видно, что в контрольной группе животных после наложения 7-й лигатуры, т. е. спустя неделю от начала опыта, функциональные резервы надпочечников находятся на грани истощения. Железы уже неспособны ответить на наложение очередной (8-й по счету) лигатуры таким же резким увеличением стероидогенеза, как на первую. Из сравнения рис. II-8 и II-9 следует, что одинаковое стрессорное воздействие в конце опыта стимулирует функцию надпочечников всего на 50 %, т. е. в 8 раз меньше, чем в начале. Ежедневное парентеральное введение тиамина в течение всего эксперимента заметно препятствует истощению функциональных резервов желез.

Рис. II-8. Влияние тиамина на стероидогенную реакцию надпочечников крыс при мощном болевом раздражении. Значения М±m для кортикостероидов крови (а – мкмоль/л) и надпочечников (б – мкмоль/кг). 1 – контроль, 2 – стресс, 3 и 4 – стресс на фоне однократного и двукратного введения тиамина

Рис. II-9. Влияние тиамина на функциональные резервы коры надпочечников при длительном мощном болевом раздражении: 1 – контроль, 2 – стресс, 3, 4 – стресс на фоне семидневного введения тиамина в дозах (мг/кг) (3 – 0,2, 4 – 0,5), 5 – 1,0, 6 – 2,0, 7 – 4,0

Защитный эффект тиамина отчетливо зависит от дозы: чем больше вводилось витамина, тем выше секреторный ответ надпочечников на стрессорное воздействие в конце опыта. Так, в аналогичных условиях раздражения степень увеличения функциональной активности надпочечников у крыс, получавших 4 мг/кг тиамина, оказалась в 1,5 раза выше, чем у животных, которым витамин не вводился. Вместе с тем дозозависимость сдвигов и отсутствие плато, т. е. неуклонное нарастание защитного эффекта в широком диапазоне применявшихся концентраций тиамина (рис. II-9), указывают на наличие неиспользованных резервов биологического действия витамина, которые, очевидно, могут быть реализованы при дальнейшем увеличении его дозы. Сохранение к концу опыта определенного запаса функциональной емкости желез у животных, получавших тиамин, может рассматриваться как прямое доказательство тезиса о предохранении витамином секреторных элементов коры надпочечников от функционального перераздражения в условиях стресса.

5.2. Тиамин и инволюция тимуса при стрессе

Знаменитая триада морфологических проявлений стресса Г. Селье: увеличение веса надпочечников – инволюция тимуса – лимфопения не только свидетельствует о тесной интеграции гормонального и иммунного гомеостатов в реализации «Общего адаптационного синдрома» [153] при развитии реакции напряжения, но и может служить своеобразной тест-системой для оценки иммунопротекторного действия различных антистрессорных препаратов. Введенное Г. Селье в научный обиход понятие «инволюция тимико-лимфатического аппарата» учитывает особую чувствительность тимуса и лимфоцитов периферической крови к повышенному содержанию гормонов надпочечников [154]. Согласно наиболее распространенной гипотезе, снижение массы и клеточное опустошение тимуса при стрессе связано с увеличением секреции корой надпочечников стероидных гормонов, вызывающих распад лимфоцитов и угнетение метаболических процессов в клетках тимуса с последующим длительным нарушением процессов пролиферации [280, 398, 400, 401].

Констатирующая часть гипотезы фактологически безупречна, поскольку при воспроизведении апробированной Г. Селье модели иммобилизационного стресса (фиксация крыс в положении на спине) к 72-му часу опыта тимус животных действительно теряет 2/3 своей массы (рис. II-10), что сопровождается столь же экстенсивным уменьшением содержания клеток в органе [57].

Рис. II-10. Инволюция вилочковой железы в динамике хронического стресса до (○) и после () введения тиамина. По оси абсцисс – срок наблюдения; по оси ординат – масса тимуса, мг

Роль стероидных гормонов коры надпочечников здесь очевидна, поскольку у гипофизэктомированных и адреналэктомированных крыс тимолитический эффект иммобилизационного стресса не воспроизводится [31, 41]. Тезис о гормональнообусловленном нарушении пролиферации в органе на первый взгляд тоже выглядит вполне правдоподобно: на гистологических препаратах тимуса при стрессе, вызванном иммобилизацией, пикнотичные и лизированные клетки выявляются уже через 3–6 ч опыта [54]. Кроме того, известно, что глюкокортикостероиды служат «исполнителями» так называемой «индуцированной активации клеточной смерти лимфоцитов» – AICD (activation-induced cell death), которая является вариантом апоптоза лимфоцитов, закономерной гибели однажды активированных клеток [429].

Синтетическую активность клетки отражает параметр α – характерное для нее отношение односпиральных к двухспиральным нуклеиновым кислотам [67]. Параметр α был достаточно информативен при исследовании синтетической активности разнодифференцированных клеток тимуса лейкозных мышей [199]. Двухспиральные молекулы нуклеиновых кислот (ДНК), обладающие большей, чем односпиральные, устойчивостью к повреждающим факторам и предназначенные для хранения информации, неактивны в синтетическом отношении. Процесс реализации информации в виде синтеза тех или иных эффекторных белков в клетке всегда сопряжен с появлением активных в синтетическом отношении односпиральных нуклеиновых кислот, которые могут быть представлены как «расплетенными» односпиральными участками ДНК, доля которых составляет 5 % от односпиральных молекул нуклеиновых кислот, так и молекулами РНК.

Таким образом, в полностью неактивной в синтетическом отношении клетке нуклеиновые кислоты представлены в основном двухспиральными нуклеиновыми кислотами (ДНК) и характеризуются низким значением параметра α. Активация синтетических процессов в клетке неизбежно приводит к повышению величины параметра α либо за счет появления «расплетенных» участков ядерной ДНК при активации генома клетки, либо за счет накопления различных форм РНК, либо за счет обоих этих факторов, которые приводят к «включению» белок-синтезирующего конвейера [67]. Этот вывод подтверждается результатами работ [30], в которых было показано, что величина параметра α была пропорциональна количеству рибосом, входящих в состав синтезирующих белки полисом. Распад полисом на моносомы без изменения общего количества рибосом приводит к резкому уменьшению величины параметра α.

Используя информативность параметра α как критерия синтетической активности клеток, можно было легко проверить предположение о стрессиндуцированном блоке пролиферации тимоцитов. Для этого, учитывая гетерогенность клеточного пула тимуса (20 % составляют пролиферирующие Р-клетки диаметром 8—14 мкм и 80 % – непролиферирующие Q-клетки диаметром 4–8 мкм [54]), мы изучили профиль распределения тимоцитов по величине с одновременной регистрацией уровня синтетической активности в них по соотношению РНК/ДНК (параметр α) у крыс во временной динамике иммобилизационного стресса.

Из рис. II-11 видно, что в пуле непролиферирующих Q-клеток тимуса (диаметр менее 8 мкм) соотношение односпиральных и двухспиральных нуклеиновых кислот не изменяется во все сроки опыта, в то же время пул пролиферирующих Р-клеток (диаметром более 8 мкм) отвечает на раздражение (иммобилизация) не понижением, а повышением параметра α в терминальной фазе стресса. Следовательно, говорить о стрессиндуцированном блоке пролиферации тимоцитов в принятых условиях опыта не приходится. Определение степени деградации ДНП (в лимфоидных тканях большая часть массы ДНК связана с белками в виде дезоксирибонуклеопротеида и лишь небольшая ее часть находится в свободной солерастворимой форме), проведенное ранее [55], показало, что целостность ДНП тимоцитов на протяжении исследованного промежутка времени иммобилизации крыс сохраняется.

Рис. II-11. Соотношение РНК/ДНК (параметр α) разных размерных классов на мазках-отпечатках тимуса в динамике иммобилизационного стресса до и после введения тиамина

Эти данные свидетельствуют о минимальном вкладе распада тимоцитов в опустошение тимуса при стрессе. Кстати, небольшое число пикнотичных и лизированных клеток всегда обнаруживается в тимусе интактных животных, что, очевидно, является результатом естественной убыли тимоцитов за счет их функционального изнашивания. Существуют различные мнения о гистогенезе клеток в тимусе. Предположение о дифференциации клеток в направлении: большой лимфоцит – средний – малый не подтверждается экспериментальными данными. Согласно другой точке зрения, в тимусе имеются по крайней мере два независимо дифференцирующихся, т. е. невзаимодействующих по принципу обратной связи, суб-класса Т-лимфоцитов с различными фенотипами: Thy-1+, TL+ и Thy-1+, TL− [54].

Клетки первого фенотипа интенсивно обновляются и составляют, главным образом, популяцию Р-клеток, жизненный цикл которых завершается в самом тимусе – они не попадают в кровоток и не выявляются в периферических лимфоидных органах. Являются ли они предшественниками клеток второго фенотипа, неизвестно. Предполагается, что гистогенез тимоцитов осуществляется по следующей схеме: Р-клетка (фенотип ее неизвестен) пролиферирует и дифференцируется в клетки Q1 (Thy-1+, TL−, диаметр 5–7 мкм), которые выходят в циркуляцию. Часть Q1-клеток остается в тимусе и трансформируется в Р2-клетки фенотипа Thy-1+, TL+, которые, завершая цикл, дифференцируются в Thy-1+, TL− Т-клетки [54].

Увеличение параметра α, характеризующего синтетическую активность тимоцитов в терминальной фазе иммобилизационного стресса (рис. II-11), связано не с манифестацией пролиферации, а с изменением качественного состава клеточной популяции тимуса. Если в норме (контроль), в фазу тревоги (1—12 ч опыта) и фазу резистентности (24 ч опыта) иммобилизационного стресса тимус крыс на 80 % представлен Q-популяцией малых (4–8 мкм) лимфоцитов, то в начале фазы истощения (48 ч опыта) и ее конце (72 ч опыта) 80 % клеточного состава органа приходится на долю Р-популяции больших (8– 14 мкм) лимфоцитов (табл. II-1, рис. II-12).

Таблица II-1.

Относительное количество лимфоцитов разных размерных классов на мазках-отпечатках тимуса в зависимости от времени иммобилизации животных, не получавших тиамин и получавших тиамин

* Статистически достоверные различия с контрольными животными в группе.

Поскольку в контроле и опыте в мазках тимуса подсчитывали 100 произвольно выбранных клеток, находящихся в поле зрения, кардинальное изменение внутрипулового соотношения в пользу больших тимоцитов в терминальную фазу стресса, когда масса тимуса уменьшается на 2/3 (рис. II-10), однозначно свидетельствует о радикальном и пропорциональном сокращении доли малых.

Рис. II-12. Профиль распределения тимоцитов в мазках тимуса крыс по размерным классам в динамике иммобилизационного стресса до введения тиамина

Если стрессобусловленное изменение количества больших и малых тимоцитов представить в координатах – «клетки / время», то со всей очевидностью выясняется факт, что внутрипуловые сдвиги количества первых являются зеркальным отражением динамики вторых (рис. II-13).

Следовательно, в принятых условиях, т. е. при иммобилизационном стрессе, имеет место не изменение пролиферации, а клеточное опустошение органа за счет малых тимоцитов.

Пролиферативную активность тимоцитов, т. е. количество клеток (Nt), производимых в единицу времени, можно рассчитать по формуле [55]:

Nt = N0Imt / Tm,

где N0 – количество клеток в органе, Im – митотический индекс, Tm – среднее время митоза, t – время.

Рис. II-13. Профили содержания больших (> 8 мкм) и малых (< 8 мкм) тимоцитов в мазках тимуса крыс в динамике иммобилизационного стресса до и после введения тиамина

Суточная продукция клеток в тимусе крыс и мышей составляет 30–35 % от исходного количества – рекордный показатель для организма млекопитающих. На основании морфологического исследования и оценки интенсивности пролиферации теоретически рассчитано, что из тимуса крыс Wistar за сутки эмигрирует около 3 · 108 клеток [55]. Отсюда следует, что в норме основная масса новообразованных лимфоцитов эмигрирует из тимуса. Как известно, постоянство числа клеток в тимусе поддерживается двумя процессами – пролиферацией и иммиграцией клеток (притоком), с одной стороны, а также лизисом и эмиграцией (оттоком) – с другой.

Гистологическими методами было показано, что лимфоциты из коркового слоя тимуса вначале переходят в мозговой слой [394], где они линейно ориентируются вдоль сосудов [280], а затем поступают в кровоток [284]. Миграции способствует и анатомическое расположение сосудов в тимусе – артерии находятся в корковом слое, а вены – в мозговом [108]. Прямым подтверждением миграции лимфоцитов в кровоток является тот факт, что в венах тимуса морских свинок содержится большее количество клеток, чем в притекающей в орган крови, и эта разница увеличивается после введения животным глюкокортикостероидов [283].

Согласно расчетам, выполненным по кинетическим параметрам клеток тимуса крыс Wistar (митотический индекс – 8—10‰, время генерации пролиферирующих клеток – 8—10 ч, время обновления – 72 ч, средняя продолжительность митоза – 25–26 мин и др.), в первые 9—12 ч иммобилизации эмиграция тимоцитов увеличивается на 50–80 %. Количество клеток в тимусе в течение суток уменьшается на 35–40 % [55]. Из рис. ІІ-12 видно, что в процессе клеточного опустошения тимуса в фазу тревоги (1—12 ч) и фазу резистентности (24 ч) иммобилизационного стресса существенного изменения профиля распределения остающихся в органе клеток по величине не происходит. Это означает, что в первые сутки иммобилизации тимус покидают клетки всех степеней зрелости. Поскольку тимус на 90–95 % представлен клетками, иммунологические функции которых несовершенны, и только 5—10 % популяции составляют зрелые, дифференцированные, иммунологически компетентные клетки, можно заключить, что в кровоток поступают клетки, не завершившие «нормальной» дифференциации в органе [55].

В фазу истощения иммобилизационного стресса (48–72 ч) «подвижный» клеточный ресурс тимуса полностью отмобилизован и в органе остается только популяция «оседлых» тимоцитов, неспособная выходить в кровяное русло (рис. II-12).

Что касается регуляции процесса опустошения тимуса, то известна его зависимость от гормонов гипофизад-реналовой системы. По данным [31], адреналэктомия и гипофизэктомия полностью предотвращают убыль тимоцитов при воздействии стрессоров. Сопоставляя динамику содержания малых лимфоцитов в тимусе (рис. II-13) и динамику содержания 11-ОКС в крови крыс (рис. II-4), следует отметить идентичность (однонаправленность) сдвигов обоих показателей во все фазы иммобилизационного стресса. Факт дублирования стрессобусловленных ритмов изменения клеточного состава тимуса и секреции глюкокортикостероидов надпочечниками, указывающий на их взаимообусловленность (соподчиненность), прямо свидетельствует о гормональном контроле эмиграции лимфоцитов из тимуса. Следовательно, коррекция гормонального фона должна лежать в основе тимуссберегающих технологий профилактики стрессорных иммунодефицитов, поскольку не исключено, что все антистрессорные факторы могут оказывать органопротекторное действие на тимус при развитии реакции напряжения. Правомерность такого заключения можно проиллюстрировать на примере тиамина, который способен уменьшать амплитуду стероидогенной реакции надпочечников при иммобилизационном стрессе (рис. II-4). Антистрессорные эффекты тиамина аппроксимируются снижением скорости падения массы тимуса, т. е. величины клеточного опустошения органа (рис. II-10). На фоне введения тиамина даже в терминальной фазе стресса (48–72 ч иммобилизации) тимус крыс в какой-то мере сохраняет свой мобилизуемый клеточный ресурс.

Рис. II-14. Профиль распределения тимоцитов в мазках тимуса крыс по размерным классам в динамике иммобилизационного стресса после введения тиамина

Об этом свидетельствует нивелирование сдвигов параметра α, отражающего, как указывалось выше, соотношение пролиферирующих и непролиферирующих клеток в тимусе (рис. II-11), данные гистограмм распределения тимоцитов по величине, которые в отличие от контроля на стресс (рис. II-12) приближаются к норме (рис. II-14), а также динамика содержания в тимусе больших (8– 14 мкм) и малых (4–8 мкм) лимфоцитов во все фазы иммобилизационного стресса, которая четко отражает факт стабилизирующего влияния тиамина (рис. II-13).

5.3. Тиамин и стрессорная лимфопения

Механизмы регуляции функций иммунной системы связаны с рядом ключевых концепций эндокринологии. Так, катаболическая активность стрессорных гормонов в отношении лимфоидных органов – это, по-существу, механизм иммуносупрессии, а пролиферативная активность инсулина в отношении иммунокомпетентных клеток определяет механизм иммуномодуляции. На поверхности и внутри Т(В) – лимфоцитов, а также макрофагов обнаружены высокоаффинные рецепторы для стресслимитирующих (инсулин) и стрессреализующих (катехоламины, кортикостероиды) гормонов, а вторичные гормональные мессенджеры (цГМФ и цАМФ) одновременно являются положительными и отрицательными медиаторами их пролиферации.

Адекватность «эндокринологического подхода» к иммунологическим проблемам особенно ярко проявляется при анализе взаимоотношений стресса и иммунитета, которые Г. Н. Крыжановский рассматривал в неразрывной связи, как общебиологические категории, реализующиеся в ряде своих существенных проявлений сочетанно и друг через друга [90]. Исходя из этого, некоторые авторы оценивают иммунологические проявления стресса как патологию нейроэндокринной регуляции иммуногенеза [47].

В серии работ [47, 54] реакцию системы крови крыс на 6-часовой иммобилизационный стресс исследовали через 6, 9, 12, 24, 48 и 72 ч от начала опыта, т. е. фактически в период отдыха животных, где выявленные изменения клеточного состава довольно сложно интерпретировать как гормональнообусловленные, поскольку время возникновения наблюдаемых сдвигов в большинстве случаев синхронизируется не с максимумом гормональных перестроек, а с периодом послестрессовой нормализации уровня гормонов [86]. Особенно трудно в принятых условиях выявить катехоламиновую составляющую, поскольку повышение тонуса симпатической нервной системы и выделение адреналина из хромаффинной ткани всегда имеет место в самом начале развития стрессорной реакции [131].

В иммунологических экспериментах на мышах [84] животным после 3-кратного ежедневного 8-часового обездвиживания давали 3 дня отдохнуть, затем их забивали и исследовали способность Т-лимфоцитов селезенки к продукции ИЛ-2мРНК. В то же время известно, что при часовой фиксации кроликов в положении лежа на спине уровень 11-оксикортикостероидов в их крови увеличивается вдвое, а через 1 ч после прекращения раздражения падает до исходного [201]. Поэтому наблюдаемые разными авторами колебания гуморального и клеточного иммунитета, особенно в отдаленные сроки после воздействия, могут быть связаны не с предшествующим стрессорным эпизодом, а с физиологической (циркадной) ритмикой функционирования эндокринных желез [22] и органов иммунной системы [77].

Часто используемые в качестве аргументов поддержки тезиса о стрессзависимости сдвигов ссылки на известное катаболическое действие экзогенных кортикостероидов в отношении лимфоидной ткани здесь вряд ли уместны, поскольку индуцируемая в опытах in vitro и in vivo иммуносупрессия, как правило, лимитируется их эффективной концентрацией, т. е. проявляется при внесении гормонов в культуры клеток или при тестировании способности к ответу на митогены клеток, взятых после введения гормонов в организм, и зависит от дозы и времени аппликации по отношению к митогенной стимуляции [422].

Отсюда ясно, что для дифференцированной оценки влияния стресса на те или иные иммунологические показатели забой животных следует производить во время раздражения, а для учета фазового характера стрессорной реакции (0—12 ч иммобилизации крыс – стадия тревоги, 12–24—48 ч – стадия резистентности, 48–72 ч – стадия истощения [22]) наблюдаемые сдвиги требуют четкой «привязки» к ее временным координатам. Гормональную составляющую в стрессзависимой динамике иммуногенеза, очевидно, можно оценить только при сопоставлении соответствующих сдвигов во временной шкале опыта.

У людей и животных при психоэмоциональном, болевом, травматическом, операционном и других видах стресса подавление пролиферативной активности лимфоидных клеток и их ответа на митогены прямо зависит от выраженности и длительности раздражения [54, 86, 363], поэтому снижение реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) у больных рассматривается как плохой прогностический признак, свидетельствующий о глубоком иммунодефиците с перспективой развития септического состояния [347].

Результаты исследования влияния хронического иммобилизационного стресса на способность лимфоцитов периферической крови к пролиферации в ответ на митогенные стимулы приведены на рис. II-15—II-18.

Рис. II-15. Спонтанная пролиферация Т-лимфоцитов в крови крыс в динамике хронического стресса до (○) и после () введения тиамина. Здесь и на рис. II-16, II-17, II-18 по осям абсцисс – срок наблюдения; по осям ординат – количество импульсов в 1 мин, заштрихованные участки – доверительные границы нормы

Действительно, в стадии истощения (48 ч иммобилизации) синтез ДНК при культивировании лимфоцитов с митогенами снижается, что может свидетельствовать о развитии иммунодефицита. Однако в отличие от того, что описано в литературе, такое же снижение включения 3Н-тимидина в ДНК зафиксировано и в самом начале стадии тревоги (1 ч), где предполагалась стимуляция иммуногенеза [183], а к концу стадии истощения (72 ч) иммунодефицит не только не усугубляется, но исчезает совсем. Исходя из того, что при иммобилизации животных митогензависимые колебания РБТЛ дублируют динамику фоновой (спонтанной) пролиферации, можно предположить, что ФГА-, ЛПС– и РКW-лимитируемые сдвиги обусловлены не собственно механизмом иммуномодуляции (межклеточной кооперацией), а изменением в каждую фазу стресса количества митогенчувствительных иммунокомпетентных клеток крови, т. е. фактически определяются соответствующими сдвигами лимфопении.

Рис. II-16. ЛПС-реактивность Т-лимфоцитов в крови крыс в динамике хронического стресса до (○) и после () введения тиамина

Рис. II-17. PKW-реактивность Т-лимфоцитов в крови крыс в динамике иммобилизационного стресса до (○) и после () введения тиамина

Известно, что антигенная стимуляция иммуногенеза является функцией содержания лимфоцитов в крови. У ночных животных в утреннее и дневное время из центральных органов в периферическую циркуляцию идет интенсивная эмиграция лимфоцитов с высоким уровнем внутриклеточного метаболизма. В вечернее и ночное время интенсивность этих процессов значительно снижается. Соответственно и введение Т-зависимого антигена (эритроцитов барана) мышам утром и днем обусловливает более высокий уровень гуморального иммунного ответа, чем вечером и ночью [77].

В течение 48 ч иммобилизации животных в циркулирующей крови происходит уменьшение общего количества лимфоцитов (рис. II-21), которое к 72 ч опыта нормализуется.

Рис. II-18. ФГА-реактивность Т-лимфоцитов в крови крыс в динамике хронического стресса до (○) и после () введения тиамина

Повышение содержания нейтрофильных гранулоцитов отмечается в первые 12 ч иммобилизации, что соответствует данным литературы [31]. Адреналэктомия в принятых условиях опыта устраняет лимфопению, но не лейкоцитоз (рис. II-20), что подчеркивает стероидозависимость именно лимфоцитарной реакции. Однако несовпадение динамики РБТЛ с динамикой 11-ОКС (рис. II-15, II-16 и рис. II-18, II-19) свидетельствует о том, что циркуляторные эффекты гормонов коры надпочечников, очевидно, скорректированы влиянием стероидозависимых факторов с противоположным действием. Не исключено, что одним из них является мощный антистрессор – инсулин, биосинтез которого в инсулоцитах in vivo активируется кортикостероидами [83].

Характерно, что максимальное снижение общего содержания лимфоцитов крови (рис. II-21) и активности РБТЛ (рис. II-15, II-16, II-17, II-18) наблюдается в самом начале иммобилизационного стресса (1 ч – стадия тревоги), когда имеет место катехоламиновый блок α-рецепторов поджелудочной железы, приводящий к так называемому «диабету напряжения» [49, 131], и в его заключительной фазе (48 ч – стадия истощения) с развитием типичного «стероидного диабета» из-за функционального перераздражения инсулярного аппарата [5].

Рис. II-19. Стероидогенная реакция надпочечников в динамике хронического стресса до (○) и после () введения тиамина. По оси абсцисс – срок наблюдения; по оси ординат – содержание 11-ОКС в крови, мкМ/л.

Заштрихованные участки – доверительные границы нормы

На возможность инсулиновой корректировки стероидозависимой лимфопении и РБТЛ указывают данные по тиамину, который повышает уровень лимфоцитов в крови (рис. II-21) и их способность к пролиферации (рис. II-15, II-16, II-17, II-18) in vitro именно в те сроки иммобилизационного стресса (1 ч и 48 ч), где предполагается функциональный дефицит инсулина. Дело в том, что тиамин активирует инсулинсинтетическую функцию поджелудочной железы, повышает уровень иммунореактивного инсулина в крови при стрессе и оказывает выраженное инсулиноподобное действие на обмен веществ, в том числе и в отношении процессов, являющихся маркерными на действие инсулина [23]. Показано, что инсулинотропные эффекты тиамина наиболее четко проявляются на гипоинсулиновом фоне [18].

При анализе механизмов инсулиноподобного (иммуномодулирующего) действия тиамина, прежде всего, следует учитывать его антикатехоламиновый (1 ч) и антистероидный (48 ч) эффекты. Известно, что катехоламины усиливают миграцию Т-лимфоцитов в костный мозг [31, 54].

Рис. II-20. Содержание лейкоцитов в крови крыс в динамике хронического стресса до (○) и после () введения тиамина или после адреналэктомии (D). По оси абсцисс – срок наблюдения; по оси ординат – число нейтрофилов, в % от нормы

Миграционная способность лимфоцитов каким-то образом зависит от степени заполненности β-рецепторов на их поверхности катехоламинами [265]. На фоне блокирования β-рецепторов обзиданом введение адреналина уже не вызывает увеличения количества лимфоцитов в костном мозгу по сравнению с исходным его содержанием [54]. Поскольку число лимфоцитов в крови отражает только баланс между приходящими и уходящими из нее клетками, совершенно очевидно, что β-блокаторы будут нивелировать лимфопению.

Это относится и к тиамину, который усиливает действие обзидана, создавая условия, при которых адреноблокатор выигрывает конкуренцию за β-рецепторы эффекторных клеток у катехоламинов [23]. Как и другие соединения, содержащие четвертичный атом азота, он обладает ганглиоблокирующими свойствами и является антагонистом ацетилхолина [223]. Этот антагонизм проявляется уже при относительно небольшой концентрации витамина В1 в перфузате (10—5 М) и возрастает при ее увеличении. Установлено, что в механизме антагонизма тиамина с ацетилхолином имеют место конкуренция за места связывания, угнетение синтеза медиатора и усиление его распада за счет активации холинэстеразы, причем решающую роль здесь играет тиаминовый блок н-хо-линорецепторов [361].

В то же время, как и любой ганглиоблокатор, он выключает не только парасимпатические, но и симпатические узлы, вызывая синаптоанестезию [107], угнетение каротидных клубочков и хромаффинной ткани надпочечников, что приводит к уменьшению секреции катехоламинов и ослаблению их тропности в отношении эффекторных клеток-мишеней [100]. При внутривенном введении большие дозы тиамина оказывают выраженное депрессивное влияние на разных уровнях нервной системы: подавление возбудимости чувствительных нервных окончаний, блокирование проведения нервных импульсов через нервно-мышечные синапсы и ганглии, угнетение вазомоторных и других центров в центральной нервной системе, депрессию в ретикулярной формации [267]. Эти данные в значительной мере объясняют факт пермиссивного влияния тиамина в отношении проявления эффектов β-блокаторов, но не исчерпывают всех вариантов, поскольку его антикатехоламиновое действие может быть опосредовано и инсулином, который при парентеральном введении вызывает резкое снижение уровня катехоламинов сначала в венозной, а затем и артериальной крови [439].

Рис. II-21. Содержание лимфоцитов в крови крыс в динамике хронического стресса до (○) и после () введения тиамина или после адреналэктомии (∆). По оси абсцисс – срок наблюдения, по оси ординат – число лимфоцитов, в % от нормы

Согласно [54], стресс-реакция сопровождается фазовым изменением иммунореактивности. Начальный период характеризуется массовым перераспределением иммунокомпетентных клеток, снижением клеточного и гуморального иммунитета. Продолжительность и степень иммунодепрессии зависят от силы и длительности действия стрессора. После завершения стрессорного эпизода реституция показателей происходит в следующем порядке: раньше всего нормализуется количество циркулирующих лимфоцитов, затем восстанавливается реактивность на поликлональные митогены и, наконец, – ответ на антигенную стимуляцию. Считается, что при хроническом стрессе с нарастающей эффективностью раздражения период восстановления становится малозаметным или отсутствует вовсе и организм плавно переходит в состояние вторичной иммунологической недостаточности со стероидозависимой инволюцией лимфоидных органов [153].

Действительно, как видно из рис. II-10, через 72 ч иммобилизации животных масса тимуса у них уменьшается в три раза, что может свидетельствовать о развитии вторичного иммунодефицита. Но на этом аналогии с данными литературы заканчиваются, поскольку через 72 ч непрерывного раздражения, на фоне инволюции тимуса, которую вызывает истощающий иммобилизационный стресс, функциональные признаки иммунодефицита исчезают, лимфопения прекращается (рис. II-21), а пролиферативный ответ лимфоцитов на поликлональные митогены полностью восстанавливается (рис. II-15, II-16, II-17, II-18).

Биологический смысл этого парадоксального явления пока неясен. Можно лишь полагать, что данный факт отражает некую фазовость общего иммуннострессорного процесса, проявляющуюся даже в условиях непрерывного 72-часового раздражения, когда функции донора Т-клеток начинают выполнять другие иммунокомпетентные органы, например костный мозг, который в терминальную стадию стресса возвращает в кровоток накопленные им накануне лимфоциты, отмобилизованные тимусом[31]. Что касается гормональной составляющей, то здесь, по-видимому, уместны следующие допущения. Уменьшение лимфопении и восстановление активности РБТЛ в заключительной фазе истощающего стресса, очевидно, обусловлено антистрессорным действием инсулина, концентрация которого в крови животных в этот период повышается [131]. Инсулинозависимость и одновременно фазовость процесса подтверждают данные по тиамину, который способствует более раннему выхождению пика инсулина в крови при стрессе [18], соответственно сдвигая влево во временной шкале опыта его тропные эффекты в отношении циркулирующих лимфоидных клеток (рис. II-15, II-16, II-17, II-18 и II-21).

Само собой разумеется, что гормональная обусловленность иммуномодулирующего действия тиамина, которая логически вытекает из вышеприведенных материалов, должна быть подтверждена прямым изучением динамики уровня иммунореактивного инсулина в крови крыс в аналогичном опыте. Для объяснения фазового характера единого иммуннострессорного процесса, имеющего место при длительной иммобилизации животных, требуется расшифровка триггерного механизма регуляции иммуногенеза стресслимитирующими (инсулин) и стрессреализующими (катехоламины, кортикостероиды) гормонами.

5.4. Тиамин и генетический триггер лимфоцитов при стрессе

Наглядным примером тесной корреляции между дифференцировкой и делением лимфоцитов служит четкий инверсный ритм их суточной периодичности [77]. Наследуемый в соответствии с законом Г. Менделя о независимом распределении родительских признаков эндогенный ритм циркадных «волн митоза», или синхронного кариокинеза и дифференцировки, является очень устойчивым, однако циклическая природа роста и деления клеток позволяет им изменять степень синхронности с помощью внешних периодических сигналов, и этот триггерный тип поведения может объяснять в общих чертах суточные сдвиги митотической активности и синтеза ДНК, наблюдаемые в лимфоидном ростке крови.

В роли синхронизаторов биоритмов вообще и циркадного ритма митозов в частности могут выступать не только эффекторы дифференцировки – АКТГ, кортикостероиды, адреналин [232, 245, 302], но и эффекторы пролиферации – инсулин, тиреоидин, эстрогены [48, 349]. Биологический смысл реципрокной регуляции генома промоторами дифференцировки и пролиферации состоит не только в целесообразности дубляжа систем управления синхронизацией циркадных ритмов митоза, но и в ее гомеостатических функциях – стабилизации оптимального уровня деления клеток путем устранения апериодических возмущающих влияний противонаправленным действием на генетический триггер [22]. Факт осцилляций митотической активности тканей на разных этапах стресса был установлен еще Г. Селье, который указывал, что стадия тревоги характеризуется угнетением митотических делений, в стадии резистентности имеется обилие митотических фигур, а в стадии истощения их число снова уменьшается [153].

Поскольку фазовая пролиферация лимфоцитов крови крыс в динамике истощающего иммобилизационного стресса по Селье также является векторной функцией реципрокного плейотропного действия стрессреализующих и стресслимитирующих гормонов [104], было интересно оценить влияние на нее тиамина, который в отношении других эффекторных клеток-мишеней (гепатоциты, кардиомиоциты, кортикоциты) при аналогичном раздражении производил выраженный гомеостатический эффект [23].

Для анализа выделим следующие результаты, полученные при исследовании модели хронического стресса: во-первых, снижение пролиферативной активности лимфоцитов в первые 48 ч опыта (рис. II-15). Это соответствует данным литературы об иммуносупрессорном действии иммобилизационного стресса [86, 104]. Тиамин активирует включение меченого тимидина в ДНК на 1 ч и 48 ч опыта, что может быть оценено как проявление иммуномодуляции; во-вторых, повышение уровня 11-ОКС в крови в течение всего опыта, что, очевидно, является причиной иммуносупрессии (рис. II-19). Тиамин уменьшает амплитуду стероидогенной реакции, проявляет обычное свое антистрессорное действие, как и при любом другом виде стресса [23].

В-третьих, отчетливое дублирование колебаний пролиферативной активности лимфоцитов (рис. II-15) и осцилляций уровня ИРИ в крови крыс во все фазы иммобилизационного стресса (рис. II-22). Одинаковый синфазный ритм инсулиногенеза и синтеза ДНК в эффекторных клетках в динамике развития стрессорной реакции до и после нагрузок тиамином свидетельствует о том, что сдвиги пролиферации в обоих случаях – это инсулининдуцируемые изменения и что плейотропный эффект витамина В1 является гормональноопосредованным.

Рис. II-22. Содержание ИРИ (пкМ/л) в крови крыс в динамике хронического стресса до (○) и после () введения тиамина. По оси абсцисс – срок наблюдения, по оси ординат – единицы измерения. Заштрихованные участки – доверительные границы нормы. Достоверные сдвиги (р<0,05) обозначены звездочкой

Тиамин повышает инсулинсинтетическую функцию поджелудочной железы и оказывает выраженное инсулиноподобное действие на обмен веществ, в том числе и в отношении показателей, являющихся маркерными на действие инсулина [430]. Обусловленный тиамином сдвиг «влево» стрессорного ритма секреции инсулина (рис. II-22) и соответственно инсулинзависимого ритма пролиферативной активности лимфоцитов (рис. II-15), очевидно, связан с тем, что инсулинотропное действие витамина проявляется с наибольшей эффективностью, прежде всего на гипоинсулиновом фоне [23], в том числе на фоне «транзиторного диабета напряжения», который сопутствует стрессу [131].

Этот минимальный набор данных позволяет сформулировать рабочую гипотезу триггерного механизма, обсуждение которого целесообразно начать с уже детально изученного [215] клеточного цикла эукариот (фазы M, G0, G1, S и G2).

Во время прохождения клетками метаболического пути от М до М наблюдаются критические моменты, чрезвычайно важные для регуляции деления, – «точки ограничения R» [48]. Согласно [378], в момент R в клетках, находящихся в фазе G1, срабатывает специфический регуляторный механизм переключения из состояния покоя в состояние деления и обратно. Добавляя в среду различные гормоны, можно воздействовать на процесс деления клеток, который обеспечивается магистральным переключением всего типа обмена дифференцированных клеток на синтез биополимеров, необходимых для построения митотического аппарата. Последнее предполагает фундаментальную перестройку белкового спектра ферментов (за счет включения реципрокного механизма репрессии – дерепрессии синтеза ферментных ансамблей), определяющих новый тип обменной активности клетки, в том числе переключение энергии с одного русла на другое в интересах пролиферации [244]. Естественно, что подобное переключение возможно и в обратную сторону,т. е. в направлении дифференцировки клетки благодаря избирательному действию гормонов.

Приведенная на рис. II-23 схема перекрестной регуляции дифференцировки и пролиферации лимфоидных клеток крови крыс при стрессе фактически описывает генетический триггер, который в зависимости от природы и степени сродства управляющих сигналов может работать как рубильник-переключатель реципрокных оперонов, «перебрасывающий» жизнедеятельность системы из одного стационарного состояния в другое. Согласно [111], триггеры, т. е. системы, способные неопределенно долго находиться в любом из двух возможных устойчивых пограничных состояний, играют большую роль в механизмах биологической регуляции.

Настоящая модель учитывает представления о перекрестной регуляции дифференцировки и пролиферации по механизму обратной связи, который осуществляется при соединении эффектора с соответствующим репрессором функционального и митотического оперонов [111], кейлонную гипотезу [244], где важную роль в реализации механизма обратной связи, лимитирующего пролиферацию, играют циклические нуклеотиды (цАМФ) и стрессорные гормоны, а также данные о том, что инсулин и гидрокортизон являются соответственно индукторами пролиферации и дифференцировки клеток молочной железы [349] и могут разнонаправленно влиять на содержание цГМФ и цАМФ в лимфоцитах как in vivo, так и in vitro [86].

Рис. II-23. Гипотетическая схема функционирования генетического триггера лимфоцитов крови крыс при стрессе. ГR1 и ГR2 – генырегуляторы, R1 и R2 – репрессоры, R1цАМФ – комплекс R1+цАМФ, R2цГМФ – комплекс R2+цГМФ, О1 и О2 – операторы, СГ1 и СГ2 – структурные гены, Бп – белки пролиферации, Бд – белки дифференцировки, Е1 – аденилатциклаза, Е2 – гуанилатциклаза. Остальные пояснения в тексте

Стрессреализующие (адреналин – кортикостероиды) и стресслимитирующие (инсулин) гормоны, активируя мембранные или цитоплазматические рецепторы (S1 и S2), синергично с ферментами Е2 (аденилатциклаза) и Е1 (гуанилатциклаза) инициируют производство внутриклеточных посредников (циклические нуклеотиды). Далее в соответствии с концепцией оперона цАМФ – корепрессор синтеза Е1, соединяясь с репрессором R1, блокирует оператор структурного гена О1, препятствуя образованию мРНК1, мРНКП и митотических белков (РМ). А цГМФ – корепрессор синтеза Е2 вместе с R2 репрессирует синтез мРНК2, мРНКД и специфических функциональных белков (РД).

Динамика существенных переменных в этой симметричной модели триггера описывается следующей системой дифференциальных уравнений.

Изменение концентрации мРНК соответствует

Член А / (В + [Re]n) представляет собой скорость синтеза мРНК на ДНК, которая пропорциональна вероятности застать оперон свободным. Последняя, в свою очередь, лимитируется концентрацией свободного репрессора Re1. А и В – постоянные, зависящие от констант скорости реакции А = В = k—1/k1. Поскольку неактивный репрессор находится в избытке, n – концентрация активного репрессора будет пропорциональна количеству корепрессора в другой половине системы, которое, в свою очередь, пропорционально количеству фермента в той же половине системы. Тогда для n = 2 (n > 1 – условие триггерности исследуемой модели) получим:

Изменение концентрации ферментов описывается уравнениями

В любом из двух устойчивых состояний амплитуда триггера (отношение цАМФ / цГМФ) зависит в основном от интенсивности синтеза мРНК. Варьируя этот параметр, можно получить любое отношение специфических корепрессоров в стационаре. Для переключения триггера путем специфического (гормонального) сигнала необходимо хотя бы на очень короткий период изменить концентрацию соответствующего специфического вещества (корепрессора, фермента или мРНК) по меньшей мере во столько раз, какова амплитуда триггера. Далее система сама переходит в другой режим за счет механизма собственного подкрепления (реципрокное увеличение синтеза соответствующего корепрессора).

Представленная схема общего типа взаимодействия между указанными группами генов предельно упрощена, ее не следует понимать буквально, однако она решает поставленную задачу – позволяет рассмотреть динамическое поведение системы. Согласно схеме, гены связаны с различными клеточными функциями и со средой через специфические рецепторы, которые могут реагировать на гормональные сигналы и изменять внутриклеточное состояние. Связывание гормонального эффектора дифференцировки (стрессреализующие гормоны) с рецепторным аппаратом лимфоцитов вызовет увеличение в них уровня цАМФ и соответственно блокирование белков митоза, что может привести к новому стационарному состоянию с пониженной скоростью пролиферации и постепенному дрейфу системы в направлении дифференцировки. При этом в результате репрессии митотического оперона клеточного цикла и снижения уровня цГМФ, подавляющего вместе с R2 оперон дифференцировки, будет производиться все больше и больше цАМФ (и соответственно R1цАМФ), что в конце концов приведет к полному прекращению пролиферации и остановке клеточного цикла.

С другой стороны, связывание митогенных факторов роста (инсулин) с рецепторами клеточной мембраны через повышение в лимфоцитах уровня цГМФ будет с зеркальной точностью инициировать пролиферацию в ущерб дифференцировке.

О митогенной активности инсулина свидетельствуют следующие факты. На клетках печени показано, что действие инсулина можно воспроизвести с помощью бивалентных антител к его рецептору или их бивалентных фрагментов F(ab′)2-фрагментов, способных «сшивать» на поверхности клетки-мишени несколько рецепторов для этого гормона. Моновалентные Fab-фрагменты способны лишь блокировать связывание инсулина рецепторами, однако если восстановить бивалентность, добавив в среду инкубации еще антитела против Fab′-фрагментов, то снова обнаруживаются те же инсулиноподобные эффекты. Действие субоптимальных концентраций инсулина заметно увеличивается после добавления в среду антител к этому полипептиду [327]. Следовательно «сшивка» рецепторов имитирует и лимитирует эффект гормона.

Инкубация флуоресцентно меченого инсулина с лимфоцитами приводит к образованию на их поверхности «шапок» (cap) [399]. Такие же образования (caps) обнаружены при инкубации лимфоцитов с аналогично мечеными антителами к инсулиновым рецепторам. По данным Шлессингера, сразу после взаимодействия инсулина с клетками (в течение 1 с) в результате локальной агрегации образуются микрокластеры, невидимые под микроскопом, которые затем разрастаются до хорошо различимых флуоресцирующих пятен, содержащих сотни рецепторных молекул. В течение короткого времени от нескольких секунд до 10 мин процесс кластеризации охватывает всю клеточную поверхность и включает в себя движение гормонрецепторных комплексов на расстояние до нескольких микрон. Такая агрегация является обязательным условием для нормального протекания процессов интернализации [399].

Существенно, что инсулин сам способен регулировать экспрессию собственных рецепторов на поверхности лимфоцитов, лимитирующей пролиферацию [98].

Важность гормонального контроля пролиферации иммунокомпетентных клеток подчеркивает тот факт, что экспрессия инсулиновых рецепторов на лимфоцитах увеличивается при любой активации их клеточного цикла: в смешанной культуре [309], при использовании антигенов или поликлональных митогенов [433]. Методом проточной цитометрии установлено, что на разных фазах клеточного цикла стимулированные ФГА лимфоциты несут разное число рецепторов для инсулина – в фазе G0 – 35, в фазе G1a – 465, в фазе G1b – 5554 [433].

С помощью специфических антител против ФГА доказано, что этот лектин в отсутствие макрофагов «включает» только процесс выхода клеток из состояния покоя в цикл клеточного деления, что на языке символов может быть обозначено как (G0/G1) переход [132].

Считается, что in vivo инициирующим механизмом включения (G0/G1) перехода является физиологическая недостаточность данного типа клеток, при этом избыток одного из внешних факторов становится выше определенного критического уровня и инициирует цикл [42]. Сам по себе (G0/G1) переход обычно не приводит к пролиферации. Для ее запуска необходим дополнительный сигнал, включающий следующий и основной (G1/S) переход. Инициация S-фазы и включение механизма синтеза ДНК является результатом действия на клетку второго сигнала, который может быть представлен специфическими активирующими факторами или неспецифическими агентами, содержащимися в сыворотке крови [42].

Поскольку существуют веские экспериментальные доказательства включения (G0/G1) и (G1/S) переходов при импульсной активации гуанилатциклазы и (или) угнетении аденилатциклазы [236], становится очевидным, что роль первого и второго сигналов может выполнять один и тот же эффектор, например Кон-А, способный повышать уровень цГМФ в лимфоцитах. Данный лектин отличается настолько высоким сродством к рецептору инсулина, что Кон-А-сефарозу используют для выделения этих рецепторов [264], а его митогенная активность не зависит от присутствия макрофагов или их продуктов [434]. Последнее означает, что Кон-А «включает» оба перехода (G0/G1) и (G1/S), и его действие имитирует инсулиновый механизм активации пролиферации, так как осуществляется через «сшивание» инсулиновых рецепторов и активацию гуанилатциклазы [132]. Сукцинил-Кон-А, не обладающий митогенной активностью, предотвращает постмитотическую трансформацию фагоцитов в ранней фазе G1, что приводит к стабилизации фазы покоя.

Для деблокирования (G0/G1) перехода клеток в позднюю фазу G1 необходимо было отмыть их от сукцинил-Кон-А и добавить инсулин [358]. Отсюда не исключено, что в условиях организма этот гормон, в определенных концентрациях постоянно присутствующий в крови, может исполнять роль универсального митогена, имеющего двойную триггерную функцию в регуляции клеточного цикла лимфоцитов.

Регуляция пролиферации у эукариот осуществляется с помощью механизма строгого контроля, при котором определяющим фактором является равновесие двух антагонистов [276]. Они могут быть как внутриклеточными (цАМФ и цГМФ, катионы и анионы, различные реципрокные инициаторные белки для каждой фазы митотического цикла), так и внеклеточными (стрессорные гормоны и инсулин). На протяжении клеточного цикла концентрации цАМФ и цГМФ изменяются противонаправленно, что является основанием для утверждения о взаимном антагонизме этих циклических нуклеотидов. В большинстве случаев между концентрацией цАМФ и пролиферацией клеток была обнаружена обратная зависимость, а с содержанием цГМФ – прямая [204]. Монобутирильные производные цАМФ и цГМФ, которые хорошо проникают через клеточную мембрану, легко индуцируют отрицательную и положительную плейотропную реакцию в культуре фибробластов [393]. Экзогенный цГМФ даже в такой низкой концентрации, как 10—6 М, стимулирует не только пролиферацию, но и гидролиз цАМФ [364]. Из этого следует, что стрессорные гормоны и все физиологические факторы, способные повышать внутриклеточную концентрацию цАМФ (отрицательный сигнал) и (или) уменьшать концентрацию цГМФ (положительный сигнал), можно рассматривать как неспецифические ингибиторы пролиферации [204]. Естественно, что как активаторы пролиферации могут квалифицироваться все факторы, способные вызывать противоположные сдвиги, например инсулин, который устраняет контактное торможение и активирует клеточный цикл фибробластов через увеличение в них соотношения цГМФ/цАМФ с 0,18/22,0 до 2,00/17,0 [324].

К их числу, очевидно, принадлежит и тиамин, который усиливает положительное и снижает отрицательное плейотропное влияние внешних эффекторов, т. е. оптимизирует вклад инсулиногенной и стероидогенной составляющих иммобилизационного стресса в пролиферацию лимфоцитов, что может служить основанием для разработки соответствующего регламента тиаминопро-филактики и тиаминотерапии стрессорных иммунодефицитов.

5.5. Тиамин и ферментные маркеры генетического триггера гепатоцитов при стрессе

Триггеры, т. е. системы, способные неопределенно долго находиться в любом из двух возможных устойчивых состояний, играют большую роль в биохимической регуляции гомеостаза [192]. Функционирование триггерного механизма in situ можно оценить с помощью ферментных маркеров. Например, активность глюкозо-6-фосфатазы (Г-6-Фазы) печени у эмбрионов практически отсутствует, впервые она появляется в пренатальном периоде, затем резко возрастает в период рождения и остается на высоком уровне у взрослых животных, а активность гексокиназы, наоборот, максимальна у эмбрионов млекопитающих и снижается по мере онтогенетического развития [61]. При малигнизации ткани активность Г-6-Фазы падает, а активность гексокиназы (Гк) увеличивается пропорционально скорости роста опухоли [61]. Следовательно, первый фермент является маркером дифференцировки, а второй – маркером пролиферации. Сдвиги активности обоих ферментов лимитируются не их оборачиваемостью, а изменением массы ферментного белка, реализуемого через геном клетки [437] с помощью промоторов дифференцировки (адреналин, гидрокортизон [35]) и пролиферации (инсулин [4]). Предложенная Г. Вебером схема срочной и хронической адаптации данных ферментов [436] фактически описывает перекрестную регуляцию их синтеза и в этом смысле является аналогом генетического триггера Ф. Жакоба и Ж. Моно [111].

Известно, что активность Г-6-Фазы в печени у интактных мышей максимальна в темноте и минимальна в светлое время суток, когда функция надпочечников имеет соответственно максимальные и минимальные значения [212]. Поскольку в принятых условиях повышение уровня кортикостероидов в крови количественно соответствовало степени активации глюкозо-6-фосфатазы и включению [14С]-оротовой кислоты в общую РНК печени [18], можно допустить, что эта корреляция обеспечивается гормональной индукцией синтеза фермента. Согласно модели перекрестной регуляции генетических локусов, активация оперона дифференцировки автоматически блокирует оперон клеточного деления [245]. Действительно, по данным Ф. Халберга, время наибольшего количества митозов в эпидермисе уха и печени у мышей приходится на утренние часы, когда наблюдается анафаза суточного ритма кортикостероидов в крови, а наименьшего – на вечерние, что соответствует его акрофазе [303]. Существует представление, что в течение суток клетки беспрепятственно проходят все этапы подготовки к делению, но вследствие различного уровня энергетического обмена в организме в утренние и вечерние часы неодинаковое их количество вступает в митоз.

Ранее было замечено, что митотический индекс зависит от двигательной активности животных. Это наблюдение отражает известное правило – работа и деление клеток несовместимы [380]. Уровень энергетического обмена в свою очередь также зависит от двигательной активности, которая влияет на него через гормоны. По мнению В. Буллоу, последовательно развивавшего представление об определяющей роли глюкозы как энергетического фактора в делении клеток, стимулирующее или тормозящее действие гормонов на митозы связано с одной ключевой ферментативной реакцией, катализируемой гексокиназой, и осуществляется путем усиления или ослабления притока энергии в G2-периоде клеточного цикла, во время которого аккумулируется необходимая для митоза энергия [246].

Из приведенных данных следует, что Г-6-Фаза – это маркерный фермент дифференцировки, а гексокиназа – маркерный фермент пролиферации, функционирование которых генетически детерминировано реципрокным влиянием соответствующих промоторов (кортикостероидов или инсулина). В течение суток содержание гормоновиндукторов в крови, равно как и активность обоих ферментов в органах-мишенях, колеблется в противофазе друг к другу. Это полностью отвечает требованиям модели Ф. Жакоба и Ж. Моно [111] и, следовательно, может адекватно отражать ее функционирование in situ.

Исследования этой и других схем Ф. Жакоба и Ж. Моно, проведенные на аналоговой машине, показали, что для триггерной модели абсолютно исключен автокатализ и соответственно внутренняя колебательная неустойчивость. Переключение триггера из одного устойчивого состояния в другое всегда осуществляется внешним сигналом [155].

Описанный выше суточный ритм изменения активности гексокиназы и Г-6-Фазы отражает циркадные колебания гормонального фона крови [19], а функционирование данной ферментной системы в автоколебательном режиме невозможно даже по формальным соображениям. Дело в том, что в печени оба фермента могут взаимодействовать друг с другом, составляя типичный футильный (бесполезный энергозатратный) цикл, где угнетаются собственными продуктами:

Автор теории футильных циклов Е. Сельков считает, что когда концентрации АТФ и АДФ в клетке стабилизированы и относительная концентрация глюкозы много больше, чем Г-6-Ф, т. е. если

[Глюкоза] / K iГ-6-Фаза >> [Г – 6 – Ф] / KiГК, (2)

где Кi Г-6-Фаза и Кi ГК – константы ингибирования ферментов своими продуктами, то

VГК >> V Г-6-Ф (3)

и в этом случае синтезируется Г-6-Ф со скоростью

V = VГК – VГ-6-Фаза > 0. (4)

Когда относительная концентрация глюкозы много меньше относительной концентрации Г-6-Ф, т. е. если

[Глюкоза] / K iГ-6-Фаза << [Г – 6 – Ф] / KiГК, (5)

то процесс идет в обратную сторону и Г-6-Ф распадается со скоростью

V = VГК– VГ-6-Фаза < 0. (6)

Анализ взаимодействия гексокиназы и Г-6-Фазы, проведенный Сельковым, показал, что при неизменной концентрации глюкозы в среде и фиксированном состоянии углеводного обмена цикл (1) не только не может автономно (т. е. сам без внешних воздействий) переходить от состояния (2) к состоянию (5) и обратно, но даже активно сопротивляется любым изменениям. Действительно, любой прирост концентрации Г-6-Ф в системе при фиксированной концентрации глюкозы приведет к увеличению VГ-6-Фазы и уменьшению VГК, что будет противодействовать первопричинному повышению концентрации Г-6-Ф [156].

Из схемы (1) видно, что как только цикл перестает обмениваться хотя бы одним из субстратов со средой или углеводным метаболизмом, он стабилизирует максимально бесполезное состояние, где скорости встречных реакций равны друг другу

VГК = VГ-6-Фаза

и где фактически будет выполняться только эквивалентная АТФазная реакция:

Однако такой вариант работы футильного цикла in vivo вряд ли возможен, хотя бы потому, что печень выполняет функции гомеостата глюкозы крови. Постоянное соответствие скорости поглощения и высвобождения глюкозы печенью степени гипергликемии или гипогликемии объясняют результирующим эффектом работы двух функционально сопряженных ферментов – гексокиназы и Г-6-Фазы [372]. Преобладание активности одного из ферментов, объединенных в субстратный цикл, абсолютно необходимо для печеночных клеток, поскольку именно оно определяет направление потока глюкозы и соответственно уровень гликемии. Постулированные Е. Сельковым переключения нетто-тока субстратов, а также вывод о том, что сигналы, вызывающие перемену его направления, генерируются вне футильного цикла [156], уже сами по себе поддерживают триггерную схему регуляции взаимодействия гексокиназы и Г-6-Фазы в гепатоцитах, которая реализуется с помощью гормонов на генетическом уровне.

Функционирование генетически детерминированного триггерного механизма в печени, являющейся органом-мишенью действия кортикостероидов и инсулина, удобно исследовать на моделях с более или менее длительным изменением функционирования глюкозо-глюкозо-6-фосфат субстратного цикла (переключения 2–5 по Е. Селькову), которое достигается воспроизведением гипер– или гипофункции соответствующих эндокринных желез.

Ранее было показано, что при гиперкортицизме (7-дневное введение гидрокортизона) активность Г-6-Фазы в печени крыс достоверно повышается, а при гипокортицизме (7-дневная адреналэктомия) – снижается [18]. Хроническое перераздражение секреторных элементов коры надпочечников, которое имеет место при развитии истощающего иммобилизационного стресса по Г. Селье, вызывает монотонную активацию Г-6-Фазы в гепатоцитах (рис. II-24).

На этом фоне резким контрастом выглядит снижение активности фермента к 12 ч опыта, когда по расчетам Г. Селье наступает фаза резистентности иммобилизационного стресса, сопровождающаяся существенным уменьшением концентрации 11-ОКС в крови (рис. II-19). Особенно отчетливо этот сдвиг воспроизводится у крыс, получавших тиамин, который, обладая инсулиноподобным действием, способен самостоятельно уменьшать амплитуду стероидогенной реакции надпочечников при стрессе [18].

Рис. II-24. Содержание глюкозы (1), глюкозо-6-фосфата (2), активность гексокиназы (3) и глюкозо-6-фосфатазы (4) в печени крыс в различные сроки иммобилизационного стресса

Учитывая четко установленный механизм двойственного гормонального контроля синтеза ферментного белка, специфически расщепляющего Г-6-Ф [437] при анализе собственных данных, легко предположить, что изменение активности Г-6-Фазы в печени всегда зависит от несбалансированного усиления потока «плюс» (инсулиновой) или «минус» (кортикостероидной) информации к репрессору [61] соответствующего генетического локуса. С этих позиций труднее объяснить обнаруженные сдвиги на уровне гексокиназы, которая в отличие от глюкозо-6-фосфатазы не является гормониндуцибельным ферментом [122]. Действительно, при суточной экспозиции иммобилизации по Г. Селье активность ГК в печени стрессировавшихся крыс падает вдвое, а у животных, подвергавшихся аналогичному воздействию, но на фоне тиамина, она в такой же степени увеличивается (рис. II-25).

Рис. II-25. Влияние тиамина на содержание глюкозы (1), глюкозо-6-фосфата (2), активность гексокиназы (3) и глюкозо-6-фосфатазы (4) в печени крыс в различные сроки иммобилизационного стресса

Хотя считается, что ГК не контролируется инсулином [122], ее ингибирование и стимуляция в принятых условиях опыта фактически накладываются на однонаправленные колебания инсулинового фона: в конце фазы резистентности истощающего стресса (24 ч иммобилизации), когда отмечается повторный и уже критический всплеск стероидогенеза (рис. II-19), очевидно, имеет место развитие функционального стероидного диабета [329], а активирующее инсулиногенез действие тиамина особенно сильно проявляется как раз при гипофункции β-клеток поджелудочной железы [18]. Воспроизведение стимулирующего влияния тиамина на уровне независящей от него ГК также заставляет искать какие-то альтернативные варианты гормонального опосредования данного эффекта. В качестве исходных предпосылок здесь могут быть приняты во внимание следующие: 1) генетическая детерминированность сдвигов ГК (в оптимальных условиях определения активности фермента обнаруженные эффекты обусловлены изменением массы ферментного белка); 2) ГК – это маркер пролиферации [61]. В совокупности эти предпосылки выстраиваются в схему генетического триггера, где инсулин играет роль промотора пролиферации камбиальных элементов [4], а у дифференцированных клеток активирует аутосинтетические гены, обеспечивающие восстановительные биосинтезы (белков, липидов, углеводов) и внутриклеточную регенерацию. В обоих случаях инсулин «толкает» маятник генетического триггера клетки из одного устойчивого состояния в другое (работа – репарация) через снижение внутриклеточного уровня цАМФ, который, согласно

Б. Гудвину [35], блокирует оперон пролиферации (аутосинтетические гены). Гормональнообусловленное подавление активности аденилатциклазы и падение содержания цАМФ показаны для всех органов-мишеней [350], в том числе и для печени [27], где эффекты инсулина особенно ярко проявляются на фоне противоположного действия стрессорных гормонов [323].

В основе уникальной способности инсулина тормозить различные эффекты множества контринсулярных гормонов, очевидно, лежит механизм его разнонаправленного влияния на тканевую концентрацию цАМФ и цГМФ [18, 25, 171]. Считается, что реципрокные взаимоотношения цАМФ и цГМФ на клеточном уровне обеспечивают динамический контроль, т. е. «включение» и «выключение» внутриклеточных систем, претерпевающих при своем функционировании противоположно направленные сдвиги [294].

В порядке проверки предположения, что торможение тиамином избыточного гормонообразования в надпочечниках [18], опосредованное антистрессорными эффектами инсулина [218], может сопровождаться переключением генетического триггера в гепатоцитах [33], было проведено исследование динамики соответствующих маркеров на высоте мощного болевого раздражения крыс по Г. Селье [153]. Для этого в стандартных условиях моделирования стресса (подкожное введение 1 мл скипидара) и предварительной нагрузки тиамином (400 мг/кг на 24 ч) через каждые 15 мин от начала раздражения животных в крови измеряли содержание иммунореактивного инсулина, в ткани надпочечников – концентрацию кортикостероидов, а в печени – уровень цАМФ.

Из рис. II-26 видно, что при данном виде стресса гормонообразование в надпочечниках достигает наивысшего уровня уже через 15 мин от начала опыта, а содержание инсулина в крови – только к 30-й минуте (рис. II-27).

Рис. II-26. Содержание 11-ОКС (а – мкМ/кг) в надпочечниках крыс в динамике острого стресса до (1) и после (2) введения тиамина. Здесь и на рис. II-27, II-28 по осям абсцисс – срок наблюдения, по осям ординат – единицы измерения. Достоверные сдвиги (р<0,05) обозначены звездочкой

На фоне предварительного введения тиамина максимумы стероидогенной и инсулиногенной реакций совпадают по времени. Тиамин не только способствует более раннему увеличению концентрации инсулина в крови, но, что особенно важно, поддерживает повышенный уровень инсулинемии даже через 45 и 60 мин от начала опыта. Результатом этого является нормализация содержания цАМФ, устойчиво повышенного в печени стрессированных крыс (рис. II-28).

Исходя из того, что цАМФ – это мессенджер генетического триггера в эффекторных клетках [35], уменьшение его уровня в принятых условиях может говорить о выключении активности гетеросинтетических генов (оперон дифференцировки), контролируемых стрессорными гормонами [246], и реципрокном включении аутосинтетических генов (оперон пролиферации), контролируемых инсулином [4]. Об этом свидетельствуют факты ингибирования под влиянием тиамина Г-6-Фазы, являющейся маркером дифференцировки [436], и стимуляции гексокиназы (рис. II-25) – маркера пролиферации [430].

Рис. II-27. Содержание ИРИ (б – МЕ/л · 10—3) в крови крыс в динамике острого стресса до (3) и после (4) введения тиамина

Рис. II-28. Содержание цАМФ (в – пкМ/г) в печени крыс в динамике острого стресса до (5) и после (6) введения тиамина

Поскольку такое действие тиамина проявляется не только при гипокортицизме [18], но и на фоне активации стрессреализующих систем, это означает, что он включает достаточно мощный конкурентный по отношению к стрессорным гормонам механизм инсулиновой регуляции метаболического гомеостаза, на основании которого можно строить новую стратегию витаминокоррекции стресса в клинике.

6.1. Иммунный гомеостат и его регуляция

Проблема влияния стресса на иммунитет тесно связана с проблемой адаптации организма к постоянно меняющимся условиям среды обитания. Исследования регуляции нормального функционирования и формирования адаптивных реакций иммунной системы, очевидно, не могут быть успешными без анализа естественной периодичности биологических процессов, среди которых наибольший практический интерес представляют суточные ритмы, обусловленные чередованием света и темноты, режимом двигательной активности и питания [14, 307]. Известно, что целый ряд морфофункциональных показателей лимфоидной системы изменяется по типу циркадного ритма, причем эти колебания тесно связаны с суточным ритмом функционирования желез внутренней секреции – гипофиза и надпочечников [97, 135, 159],

т. е. по сути они являются гормональнообусловленными и реализуются, как и ритмы с длинным шагом (сезонные), по стрессорному механизму [17]. Согласно [307], циркадная организация иммунной системы представляет комплекс миграционных, пролиферативных, дифференцировочных и биохимических процессов, связанных метаболическими путями и обладающих эволюционно закрепленными ритмами с высокой степенью консервативности, но находящимися под регулирующим воздействием нейроэндокринной системы [64].

Циркадианная система у высших животных состоит из множества потенциально независимых осцилляторов, которые связаны друг с другом и сопряжены с внешней средой посредством циркадных ритмов в нервной и эндокринной системах [115]. Суточная периодичность функций иммунной системы априори находится под контролем нейроэндокринных осцилляторов, так как в самой системе иммунитета отсутствуют структуры, способные непосредственно воспринимать внешние ритмы чередования света и темноты. Поскольку внешними водителями (экзогенными времязадателями) циркадного ритма иммуногенеза служат такие стрессорные раздражители, как световой, пищевой и двигательный режимы [92], то не исключено, что главным синхронизатором, обеспечивающим восприятие (рецепцию) этих сигналов на организменном уровне, является гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая ось, которая занимает одно из центральных мест в общей циркадианной системе организма [115]. Такая вероятность вполне очевидна в свете имеющихся данных, что глюкокортикостероиды – основной фактор, лимитирующий иммунитет [52], а эндокринная функция тимуса и оси гипоталамус – гипофиз – надпочечники находятся во взаимосвязи, которая обеспечивает динамику иммунного ответа [304]. Другая эндокринная подсистема, которая могла бы претендовать на роль синхронизатора, – это ось гипоталамус – гипофиз – тимус [384]. С одной стороны, вилочковая железа как центральный орган иммунитета осуществляет специфическую регуляцию иммунных функций, а с другой – как эндокринный орган является неотъемлемой частью нейроэндокринной системы, где все железы внутренней секреции функционально взаимосвязаны. Таким образом, тимус может быть внутрисистемным синхронизатором, т. е. осциллятором второго порядка, передающим ритм центрального осциллятора функциям периферических структур иммунной системы [92].

Согласно сценарию [10], «реализация циркадных биоритмов иммунной системы предполагает следующую последовательность лимфоэндокринных взаимодействий в суточном цикле. В гипоталамусе как центральном осцилляторе нейроэндокринных функций формируется циркадный ритм рилизинг-факторов для тропных гормонов гипофиза. Этот ритм синхронизируется с суточным циклом внешними водителями (времязадателями), например чередованием света и темноты [106]. В период окончания физической активности (у крыс и мышей предрассветные и утренние часы суток) гипофиз продуцирует максимальное количество соматотропного и тиреотропного гормонов [440]. Повышается образование гормонов щитовидной железы, которые стимулируют эндокринную функцию тимуса [166]. Соматотропный гормон стимулирует пролиферацию тимоцитов, пик которой отмечается в утренние часы [180, 331]. Рост концентрации гормональных факторов тимуса стимулирует дифференцировку лимфоцитов, их рециркуляцию и миграцию. Увеличение уровня тимозина в крови, а затем и в структурах головного мозга стимулирует образование рилизинг-факторов для АКТГ в гипоталамусе и запускает функцию оси гипоталамус – гипофиз – надпочечники [304].

Во второй половине светового периода начинается усиленное продуцирование глюкокортикостероидов, стимулирующих миграцию лимфоцитов из тимуса. Активность миграции увеличивается во второй половине светового периода, достигает максимума в первой половине темнового периода, а к утру снижается. Это снижение может быть связано с предыдущим пиком концентрации глюкокортикоидных гормонов в плазме крови и минимумом продуцирования тимозина в конце светового периода. Повышение концентрации глюкокортикостероидов по принципу обратной связи тормозит секрецию АКТГ гипофизом, что приводит к снижению стероидогенеза в коре надпочечников во второй половине темнового периода, который совпадает с окончанием физической активности животных.

Миграция Т-лимфоцитов из тимуса и их расселение заканчиваются, чему способствует гормональный фон: минимальное содержание тимусных факторов и понижающийся уровень глюкокортикостероидов, находящихся в прямой коррелятивной связи с признаками миграции из тимуса. В предутренние часы усиливается образование рилизинг-факторов для тиреотропного и соматотропного гормонов в гипоталамусе и соответственно образование этих гормонов в гипофизе. В тимусе активируются пролиферативные процессы и гормонообразование и цикл повторяется снова [10]. Данный сценарий подчеркивает важную роль тимуса в оформлении хронобиологической структуры иммунитета эндокринной системой организма в составе гипоталамо-гипофизарно-тимусной оси, контролирующей продукцию гормонов и трансмиттеров, регулирующих иммунные функции [384].

Кроме того, тимус функционирует как лимфопоэтический орган, в котором происходят размножение и дифференцировка Т-лимфоцитов с последующей эмиграцией их на периферию, что несомненно оказывает влияние на временную организацию перераспределения клеточных элементов лимфоидной системы. Показано, что суточные ритмы лимфоцитоза периферической крови у человека обусловлены колебаниями Т-лимфоцитов, отражающими динамику тимусного лимфопоэза [197]. У мышей около 70 % лимфоцитов периферической крови представлено Т-клетками [325], суточный ритм лимфоцитоза крови находится в противофазе к ритму цитоза тимуса, пик лимфоцитоза крови и минимум клеточности тимуса в суточном цикле наступают после максимума митотической активности клеточных элементов вилочковой железы [331]. Это означает, что у мышей, как и у человека, суточная динамика лимфоцитоза периферической крови отражает последовательность процессов пролиферации и выселения клеток из центрального органа иммунитета.

Для модуляции суточных ритмов метаболической активности лимфоцитов может иметь значение функция тимуса как эндокринной железы, продуцирующей факторы, необходимые для созревания и дифференцировки Т-клеток как в самом органе, так и на периферии [191]. Гуморальные факторы тимуса (тимозин, тимарин, Т-ак-тивин и др.) синтезируются в клетках ретикулярного эпителия вилочковой железы и представляют собой полипептиды с характеристиками гормонов [351]. Как и большинство полипептидных гормонов, тимусные факторы действуют на клетки-мишени через стимуляцию

биосинтеза цАМФ в аденилатциклазной реакции [425], с последующей активацией цАМФ-зависимых протеин-киназ, катализирующих фосфорилирование ядерных и мембранных белков, а также ряда ферментов, лимитирующих дифференцировку и созревание лимфоцитов, включая экспрессию генетической информации, модуляцию функции мембран и ферментных ансамблей [43, 179]. Генерация гормонов тимуса осуществляется по типу суточного ритма, находящегося почти в противофазе к ритму секреции кортикостероидов [359].

Поэтому не исключено, что утренне-дневное повышение уровня лимфоцитов в крови интактных мышей, главным образом за счет АЦ++-фракции (лимфоциты с высокой активностью аденилатциклазы), связано с максимальной продукцией в этот период гормональных факторов тимуса [92], которые, стимулируя дифференцировку периферических Т-клеток, действуют через систему аденилатциклаза-цАМФ [425]. Очевидно, пермиссивный вклад в этот эффект дает и анафаза циркадного ритма глюкокортикостероидов, поскольку чувствительность Т-лимфоцитов к тимозину находится в обратной зависимости от уровня гормонов коры надпочечников в плазме крови [191], минимум которых у крыс и мышей наблюдается именно в утренние и дневные часы [359]. Показаны обратные взаимоотношения в суточных колебаниях количества Т-лимфоцитов в периферической крови и уровня кортизола в плазме у людей [362]. Наличие функциональной связи между этими биоритмами подтверждается опытами с удалением гипофиза или надпочечников у лабораторных животных и исследованием ритмов лимфоцитоза у больных с надпочечниковой недостаточностью, зафиксировавших исчезновение или сглаживание суточных колебаний содержания лимфоидных клеток в крови во всех случаях гипофункции гипофизадреналовой системы [114, 242, 310, 421].

Следовательно, можно сделать вывод, что циркадные осцилляции лимфоцитоза в периферической крови – это стрессобусловленные колебания, а глюкокортикостероиды как эффекторные гормоны стрессреализующей системы (гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая ось) являются их непосредственными модуляторами. Значимость гормонов коры надпочечников как эндогенных регуляторов суточного ритма количества лимфоцитов в крови подчеркивает факт его инверсии под влиянием 7—10-дневного введения гидрокортизона в середине периода дневного сна животных, когда концентрация кортикостерона в крови у мышей минимальна [92]. Стрессорный характер сдвигов документируется данными литературы [31] и результатами наших опытов, свидетельствующих о том, что уровень лимфопении в крови крыс при иммобилизационном стрессе зеркально отражает содержание в плазме 11-оксикортикостероидов (рис. II-19, рис. II-21). А из факта, что гипофизэктомия [31] и адреналэктомия (рис. II-21) предотвращают развитие лимфопении в крови животных при воспроизведении иммобилизационного стресса, следует, что уровень лимфоцитоза – это функция концентрации стероидных гормонов в крови.

Данная констатация означает, что стрессорные гормоны (глюкокортикостероиды) действительно могут быть лимитирующими факторами в синхронизации хронобиологической структуры иммунного гомеостаза. Возможно, что фазовые взаимоотношения ритмов иммунной и эндокринной систем определяют суточные колебания иммунного статуса. Суточный ритм иммунного ответа у людей (по тесту кожной чувствительности к антигену) находится в противофазе к ритму экскреции кортизола с мочой [92]. Исследование соотношения суточных колебаний силы иммунного ответа на эритроциты барана и циркадных ритмов стероидогенеза у мышей показало, что максимальная генерация антителообразующих клеток в селезенке возникала в том случае, если антиген вводился днем, т. е. на минимальном уровне кортикостерона в плазме крови. Из сопоставления различных комбинаций показателей клеточного фона, концентрации кортикостерона в плазме крови и уровня иммунного ответа было выяснено, что его сила (амплитуда) находится в обратной связи с отношением лимфоцитоза периферической крови к количеству клеток в тимусе и напряженности гормонального фона. Высокий иммунный ответ в 100 % случаев наблюдался при иммунизации животных на низком фоне эндогенных кортикостероидов и высоком отношении лимфоцитов крови к количеству клеток в тимусе [10]. Судя по всему, иммунная система эффективно реагирует на антиген, если он применяется во время активной миграции клеток из тимуса.

Согласно [92], высокая отвечаемость иммунной системы на антигенный раздражитель, применяемый на низком фоне глюкокортикоидных гормонов, связана не столько с отсутствием иммунодепрессивного действия последних, сколько с поддержанием «оптимальной» регулируемой лимфоэндокринной ситуации, характеризующейся интенсивной миграцией и рециркуляцией клеток с высокой активностью метаболических процессов. Свой вклад в реализацию высокого иммунного ответа в принятых условиях, очевидно, вносит и повышенная концентрация в крови гормональных факторов тимуса, поскольку анафазе в суточном ритме глюкокортикоидов всегда соответствует акрофаза циркадного ритма тимозина [359].

Таким образом, иммунный гомеостат – это структурно-временная организация иммунной системы организма, представленная комплексом биоритмов пролиферации, дифференцировки, миграции, метаболизма и гибели иммунокомпетентных клеток, находящихся между собой в определенных фазовых взаимоотношениях, регулируемых стрессгормонами. Динамический баланс лимфоэндокринного взаимодействия, очевидно, обеспечивает оптимальный уровень функционирования иммунной системы в каждый момент времени. С фазовым соотношением биологических ритмов организма связан феномен неодинаковой чувствительности системы к иммуномодуляторам. Один и тот же биологически активный фактор может оказывать разной степени выраженный (иногда даже противоположный) эффект в зависимости от фазы биологического ритма, во время которого он применяется [158, 200, 334].

Считается, что явления хроностезии и хроноэффективности связаны не только с ритмами продукции эндогенных регуляторных факторов, в результате чего при введении их извне создается различная конечная концентрация вещества в организме, но и с ритмами экспрессии рецепторов к ним на иммунокомпетентных клетках и состоянием метаболизма этих клеток [200], которые также лимитируются глюкокортикостероидами [77]. Синхронизирующее (регуляторное) влияние стрессреализующей системы на функциональное состояние всех звеньев иммунного гомеостата обеспечивает временную адаптацию иммунной системы к периодическим раздражениям, т. е. к циркадному ритму чередования внешних сигнальных факторов (световой, пищевой, двигательный режимы). Нарушение временной структуры лимфоэндокринных взаимоотношений при хроническом истощающем стрессе ведет к нарушению механизмов адаптации, снижению общей резистентности организма и активации иммунопатологических процессов – развитию вторичных иммунодефицитов и сепсиса. Отсюда ясна тактика корригирующих лечебных мероприятий – это не только компенсация дефицита эндогенных иммуномодуляторов их дополнительным введением, но и нивелирование эндогенного гиперкортицизма с помощью антистрессорных средств.

6.2. Т-активин и витамины

Сепсис, т. е. генерализация инфекции, всегда имеет место на фоне несостоятельности гомеостаза. Летальность при сепсисе достигает значительных цифр и колеблется в широких пределах – от 20 до 40 % и прогрессивно нарастает при развитии септических осложнений, таких, как ПОН и септический шок, – от 40 до 70 % [2, 3, 7, 288]. Причиной этого может быть тот факт, что применяемые лечебные мероприятия не решают реабилитационной задачи, т. е. восстановления имеющегося дефекта гомеостаза, а иногда даже усугубляют его. Исходя из представлений о перекрестной адаптации и системных реакциях организма [19], а также концепции витаминно-гормональных взаимоотношений [18, 20], было интересно использовать имеющиеся теоретические и экспериментальные наработки по функциональной реабилитации гомеостаза [430] в целях снижения смертности при сепсисе.

Исходя уже из принципов интенсивного комплексного лечения сепсиса, которое сегодня включает: устранение нарушений в иммунной, эндокринной, сердечно-сосудистой, дыхательной системах, системе детоксикации, системе свертывания крови, микроциркуляции и т. д., необходимо признать, что эта патология должна квалифицироваться, как тотальная несостоятельность гомеостаза. Сепсис – это системное заболевание с множественными дефектами гомеостаза, и прежде всего в гуморальном звене его регуляции. Здесь на первый план выдвигаются взаимоотношения между гормональной и иммунной системами, которые в аспекте сепсиса в литературе фактически не анализируются и не учитываются в клинической практике, что, безусловно, снижает эффективность лечения.

Если принять, что постоянство внутренней среды организма является результатом интеграции функций [19], а развитие сепсиса, т. е. генерализация инфекционного процесса, всегда имеет место на фоне первичного или вторичного иммунодефицита [382], то показатели специфического иммунитета в данном случае, очевидно, могут служить адекватными критериями состоятельности гомеостаза в целом. Из рис. ІІ-29 видно, что традиционная интенсивная терапия сепсиса не устраняет исходный иммунодефицит. Более того, по имеющимся в литературе данным, некоторые лечебные мероприятия способны даже его усугубить [26, 168].

Почему это происходит, можно показать на примере гемосорбции. Гемосорбция (ГС), позволяющая элиминировать из крови вещества молекулярной массой от 500 до 5000 дальтон [94], так называемые средние молекулы, в том числе пептиды, с накоплением которых связывают развитие эндотоксикоза и иммуносупрессии [93], является на сегодняшний день одним из важнейших и наиболее патогенетически обоснованным методом в комплексной схеме интенсивного лечения сепсиса [6].

Рис. II-29. Иммунный и гормональный статус больных сепсисом (1-я группа) до (прерывистая линия) и после лечения (сплошная линия). В виде радиусов отложены иммунологические и гормональные показатели (в % к норме, представленной в виде окружности): ЛФ – лимфоциты (в 1 мкл крови); Та – активные Т-клетки; То – общие Т-клетки; Тр – теофиллинрезистентные; Тч – теофиллинчувствительные; В – В-лимфоциты; lgA, lgM, lgG – иммуноглобулины плазмы; С – суммарные 11-ОКС (б – белковосвязанные, с – свободные); Гб – гидрокортизон, связанный с белком; Кб – кортикостерон, связанный с белком; Гс – гидрокортизон свободный; Кс – кортикостерон свободный; ССТ – связывающая способность транскортина; n – число связывающих мест на транскортине. Достоверные сдвиги (р < 0,05) между прерывистой и сплошной линиями обозначены кружком

Тем не менее гемосорбция не только не компенсирует имеющуюся при сепсисе недостаточность Т– и В-звеньев иммунитета, но обусловливает некоторую тенденцию к ее углублению, в результате стимуляции стероидогенеза [167, 168]. Активация надпочечников фиксируется уже после первой процедуры и сохраняется на протяжении всего времени применения экстракорпоральной детоксикации, формируя состояние устойчивого гиперкортицизма (табл. II-2). Элиминация глюкокортикостероидов из крови активированными углями при проведении гемосорбции [167] приводит к суперкомпенсации потерь, за счет растормаживания гипофиза (устранение отрицательной обратной связи) и развития обычной стрессорной реакции.

Известно, что кортикостероиды ингибируют миграцию стволовых и B-клеток из костного мозга, кооперацию Т– и B-клеток, вызывают транзиторную лимфопению [286].

При стрессе изменяется не только спектр лимфоцитов, но и общая масса лимфоидной ткани в организме (атрофия тимуса, инволюция селезенки и т. д.), что является морфологической основой развития иммунодефицита. Функциональная взаимосвязь между гормональной и иммунной системами здесь настолько очевидна, что ее используют в диагностических целях при тестировании адаптации, т. е. для контроля фаз развития стрессорной реакции по изменению клеточного состава крови [271].

Таким образом, проблема иммунокоррекции при сепсисе – это в значительной мере проблема оптимизации стресса, которая в практическом плане связана с решением следующих основных вопросов: 1) снижение биосинтеза стероидов (определяет амплитуду функционального ответа надпочечников на раздражение); 2) снижение рецепции стероидов (определяет возможность проявления биологического действия гормонов); 3) активация катаболизма стероидов (определяет время существования эффективных концентраций гормонов); 4) снятие иммунодепрессантного действия стероидов (определяет реабилитацию иммунитета). Исходя из концепции витаминно-гормональных связей [18, 20] и имеющихся данных что:

1) витамин В1 является антистрессором, активирует инсулярный аппарат поджелудочной железы, нормализует углеводный обмен [18]; 2) витамин В6 блокирует стероидные рецепторы и, следовательно, биологическое действие гормонов [271, 375]; 3) витамин В12 активирует катаболизм стероидов и является метаболическим антагонистом стероидных гормонов, нормализует белковый и жировой обмен [205]; 4) Т-активин обладает реципрокным по отношению к глюкокортикостероидам иммуномодулирующим действием [191] – предполагалось, что эта комбинация (В1+В6+B12+Т-активин) может дать при сепсисе аддитивный антистрессорный иммунокорригирующий эффект.

Клинические испытания подтвердили это предположение. Исследования были проведены на 78 больных сепсисом, в лечении которых широко использовали детоксикационную гемосорбцию. В зависимости от характера лечения больные были разделены на 4 группы: 1 (32) – гемосорбция (ГС – 2–6 сеансов); 2 (15) – ГС (2–6 сеансов), накануне и за 2 ч до каждой ГС внутривенно 2 мл 6 % витамина В1, а через час последовательно 2 мл 5 % р-ра витамина В6 и 2 мл 0,01 % витамина В12, на ночь подкожно 0,01 % раствор Т-активина из расчета 40 мкг/м2 поверхности тела; 3 (17) – ГС (2–6 сеансов), витамины группы B (как больным 2-й группы) + УФО крови с помощью аппарата «Изольда МД 73М» (5—10 сеансов) по общепринятой методике; 4 (14) – к назначениям, аналогично больным 3-й группы, добавлен Т-активин подкожно из расчета 40 мкг/м2 поверхности тела.

Применение антистрессорных средств здесь регламентируется тем, что сама патология (сепсис) и лечение (мощная антибактериальная терапия, хирургическая санация очагов, использование различных травматических видов экстракорпоральной детоксикации) являются большой, а в сочетании, возможно, чрезмерной стрессорной нагрузкой на надпочечники (активация стероидогенеза), что в свою очередь приводит к тяжелой иммуносупрессии. Причинами снижения функциональной активности лимфоцитов периферической крови при стрессе являются: транзиторная лимфопения, вызывающая обеднение внутрисосудистого пула лимфоцитов благодаря избирательной эмиграции рециркулирующих клеток, а также прямое угнетение глюкокортикостероидами пролиферации отдельных субпопуляций лимфоцитов [305].

По данным [256], в механизме лимфопенического действия гидрокортизона и АКТГ большую роль играет уменьшение количества митозов и кариорексис лимфоцитов. Кроме того, гормоны коры надпочечников могут изменить реакцию макрофагов на Т-клеточные факторы посредством блокады активации лимфоцитов, угнетения синтеза лимфоцитов, а также влияния на взаимодействие этих медиаторов с клетками-мишенями [255].

Рис. II-30. То же, что и на рис. ІІ-29, для 2-й группы

Как видно из рис. II-30, применение комплекса витаминов В с Т-активином при сепсисе вызывает выраженный антистрессорный эффект (снижение функционального ответа надпочечников на гемосорбцию) и устранение исходного иммунодефицита (достоверное повышение содержания в крови иммунокомпетентных клеток). Четкая синхронизация (зеркальность) сдвигов указывает на их взаимную обусловленность. Пролиферация лимфоцитов является важнейшим элементом развития нормальной иммунной реакции [25, 171]. В соответствии с современными теориями иммунитета этот процесс лежит в основе образования антигеноспецифического клона лимфоцитов и определяет интенсивность иммунной реакции [186, 188]. Поскольку иммунный ответ зависит от пролиферации Т– и В-лимфоцитов (в случае тимусзависимых антигенов пролиферация В-клеток осуществляется в кооперации с Т-клетками), то вполне возможно, что при сепсисе критической лимитирующей стадией может стать гормональнообусловленное нарушение способности прекомитированных антигеном клеток (осуществивших G0—G1-переход) включаться в митотическое деление.

Показано, что in vivo глюкокортикостероиды существенно ослабляют иммунный ответ сенсибилизированных лимфоцитов (после первого введения антигена) на последующие антигенные стимулы [230]. In vitro гормоны коры надпочечников угнетают бласттрансформацию сенсибилизированных Т-лимфоцитов в смешанной лимфоцитарной реакции и ответ на введение в культуру антигена [191]. Исходя из того, что процесс бласттрансформации есть не что иное, как рост клеток в фазе G1—S – G2, сопряженный с синтезом ДНК [132], можно заключить, что кортикостероиды способны изменять ответ Т-лимфоцитов на митогены (антигены) посредством блокирования триггерного по отношению к митозу перехода G1—S в клеточном цикле [256]. Изучение эффекта бласттрансформации лимфоцитов человека при воздействии на них ФГА показало, что добавление в систему преднизолона блокирует их трансформацию в бластные формы из-за специфического подавления синтеза ДНК [248].

Кортизолобусловленное ингибирование синтеза ДНК в лимфоидных клетках in vivo дозозависимо и проявляется уже через 150–390 мин после введения гормона [415, 416], что в принципе сопоставимо с экспозицией G1-фазы в клеточном цикле [42, 132]. Существенно, что именно в середине G1-фазы при активации лимфоцитов в смешанной культуре [419] либо при их активации антигенами или митогенами [308] на Т-клетках во множестве появляются рецепторы для инсулина, выполняющего, очевидно, функции триггера G1—S-перехода в условиях организма [132]. Следовательно, не исключено, что иммунодепрессантное действие глюкокортикостероидов реализуется через их реципрокные взаимоотношения с инсулином, на уровне рецепторного аппарата, генома и метаболизма лимфоцитов, как это известно в отношении гепатоцитов и клеток других органов-мишеней для обоих гормонов [18, 19]. В этой связи интересны следующие факты. Сепсис, как правило, сопровождается развитием инсулинорезистентности [113], частично за счет сопутствующего стрессорного гиперкортицизма [112], частично за счет связывания эндогенного инсулина накапливающимися в крови средними молекулами [177], что в обоих случаях нарушает специфическую рецепцию гормона и соответственно его биологическое действие.

Если уровень иммунокомпетентных клеток действительно отражает активность зависящей от инсулина пролиферации лимфоцитов, то отсутствие признаков иммунокоррекции после ГС (рис. II-29) прямо указывает на то, что данная процедура, несмотря на элиминацию средних молекул, проблему относительной недостаточности инсулина у больных сепсисом не решает. Наоборот, судя по направленности сдвигов, здесь скорее имеет место усиление инсулинорезистентности в результате выраженного стрессорного действия ГС (табл. II-2).

Следуя этой логике и представлениям о триггерной роли инсулина в «запуске» G1 – S-перехода клеточного цикла лимфоцитов [132], иммунокорригирующее действие витаминов группы В при сепсисе (т. е. достоверное увеличение пула иммунокомпетентных клеток – рис. II-30) можно объяснить следующим образом. Прежде всего, существенным моментом этого действия безусловно является сам совокупный антистрессорный эффект данного комплекса (см. выше), поскольку снижение уровня глюкокортикостероидов в крови устраняет инсулинорезистентность и соответственно отменяет «стероидный блок» пролиферации иммунокомпетентных клеток [191]. Однако не менее важное значение здесь, очевидно, имеет и аддитивный иммуномодуляторный эффект комплекса, где каждый его компонент вносит свой вклад в реализацию пролиферативного цикла.

В условиях антигенной стимуляции лимфоцитов (сепсис), т. е. «включенного» G0—G1-перехода, процесс активации транскрипции является центральным моментом действия активирующих факторов, так как синтез РНК и белка – суть G1-фазы клеточного цикла, в ходе которого клетка растет и готовится к делению на две [42]. Поэтому немаловажно и то, что стресслимитирующие витамины в составе соответствующих ферментов in vivo участвуют в формировании интрацеллюлярного пластического резерва для роста клеток в фазе G1, обеспечивая синтезы белков и нуклеиновых кислот необходимыми субстратами за счет катализирования межмолекулярных обменов простыми (трансаминирование – В6, трансметилирование – В12) и сложными (транскетолазные реакции – В1) фрагментами. Хотя актуальность дополнительного введения витаминов при сепсисе кажется очевидной, поскольку длительное антигенное раздражение в силу своего стрессорного характера [230] приводит к вторичной витаминной недостаточности [18], применение В-витаминов в принятых условиях решает регуляторную задачу реабилитации метаболического и соответственно иммунного гомеостаза. В этом отношении показательно активирующее влияние тиамина на инсулинсинтетическую функцию поджелудочной железы, которое воспроизводится как у интактных, так и гиповитаминозных животных [430].

Таблица II-2.

Содержание 11-оксикортикостероидов (в мкмоль/л) в крови больных сепсисом до и после гемосорбции (ГС)

Примечание. I – до ГС; II – после ГС; III – через 6 часов; IV – через 24 часа; V – после всех ГС. * До

При стрессе тиамин не только снижает амплитуду пика глюкокортикостероидов в крови (рис. II-26), но и синхронизирует его с выходом пика инсулина (рис. II-27), что обеспечивает эффективную конкуренцию гормонов – антагонистов (т. е. отмену стероидного влияния) на уровне регуляции метаболических функций [23]. Повышение концентрации инсулина в крови [430] и маркерные эффекты его действия в органах-мишенях выявляются уже через 2 ч после введения тиамина интактным животным [18, 66]. Следовательно, экспозиционные характеристики инсулинотропного действия тиамина полностью укладываются во временные параметры G1-фазы клеточного цикла лимфоцитов, когда на их поверхности экспрессируются инсулиновые рецепторы, что создает реальные предпосылки лиганд-рецепторного взаимодействия, т. е. включения G1-перехода и соответственно пролиферации клеток лимфоидного ряда.

Рис. II-31. То же, что и на рис. ІІ-29, для 3-й группы

Насколько значим для роста каждой клетки в фазе G1 «интрацеллюлярный пластический резерв», очевидно, настолько же важен для количественного роста всей популяции эффекторных лимфоцитов резерв иммунокомпетентных клеток, который лимитирует процесс генерализации их деления. Предполагалось, что формирование этого клеточного резерва при сепсисе должен был обеспечить Т-активин, поскольку известно, что гормоны тимуса в присутствии антигена индуцируют двухэтапное созревание Т-клеток (Т0—Т1—Т2), т. е. превращение их в иммунокомпетентные лимфоциты [257]. Судя по амплитуде иммунокорригирующего действия (рис. II-30), такие ожидания не были беспочвенными. При этом вряд ли можно думать, что Т-активин способен активировать пролиферацию, поскольку для созревания лимфоцитов, т. е. для появления на их поверхности соответствующих антигенных маркеров, обеспечивающих иммунокомпетентность, не требуется деления клеток [191]. Более того, в большинстве случаев дифференцировка клеток связана с подавлением пролиферации. Филогенетически древние процессы дифференцировки сопровождаются появлением, углублением G1-фазы клеточного цикла и последующим переходом клеток в состояние покоя – G0 [42]. Кстати, длительное переживание Т2-клеток в фазе G0 in vivo может быть важным условием формирования клеточного резерва пролиферации [257].

Рис. II-32. То же, что и на рис. ІІ-29, для 4-й группы

Если вместо Т-активина в схему лечения сепсиса ввести ультрафиолетовое облучение (УФО), действие которого в отношении лимфоцитов крови противоположно действию гормонов тимуса, то иммунокорригирующий эффект (прирост клеточного пула) В-витаминного комплекса, несмотря на сохранение его антистрессорного влияния (одинаковое снижение в крови уровня биологически активных свободных форм кортикостероидов), заметно сокращается (рис. II-31). УФО негативно влияет на жизнеспособность и функциональное состояние иммунокомпетентных клеток [172]. Например, у облученных макрофагов снижается функция презентации антигена и нарушается выработка интерлейкина-1 [322]. По-видимому, УФО-зависимая фотоальтерация клеточных мембран [151] нарушает дифференцировку лимфоцитов и соответственно сокращает клеточный резерв пролиферации. Изменения клеточных мембран, очевидно, носят малообратимый характер [151], поскольку дополнительное введение Т-активина хотя и повышает суммарный иммунокорригирующий эффект В-витаминов (рис. II-32), но не выводит его на уровень сдвигов, наблюдающихся без облучения (рис. II-30).

Следовательно, сочетание УФО и Т-активина в схеме лечения сепсиса вряд ли целесообразно. В то же время сочетание Т-активина с витаминами антистрессорного действия в принятых условиях себя полностью оправдало (рис. II-30).

Таблица II-3.

Уровень летальности больных в условиях проведения интенсивного комплексного лечения сепсиса

Сейчас хорошо известно, что биологическое действие гормонов тимуса резко усиливается на фоне гипокортицизма и зачастую достаточно даже кратковременного снижения уровня глюкокортикостероидов в крови для создания условий, обеспечивающих длительный, стимулирующий систему клеточного иммунитета эффект тимозина [191]. Полученные нами данные показывают, что вызванные совместным применением В-витаминов и Т-активина иммуномодуляция и нивелирование гормональнообусловленной иммуносупрессии (рис. II-29—ІІ-32) позволяют существенно (с 37,4 до 13,3 %) снизить уровень летальности у больных в условиях проведения интенсивного комплексного лечения сепсиса (табл. II-3).

Если выздоровление рассматривать как интегральный критерий реабилитации гомеостаза, то следует признать, что В-витамины в сочетании с иммуномодуляторами являются эффективным гомеостатическим (иммунокорригирующим) средством при сепсисе.

6.3. Ронколейкин (ИЛ-2) и витамины

Рекомбинантный ИЛ-2, синтезируемый на дрожжевой матрице, впервые появился в поле зрения клиницистов в 1995 г., а сейчас уже широко применяется в сепсисологии для иммунокоррекции ВИД. В возникновении ВИД важную роль играет гиперпродукция эндогенных глюкокортикостероидов в результате действия предшествующих сепсису различных видов стресса: операционного, травматического, болевого и др. В опытах на животных показано, что in vivo ИЛ-2 вызывает активацию гипофизад-реналовой системы [53]. Однако стрессогенное действие ИЛ-2 при его введении больным сепсисом клиницистами не учитывается, хотя это может быть важным как для выбора тактики иммунореабилитации, так и для оценки ее эффективности. Поскольку в медицинской литературе практически отсутствуют сведения о влиянии ИЛ-2 на уровень глюкокортикостероидов в крови больных сепсисом, прежде всего необходимо было восполнить существующий пробел.

Изучение иммунокорригирующего влияния ронколейкина при сепсисе проводили на 12 больных (6-я группа), еще 12 больным перед введением ронколейкина вводили комплекс витаминов группы В (7-я группа – накануне и за 2 ч до каждой инфузии ронколейкина внутривенно вводили 2 мл 6 % раствора витамина В1, а через 1 ч последовательно 2 мл 5 % раствора витамина В6 и 2 мл 0,01 % раствора витамина В12). Контролем служили 12 больных, которым проводилась интенсивная комплексная терапия сепсиса без применения ронколейкина и витаминов (5-я группа).

У 16 из 24 больных сепсисом, леченых ронколейкином, отмечены побочные реакции: незначительное (не более 0,5 °C по сравнению с исходным) повышение температуры тела во время введения препарата – у 12 (50 %), лихорадка с повышением температуры тела от 0,5 °C и выше – у 4 (16,7 %) больных. Пирогенные эффекты, сопряженные с повышением уровня стрессорных гормонов в крови [101], как правило, наблюдаются после введения корпускулярных или растворимых белков, являющихся аллоантигенами [86]. Существующий опыт использования в клинике дрожжевого рекомбинантного интерлейкина-2 показывает, что наряду с выраженной иммуностимуляцией многочасовое капельное введение ронколейкина часто вызывает у больных развитие лихорадочного состояния [13], которое может быть проявлением побочного стрессогенного действия препарата, снижающего эффективность иммунокорригирующего лечения.

У животных внутривенное введение ИЛ-2 сопровождается стрессогенной реакцией, которая проявляется повышением уровня АКТГ и глюкокортикостероидов в крови [53] и одновременно септическими проявлениями: лихорадкой, тахикардией, снижением системного АД, сердечного индекса, транзиторной почечной недостаточностью [77]. Были случаи, когда большие дозы ИЛ-2 при проведении противоопухолевой терапии вызвали усиление признаков сепсиса и тяжелые стрессобусловленные осложнения: инфаркт миокарда, канюлярный сепсис, почечную недостаточность, тромбоз легочных артерий и др. [33].

Экзогенный ИЛ-2 проявляет себя как стрессор и при сепсисе. Об этом свидетельствует двукратное повышение общих, белковосвязанных и свободных 11-ОКС, а также лимфопения, наблюдающиеся сразу после завершения первой инфузии ронколейкина (табл. II-4).

Таблица II-4.

Уровень 11-ОКС и лимфоцитов в крови больных сепсисом в конце 1-й 4-часовой инфузии ронколейкина

* р<0,05; ** р<0,02; *** р<0,001.

В работах [33] и [116] зафиксировано некоторое снижение абсолютных цифр лимфоцитоза у больных с хирургическим и ожоговым сепсисом даже на следующий день после разового применения ронколейкина, что косвенно указывает на проявление его стрессогенного действия и является основанием для продолжения цитокиновой терапии. Зеркальный характер сдвигов в системе «11-ОКС-лимфоциты» подчеркивает их взаимообусловленность, т. е. определяющую роль гормонов коры надпочечников в развитии лимфопенической реакции [31].

Аналогично, т. е. в противофазе, колеблется уровень кортикостероидов и лимфоцитов в крови крыс при циркадной ритмике [10]. По-видимому, ИЛ-2 является более сильным стрессором, чем Т-антиген (эритроциты барана – ЭР), так как первый вызывает инверсию циркадного ритма лимфоцитоза у мышей [200], а второй – нет [77]. Поскольку при введении глюкокортикостероидов интактным животным наблюдается смещение фаз суточной динамики уровня лимфоцитов [10], можно допустить, что парадоксальный лимфопенический эффект ронколейкина является результатом 4-часовой экспозиции стрессогенного действия препарата. Исходя из того, что экзогенные и эндогенные стресс-гормоны вносят помехи в действие активаторов иммунитета – ЭР и ИЛ-2 (в обоих случаях имеют место нарушения циркадного ритма лимфоцитоза [77, 200]), легко заключить, что для усиления иммуномодулирующих эффектов ронколейкина необходимо нивелировать стрессогенную составляющую его действия.

Неспецифический характер этих изменений подчеркивает основной компонент используемого нами комплекса витаминов – тиамин, который при введении септическим больным ронколейкина действует так же, как и при любом другом виде стресса – достоверно снижает амплитуду стероидогенной реакции (табл. II-4) [430] и тем самым нивелирует стрессорные сдвиги в системе крови [23].

Клинический анализ крови (табл. II-5) показал, что у больных сепсисом исходно наблюдаются такие же изменения, как и при стрессе: лейкоцитоз со сдвигом формулы влево и лимфопения [153].

Таблица II-5.

Содержание нейтрофильных гранулоцитов в крови больных сепсисом через сутки после 1-й инфузии ронколейкина

*р<0,05; ** р<0,02; *** р<0,001.

У больных 5, 6 и 7-й групп до лечения (контроль) наличие 2, 3 и 4 клинических признаков SIRS (системный ответ на агрессию) было выявлено соответственно в 100, 69 и 33 % случаев.

Оценка исходного состояния пациентов по системе APACHE-II и шкале SAPS показала, что в целом у всех больных до лечения средний балл в первом случае составил 14, а во втором – 8,0, что позволяло прогнозировать вероятную летальность на уровне 25 % (табл. II-6).

Факт повышения эффективности лечебного действия ронколейкина под влиянием комплекса антистрессорных витаминов документируется улучшением клинического состояния больных 3-й группы, которое проявлялось 2-кратным снижением среднего балла по шкалам SAPS и APACHE-II, ослаблением степени тяжести эндотоксикоза в виде нормализации температуры и гемодинамики, достоверного снижения лейкоцитоза, индекса сдвига лейкоцитарной формулы, увеличением относительного и абсолютного количества лимфоцитов, улучшением биохимических показателей крови. У больных 2-й группы, получавших только ронколейкин, клинический эффект был менее выражен, тогда как у пациентов 1-й группы (контроль) либо вообще не отмечалось положительной клинической динамики, либо она достигалась за более длительное время, хотя и в данной группе регистрировалось умеренное снижение среднего балла по обеим шкалам.

Таблица II-6.

Клинические показатели тяжести состояния больных до и после лечения

Цитокинотерапия на фоне комплекса витаминов группы В характеризовалась выраженным иммунокорригирующим действием. При сочетанном применении стресслимитирующих витаминов и ронколейкина устранение лимфопении у больных сепсисом в третьей группе происходило значительно быстрее, чем во второй, где указанный комплекс не применялся, о чем свидетельствует снижение общего количества инфузий иммуномодулятора.

Из данных, представленных в табл. II-7, следует, что при сочетанном применении ронколейкина и комплекса антистрессорных витаминов коррекция клеточного и гуморального иммунитета была более выраженной.

Через сутки после первой инфузии ронколейкина общее количество Т-лимфоцитов (CD3) и Т-хелперов (CD4) по сравнению с исходным уровнем изменилось мало, а вот субпопуляция Т-супрессоров (CD8) сократилась почти на четверть. В результате структура кооперативных связей между элементами иммунореактивности в системе Т-клеточного иммунитета формально восстанавливается, однако это вряд ли можно рассматривать как признак иммунореабилитации. Оптимальное соотношение внутрипуловых субпопуляций, обеспечивающих эффективную реализацию специализированной функции иммунокомпетентных Т-клеток, отражает индекс CD4/CD8, который в норме равен 1,2–1,8. У больных сепсисом исходное снижение индекса CD4/CD8 до 0,8 определяется не только избытком Т-супрессоров, но и подавлением Т-хелпе-ров [130], о чем свидетельствует угнетение продукции эндогенного ИЛ-2 в принятых условиях [163]. Иммунореабилитация ВИД, в принципе, предполагает общее увеличение всего пула Т-клеток, когда же ничего подобного не происходит (табл. ІІ-7), а имеет место снижение одной из его субфракций (CD8), то речь здесь может идти в первую очередь об иммуносупрессии, т. е. о стрессогенном влиянии ронколейкина.

Если ронколейкин применять вместе со стресслимитирующими витаминами, то на первый план выдвигается иммунопротекторная составляющая его действия. В этом случае через сутки после первой инфузии цитокина наблюдается существенный рост общего содержания Т-лимфоцитов в крови больных сепсисом (7-я группа), главным образом за счет увеличения субпопуляции Т-хелперов и в меньшей степени Т-супрессоров (табл. II-7). Нивелирование снижения уровня Т-супрессоров, отмеченное у больных, получавших ронколейкин (6-я группа), очевидно, может быть еще одним проявлением антистрессорного действия витаминов, поскольку известно, что именно эта субпопуляция лимфоидных клеток (CD8) отличается наибольшей чувствительностью к кортикостероидам [86]. Таким образом, витамины фактически нормализуют нарушенное стрессом функционально важное соотношение CD4/CD8, которое у больных сепсисом после совместного применения комплекса антистрессорных витаминов группы В и ронколейкина достигает оптимального значения (табл. II-7), что объективно отражает факт иммуномодуляции.

Таблица II-7.

Содержание субфракций Т-лимфоцитов и иммуноглобулинов в крови больных сепсисом через сутки после 1-й инфузии ронколейкина

* р<0,05; ** р<0,02; *** р<0,001.

При тяжелом сепсисе [150] и стрессе [136] наблюдается феномен «исчезающих глобулинов» – резкое снижение иммуноглобулинов класса IgA, IgM и особенно IgG, что является поводом для применения соответствующей заместительной терапии антителами. Согласно [148], лечебный эффект IgG при сепсисе зависит от показателя формализованной оценки тяжести состояния по шкале SAPS: в диапазоне 20–25 баллов авторами зафиксировано снижение летальности на 33 %, а в группах больных с индексом тяжести менее 20 баллов заместительная терапия была неэффективной, очевидно, из-за отсутствия исходного дефицита антител. У наших больных при гораздо меньших значениях SAPS – 8 и APACHE – 14 (5-я группа) все фракции иммуноглобулинов крови находятся на уровне нижней границы нормы (табл. ІІ-7). На следующий день после первой инфузии ронколейкина (6-я группа) концентрация IgA, IgM и IgG заметно не изменялась. Введение ронколейкина на фоне действия комплекса антистрессорных витаминов группы В (7-я группа) в это же время достоверно повышало уровень IgG по сравнению с исходным.

Известно, что стрессорный всплеск стероидогенеза подавляет не только клеточный, но и гуморальный иммунитет, вызывая сбои в работе В-лимфоцитов, препятствующие их превращению в плазматические клетки, что, в конце концов, приводит к угнетению антителообразования. В опытах на животных показано, что концентрация IgG в крови обратно пропорциональна содержанию в ней эндогенных глюкокортикостероидов: при стрессе она снижается, при адреналэктомии – увеличивается

[86]. Следовательно, снижение уровня 11-ОКС у больных сепсисом (7-я группа), обеспечиваемое антистрессорными витаминами (табл. II-4), может быть необходимым условием для проявления иммуномодулирующего действия ронколейкина, которое распространяется и на В-клетки, а через них и на продукцию IgG. Поскольку синтез IgG зависит от Т-хелперов [28], которые контролируются инсулином [68], увеличение этой фракции антител в крови больных сепсисом, получавших ронколейкин вместе с комплексом витаминов группы В (7-я группа), очевидно, можно объяснить при помощи механизма инсулинового опосредования действия основного компонента комплекса – витамина В1 как в части ограничения амплитуды стероидогенной реакции [430], так и в части влияния на пролиферацию иммуноцитов [24], являющихся клетками-мишенями для данного гормона [98].

В связи с этим важно отметить, что стресслимитирующее действие витаминов существенно повышает терапевтический эффект ронколейкина у больных сепсисом.

Оценка динамики показателей SAPS и APACHE II свидетельствует о заметно большем снижении тяжести состояния пациентов после сочетанного применения ронколейкина и комплекса антистрессорных витаминов группы В, чем одного ронколейкина (табл. ІІ-8, ІІ-9).

Объективными критериями, подтверждающими этот факт, служат также уменьшение реальной летальности по сравнению с прогнозируемой, уменьшение сроков пребывания в палате интенсивной терапии, которые были всегда самыми значимыми в группе, где применялось сочетанное витаминно-цитокиновое лечение (табл. ІІ-6).

Иммуносупрессия, сопутствующая многим заболеваниям, физиологическим состояниям (старение, роды, недоношенность новорожденных) и действию на организм экстремальных факторов (травмы, ранения, ожоги, хирургические вмешательства и т. п.), сопряжена с недостатком ИЛ-2 в периферической крови и может быть компенсирована путем введения экзогенного лимфокина. Согласно [240], в динамике развития септического процесса по схеме SIRS – CARS – MOD применение провоспалительных цитокинов оправдано начиная со второй антивоспалительной стадии при несбалансированном течении CARS, которое приводит к выраженному иммунодефициту. Основным показанием к применению ИЛ-2 здесь является стойкое снижение общего количества лимфоцитов и их субфракций в крови больных на фоне клинических и лабораторных признаков сепсиса.

Таблица II-8.

Оценка тяжести состояния больных сепсисом до и после лечения по шкале SAPS

Вводимый in vivo ИЛ-2 увеличивает пул иммунокомпетентных клеток крови за счет интенсивной пролиферации предшественников цитотоксических Т-лимфоцитов, которые затем переходят в эффекторную форму, а также зрелых киллерных и хелперных Т-клеток [196]. Последние в свою очередь генерируют лимфокины, стимулирующие поликлональную активацию, пролиферацию и дифференцировку В-лимфоцитов в антителопродуценты. Таким образом, восстанавливаются системы клеточного и гуморального иммунитета и ликвидируется имеющийся транзиторный вторичный иммунодефицит (ВИД).

Таблица II-9.

Оценка тяжести состояния больных сепсисом до и после лечения по шкале APACHE II

Хотя мишенью экзогенного ИЛ-2 являются периферийные иммуноциты, и он фактически осуществляет «центробежную» активацию иммунитета в направлении, обратном естественному движению активационного сигнала [189], тем не менее, в конечном счете, приходит в движение вся иммунная система, в результате чего повышается антиинфекционная защита организма.

Для того чтобы понять, как действует экзогенный ИЛ-2 по принципу «от обратного», необходимо рассмотреть механизм прямой иммуномодуляции. При «центростремительной» активации иммунитета первичными эффекторными клетками являются макрофаги, которые захватывают Т-зависимые антигены и перерабатывают их в поверхностные Ia-антигенные маркеры, которые распознаются Т-лимфоцитами. При контакте с Ia-положительными гистосовместимыми макрофагами происходит активация Т-иммуноцитов (первый сигнал), которая сопровождается G0/G1-переходом в их клеточном цикле, а макрофаги приобретают способность продуцировать ИЛ-1.

Рецепторы к нему на поверхности клеток-мишеней появляются в середине G1-фазы. Соединение ИЛ-1 с рецептором (второй сигнал) «включает» в активированных Т-лимфоцитах синтез ДНК, т. е. служит триггером G1/S-перехода в их клеточном цикле [187]. Таким образом, ИЛ-1 реализует индуцированную антигеном пролиферацию Т-лимфоцитов и, по-видимому, опосредованно антигензависимую активацию В-лимфоцитов с превращением их в плазматические клетки.

Действие антигена или митогена на Т-клетку (первый сигнал) инициирует одновременно синтез ИЛ-2 и экспрессию рецепторов к нему (ИЛ-2Р) [80]. Продукция ИЛ-2 происходит в G1-фазе клеточного цикла и не зависит от пролиферации. В клетках, находящихся в фазе G0, ИЛ-2 не выявляется. Увеличение экспозиции G1-фазы с помощью блокатора G1/S-перехода – оксимочевины приводит к повышению генерации ИЛ-2, а облучение клеток-продуцентов в дозе 9,5 Гр угнетает их пролиферацию, но не изменяет скорости синтеза лимфокина [196].

Биологическая роль ИЛ-2 состоит в подкреплении действия ИЛ-1 по инициации пролиферации, так как при соединении ИЛ-2 и ИЛ-2Р фактически дублируется сигнал к включению G1/S-перехода в клеточном цикле Т-лимфоцитов. Добавление ИЛ-2 к активированным лимфоцитам усиливает синтез РНК и осуществляет перевод клетки из фазы G1a в фазу G1b, что продвигает ее в фазу S. Целесообразность такого дубляжа второго сигнала обусловлена тем, что после связывания ИЛ-1 и ИЛ-2 с рецепторами клеток-мишеней происходит быстрая, зависимая от лизосом деградация обоих факторов [196].

Биохимический механизм действия ИЛ-1 и ИЛ-2 одинаков: образование лимфокин-рецепторных комплексов в обоих случаях сопряжено с активацией внутриклеточной гуанилатциклазы и накоплением в лимфоцитах цГМФ [86], который является непосредственным медиатором пролиферации, ответственным за G1/S-переход в клеточном цикле [187], и включение митотического оперона в генетическом триггере лимфоцитов, лимитирующем наработку белков митоза и построение митотического аппарата [24].

Пролиферативный эффект ИЛ-2 лимитируется фазой клеточного цикла лимфоцитов, от которой зависит экспрессия ИЛ-2Р. На покоящихся клетках (фаза G1) высокоаффинных лимфокиновых рецепторов практически нет, их количество резко возрастает после антигенной или митогенной активации лимфоцитов. ИЛ-2Р появляются на Т-лимфоцитах периферической крови через 6 ч после стимуляции ФГА. Причем 90 % клеток, экспрессирующих ИЛ-2Р, являются хелперами/индукторами, 10 % – супрессорами/киллерами [80]. ИЛ-2Р выявляются также на активированных В-лимфоцитах [196].

Следует подчеркнуть, что ИЛ-2 стимулирует пролиферацию лимфоцитов только после их бласттрансформации митогеном или антигеном [360]. Отсюда ясно, что обратный (центробежный) ход процесса иммуногенеза, т. е. ответ на экзогенный ИЛ-2, будет определяться степенью экспрессии ИЛ-2Р, пропорциональной количеству уже активированных лимфоидных клеток.

Выпадение ИЛ-2 звена иммунного ответа при развитии стрессорных ВИД у ожоговых больных и у больных после обширных операций компенсируется введением экзогенного рИЛ-2 [116]. В то же время при СПИДе этот иммуномодулятор неэффективен из-за блокирования его рецепции на иммуноцитах, поскольку в крови таких больных содержится ингибитор продукции ИЛ-2 и экспрессии ИЛ-2Р [80].

Исходя из того, что у наших больных получен четкий иммунокорригирующий эффект на введение ронколейкина, можно предположить, что здесь имеет место стрессиндуцированный ВИД, который развивается за счет снижения синтеза эндогенного лимфокина без нарушения экспрессии его рецепторного аппарата на поверхности лимфоцитов. Известно, что стрессорные гормоны блокируют продукцию ИЛ-2, но не экспрессию ИЛ-2Р [80].

Данная констатация уже сама по себе предопределяет целесообразность применения в этих условиях антистрессорных средств. С другой стороны, сопутствующий стрессорный эффект самого ронколейкина безусловно требует коррекции, поскольку вызываемое им увеличение содержания 11-ОКС в крови больных, которое сохраняется на стабильно высоком уровне даже на следующий день после завершающей инфузии, вряд ли способствует максимальному проявлению иммуноактивности дрожжевого рекомбинантного лимфокина, а скорее всего ограничивает его регуляторный потенциал.

Действительно, применение комплекса антистрессорных витаминов группы В, уменьшающего амплитуду стероидогенной реакции организма больных на введение ронколейкина (снижение 11-ОКС в крови), существенно усиливает иммуномодулирующее действие препарата (повышение общего количества циркулирующих Т-лимфоцитов, в том числе Т-хелперов и Т-супрессоров, а также А-, М-, G-иммуноглобулинов).

Показано, что антистрессорное влияние основного компонента витаминного комплекса – тиамина опосредуется инсулином [23], который ограничивает гормонообразование в надпочечниках при стрессе за счет ингибирования ключевых ферментов стероидогенеза при переключении генетического триггера кортикоцитов из состояния секреции в состояние регенерации [24], а на уровне соматических клеток-мишеней был способен уравновешивать метаболические эффекты кортикостероидов за счет реципрокной регуляции синтеза и функционирования соответствующих ферментных ансамблей [430].

In vivo тиамин [83], как и инсулин [124], усиливает иммунный ответ на эритроциты барана (ЭБ). В продуктивную фазу иммунного ответа (на 8-й день иммунизации) тиамин резко повышает количество Т-лимфоцитов (Е-РОК) в тимусе, костном мозге, а также в селезенке и бляшкообразующих клеток (БОК) – в селезенке, причем у стрессированных животных (подвергавшихся затравке CCl4) иммуномодуляция была больше, чем у интактных [208].

Важно отметить, что in vitro инсулин дозозависимо увеличивает количество антителопродуцентов в суспензии клеток селезенки мышей, иммунизированных ЭБ [76]. Поскольку в условиях in vitro тиамин не влияет на пролиферативную активность лимфоцитов, его способность поддерживать высокую чувствительность лимфоидных клеток к антигенным стимулам in vivo прямо указывает на механизм инсулинового опосредования.

При моделировании in vivo стрессорного иммунодефицита показано, что в крови крыс колебания пролиферативной активности лимфоцитов во все фазы иммобилизационного стресса отчетливо дублируют осцилляции уровня иммунореактивного инсулина. Одинаковый синфазный ритм инсулиногенеза и синтеза ДНК (включение 3Н-тимидина) в эффекторных клетках в динамике развития стрессорной реакции до и после нагрузок тиамином свидетельствует о том, что сдвиги пролиферации в обоих случаях – это инсулининдуцируемые изменения и что пролиферативный эффект витамина В1 является гормональнообусловленным [24].

При инкубации in vitro суспензии клеток селезенки мышей, иммунизированных эритроцитами барана с инсулином, теофиллином (ингибитор фосфодиэстеразы) и NaF (активатор аденилатциклазы), новообразование БОК было достоверно ниже, чем при контакте спленоцитов только с инсулином. Инсулинотропный эффект носил дозозависимый характер и был связан с изменением оптимального соотношения цГМФ/цАМФ [76]. Согласно концепции триггерного механизма [24], воздействие на функциональное состояние аденилат– и гуанилатциклаз – есть эффективный способ регуляции процессов пролиферации и дифференцировки клеток иммунной системы.

Если говорить о тиамине как базовом компоненте исследуемого комплекса антистрессорных витаминов, то из вышеизложенного следует, что его действие в отношении проявления иммунотропных эффектов ронколейкина, по-видимому, реализуется по двум взаимосвязанным направлениям: 1) через инсулинозависимое снижение стрессорной нагрузки чужеродного белкового препарата на организм больного, которая усугубляет уже имеющийся ВИД, и 2) через инсулинозависимое увеличение внутриклеточной концентрации цГМФ, который является триггером G0/G1– и G1/S-переходов в клеточном цикле лимфоцитов. В результате тиаминовой коррекции увеличивается количество активированных лимфоцитов, экспрессирующих ИЛ-2Р, и оптимизируются условия для осуществления пролиферативного процесса в целом, что в сумме дает ощутимый прирост эффективности иммуномодулирующего действия ронколейкина при сепсисе.

Фактически данный комплекс антистрессорных витаминов решает триединую задачу по обеспечению антистрессорной профилактики, коррекции и устранения ВИД, т. е. реабилитации иммунитета. Во-первых, стресслимитирующие витамины предупреждают развитие дистресса, индуцирующего ВИД (тиамин, пиридоксин), во-вторых, нейтрализуют метаболические проявления уже возникшего стресса и ограничивают проявления ВИД (тиамин, кобаламин) и, в-третьих, способствуют устранению ВИД, т. е. восстановлению клеточного пула иммуноцитов (тиамин) через подключение действия эндогенных иммуномодуляторов (инсулина) и создание благоприятных условий для действия экзогенных (ронколейкина) [24].

Таким образом, применение комплекса антистрессорных витаминов группы В при сепсисе оправдано с позиций патогенетической коррекции ВИД и усиления иммуномодулирующего действия ронколейкина. Стресслимитирующие витамины фактически обеспечивают эндогенную реактивацию иммунной системы в условиях гиперкортицизма и являются пусковым фактором последующей ре-интеграции различных звеньев иммунитета под влиянием ронколейкина, что определяет целесообразность их совместного применения в комплексной терапии сепсиса.

В клинике Гродненского медицинского университета систематический учет септического контингента проводится с 1982 г. За это время обследовано свыше тысячи пациентов. Начиная с 1994 г. витамины В1+ В6+ В12 в комбинации с иммуностимулирующей терапией здесь стали базисным лечением септических больных. Данный подход позволил снизить летальность в группе больных, подвергавшихся гемосорбции, с 37,4 до 13,3 % и с 25 до 8,3 % в группе больных, получавших ронколейкин.