В отношении Do 335 трудно говорить об оперативном применении, тем более о применении боевом. Самолет находился на ранней стадии развития, и серийное производство еще только разворачивалось, когда Германия капитулировала. Почти все самолеты находились на полигонах, заводских аэродромах и сборочных цехах. Только об отдельных машинах можно сказать, что их применяли оперативно.
Первым оперативным Do 335 стал Do 335V3. В июле 1944 года самолет оборудовали одной фотокамерой Rb 50/18 и передали в экспериментальную часть 1./Versuchsverband OKL. Самолет имел бортовой код T9+ZH. Пилотом этого самолета был Вольфганг Цизе. Как сообщается в некоторых источниках, он совершил несколько разведывательных полетов над Англией, но это кажется маловероятным. Do 335V3 был прототипом, неприспособленным для совершения боевых вылетов. Никто бы не решился отправлять новую машину в одиночный полет над территорией противника. В действительности, машина в основном стояла в ангаре, где механики отчаянно боролись с постоянно вылезающими неисправностями. Тем не менее Цизе летал над территорией Рейха совместно с реактивным самолетом Аг 234 «Blitz». После войны Цизе попал в советский плен, где его привлекали к испытанию новых самолетов. Например, он участвовал в испытаниях сверхзвукового самолета DFS 346, спроектированного в конце войны в Германии и достроенного уже в Советском Союзе. Пилот летал несколько лет, пока в 1949 году не умер от рака.
Некоторые авторы утверждают, что было построено два или три Do 335А-4. Можно предположить, что они могли попасть в 1./FAGr 1. Но это маловероятно. Во всяком случае, не известно ни одного документа, подтверждающее это предположение.
В сентябре 1944 года сформировали специальную часть Erprobungskommando 335, задачей которой было испытание Do 335 в боевых условиях. Туда передали несколько Do 335A-0 и, возможно, А-1. Задачей пилотов части было разработать тактику использования самолета в роли перехватчика, шнельбомбера и разведчика. Командиром отряда стал капитан Альфон Майер. 26 октября 1944 года в многочисленные зенитные батареи поступил специальный приказ RLM, в котором предупреждалось о появлении нового немецкого самолета. В приказе сообщались характерные черты машины: крестообразное хвостовое оперение и тандемное расположение двигателей.
Самолеты из Erprobungskommando 335 не часто вступали в непосредственный контакт с противником. Отмечено лишь несколько таких случаев. По неподтвержденным данным осенью 1944 года один Do 335 (может быть Do 335V3) был поврежден союзническими истребителями и совершил вынужденную посадку в районе Реймса. Подтверждена потеря одного Do 335. 24 декабря 1944 года во время перелета из Оберпфаффенхофена в Рехлин в районе Донефельда был потерян Do 335А-08 (W.Nr. 240108), пилотированный фельдфебелем Альфредом Волланком. Пилот погиб, причина потери самолета неизвестна. Это могла быть как механическая неисправность, так и встреча с противником. Другими жертвами «Стрелы» стали обер-ефрейтор Конрад Шефер (март 1945 года) и обер-ефрейтор Густав Теше (апрель 1945 года).
В середине апреля 1945 года пилоты 3-й эскадрильи RAF, летавшие на истребителях «Tempest», перехватили «Pfeil» над Эльбой. Уходивший на большой скорости самолет первым заметил французский ас Пьер Клостерман. Позднее Do 335 засекли пилоты 325-й истребительной группы 15-й воздушной армии США, летавшие на истребителях «Mustang». В обоих случаях немецкий самолет с легкостью ушел от преследователей. У одного Do 335 из Ekdo 335 на обшивке имелись знаки воздушных побед. Можно с уверенностью утверждать, что эти победы пилот одержал раньше, до того, как пересел в кабину Do 335.
Ни один экземпляр в модификации ночного истребителя не был закончен, но Do 335M10 вероятно все же попал в состав боевой части. Это была 1./NJG 3, возглавляемая капитаном Вернером Бааке. Пилоты эскадрильи должны были опробовать новую машину в боевых условиях. Кроме «Pfeil» эскадрилья располагала несколькими Та 154. Для эксплуатации самолетов Do 335А-6 и В-6 сформировали специальную часть V./NJG 2. Личный состав группы набрали из числа пилотов III./KG 2. Предполагалось, что первые Do 335 поступят в часть в сентябре 1944 года. Однако этих планов выполнить не удалось, и до конца войны часть летала на Ju 88G-6. Последний свой вылет (бомбардировка наземных целей) группа совершила в ночь с 27 на 28 апреля 1945 года.
Наиболее знаменитым немецким пилотом, летавшим на Do 335, был ас ночной истребительной авиации майор Вольфганг Шнауфер (121 победа). Шнауфер участвовал в испытаниях самолета и летал на первом Do 335A-1 (W.Nr. 240113). Позднее Шнауфер разбился на Do 335 в районе Гутерсло. Летчик хорошо отзывался о самолете, пророча ему успех в роли ночного истребителя. Однако он просил усилить вооружение самолета, оснастив его пушками, установленными по схеме «Schraege Musik». По некоторым данным на Do 335 однажды летал и Адольф Галланд.
Один из последних и наиболее известных полетов Do 335 имел место во второй половине апреля 1945 года. За штурвалом самолета Do 335A-02 (W.Nr. 240102, VG+PH) сидел инженер Ганс-Вернер Лерхе. Лерхе имел приказ перегнать один Do 335 из Рехлина в Оберпфаффенхофен. Первоначально ему передали самолет Do 335A-03 (W.Nr. 240103, VG+PI), но при рулежке у самолета лопнула шина. Вероятно, колесо наскочило на обломок бомбы, которыми был усеян аэродром. Запасного колеса не было, поэтому в Оберпфаффенхофен отправили другой самолет. К слову сказать, колесо А-03 позднее поменяли, и он своим ходом вернулся в Оберпфаффенхофен, но уже после войны.
Однако, вернемся к нашей истории. 20 апреля 1945 года Do 335A-02 поднялся в воздух. Лерхе, опасаясь встречи с истребителями противника, шел на малой высоте на скорости 550 км/ч. Курс он прокладывал, руководствуясь ориентирами на местности. Выяснилось, что его фактический курс на несколько градусов отличается от приборного. Лерхе планировал приземлиться в Лагер-Лехфельде, к югу от Аугсбурга, куда должен был по пути доставить важные документы. Но стало быстро темнеть, топливо подходило к концу, и пилот решил садиться на аэродром в районе Праги. При заходе на посадку возникли проблемы с шасси, но все закончилось благополучно. В 20:20, уже в темноте Лерхе посадил свой самолет.
Следующей непростой задачей было раздобыть для машины высокооктановый бензин. Чтобы заправить баки машины, Лерхе пришлось расстаться с несколькими пачками папирос. Удалось Лерхе и найти механиков, которые занялись ненадежным шасси. К счастью, неисправность удалось быстро устранить.
Еще два дня Лерхе провел на аэродроме, прикованный к земле нелетной погодой. На третий день с неба по-прежнему лился дождь, но граница облачности немного поднялась. Утром 23 апреля Do 335A-02 снова взлетел. Во время полета машина попала под огонь зенитной артиллерии, хотя точно установить чья это была артиллерия нет возможности. К счастью для Лерхе, все снаряды прошли мимо. Вскоре появился Лагер-Лехфельд. Едва Do 335 коснулся земли, аэродром подвергся налету. Налет причинил аэродрому большой ущерб, но Do 335 уцелел. Отдав документы, Лерхе снова поднял машину в воздух и взял курс на Оберпфаффенхофен. Чтобы не искушать судьбу, пилот не убирал шасси и благополучно достиг цели своего путешествия. Как оказалось, то был последний полет Do 335 во время войны.
Самолет Do 335A-02 был действительно самой счастливой машиной этого типа. Он не только пережил войну, но и благополучно сохранился до наших дней.