Введение

Структурные и функциональные изменения возникают на всех уровнях организации — молекулярном, клеточном, тканевом и на уровне целого организма — в любом организме в течение всей его жизни. Изменения, которые появляются после достижения половой зрелости, составляют феномен старения. Теоретически причина старения может быть связана с: любым уровнем организации. Все теории старения имеют некоторую ценность для понимания механизма старения, однако необходимо провести грань между первичными и вторичными, причинами этого явления. Поскольку теории основаны на наблюдаемых или вероятных изменениях структуры и функции на различных уровнях организации, необходимо вначале выяснить, являются ли эти изменения первопричиной старения или они — результат изменений, которые могут возникать на другом, более важном уровне.

Все многоклеточные организмы обладают двумя поразительными универсальными свойствами: 1) после достижения, половой зрелости у них постепенно снижается способность к адаптации, 2) все представители вида имеют более или менее постоянную продолжительность жизни. Крысы, мыши и Drosophila, которых содержат в контролируемых условиях, живут в течение времени, характерного для данного вида и линии. Очевидно, эти два универсальных свойства являются наследуемыми и контролируются генетически.

Кроме того, замечено также, что время, необходимое для достижения половой зрелости, одинаково у всех представителей вида, например 10 нед у крыс, 12 лет у человека. Репродуктивный период у всех представителей вида или линии тоже более или менее одинаков. Различные фазы развития, приводящие к репродуктивной зрелости, точно выдержаны во времени. Вероятно, изменения, возникающие во время развития, находятся под генетическим контролем и возникают в соответствии с генетической программой.

Для объяснения механизма старения на уровне гена, который является первоисточником всей информации в организме, разработано несколько теорий. В этих теориях ген расценивают как первичный участок, в котором могут возникать изменения, инициирующие процесс старения, хотя такие факторы, как температура, влажность, питание и стресс, также способны влиять на скорость старения. Теории, которые основаны на изменении содержания ферментов и гормонов, на перекрестном связывании макромолекул, накоплении возрастного пигмента, проницаемости мембран, изменениях в различных органеллах типа лизосом и митохондрий, а также на изменении гомеостаза, принимают во внимание явления, вторичные по природе, так как все они могут возникать прямо или косвенно в ответ на изменения ферментов, содержание которых контролируется главным образом генами. Например, изменения содержания ферментов, принимаемые за функцию возраста, могут быть вызваны преимущественно изменениями в транскрипции соответствующих генов, хотя определенную роль здесь играют также изменения в трансляции мРНК или скорости деградации ферментов. Гормональные сдвиги зависят от содержания ферментов, ответственных за синтез гормонов, который в свою очередь контролируется специальными генами. Усиление в пожилом возрасте перекрестного связывания макромолекул может отражать уменьшение скорости их обмена, которая зависит от уровня катаболических ферментов. И сами ферменты, участвующие в перекрестном связывании, могут изменяться при старении. Накопление старческого пигмента липофусцина может быть следствием снижения его экскреции или скорости распада побочных продуктов метаболизма. Изменение проницаемости мембран, возможно, обусловлено нарушением их фосфолипидного состава, а синтез и деградация фосфолипидов осуществляются при участии ферментов. Изменения содержания пермеаз и других белков мембраны могут появиться вслед за изменениями экспрессии генов, ответственных за их синтез. Расстройства гомеостаза происходят как во внутри-, так и во внеклеточных пространствах. События, составляющие этот процесс, регулируются главным образом гормонами и ферментами. Таким образом, указанные сдвиги являются всего лишь вторичными по отношению к изменениям, которые могут возникать на уровне генома.

Прежде чем обсуждать различные теории, которые пытаются объяснить старение на генетическом уровне, уместно рассмотреть некоторые черты старения, указывающие на участие в этом процессе генов. Хотя проявления и следствия разрушительных изменений могут различаться у разных видов живых существ, общим результатом является увеличение восприимчивости организма к различным болезням и вероятности смерти. В пределах данного класса разрушительные изменения у всех его представителей выглядят сходно, правда, их скорость может быть различной. Это хорошо видно на примере млекопитающих. Хотя максимальная продолжительность жизни человека примерно в 50 раз выше, чем у насекомоядного Sorex futneus (продолжительность жизни около 2 лет), картина возрастных изменений у тех и других более или менее одинакова, но у последних возрастные изменения происходят быстрее.

Другая важная особенность состоит в том, что в пределах вида все особи живут в течение приблизительно одинакового периода времени в данных условиях существования. Например, лабораторные крысы живут 3 года, дрозофила — 30 дней. Максимальная продолжительность жизни человека составляет около 100 лет. Эта величина является потенциалом выживания видов. Однако не все представители вида в естественных, неконтролируемых или меняющихся условиях достигают максимального возраста. Средняя продолжительность жизни заметно меньше максимальной. Например, хотя из данных статистики известно, что максимальная продолжительность жизни человека составляет около 100 лет, средняя продолжительность жизни в США к началу 20-го столетия была равна только 48 годам. С тех пор она постоянно увеличивается и в-1975 г. достигла 72 лет (см. рис. 1.3). Это вызвано преимущественно победой над инфекционными заболеваниями, ставшей возможной благодаря успехам биологической и медицинской наук, и снижением детской смертности

Другой фактор, который указывает на генетическую основу старения и продолжительности жизни, состоит в том, что потомки долгожителей имеют продолжительность жизни большую, чем средняя [102, 103]. Средняя продолжительность жизни у женщин больше, чем у мужчин. В США, Швеции и других развитых странах средняя продолжительность жизни женщин составляет 75–78 лет, а мужчин — 70–72 года. Половые различия по продолжительности жизни имеются и у животных: домашней мухи (самцы-18 дней, самки — 30), дрозофилы (самцы — 31 день, самки — 33), белой крысы (самцы — 483 дня, самки — 800) [102]. Инбридинг в короткоживущих, среднеживущих и долгоживущих линиях Drosophila melanogaster доказывает справедливость представлений о генетической основе различий продолжительности жизни у этих насекомых. Более того, продолжительность жизни идентичных близнецов одинакова [102].

В этой связи время развития и протяженность репродуктивной фазы столь же важны, как и длительность периода старения. По крайней мере у млекопитающих существует, по-видимому, положительная корреляция между временем, необходимым для достижения половой зрелости, и максимальной продолжительностью жизни [6, 57] (табл. 1.1). У вида Homo sapiens, который среди млекопитающих живет дольше всех, самый длинный период развития; у индийского слона, лошади и крупного рогатого скота период развития соответственно короче. Однако существуют исключения, особенно среди мелких животных. Эти исключения могут быть примерами адаптивных изменений, которые возникают в особых условиях обитания. У всех млекопитающих, а также у большинства других видов животных репродуктивный период занимает значительную часть жизни и сменяется пострепродуктивным периодом. Однако среди беспозвоночных и низших животных имеются случаи смерти вскоре после единственного акта размножения; таковы тихоокеанский лосось (Onchorhynchus), угорь, речная минога, небольшие однолетние рыбы и осьминог (Octopus). Вероятно, у этих видов воспроизводство вызывает резкое снижение некоторых важных факторов, которые не восстанавливаются, хотя и являются жизненно необходимыми.

В связи с этим встает вопрос о скорости репродукции, или плодовитости, о продолжительности репродуктивного периода и о продолжительности жизни после достижения половой зрелости. Мелкие млекопитающие типа грызунов, которые обладают высокой плодовитостью, имеют короткую репродуктивную фазу, а также укороченный пострепродуктивный период по сравнению с такими крупными млекопитающими, как слон, лошадь, домашний рогатый скот и человек, у которых скорость воспроизводства много ниже. Вероятно, чем быстрее воспроизводство, тем быстрее потеря определенных важных факторов и тем быстрее развитие разрушительных изменений. Однако черепахи откладывают много яиц, но тем не менее долго живут [116]. Матки общественных насекомых, пчел и термитов, которые отличаются большой плодовитостью, также имеют большую продолжительность жизни.

С вышесказанным связано наблюдение, что среди млекопитающих постепенное увеличение времени достижения половой зрелости происходит параллельно с увеличением максимальной продолжительности жизни. Это особенно очевидно для человекообразных. Во время их эволюции за последние 3 млн. лет максимальная продолжительность их жизни выросла почти в 2 раза со скоростью прироста около 14 лет на 100000 лет [23]. Это возможно только при изменениях в геноме типа мутаций и перегруппировки генов. Вызывают ли генетические изменения, результатом которых является увеличение продолжительности жизни, сокращение плодовитости, наблюдаемое у этих долгоживущих млекопитающих, или удлинение периода размножения приводит к увеличению продолжительности жизни, неизвестно.

Теперь коснемся проблемы начала и продолжительности старения. Если начало репродуктивного периода определяется для каждого вида более или менее отчетливо, то этого нельзя сказать о начале старения. Если принять время прекращения репродукции за начало старения (хотя установлено, что функциональная способность практически всех органов начинает снижаться гораздо раньше и что скорость репродукции замедляется задолго до ее прекращения), то следует отметить, что у высших млекопитающих период старения увеличивался параллельно с увеличением репродуктивного периода. Фаза старения не дает особых преимуществ, когда речь идет о выживании, сохранении и эволюции вида, и тем не менее эта фаза увеличилась. Не происходит ли это потому, что низкая скорость репродукции оказывает меньшее вредное воздействие на другие жизненные функции, которые, таким образом, дольше сохраняются? К сожалению, достоверных данных, касающихся пострепродуктивной фазы у животных, недостаточно для установления связи между периодами развития и репродукции и периодом старения.

Если даже рассматривать геном в качестве того первичного участка, где возможны перемены после достижения животным половой зрелости, необходимо иметь в виду, что изменения внеклеточного окружения, связанные с температурой, питанием и т. д., существенно влияют на функцию генома. Поэтому у представителей различных видов и популяций наблюдаются колебания во времени начала старения, его скорости и продолжительности пострепродуктивного периода.

Полученные к настоящему времени данные указывают на то, что старение имеет генетическую основу. Рядом авторов разработаны теории, в которых делаются попытки объяснить старение на уровне генома. Ниже мы обсудим теории только этого типа.

Теория соматических мутации

Росс и Скотт [104] первыми сообщили, что крысы, подвергнутые тотальному облучению, слишком слабому, чтобы вызвать какие-либо острые изменения, погибают раньше, чем необлученные контрольные животные. Затем последовали сообщения о том, что у облученных грызунов [26, 44, 108] и людей [128] симптомы старения, и смертность были такими же, как у интактных особей; было отмечено, однако, что частота опухолей у первых была выше. Поэтому предположили, что облучение вызывает ускорение процесса старения. Основываясь на этих данных, Сцилард [122, 123] предложил для объяснения старения "теорию соматических мутаций", согласна которой мутации, возникающие беспорядочно и самопроизвольно, разрушают гены и хромосомы постмитотических клеток в течение жизни организма, постоянно повышая мутационный груз. При увеличении числа мутаций и потере функциональных генов наблюдается снижение синтеза функциональных белков. Смерть клетки наступает тогда, когда мутационный груз превышает критический уровень. В результате число постмитотических клеток уменьшается, а общая функциональная активность организма снижается.

Эта теория была проверена в опытах с мышами Стивенсоном совместно с Кёртисом [118] и Кёртисом [20, 21]. Мышей облучали дозой 400 рад или им вводили химические мутагены типа азотистых аналогов иприта (0,125 мг) и затем определяли их выживание. В регенерирующей печени молодых и старых мышей исследовали также частоту хромосомных аберраций типа нерасхождения сестринских хроматид в митозе и хромосомных разрывов. У мышей из линий с различной продолжительностью жизни вызывали частичный некроз печени введением четыреххлористого углерода и подсчитывали число хромосомных аберраций после фиксации в метафазе под действием колхицина.

Было показано, что а) сокращение жизни после рентгеновского облучения зависит от дозы, б) в регенерирующих клетках печени облученных мышей повышена частота хромосомных аберраций (рис. 9.1), в) азотистые аналоги иприта не оказывают влияния ни на продолжительность жизни, ни на частоту хромосомных аберраций, г) в клетках печени короткоживущих мышей линии A/HEJ (395 дней) накапливается больше хромосомных аберраций, чем у долгоживущих мышей линии C57BL/6J (600 дней; рис. 9.2) [19]. Кёртис [20] далее предположил, что проникающая радиация повреждает постмитотические клетки больше, чем премитотические. В первых мутационные эффекты аккумулируются и клетка не может устранить их, так как она не делится. Во втором случае поврежденная клетка элиминируется и замещается неповрежденной клеткой. Клетки зародышевого пути более устойчивы к повреждению хромосом, благодаря чему возможно сохранение вида.

Рис. 9.1. Кривые выживания мышей после различных воздействий, начиная с 2-месячного возраста [20]. Кривые начинаются через 30 дней после воздействия — срока, достаточного для того, чтобы не учитывать внезапную гибель. Они показывают, что однократные массивные, но не смертельные дозы ядовитых химических веществ не уменьшают продолжительности жизни, тогда как единичные массивные, но не смертельные дозы рентгеновского облучения дают заметный эффект

Рис. 9.2. Сравнение эффекта нейтронного облучения на число хромосомных аберраций в клетках печени мышей и их возрастных изменений [22]. При однократном облучении дозой 192 рад аберрации наблюдаются в среднем) в 56 % клеток (треугольники)

Кларк и Рубин [17] изучили действие рентгеновского излучения на продолжительность жизни бабочки Habrobracon, у которой самки диплоидны, а самцы либо диплоидны, либо гаплоидны. Интактные самцы, как диплоидные, так и гаплоидные, имеют одинаковую продолжительность жизни. Однако гаплоидные особи более чувствительны к проникающей радиации, чем диплоидные. Это показывает, что соматическая мутация не может быть причиной старения; если бы это было так, то диплоидные особи имели бы большую продолжительность жизни, а диплоидные самцы и самки имели бы одинаковую продолжительность жизни. Диплоидные самцы более устойчивы к радиации. Это говорит о том, что повреждение, вызываемое облучением, восстанавливается более эффективно, если число хромосом больше, и что процесс восстановления не зависит от пола. Итак, снижение продолжительности жизни, вызванное радиацией, отличается от естественного старения. Здесь уместно процитировать Хендлера [42]: "Представление о том, что облучение приводит к преждевременному старению, верно наполовину и в широком смысле отражает нечеткость исходного параметра — продолжительности жизни".

Аналогичные наблюдения были проведены Томпсоном и Холлидеем [125] на уровне клеток in vitro. Когда фибробласты легких эмбриона человека (штамм MRC-5) обрабатывают колхицином в течение 3–6 ч, выживающая популяция содержит около 60 % тетраплоидных клеток, которые продолжают делиться. Продолжительность их жизни не отличается от продолжительности жизни диплоидных клеток. Сопоставима и скорость их роста. Если бы причиной смерти клеток было накопление мутаций или генетические дефекты, то тетраплоидные клетки должны были бы обладать большей устойчивостью и имели бы большую продолжительность жизни. Но это не так. Хён и др. [46] также наблюдали, что диплоидные фибробласты кожи человека имеют ту же продолжительность жизни, что и тетраплоидные. Если мутации и вносят свой вклад в процессе старения клеток в культуре, они не проявляют себя, в период активного роста (фаза II) и потому должны быть рецессивными. Возможно, что происходит постепенное увеличение генетического груза рецессивных дефектов, что может в итоге привести к инактивации одного или нескольких необходимых генов обеих гомологичных хромосом. Если это так, то тетраплоидные клетки могли бы противостоять большим повреждениям и имели бы большую жизнеспособность. Если мутации вредны, они вызывают гибель клеток и не аккумулируются. Диплоидные и тетраплоидные клетки, имели бы сходную продолжительность жизни только в том случае, если бы вредные мутации возникали в конце жизни.

Здесь уместно обсудить действие ионизирующей радиации на сперматогонии и виды животных с различной продолжительностью жизни. Сайнекс [114] сообщил, что приблизительная доза LD50 для сперматогониев, человека, мыши и дрозофилы составляет соответственно 50, 450, 500 и 6400 Р. Эти данные противоречат теории соматических мутаций, согласно которой клетки зародышевого пути устойчивы к мутациям, вызываемым ионизирующим излучением. Кроме того, в соответствии с этой теорией долгоживущие виды должны быть более устойчивыми к радиации, тем не менее человек, продолжительность жизни которого соответственно в 50 и 1200 раз больше, чем у мыши и дрозофилы, более чувствителен к радиации.

Уменьшение продолжительности жизни под влиянием облучения наблюдали у мыши [13, 14, 72], человека [110] и дрозофилы [3, 28, 69, 83]. Популяция дрозофилы, подвергнутая облучению дозой около 4500 рад, фактически живет дольше, чем контрольная [119]. Такой же результат получен на безмикробных мышах [127]. Симптомы, появляющиеся у облученных особей со сниженной продолжительностью жизни, отличаются от тех, которые возникают во время естественного старения без облучения. Следовательно, проникающая радиация не ускоряет процесс естественного старения, но вызывает раннюю смерть из-за повышения частоты рака или других болезней. Таким образом, укорочение жизни, вызванное ионизирующей радиацией, может представлять собой неспецифический эффект и быть следствием "радиационного синдрома", который не связан с естественным старением.

Главная трудность в оценке теории соматических мутаций состоит в отсутствии объективных способов измерения скорости накопления этих мутаций в постмитотических клетках. Единственный испробованный путь заключается в оценке смертности, которая может быть вызвана многими факторами. Кроме того, непонятно, почему клетки зародышевого пути более устойчивы к проникающей радиации. Увеличение продолжительности жизни у дрозофилы [119] и мыши [127] после воздействия излучения может быть побочным эффектом, хотя при больших дозах влияние излучения на смертность очевидно. Итак, накопление соматических мутаций не может быть причиной старения.

Следует рассмотреть другой тип изменений в хроматине, а именно повреждение структуры ДНК. Прайс и др. [94] изучали in vitro включение 3Н-тимидина в ДНК головного мозга, печени и сердца мышей различных возрастов при помощи радиоавтографии с использованием ДНК-полимеразы тимуса теленка. Более интенсивное включение наблюдали у старых мышей, что указывает на большую матричную активность ДНК. Авторы предположили, что это может быть вызвано появлением одноцепочных разрывов в ДНК, для ликвидации которых требуется дополнительный репаративный синтез. Кроме того, может иметь место утрата ферментов репарации, и тогда разрывы не восстанавливаются. Это согласуется с результатами Семиса и др. [109], которые обнаружили повышенное включение 3Н-тимидина в ДНК старых мышей. Наличие таких разрывов или повреждений ДНК в пожилом возрасте подтверждается сходными данными по чувствительности ДНК к нуклеазе S1, которая расщепляет одноцепочечные области. Четзанга и др. [16] показали, что ДНК печени старых 20-месячных мышей более чувствительна к нуклеазе S1, чем ДНК молодых (1-15 мес) мышей. Кроме того, было обнаружено, что в градиенте щелочной сахарозы ДНК головного мозга старых мышей осаждается полидисперсно в виде 4 зон, тогда как у молодых мышей осаждение монодисперсное — в виде одной зоны. Под действием нуклеазы S1 ДНК старых мышей распадается на большее число фракций с малой молекулярной массой. Предположение о деградации ДНК при старении строится также на основании данных о снижении транскрипции РНК хроматина печени в присутствии РНК-полимеразы [45].

Интенсивность внепланового репаративного синтеза ДНК в фибробластах после ультрафиолетового облучения была изучена Хартом и Сетлоу [43]. В фибробластах долгоживущих млекопитающих повреждения восстанавливались с большей скоростью, чем в фибробластах короткоживущих. Установлена линейная связь между логарифмом продолжительности жизни видов и интенсивностью включения 3Н-тимидина в их ДНК, т. е. большая продолжительность жизни может быть обусловлена более эффективной репарацией ДНК (рис. 9.3) [43]. Литтл [74] также сообщил, что репаративная способность ДНК снижена на поздних пассажах культивируемых фибробластов. Эти исследования, однако, не объясняют, почему репаративная активность ДНК снижается в пожилом возрасте или почему она больше у долгоживущих видов. Если это вызвано снижением уровня ферментов репарации, то необходимо знать причину этого снижения. Итак, имеется достаточно доказательств для утверждения, что старение не вызывается соматическими мутациями, возникающими в результате действия проникающей радиации и других экзогенных факторов.

Рис. 9.3. Зависимость между продолжительностью жизни и интенсивностью включения нуклеотида, содержащего изотоп, в ДНК фибробластов в стандартных условиях в ходе репарации после ультрафиолетового облучения [43]

Теория ошибок

Оргел [88] предложил теорию ошибок, согласно которой ошибки, появляющиеся при передаче информации на этапах транскрипции и трансляции, могут вызвать накопление дефектных белков и привести к старению. К числу ошибок относится включение неправильных нуклеотидов в мРНК во время транскрипции, что может приводить к изменению триплетных кодонов, или включение неправильных аминокислот во время трансляции, из-за чего белки частично или полностью инактивируются. Ошибки в белках, которые сами участвуют в белковом синтезе, таких, как ферменты транскрипции и трансляции, особенно усиливают процесс накопления ошибок в клетках. Эти ошибки могут саморазмножаться, вызвать экспоненциальное увеличение дефектных ферментов и белков и привести к "катастрофе ошибок", следствием которой будет старение и смерть клетки.

Накопление ошибок в ферментах, ответственных за метаболизм, может и не привести к повреждениям, так как эти ферменты имеют короткий период полужизни, вскоре деградируют и ошибка ликвидируется. Если, однако, ошибка появляется в молекуле РНК-полимеразы или аминоацил-тРНК — синтетазы, то это может быть причиной включения неправильных аминокислот во все виды белков, которые синтезирует клетка. Тогда уровень дефектных белков будет экспоненциально нарастать. Например, дефектная РНК-полимераза может способствовать появлению нескольких ошибочных нуклеотидов в мРНК различных типов, из-за чего могут появиться изменения в кодонах. Дефектная аминоацил-тРНК — синтетаза может нагрузить тРНК ошибочной аминокислотой, которая включится в белок вместо другой аминокислоты. Теория ошибок основана на предположении, что механизм передачи информации может повреждаться. Другими словами надежность, или точность, этого механизма не абсолютны и ошибки, однажды возникшие в ферментах белкового синтеза, могут распространяться.

Позже Оргел [89] модифицировал свою теорию и постулировал, что, даже если точность механизма синтеза белка не абсолютна и допускает появление ошибок, такие ошибки не обязательно накапливаются, так как последующие генерации белоксинтезирующего аппарата дискретны. Согласно Оргелу, если Cn означает частоту ошибки в n-й генерации белоксинтезирующего аппарата, R — частоту конечной ошибки и α — константу пропорциональности между числом ошибок в синтезирующем аппарате и во вновь синтезированных белках, то

Cn+ 1 = R + αCn.

Если C0= 0, то Cn= R(1 + α + α2 +… αn-1); если а > 1, то С постепенно увеличивается; если а >> 1, то частота ошибки увеличивается по экспоненте и вызывает "катастрофу ошибок".

Однако а может не быть больше 1, и тогда "катастрофа ошибок" не будет неизбежной. В таких случаях достигается постоянная частота ошибки, равная R/(1-α) [90]. Возможны две различные ситуации. Предположим, что первая генерация белоксинтезирующего аппарата, который продуцирует аминоацил-тРНК — синтетазу, рибосомные белки и т. д., не допускает ошибок. Так как точность работы аппарата не абсолютна, вторая генерация может допускать несколько ошибок, третья — еще больше и т. д. В ходе этого процесса может возникнуть одна из двух ситуаций: 1) частота ошибок рано или поздно достигнет такого высокого уровня, что клетки не смогут дальше функционировать, произойдет "катастрофа ошибок"; 2) частота ошибок может приблизиться к постоянному положительному значению или достичь равновесного уровня, при котором нельзя будет обнаружить феномен старения. Оргел [90] считает, что клетки могут создавать белоксинтезирующий аппарат, допускающий меньше число ошибок, из аппарата с более высоким уровнем ошибок; они делают это с помощью ферментов, которые убирают ошибочные белки [36], в результате чего происходит стабилизация малой частоты ошибки.

Ряд исследователей провели эксперименты с целью проверить теорию ошибок. Принц и Гросс [95] нашли, что мутант leu-5 Neurospora синтезирует термочувствительный лейцин-активирующий фермент, который при высокой температуре замещает Leu другими аминокислотами в период трансляции. При низкой температуре синтез белка протекает более или менее нормально и Neurospora имеет обычную продолжительность жизни. Однако при повышенной температуре (35 °C) мутант раньше подвергается старению. Левис и Холлидей [70] сообщили, что точность синтеза белка снижается, когда этот мутант содержится при 37 °C вместо 25. Впрочем, частота ошибок вскоре стабилизируется и остается постоянной значительное время. Однако клетки начинают стареть примерно после 70 ч. Авторы представили данные о том, что при 37 °C быстро снижаются термолабильность и удельная активность глутаматдегидрогеназы этого гриба.

Ошибки в синтезе белка могут также возникать вследствие соматических мутаций или наоборот. Поэтому эти два механизма трудно отличить один от другого. Например, ошибки в белоксинтезирующем аппарате могут привести к изменению структуры ДНК-полимер азы, которая в свою очередь может способствовать возникновению ошибок или мутаций в ДНК путем введения неправильных нуклеотидов при репликации [49].

Если накопление ошибок является причиной старения клеток, то необходимо ответить на ряд вопросов. Например, вопрос, который поставил сам Оргел [90], заключается в следующем: почему ошибки не накапливаются в клетках зародышевого пути? Если бы они там накапливались, то виды вымерли бы. Оргел предполагает, что процессы "контроля качества" могут действовать в период оогенеза и раннего развития и приводить к элиминации яйцеклеток или эмбрионов с высоким уровнем ошибок, как это происходит с яйцеклетками человека в пожилом возрасте. Другой вопрос состоит в том, как и почему такой механизм "контроля качества", если он существует, прекращает функционировать после завершения развития? Более того, если возникновение ошибок есть причина старения, прекращения деления клеток и их смерти, то отсюда следует, что трансформированные или опухолевые клетки не должны содержать ошибок. Маловероятно, чтобы репликация ДНК и синтез белка протекали в трансформированных клетках, с абсолютной точностью. Если при трансформации надежность увеличивается, то как это осуществляется?

Старение клеток in vitro рассматривали под другим углом зрения. Культивируемые клетки человека имеют ограниченный потенциал удвоения популяции, тем не менее иногда в культуре появляются клетки, которые делятся неопределенно долго. Кирквуд и Холлидей [68], Холлидей и др. [48] и Кирквуд [67] полагают, что клетки в культуре потенциально бессмертны, но в процессе роста культуры возникают определенные клетки, которые необратимо коммитированы к старению и смерти. Эти клетки какое-то время нормально размножаются, но после "инкубационного периода" М (который определяется числом делений между коммитированием и смертью) они стареют и погибают. Некоммитированные клетки продолжают делиться.

Предполагается, что клеточная популяция первоначально не коммитирована и может расти без ограничения, удваивая свой объем с каждым следующим делением до тех пор, пока при (М+1) — м делении не появятся погибшие клетки из числа первых коммитированных, которые уже достигли конца инкубационного периода. Тогда рост популяции замедляется и в дальнейшем зависит от значения фактора вероятности Р.

Если вероятность коммутирования и инкубационный период достаточно велики (Р>0,5), то число некоммитированных клеток в популяции прогрессивно снижается до 1 на 106 клеток, в итоге клетки погибают и выбывают из популяции. К этому времени все оставшиеся клетки коммитированы к старению, отчего популяция и становится смертной. Если вероятность коммитирований мала (Р<0,5) или продолжительность инкубационного периода невелика, то популяция может перейти в состояние устойчивого равновесия, при котором в ней будут находиться в постоянных соотношениях небольшая часть некоммитированных клеток, большое количество коммитированных и постоянная доля нежизнеспособных клеток. Размер клеточной популяции, таким образом, прямо связан с вероятностью потери последних некоммитированных клеток в культуре. Однако при обычной методике культивирования размер культуры ограничен и избыток клеток отбрасывается; если объем культуры не очень велик, то некоммитированные клетки теряются при "разведении". Обычно культуры содержат 106-107 клеток. Экспериментальные данные показывают, что если Р0,275, то М55-60. В зависимости от величин Р, М и числа клеток культуры либо растут непрерывно с постоянным уровнем коммитированных, некоммитированных и отживающих клеток, либо стареют и погибают. В связи с изложенным возникает ряд вопросов. Почему клетки становятся коммитированными и прекращают деление? Что влияет на этот процесс — геном или цитоплазм этические факторы? Иногда действительно в культуре находят фибробласты, которые делятся непрерывно, но они, как правило, отличаются от нормальных клеток необычным числом хромосом. Коммитирование клеток перед дифференцировкой происходит в раннем периоде развития, в результате чего некоторые клетки становятся неделящимися, т. е. постмитотическими. Это относится к нейронам, клеткам скелетной и сердечной мышц, которые синтезируют определенные белки и выполняют специфические функции. Вместе с тем некоторые клетки продолжают делиться на протяжении всей жизни, например клетки костного мозга и эпителия. Клетки того и другого типа, таким образом, являются коммитированными; как полагают, коммитирование возникает в результате дифференциальной экспрессии генов, что зависит от расположения клеток, а также от вне- и внутриклеточных факторов. Холлидей и др. [48] и Кирквуд [67] не объясняют, по какой причине клетки коммитируются к старению.

Кирквуд [67] предположил, что коммитирование соматических клеток в культуре может быть вызвано накоплением ошибок, так как этот процесс хуже регулируется вне организма. Он утверждает, что ошибки внутренне присущи всем процессам передачи макромолекулярной информации: "Для того, чтобы поддерживать дальнейшие эволюционные изменения и таким образом увеличивать возможность максимального выживания, любой организм должен совершать случайные ошибки кодирования". Создается впечатление, что организм знает, что он должен эволюционировать, и поэтому делает ошибки. Этот взгляд близок к идеям Вейсмана, которые были дискредитированы. Знает ли организм, где и когда делать ошибки, чтобы эволюционировать? Правда, если точность системы переноса информации была бы абсолютной, то, вероятно не было бы эволюции. Хоффман [47] сообщил, что механизм трансляции исключает ошибки, и, следовательно, "катастрофа ошибок" здесь невозможна. Кирквуд и Холлидей [68] указывают на нереальность такой точки зрения; они предполагают, что белоксинтезирующий аппарат может стабильно работать, даже: если он ошибается. Если обозначить общий уровень ошибок буквой R, то при малых значениях этой величины процесс накопления ошибок достигает стационарного состояния, а при больших R приводит к "катастрофе ошибок". Кирквуд и Холлидей считают, что эти явления лежат в основе эволюции. Мартин и др. [80] предположили, что in vivo клетки сохраняют способность к делению даже в старом возрасте. Средняя продолжительность жизни культуры (число удвоений популяции) составляет ∼ (42-0,2 X), где X — возраст донора. Следовательно, клетки даже 90-100-летнего индивидуума способны к 20–25 удвоениям популяции. Кирквуд [67] считает, что, как только клетки в культуре становятся коммитированными, размер популяции резко падает. Сходное положение может возникнуть in vivo, в результате чего орган теряет клетки, а следовательно, и активность. Это может быть обусловлено переходом белоксинтезирующего аппарата от стабильного состояния к нестабильному и появлением ошибок в белках.

По предположению Хопфилда [60] можно избежать ошибок репликации путем затраты дополнительной энергии на тщательное считывание информации или на разрушение дефектных макромолекул. "Ферменты-чистильщики" могут удалять ошибочные белки. Точность синтеза в клетках зародышевого пути, необходимая для сохранения наследственной информации, для соматических клеток не столь существенна. Если в соматических клетках будет поддерживаться большая точность синтеза, то затраты энергии будут слишком велики. Кирквуд [67] предположил, что старение может быть следствием выключения механизмов, ответственных за высокую точность работы аппарата трансляции до или во время дифференцировки соматических клеток; этим достигается экономия энергии. Таким образом, соматические клетки функционируют в нестабильном режиме, происходит постепенное нарастание числа ошибок, что приводит через некоторое время к старению и "катастрофе ошибок". Однако известно, что отмирают и эмбриональные клетки (гл. 1). Почему именно эти, а не другие клетки коммитируют к старению на такой ранней стадии, почему возникают ошибки и что регулирует их уровень? Приведенные доводы не объясняют различий между клетками разных типов, такими, как нейроны и мышечные клетки, которые полностью прекращают деление, или клетки печени, которые постоянно медленно пролиферируют, или эпителиальные и кроветворные клетки, которые интенсивно делятся в течение (Всей жизни. Кроме того, связь между старением клеток in vitro и старением всего организма сомнительна, было показано, что фибробласты цыплят и человека имеют ограниченную продолжительность жизни, в то же время фибробласты быка, кролика, хомяка, крысы и мыши обладают неограниченной способностью к делению, хотя если потенциал удвоения популяции имеет какое-нибудь отношение к продолжительности жизни, можно было ожидать, что у этих клеток он должен быть меньше.

Ряд экспериментальных данных противоречит возможности появления ошибок в белках в таких количествах, которые могли бы вызвать старение или "катастрофу ошибок". Канунго и Ганди [59] сравнивали малатдегидрогеназу печени молодых и старых крыс иммунологическими методами. Они не обнаружили возрастных различий в свойствах ферментов. Следовательно, ген малатдегидрогеназы не подвергается с возрастом никаким структурным изменениям. Кинетические, электрофоретические и иммунологические исследования ацетилхолинэстеразы головного мозга [84] и аланинаминотрансферазы печени [93] также показали отсутствие явных возрастных различий. В дальнейшем это заключение подтвердилось тем, что карты триптических гидролизатов актина и миозина скелетной мышцы молодых, взрослых и старых (8, 21 и 84 нед) крыс оказались одинаковыми [117]. Очевидно, первичная структура ферментов при старении не изменяется.

Позже в исследованиях альдолазы из печени мыши [32,33] и цитоплазматической пероксид-дисмутазы из печени головного мозга и сердца крыс и мышей [97, 99] было показано, что антигенность, Км, Ki, электрофоретическая подвижность в полиакриламидном геле и полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия одинаковы для молодых и старых животных. Более того, при изоэлектрофокусировании этих ферментов не ВЫЯВИЛИ никаких различий в их электрических зарядах [39]. Наблюдали только различия в таких свойствах, как удельная активность фермента (ед/мг белка), которая была понижена у старых особей, и чувствительность к температуре, которая была повышена. Эти сдвиги были отнесены к посттрансляционным химическим изменениям типа фосфорилирования, ацетилирования, дезаминирования, аденилирования, окисления SH-групп и т. д., которые не определяются при электрофорезе в полиакриламидном геле [30]. Такие измененные молекулы имеют пониженную удельную активность и с возрастом накапливаются.

Однако сообщалось о различиях в антигенных свойствах альдолазы и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы из эритроцитов молодых и старых людей [55, 82]. Частоты соматических мутаций, установленные по изменениям глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы [27] и хромосомным отклонениям [125], значительно выше у старых животных. Ягил [131] показал, что электрофоретическая подвижность, электроиммунодиффузия и чувствительность к температуре глюкозо-6-фосфат — дегидрогеназы печени одинаковы у молодых и старых мышей.

Исследования Гершона и его коллег показали близость величин Км, Ki, молекулярной массы и электрофоретической подвижности изоцитрат-лиазы [31] и альдолазы [133] у молодых и старых особей свободноживущей нематоды Turbatrix aceti. Однако ферменты старых животных обладали пониженной антигенностью и удельной активностью. Ротстайн и сотрудники изучили ряд ферментов молодых и старых Turbatrix aceti: изоцитрат-лиазу (рис. 9.4) [100], енолазу [111–113], триозофосфатизомеразу и фосфоглицераткиназу [40, 41], и в каждом случае молекулярная масса, Км, термостабильность и электрофоретическая подвижность были сходными. Каталитическая активность, однако, была ниже в старом возрасте, что, как предположили авторы, может быть вызвано полной инактивацией молекул фермента, но не включением ошибочных аминокислот. Возрастные изменения изоцитрат-лиазы, енолазы и фосфоглицераткиназы были также исследованы в гомогенной популяции Turbatrix aceti; гомогенность культуры достигалась удалением вновь появляющихся особей через равные интервалы времени. В старом возрасте каталитическая активность всех исследованных ферментов снижалась. Кроме того, енолаза старых особей отличалась по антигенности от фермента молодых животных [113]. На основе этих данных Ротстайн [105, 106] предположил, что наблюдаемые различия вызваны конформационными изменениями, но не замещением аминокислот.

Рис. 9.4. Зависимость общей активности изоцитрат-лиазы, преципитированной данным количеством антител, от возраста круглого червя Tyrbatrix aceti [100]

Были сделаны попытки определить накопление ошибок в белках в зависимости от возраста культивируемых фибробластов. Холлидей и Террент [49] описали увеличение доли неактивной и термолабильной глюкозо-6-фосфат — дегидрогеназы на поздних пассажах фибробластов MRC-5. Лактатдегидрогеназа фибробластов поздних пассажей этой линии отличалась по антигенности от фермента ранних пассажных клеток [71]. Голдстайн и Мёрмен [37] представили сходные данные по трем ферментам фибробластов кожи человека. Имеются данные не только о значительном уменьшении точности работы ДНК-полимеразы в клетках поздних пассажей (что изучалось с помощью синтетических матриц), но и об уменьшении скорости элонгации репликона [73]. Большой процент ошибок, регистрируемый этими авторами, вряд ли присущ нормальным клеткам; поскольку он был бы для них катастрофичным, не исключено, что регистрируемая неточность считывания обусловлена использованием в качестве матриц синтетических полинуклеотидов. Мартин и др. [79] не обнаружили различий в термочувствительности и антигенности ферментов клеток ранних и поздних пассажей в культуре WI-38. Следовательно, иммунные и каталитические свойства, а также положение при электрофокусировании фосфоглицераткиназы, пируваткиназы типа М2, глюкозофосфатизомеразы и глюкозо-6-фосфат — дегидрогеназы не отличаются у фибробластов ранних и поздних пассажей. Не изменяется также скорость, а следовательно, и надежность репликации вирусов.

Ферменты β-N-ацетилглюкозаминидаза, α-глкжозидаза и α-N-ацетилгалактозаминидаза лизосом и NADH-дегидрогеназа митохондрий молодых и старых фибробластов WI-38 имеют сходную термолабильность [52]. РНК-полимераза, которая участвует в синтезе белка и, согласно Оргелу, является одним из основных виновников появления ошибок, была изучена Ивенсом [25]. Он не нашел различий в термолабильности и удельной активности ферментов, полученных из молодых и старых клеток.

Гервин и др. [29] измерили ошибки считывания poly (U) in vitro в неочищенных препаратах, полученных в различное время из E. coli, растущей в присутствии дигидрострептомицина, который, как известно, вызывает ошибки трансляции. Они наблюдали значительное увеличение ошибок считывания poly (U), но их уровень достигал стабильных значений в присутствии антибиотика в течение нескольких генераций. Исследования Эделмена и Гелланта [24] in vivo дали сходные результаты. Оценка ошибочной трансляции (включение цистеина в флагеллин) у E. coli в присутствии стрептомицина показала, что частота ошибки становится в 50 раз выше, чем в норме, и затем стабилизируется на одном уровне (рис. 9.5). Таким образом, даже если ошибки появляются в процессе трансляции, то, как и предполагали Гоел и Икес [35], достигается стабилизация ее точности. Поэтому маловероятно, чтобы первопричиной старения было возникновение ошибок в процессе переноса информации.

Рис. 9.5. Кинетика частоты ошибки в присутствии и в отсутствие стрептомицина [24]. Культура АС92 была выращена в отсутствие стрептомицина, и в ней была измерена частота фоновой ошибки. В момент, отмеченный стрелкой, добавляли 5 мкг/мл стрептомицина и измеряли частоту ошибки на протяжении более чем восьми последующих генераций. После двух генераций в присутствии стрептомицина из культуры отбирали аликвоту, отмывали минимальной средой без добавок для удаления стрептомицина и ресуспендировали в среде с добавками. Снова вычисляли частоту ошибки. Культуру метили 3 Н-аланином (53 Ки/ммоль) и 35 S-сульфатом (2 мКд/нмоль) и выделяли флагеллин, как описано ранее [24]. Сплошная линия и темные значки — частота ошибок в клетках, растущих в присутствии стрептомицина; штриховая линия и светлые значки — частота ошибок в клетках после удаления стрептомицина; светлые и темные кружки и треугольники обозначают данные, полученные в двух экспериментах. Длина горизонтальных линий на значках указывает на фракции той генерации, в пределах которой включалась метка

В заключение можно сказать, что существует очень много данных о снижении в пожилом возрасте на 30–70 % удельной активности альдолазы А и В [32, 33] и пероксид-дисмутазы у крыс [[98, 99], а также изоцитрат-лиазы [31, 100], фруктозобисфосфат-альдолазы [133], енолазы [111] и фосфоглицераткиназы [41] у Turbatrix aceti. Для нескольких ферментов установлены различия в термолабильности и антигенных свойствах. Вместе с тем удельная активность триозофосфатизомеразы Turbatrix aceti [40] и орнитиндекарбоксилазы печени крыс [86, 87] не изменяется.

При измерении других параметров перечисленных ферментов: Км, Ki, электрофоретической подвижности и молекулярной массы никаких существенных различий не обнаружено. Каковы же причины возрастных изменений свойств ферментов? Использование совершенной методики типа изоэлектрофокусирования, с помощью которой можно разделять белки, отличающиеся только суммарным электрическим зарядом, не выявило никаких отличий между пероксид-дисмутазами молодых и старых крыс [39, 98, 99]. Более того, когда провели двумерное картирование белков верхних шейных нервных узлов молодых и старых крыс, также не нашли никаких различий, причем в одном направлении белки разделялись в соответствии с их изоэлектрической точкой, а в другом — в соответствии с их молекулярной массой [129]. Триптические карты актина и миозина скелетной мышцы молодых и старых крыс оказались одинаковыми [117].

Таким образом, имеются убедительные данные, которые показывают, что с увеличением возраста ошибки типа замещения аминокислот в белках не возникают в сколько-нибудь существенном количестве ни in vivo, ни in vitro. Появление ошибок является случайным процессом, и если бы они возникали, то существовали бы белки с замещенными аминокислотами, однако такие белки не обнаружены. Кроме того, более или менее постоянную продолжительность жизни видов и постепенное ослабление функции с увеличением возраста нельзя объяснить теорией ошибок, так как для того, чтобы иметь отношение к упомянутым феноменам, ошибки должны возникать с определенной скоростью. Приходится предполагать, что частота ошибок регулируется генами или другими факторами, что противоречит основной идее теории ошибок. Следовательно, маловероятно, чтобы причиной старения было нарастание ошибок в функциональных макромолекулах с возрастом.

Что же тогда служит причиной снижения удельной активности и увеличения термолабильности ферментов, наблюдаемых я пожилом возрасте? Считают, что эти изменения могут появляться в результате незначительных посттрансляционных модификаций белков типа гликозилирования, метилирования и т. д., которые не меняют суммарного электрического заряда молекулы [30]. Это возможно в том случае, если увеличение с возрастом времени полужизни T½ ферментов обусловлено снижением скорости их деградации. В этом случае молекулы сохраняются дольше и в большей степени подвергаются действию трансфераз, трансаминаз и т. д. Величина T½ белков будет возрастать, если снижается активность протеаз. Следовательно, необходимо объяснить, почему в старческом возрасте снижается активность ферментов деградации типа протеаз. Таким образом, рассмотренные гипотезы (теория ошибок и посттрансляционных изменений) являются поверхностными, они не вскрывают основной причины старения.

Теория ограничения кодона

Эта теория основана на предположении, что надежность трансляции в клетках зависит от точности считывания триплетных кодонов в молекуле мРНК. [2, 120, 121]. За точное считывание кодонов ответственны в основном тРНК и аминоацил-тРНК — синтетазы. Для кодирования двадцати аминокислот используется 61 триплетный кодон, причем генетический код является вырожденным, т. е. несколько аминокислот кодируются двумя или большим числом кодонов, которым соответствуют две или более изоакцепторных тРНК. Способность к аминоацилированию у разных изоакцепторных тРНК различна. Поэтому количественные изменения в спектре изоакцепторных тРНК могут влиять на скорость считывания и трансляцию. Используются те триплетные кодоны, для которых имеются в наличии соответствующие аминоацил-тРНК. Известно, что молекулы тРНК подвергаются посттранскрипционным модификациям оснований типа метилирования цитозина. Колебания степени этих модификаций могут влиять на аминоацилирование, а следовательно, и точность считывания кодонов мРНК во время трансляции.

Аминоацил-тРНК — синтетазы также играют большую роль в трансляции, так как они распознают соответствующие тРНК и нагружают их специфическими аминокислотами. Они существуют в виде изоферментов. Изменения их специфичности могут привести к неточному аминоацилированию тРНК, неправильному считыванию кодонов и включению неподходящих аминокислот, т. е. синтезу ошибочных белков. Таким образом, точность трансляции является ключевым фактором для сохранения нормальной активности клеток и нормального функционирования организма. Согласно рассматриваемой теории, после достижения половой зрелости может происходить потеря точности трансляции вследствие изменения тРНК и аминоацил-тРНК — синтетаз, что и является причиной старения.

Изменения изоакцепторных тРНК и аминоацил-тРНК — синтетаз возникают как при развитии, так и при старении. Семядоля сои полностью стареет за 21 день. Она содержит 6 изоакцепторных тРНК для Leu и 3 — для Tyr. Доля двух из этих шести тРНКLeu увеличивается между вторым и пятнадцатым днями. Содержание одной из изоакцепторных тРНКTyr снижается в течение 15 дней, тогда как количество другой в этот период увеличивается. Одновременно изменяется активность лейцил-тРНК — синтетаз; через 21 день активность синтетазы по отношению к изоакцепторным тРНК 1–4 резко снижается, но скорость ацилирования изоакцепторных тРНК 5 и. 6 остается высокой.

Количественные изменения изоакцепторных тРНКArg и тРНКTyr происходят во время старения свободноживущей нематоды Turbatrix aceti [101]. Айлен и др. [53] наблюдали изменения тРНКTyr и тРНКLeu и соответствующих синтетаз в период развития насекомого Tenebrio molitor. Исследования Хосбаха и Кабли [51] показали, что тРНК, выделенные из 35-дневной Drosophila melanogaster, аминоацилируются хуже, чем тРНК, выделенные из, 5-дневных насекомых. Кроме того, аминоацилирующая активность некоторых синтетаз старых мух составляет только, 50 %. уровня, характерного для молодых особей. По крайней мере одна из изоакцепторных тРНК (для Arg, He, Leu и Lys) хрусталика глаза и мышцы быка в период развития приобретает. 2-3-кратное количественное преимущество [91]. Хроматографические профили тРНКSer и тРНКPhe, выделенных из головного мозга и почки эмбриона кролика, существенно отличаются от профилей соответствующих тРНК из тканей взрослых кроликов.

Печень плода крысы содержит 6 изоакцепторных тРНКTyr, тогда как печень взрослого животного — только при [132]. Мейз и др. [81] обнаружили, что паренхиматозные клетки печени старых крыс содержат быстродеградирующую фракцию тРНК, которая отсутствует у крыс среднего возраста. К тому же тРНК старых крыс аминоацилируется хуже, чем тРНК из тканей животных среднего возраста, что может быть обусловлено различиями в их посттранскрипционных модификациях, особенно при метилировании оснований. При старении изменяется содержание изоакцепторных TPHKLys HTPHKSer. Особое значение имеет увеличение содержания изоакцепторных TPHKLys четвертого типа у старых крыс.

Эндогенные факторы, например гормоны, изменяют профиль тРНК. Профили тРНКSer, тРНКArg и TPHKLys меняются в печени петуха после введения эстрогена [8, 11, 76]. Поскольку содержание гормонов, особенно стероидов, с возрастом меняется (гл. 5), параллельно могут происходить изменения в тРНК, что в свою очередь отражается на синтезе белка.

Существует много данных о том, что профили тРНК и аминоацил-тРНК — синтетаз подвергаются последовательным изменениям во время дифференцировки и развития. В соответствии с рассматриваемой теорией к старению могут приводить изменения в скорости синтеза или репрессии различных изоакцепторных тРНК и (или) аминоацил-тРНК — синтетаз, происходящие по окончании репродуктивного периода. Однако специфические тРНК транскрибируются со специфических генов так же, как и мРНК для специфических синтетаз. Изменение профилей изоакцепторных тРНК напоминает изменение состава изоферментов, наблюдающееся на протяжении всей жизни (гл. 3). Теория ограничения кодона не объясняет, какие факторы, ответственные за изменение экспрессии генов, способны изменить содержание тРНК и синтетаз, или какие факторы, ответственные за посттранскрипционные модификации тРНК, влияют на ее специфичность по отношению к синтетазам. Изменения функциональных молекул этих двух типов в течение жизни аналогичны изменениям изоферментов и, следовательно, также являются вторичными. Итак, данная теория так же, как и все предыдущие, не способна выявить причины старения.

Теория генной регуляции

Все эукариоты обладают двумя характерными особенностями: 1) их способность адаптироваться в естественных условиях постепенно снижается после достижения половой зрелости, 2) все представители вида имеют более или менее постоянную, продолжительность жизни (табл. 1.1). Более того, установлена корреляция между длительностью развития и долголетием. Старение нельзя рассматривать как изолированную и независимую фазу жизни; его следует оценивать в совокупности с периодом развития и репродуктивным периодом, так как эти два периода влияют не только на, продолжительность жизни, но и на скорость, длительность и характер процесса старения. В этой связи уместно разобраться в следующих вопросах.

1. Имеется ряд данных, указывающих на то, что раннее, развитие есть результат последовательной активации и репрессии специфических генов.

а) Если обработать личинку Chironomus экдизоном, гормоном линьки, то гены, локализованные в различных хромосомах их слюнных желез, последовательно активируются, что заметно по образованию пуффов [18].

б) Различные цепи гемоглобина, синтез которых контролируется разными генами, при внутриутробном развитии человека образуются последовательно [134]. Гемоглобин 1-2-месячного плода представляет собой молекулы α2ε2. Затем появляется гемоглобин α2γ2, основной гемоглобин плода (foetal, HbF). Гемоглобин взрослых HbA, α2β2, появляется сразу после рождения. Гены α-, ε-, λ- и β-цепей активируются последовательно один за другим, но ген α-цепи остается активным с первого месяца внутриутробного развития до конца жизни. Кроме того, когда активируется ген γ-цепи, ген ε-цепи репрессируется, а, репрессия гена γ-цепи совпадает с активацией гена β-цепи во, время рождения. Другой факт, на который следует указать, состоит в том, что эти гены остаются активными в течение разных промежутков времени: ε — в течение ~2 мес, γ — в течение ~8 мес и β — всю Жизнь начиная с рождения. Факторы, ответственные за последовательное включение этих генов, неизвестны. Предполагают, что важную роль в этом процессе; играет уровень кислорода, поступающего к плоду в матке.

в) В период раннего развития морского ежа Lutechinus гистон Н1 одного типа (H1m) вырабатывается на стадии. морулы. Затем на стадии гаструлы образуется гистон другого типа, Hlg [4, 107]. Набор белков в тканях личинки Drosophila melanogaster меняется по мере ее развития [5]. Это указывает на последовательное изменение активности соответствующих генов. Все ткани личинки имеют некоторые общие белки, но каждая немногими белками все же отличается от другой.

г) Изоферменты лактатдегидрогеназы не только тканеспецифичны, они изменяются также во время развития [77, 78]. Было обнаружено [62, 115], что доля лактатдегидрогеназы М4 в сердце, головном мозгу и скелетной мышце старых (96 нед) крыс значительно снижена. Поскольку две субъединицы лактатдегидрогеназы, Н и М, кодируются разными генами, полученные данные говорят о том, что в старом возрасте ген для субъединицы М почему-то репрессируется. Аланинаминотрансфераза представляет собой димер, состоящий из субъединиц двух типов, А и В. Исследования аланинаминотрансферазы печени крыс показали, что ген А активен в раннем периоде жизни. При старении крыс ген А репрессируется, а ген В активируется, так что в старческом возрасте (100 нед) димерный фермент образуют только субъединицы В [60, 93]. Для глюкозофосфатизомеразы и алкогольдегидрогеназы дрозофилы с возрастом также наблюдается постепенное изменение изоферментных спектров (гл. 3). Полученные результаты указывают на то, что последовательная активация и репрессия генов происходит не только в период развития, но и на протяжении всей жизни.

2. В ряде работ было показано, что возрастные изменения ферментов обратимы, с возрастом активность одних ферментов снижается, других — повышается. Некоторые ферменты не подвержены возрастным изменениям (гл. 3). Уровни определенных ферментов, которые снижаются в пожилом возрасте, можно повысить введением стероидных гормонов, например холин-ацетилтрансферазы и ацетилхолинэстеразы головного мозга [54], пируваткиназы ткани сердца [15], тирозинаминотрансферазы [97] и аланинаминотрансферазы печени [92] крыс. Лаг-фаза индукции некоторых ферментов гормонами с возрастом увеличивается [1]В дальнейшем для удобства мы будем называть возраст, соответствующий периоду развития, молодым, или незрелым; возраст, соответствующий репродуктивному периоду, — средним, или зрелым, и возраст, соответствующий периоду старения, — старым, или старческим. — Прим перев.
. Это отражает уменьшение числа рецепторов или их сродства к гормонам [61]. Вместе с тем изменения в хроматине могут привести к ослаблению его связывания с комплексом гормон — рецептор, следствием чего будет ухудшение ответа на гормоны. В общем, однако, содержание некоторых ферментов можно изменить введением стероидных гормонов in vivo. Поскольку действие этих гормонов опосредовано экспрессией генов, результаты этих работ показывают, что те изменения, которые связаны с перестройкой функции генома, являются обратимыми.

3. а) Для того чтобы выяснить, изменяется ли с возрастом первичная структура белков, были изучены некоторые ферменты у молодых и старых животных. Замещение любой аминокислоты в белке указывало бы на изменение кодона соответствующего гена или на появление ошибок во время транскрипции/трансляции. Кинетические и иммунологические исследования малатдегидрогеназы [59], аргиназы [96], ацетилхолинэстеразы [84] и цитоплазматической аланинаминотрансферазы [93], выполненные Канунго и сотр., показали, что первичная структура этих ферментов у старых крыс, по-видимому, такая же, как у молодых. Сривастава [117] провел триптическое картирование актина и миозина скелетных мышц молодых, взрослых и старых крыс и никаких различий не обнаружил.

б) Работы Гершона и его сотрудников [30, 98, 99, 133] и Ротстайна и его сотрудников [106, 111] показали, что величины Км, Ki, электрофоретическая подвижность и положение при изоэлектрофокусировании различных ферментов нематоды Turbatrix aceti и крыс с возрастом не меняются. Снижение удельной активности и увеличение термолабильности ферментов в старом возрасте, по-видимому, обусловлено незначительными посттрансляционными изменениями боковых групп аминокислот, но не замещениями аминокислот. Хотя определение первичной структуры белков молодых и старых животных является лучшим способом для выяснения, остаются ли последовательности аминокислот специфических белков одинаковыми в течение всей жизни, этот способ вызывает некоторые возражения. Поскольку очистка любого фермента включает этапы, на которых происходит разделение молекул белка по ряду свойств, может происходить элиминация любого измененного белка. Поэтому обычно выделяют только те белки, которые имеют одинаковую первичную структуру. Однако современный уровень знаний позволяет утверждать, что первичная структура белков и, следовательно, последовательность нуклеотидов в соответствующих генах с возрастом не меняются.

Почему же тогда изменяется с возрастом содержание ферментов, кодируемых специфическими генами? Эти изменения, ответственные за перестройку различных функций, отмечаются на протяжении всей жизни. Если структура генов не зависит от возраста, то содержание ферментов может изменяться в результате функционирования или экспрессии генов, трансляции или обмена ферментов. Транскрипция и период экспрессии генов — наиболее ранние стадии синтеза белка, нарушение которых может быть причиной изменения уровня ферментов. Гены образуют комплексы с белками двух видов, гистонами и негистоновыми хромосомными белками (НГБ), которые могут влиять на их экспрессию. Гистоны — это основные, неспецифические белки, обладающие общим репрессивным действием на функцию гена. Они подвержены различным модификациям типа фосфорилирования, ацетилирования, метилирования и ADPрибозилирования которые в разной степени влияют на их ассоциацию с ДНК. Кроме того, степень подобных модификаций снижается не только с возрастом, но и после транскрипции [64–66].

НГБ гетерогенны и участвуют в тонкой регуляции экспрессии генов. Они также подвергаются ковалентным изменениями которые модулируются эффекторами типа эстрадиола и кальция [64]. НГБ принимают участие в транскрипции (гл. 2).

Ковалентные изменения хромосомных белков и их модуляция эндогенными эффекторами могут быть главной причиной, изменения экспрессии гена; они индуцируются в различные периоды жизни, вызывая изменения уровней продуктов генов, в. том числе ферментов, и побочных продуктов, таких, как гормоны и метаболиты (гл. 2). Последовательные появления и исчезновения белков во время дифференцировки проста являются показателем подобных изменений экспрессии гена. Как предположили Каплан и Ордал [12], на самой ранней стадий развития экспрессируется большинство генов, а по завершении развития все большее число генов становится необратимо репрессированным, что приводит к появлению клеток различных типов. Полагают, что это происходит под действием внутри- и межклеточных модуляторов. Бенкс и Мехеффи [7] предположили, что за дифференцировку ответственна сходная цикличная репрессия генов. В обоих случаях уровни модуляторов являются критическими для репрессии некоторых генов в одних, но не в других клетках. Так образуются дифференцированные клетку.

Возникает вопрос, каким образом после прохождения стадии дифференцировки и по достижении организмом способности к воспроизведению изменяется функциональное состояние генома, что приводит к снижению репродуктивной активности и началу старения. В 1970 г. Канунго [56] предложил генно-регуляторную теорию и в 1975 г. он [57] разработал ее в виде модели, которая объясняет два характерных признака старения: а) снижение функциональной активности и б) фиксированную продолжительность жизни представителей одного вида.

Нарушение функций после достижения половой зрелости

В соответствии с моделью старение [57, 58] может развиваться в результате изменения экспрессии генов после достижения половой зрелости. Как видно из схемы (рис. 9.6), дифференцировка и рост сопровождаются последовательной активацией и репрессией определенных уникальных генов, функционирующих только в этих фазах. Основные и побочные продукты генов, ответственные за дифференцировку и рост, достигают критического содержания и стимулируют другие уникальные гены, продукты которых, например половые стероидные гормоны, обусловливают переход к репродуктивному периоду. Репродуктивная способность жизненно необходима для сохранения и эволюции вида. Некоторые генные продукты, образующиеся в репродуктивной фазе, в свою очередь подавляют функцию генов роста и дифференцировки, в связи с чем дальнейший рост организма прекращается у большинства животных после короткого периода размножения. Вопрос состоит в том, почему репродуктивный период не продолжается беспредельно.

Рис. 9.6. Модель старения с некоторыми изменениями по Канунго [57]. Верхняя часть — условное изображение различных периодов жизни: развития, репродуктивного периода и старения. Нижняя часть — схема последовательной активации и репрессии генов; для большей ясности Число активных генов на рисунке сведено к минимуму, а постоянно репрессированные гены вообще не показаны. Период развития и репродуктивный период зависят от уникальных генов А-F и G-L соответственно. Согласно этой модели, никаких специфических генов старения не существует. Развитие начинается в результате последовательной активации генов А-F, продукт гена. А включает ген В и т. д. Некоторые гены поздней фазы развития Е и F включают уникальные гены G и H, функционирующие в раннем репродуктивном периоде. Эти гены в свою очередь последовательно включают другие гены репродуктивного периода. Организм достигает половой зрелости, когда образуется необходимое количество генных продуктов. При непрерывном размножении может происходить потеря определенных факторов, необходимых для сохранения активности некоторых важных генов. Выключение этих генов может привести к нарушению определенных функций. При непрерывном размножении могут также накапливаться выше критического уровня другие продукты (факторы), в результате чего будут активироваться нежелательные гены М и N, продукты которых могут быть причиной аутоиммунных заболеваний. Таким образом, снижение физиологических функций, наблюдаемое после некоторого периода размножения, может зависеть от дестабилизации работы генов в репродуктивном периоде

Репродуктивная способность организма наиболее высока вскоре после достижения половой зрелости. Однако при репродукции определенные факторы могут утрачиваться и, будучи утраченными, уже не возмещаются. А между тем эти факторы могут быть исключительно важны для поддержания определенных генов в состоянии экспрессии или репрессии, тогда как другие факторы в процессе репродукции могут накапливаться, что не только влияет на экспрессию определенных генов, но может приводить к активации некоторых нежелательных генов, например генов вирусов, которые обычно остаются репрессированными. В результате всех этих событий может произойти дестабилизация тех уникальных генов, от функционирования которых зависит репродуктивная способность. Иными словами, в репродуктивном периоде нарушается гомеостатический контроль. Происходит постепенное снижение плодовитости, что отчетливо регистрируется вскоре после достижения половой зрелости.

В соответствии с этой моделью, если организм обладает механизмом, при помощи которого он способен возместить утрату факторов, вызываемую длительной репродукцией, или предотвратить накопление нежелательных факторов выше критического уровня, его репродуктивный период и продолжительность жизни будут длиннее. И действительно, данные по продолжительности жизни млекопитающих указывают на существование такого механизма, так как у них в процессе эволюции происходило постепенное увеличение продолжительности жизни, особенно репродуктивного периода [23]. Причиной этого явления могли быть мутации генов, ответственных за данный период, которые, вероятно, в процессе эволюции подверглись отбору. Уменьшение репродуктивной способности и других функциональных показателей организма является следствием незавершенности этого процесса. Однако ограниченность репродуктивного периода косвенно благоприятствует видам, так как быстрая смена поколений способствует эволюции. Таким образом, короткий репродуктивный период и ограниченная продолжительность жизни были благотворными для видообразования.

Здесь уместно привести последние данные о влиянии одного гормона на функцию другого. Ниссенсон и др. [85] обнаружили, что 17β-эстрадиол повышает уровень рецепторов окситоцина в матке кролика и, таким образом, усиливает ее сократимость в ответ на окситоцин. Вместе с тем прогестерон снижает уровень окситоциновых рецепторов, а также сократимость матки. В старом возрасте содержание одних стероидных гормонов снижается, а некоторых других — не меняется (гл. 5). Происходящие сдвиги могут быть следствием размножения. Дисбаланс содержания гормонов и других эффекторов, вызванный репродукцией, а также такими факторами, как температура, питание и стресс, может привести к дестабилизации экспрессии генов, необходимых для размножения.

Репродуктивный период уникален в том отношении, что в этом периоде вырабатывается несколько единственных в своем роде факторов, например гормоны. Присутствие какого-либо гормона, необходимого для экспрессии одного или немногих генов, в очень высокой концентрации может оказать обратное действие на экспрессию тех генов, которые зависят от других гормонов. Таким образом, незначительные изменения содержания гормонов и других метаболитов-эффекторов могут дестабилизировать гомеостатический контроль в репродуктивном периоде. Сходные результаты наблюдаются даже в. том случае, если животные по каким-либо причинам не способны к размножению. Обоюдное влияние одного гормона на другой может возникнуть после достижения их максимальных концентраций в период половой зрелости, что приведет к дестабилизации генов. Таким образом, изменения содержания гормонов и других модуляторов, прямо или косвенно влияющих на функцию генома, могут привести к постепенному снижению репродуктивной активности и к старению. Для изменений содержания модуляторов характерен не аддитивный, а скорее синергичный эффект, что может быть причиной экспоненциального снижения функциональных показателей организма при старении. Так, общая скорость нарушения функций у человека между 70 и 80 годами много выше, чем между 60 и 70 годами.

Определение продолжительности жизни

Продолжительность жизни видов можно приблизительно, разделить на три периода: развитие, репродуктивный период (размножение) и старение. Каждый период имеет характерную протяженность, скорость и регуляторные механизмы. Начало, скорость и продолжительность периодов развития и размножения зависят от уникальных наборов генов, которые последовательно активируются и репрессируются. Продолжительность этих периодов изменяется в определенных пределах и на нее влияют как эндогенные, так и экзогенные факторы: питание, стресс и температура. От этого зависит изменчивость продолжительности всей жизни и ее отдельных периодов у особей данного вида.

Вариабельность продолжительности периодов жизни, наблюдаемая, например, у млекопитающих, зависит от времени, требующегося для активации или репрессии необходимых генов. Количество ДНК и число генов, активирующихся в каждом периоде жизни, у различных видов млекопитающих могут различаться очень мало. Продолжительность жизни человека примерно в 50 раз превышает продолжительность жизни землеройки, но по количеству ДНК эти виды отличаются друг от друга незначительно. Время, необходимое для активации и репрессии генов, и содержание эффекторов, участвующих в этих процессах, могут детерминировать не только длительность, но и скорость прохождения каждого периода.

Новые виды, которые эволюционируют из предшествующих, могут обладать более коротким или более длинным по сравнению с последними сроком жизни. Это обусловлено генетическими изменениями: делецией, транслокацией, дупликацией, перестройкой и мутацией одного или нескольких генов в одном или нескольких периодах жизни. В результате меняется реактивность генов по отношению к эффекторам и укорачивается или удлиняется, один или несколько периодов жизни, т. е. изменяется, общая ее продолжительность. Например, если ген D (рис. 9.6) изменится так, что потребуется больше времени для его активации под влиянием продукта предыдущего гена, из-за чего побочный продукт последнего также будет производиться дополнительно, то будет наблюдаться удлинение фазы роста начиная с этого периода. Вместе с тем ген D может измениться таким образом, что содержание его продукта достигнет порогового уровня раньше и раньше активирует следующий ген последовательности. Такая перестройка приведет к сокращению данного периода и общей продолжительней жизни. Аналогичные изменения гена J в репродуктивном периоде могут удлинить этот период и следовательно, повлиять на продолжительность жизни. Такие изменения одного или нескольких генов в периоде репродукции у короткоживущих млекопитающих, которые быстро достигают половой зрелости, могли повлечь за собой постепенное удлинение этого периода и вызвать развитие долгоживущих млекопитающих. Если активация гена J ускорится, то за этим последует сокращение репродуктивного периода. Такие генетические изменения, которые способствуют созреванию организма в подходящее время, создают селективные преимущества. Генетические сдвиги, которые приводят к созреванию в неподходящее время, действуют против отбора. Первые будут способствовать лучшему выживанию и развитию особей, они будут отобраны и помогут сохранению вида. Такие изменения функции генов могли играть большую роль в процессе отбора, что существенно для эволюции.

Ускорение или замедление последовательных процессов активации и репрессии генов может начаться в любой точке данной последовательности функционирования генов для каждого периода и зависит от того, где именно происходит изменение одного или нескольких генов. Поэтому периоды жизни формируются каждый раз, когда возникают новые виды. Это может приводить к укорочению или удлинению жизни новых видов по сравнению с их предками и определять различия в продолжительности жизни родственных видов млекопитающих (табл. 1.1). Другие механизмы, которые изменяют продолжительность и скорость протекания каждого периода, могут быть связаны со временем, необходимым для процессинга гяРНК в мРНК в ядре и для трансляции мРНК.

Подтверждение модели

В соответствии с рассматриваемой моделью (рис. 9.6) изменения в генах, происходящие в определенное время данного периода, могут повлиять не только на длительность и скорость протекания данного периода, но и на общую продолжительность жизни. Основные положения этой модели подтверждаются симптомами наследственных болезней человека — прогерии и синдрома Вернера. Причиной прогерии является мутация аутосомного гена. В этом случае, даже если новорожденный ребенок кажется нормальным и нормально растет, примерно в 6-летнем возрасте у него обнаруживаются признаки старения, а в 8 лет появляются такие старческие симптомы, как атеросклероз, накопление липофусцина, поседение волос и пр., т. е. ребенок выглядит как преждевременно состарившийся человек. Кроме того, фибробласты, полученные от 9-летних больных прогерией, претерпевают меньшее число удвоений популяций, чем фибробласты здорового 9-летнего ребенка. Очевидно, такое состояние вызвано изменениями в одном или нескольких генах, необходимых, согласно модели, для развития организма. Мутация в этих генах, возможно, препятствует синтезу важного фактора (факторов), который необходим для дальнейшего развития и роста ребенка. Отсутствует инициация перехода в репродуктивный период, так как это событие зависит от включения нескольких уникальных генов, осуществляемого факторами, которые продуцируются в относительно поздней стадии развития, а эти факторы у больных прогерией не образуются. Следовательно, рост не завершается, сокращается период развития и полового созревания не происходит. С момента экспрессии мутантных генов продолжительность жизни сокращается. Не исключено, что продукты мутантных генов включают функционирование каких-то нежелательных генов. Было бы важно выяснить, продуцируются ли при этом половые гормоны и в каком количестве. Подобно прогерии, синдром Вернера также является наследственным заболеванием, которое вызывается мутацией аутосомного гена. У больных с синдромом Вернера развитие по длительности и характеру протекает более или менее нормально. По-видимому, мутации происходят в одном или нескольких генах, ответственных за инициацию и поддержание половой функции в репродуктивном периоде. В этом случае сокращается репродуктивный период, а следовательно, и продолжительность жизни. Исследование большого числа мутаций у человека и животных, которые изменяют длительность развития и репродуктивного периода, могло бы внести ясность в этот вопрос.

Другим подходящим примером является феномен "внезапной смерти", наблюдаемый у самки осьминога [130]. Самки осьминога Octopus hummelincki откладывают яйца только один раз; высиживая их, они отказываются от пищи и погибают вскоре после вылупления молодых особей. Если после кладки у животного удаляют обе глазные железы, оно не высиживает яйца, продолжает питаться и расти и долго живет. Очевидно, в глазной железе вырабатываются определенные факторы, ответственные за высиживание и прекращение приема пищи, из-за чего наступает старость и смерть. Удаление железы или этих факторов предохраняет животное от ранней гибели. По-видимому, в процессе кладки яиц может истощиться запас каких-то веществ, способных стимулировать зрительные железы к образованию гормонов, изменяющих поведение. Было бы важно установить, сохранит ли жизнеспособность и будет ли расти самка осьминога, если ее подвергнуть стерилизации. Сходное явление наблюдается у лосося и некоторых насекомых.

Резюме

Каждый вид имеет уникальный набор генов, необходимых для развития и размножения. Их последовательная активация/репрессия, начиная с оплодотворения, определяет продолжительность периода развития и начало репродуктивного периода. Продолжительность репродуктивного периода зависит от способности организма возмещать утраченные факторы и (или) предупреждать накопление некоторых других факторов. Утрачиваемые факторы могут быть необходимы для поддержания определенных генов в активном состоянии, а других — в репрессированном. Факторы, которые накапливаются, могут инициировать некоторые нежелательные гены, например гены вирусов, или воздействовать на функцию других важных генов. Результатом дисбаланса факторов и модуляторов является потеря организмом репродуктивной и других функций, т. е. старение. Последней рассмотренной теорией не предусматриваются никакие уникальные гены, которые вызывают старение. Не предполагается также, что старение запрограммировано как развитие и размножение. Тогда как периоды развития и размножения находятся под контролем уникальных генов, которые активируются или репрессируются в определенное время, в соответствии с данной моделью никакие специальные гены в процессе старения не участвуют. Следовательно, старение нельзя считать запрограммированным событием, иначе нужно допустить существование специфических генов, предназначенных для этой цели и отобранных в ходе эволюции, которые активируются в определенное время после репродуктивного периода. Предполагают, что физиологическое старение — только следствие полового созревания, причем оно реализуется и в том случае, когда размножение не осуществляется. Преждевременное старение, как видно на примерах прогерии и синдрома Вернера, является патологическим и вызывается мутациями. Оно возникает вследствие дестабилизации гомеостатического контроля генов, функционирующих в репродуктивном периоде. Отсюда следует возможность продления репродуктивного периода путем улучшения функции генома, например возмещением утраченных факторов или удалением накопившихся вредных продуктов, и действительно, у млекопитающих в ходе эволюции отмечено постепенное увеличение продолжительности жизни, в частности репродуктивного периода. Это указывает на то, что происходил отбор в пользу видов с большей продолжительностью жизни и более длинным репродуктивным периодом. Следовательно, предположение об эволюции старения так же невероятно, как предположение о программировании старения по аналогии с периодами развития и размножения. Несомненно, старение сыграло в эволюции положительную роль, так как оно способствовало избавлению популяции от неразмножающихся особей, что создавало условия для размножения более молодых; тем самым оно благоприятствовало обновлению вида. Благодаря этому появлялись особи с новыми свойствами, более перспективными для отбора и эволюции.

Литература

1. Adelman R. C . In: Enzyme Induction (D. V. Parke, Ed.), 303–311, Plenum Press, New York (1975).

2. Andron L. A., II, Strehler B. L . Mech. Age. Dev., 2, 97-116 (1973).

3. Atlan H., Miquel J., Binnard R. M . J. Gerontol., 24, 1–4 (1969).

4. Arceci R. J., Senger D. R., Gross P. R . Cell, 9, 171–178 (1976).

5. Arking R . Devi. Biol., 63, 118–127 (1978).

6. Asdell S . Patterns of Mammalian Reproduction, Comstock Publishing Co., Ithaca, New York (1946).

7. Banks H. R., Mahaffy J. M . J. Theo. Biol., 74, 323–324 (1978).

8. Bemfield M. B., Maetvpac P. H . Cancer Res., 31, 684–687 (1971).

9. Bick M. D., Liebke H., Cherry J. H., Strehler B. L . Biochim. Biophys. Acta, 204, 175–182 (1970).

10. Bick M. D., Strehler B. L . Proc. nat. Acad. Sci., USA, 68, 224–228 (1971).

11. Busby W., Hele P . Biochim. Biophys. Acta, 224, 413–422 (1970).

12. Caplan A. I., Ordahl C. P . Science, 201, 120–130 (1978).

13. Casarett G. W . J. Gerontol., 11, 436–439 (1956).

14. Casarett G. W . Adv. Gerontol. Res., 1, 109–163 (1961).

15. Chainy G. B. N., Kanungo M. S . Biochim. Biophys. Acta, 540, 65–72: (1978).

16. Chetsanga C. J., Boyd V., Peterson L., Rushlow K . Nature, 253, 130–131 (1976).

17. Clark A., Rubin M. A . Radiat. Res., 15, 244–248 (1961).

18. Clever V., Romball C. G . Proc. nat. Acad. Sci., USA, 56, 1470–1473 (1966).

19. Crowley C, Curtis H. J . Proc. nat. Acad. Sci., USA, 49, 626–628 (1963).

20. Curtis H. J . Science, 141, 686–694 (1963).

21. Curtis H. J . Fed. Proc, 23, 662–667 (1964).

22. Curtis H. J . Biological Mechanisms of Aging, Thomas, Springfield (1966),

23. Cutler R. G . Proc. nat. Acad. Sci., USA, 72, 4664–4668 (1975).

24. Edelmann P., Gallant J . Proc. nat. Acad. Sci., USA, 74, 3396–3398 (1977).

25. Evans G . In: The Biology of Aging (B. L. Strehler, Ed.), 170–175, Am. Inst. Biol, Sci., Washington (1960).

26. Failla G . In "The Biology of Aging" (B. L. Strehler Ed.), 170–175. Am. Inst. Biol. Sci., Washington (1960).

27. Fulder S. J., Holliday R . Cell, 6, 67–75 (1975).

28. Gartner L. P . Gerontologia, 19, 295–302 (1973).

29. Garvin R. T., Rosset R., Gorini L . Proc. nat. Acad. Sci., USA, 70, 2762–2766 (1973).

30. Gershon D . Mech. Age. Dev., 9, 189–196 (1979).

31. Gershon H., Gershon D . Nature, 227, 1214–1217 (1970).

32. Gershon H., Gershon D . Mech. Age. Dev., 2, 33–41 (1973).

33. Gershon H., Gershon D . Proc. nat. Acad. Sci., USA, 70, 909–913 (1973).

34. Gershon D., Reznick A., Reiss U . In: Biochemistry of Aging (N. Kharasch, Ed.), Raven Press, New York (1978).

35. Goel N. S., Yeas M. J . Theo. Biol., 55, 246–282 (1975).

36. Goldberg A. L . Proc. nat. Acad. Sci., USA, 69, 422–426 (1972).

37. Goldstein S., Moerman C. J . Nature, 255, 159 (1975).

38. Goldstein S., Moerman C. J . New Eng. J. Med, 292, 1306–1309 (1975).

39. Goren R., Reznick A. Z., Reiss U., Gershon D . FEBS Lett., 84, 83–86 (1977).

40. Gupta S. K., Rothstein M . Arch. Biochem. Biophys., 174, 333–338 (1976).

41. Gupta S. K., Rothstein M . Biochim. Biophys. Acta, 445, 632–644 (1976).

42. Handler P., Fed . Proc. (Suppl. 8), 20, 46–50 (1961).

43. Hart R. W., Setlow R. B . Proc. nat. Acad. Sci, USA, 71, 2169–2173 (1974).

44. Henshaw P. S . Radiology, 69, 30–36 (1957).

45. Hill B. T., Whelan R. D. H . Gerontology, 24, 326–336 (1978)

46. Hoehn H., Bryant E. M., Johnston P., Norwood T. H., Martin G. M . Nature, 258, 608–609 (1975).

47. Hoffman O. W . J. molec. Biol, 86, 349–362 (1974).

48. Holliday R., Huschtscha L. I., Tarrant G. M., Kirkwood T. B. L . Science, 198, 366–372 (1977).

49. Holliday R., Tarrant G. M . Nature, 238, 26–30 (1972).

50. Hoofield J. J . Proc. nat. Acad. Sci., USA, 71, 4135–4139 (1974).

51. Hosbach H. A., Kubli E . Mech. Age. Dev, 10, 131–140 (1979).

52. Houben A., Remade J . Nature, 275, 59–60 (1978).

53. Ilan J., Han J., Patel N . J. biol. Chem, 245, 1275–1281 (1970).

54. James T. C., Kanungo M. S . Biochim. Biophys. Acta, 538, 205–211 (1978).

55. Kahn A., Boivin P., Vibert M., Cottrean D., Dreyfus J. C . Biochimie, 56, 1395–1407 (1974).

56. Kanungo M. S . Biochem. Rev. (India), 41, 13–23 (1970).

57. Kanungo M. S . J. Theo. Biol., 53, 253–261 (1975).

58. Kanungo M. S . Interdisc. Topics. Gerontol, 10, 100–107 (1976).

59. Kanungo M. S, Gandhi B. S . Proc. nat. Acad. Sci, USA, 69, 2035–2038 (1972).

60. Kanungo M. S., Patnaik S. K . In: Regulation of Growth and Differentiated Function in Eukaryote Cells (G. P. Talwar, Ed.), 479–490, Raven Press, New York (1975).

61. Kanungo M. S., Patnaik S. K., Koul O . Nature, 253, 366–367 (1975).

62. Kanungo M. S., Singh S. N . Biochem. Biophys. Res. Commun, 21, 454–459 (1965).

63. Kanungo M. S, Thakur M. K . Biochem. Biophys. Res. Commun, 79, 1031–1036 (1977).

64. Kanungo M. S., Thakur M. K . Biochem. Biophys. Res. Commun, 86, 14–19 (1979).

65. Kanungo M. S, Thakur M. K . J. Steroid Biochem, 11, 879–887 (1979).

66. Kanungo M. S., Thakur M. K . Biochem. Biophys. Res. Commun, 87, 266–271 (1979).

67. Kirkwood T. B. L . Nature, 270, 301–304 (1977).

68. Kirkwood T. B. L., Holliday R. J . Theo. Biol., 53, 481–496 (1975).

69. Lamb M. J., McDonald R. P . Expl. Gerontol., 8, 207–217 (1973).

70. Lewis C. M., Holliday R . Nature, 228, 877–880 (1970).

71. Lewis C. M., Tarrant G. M . Nature, 239, 316–318 (1972).

72. Lindop P. J., Rotblat J . Proc. Rov. Soc. (B) bond, 154, 332–368 (1961).

73. Linn S., Kairis M., Holliday R . Proc. nat. Acad. Sci, USA, 73, 2818–2822 (1976).

74. Little J. B . Gerontologia, 22, 28–55 (1976).

75. Macieira-Coelho A., Daitloff C., Malaise E . Gerontology, 23, 290–305 (1977).

76. Maenpac P. H., Bemfield M. B . Biochemistry, 8, 4926–4935 (1969).

77. Markert C. L., Moller F . Proc. nat. Acad. Sci, USA, 45, 753–763 (1959).

78. Markert C. L., Ursprung H . Devi. Biol, 5, 363–381 (1962).

79. Martin G. M., Ogburn C. E., Sprague C. A . 10th Internat. Cong. Gerontol, Vol. 1, p. 68 (1975).

80. Martin G. M., Sprague C., Epstein C . Lab. Invest, 23, 86–92 (1970).

81. Mays L. L., Lawrence A. E., Ho R. W., Ackley S . Fed. Proc, 38, 1984–1988 (1979).

82. Mennecier F., Dreyfus J. C . Biochim. Biophvs. Acta, 364, 329–336 (1974).

83. Miquel J., Bensch K. G., Philpott D. E., Atlan H . Mech. Age. Dev, 1, 71–97 (1972).

84. Moudgil V. K., Kanungo M. S . Biochim. Biophys. Acta, 329, 211–220 (1973).

85. Nissenson R., Flouret G., Hechter O . Proc. nat. Acad. Sci., USA, 75, 2044–2048 (1978).

86. Obenrader M., Prouty W. F . J. biol. Chem., 252, 2860–2865 (1977).

87. Obenrader M., Prouty W. F . J. biol. Chem., 252, 2866–2872 (1977).

88. Orgel L. E . Proc. nat. Acad. Sci., USA, 49, 517–521 (1963).

89. Orgel L. E . Proc. nat. Acad. Sci., USA, 67, 1476–1480 (1970).

90. Orgel L. E . Nature, 243, 441–445 (1973).

91. Ortwerth B. J . Biochemistry, 10, 4190–4197 (1971).

92. Patnaik S. K, Kanungo M. S . Biochem. Biophys. Res. Commun., 56, 845–850 (1974).

93. Patnaik S. K., Kanungo M. S . Ind. J. Biochem. Biophys., 13, 117–124 (1976).

94. Price G. B., Modak S. P., Makinodan T . Science, 171, 917–920 (1971).

95. Printz D. B., Gross S. R . Genetics, 55, 451–467 (1967).

96. Rao S. S., Kanungo M. S . Ind. J. Biochem. Biophys., 11, 208–212 (1974).

97. Ratha B. K., Kanungo M. S . Mech. Age. Dev., 6, 431–439 (1977).

98. Reiss U., Gershon D. Europ. J . Biochem., 63, 617–623 (1976).

99. Reiss U., Gershon D . Biochem. Res. Commun., 73, 255–262 (1976).

100. Reiss V., Rothstein M . J. biol. Chem., 250, 826–830 (1975).

101. Reitz M. S., Sanadi D. R . Expl. Gerontol., 7, 119–129 (1972).

102. Rockstein M . Ln: Theoretical Aspects of Aging (M. Rockstein, Ed.), 1-10, Academic Press, New York and London (1974).

103. Rockstein M., Chasky J. A., Sussmann M. L . In: The Handbook of the Biology of Aging (C. E. Finch and L. Hayflick, Eds.), 3-34, Reinhold, New York (1977).

104. Ross S., Scott G . Brit. J. Radiol., 12, 440–444 (1939).

105. Rothstein M . Mech. Age. Dev., 6, 241–257 (1977).

106. Rothstein M . Mech. Age. Dev., 9, 197–202 (1979).

107. Ruderman J., Baglioni C., Gross P. Nature, 247, 36–38 (1974).

108. Sacher G. A . Radiology, 67, 250–257 (1956).

109. Samis H. V., Jr., Falzone J. A., Jr., Wulff V. J . Gerontology, 12, 79–88 (1966).

110. Seltsen R., Sartwell . Amer. J. Epidemiol., 81, 2-22 (1965).

111. Sharma H. K., Gupta S. K., Rothstein M . Arch. Biochem. Biophys., 174, 324–332 (1976).

112. Sharma H. K., Rothstein M . Biochemistry, 17, 2869–2876 (1978).

113. Sharma H. K., Rothstein M . Mech. Age. Dev., 8, 341–354 (1978).

114. Sinex F. M . In: Theoretical Aspects of Aging (M. Rothstein, Ed.), 23–31, Academic Press, New York (1974).

115. Singh S. N., Kanungo M. S . J. biol. Chem., 243, 4526–4529 (1968).

116. Spector W. E . (Ed.). In: Handbook of Biological Data, 182–184, W. B. Saunders Co., London (1956).

117. Srivastava S. K . Biochemical changes in rats during aging, Ph. D. Thesis, Banaras Hindu University, Varanasi, India (1977).

118. Stevenson K. G., Curtis H. J . Radiat. Res., 15, 774–784 (1961).

119. Strehler B. L . J. Gerontol., 19, 83–87 (1964).

120. Strehler B. L . Time, Cells and Aging, pp. 307–324, Academic Press, New York and London (1977). [Имеется перевод 1-го изд.: Стрелер Б. Время, клетки и старение. — М.: "Мир", 1964.]

121. Strehler B. L., Hirsch G., Gusseck D., Johnson R., Bick M. J . Theo. Biol., 33, 429–474 (1971).

122. Szilard L . Nature, 184, 958–960 (1959).

123. Szilard L . Proc. nat. Acad. Sci., USA, 45, 30–45 (1959).

124. Thakur M. K., Das R., Kanungo M. S . Biochem. Biophys. Res. Commun., 81, 828–831 (1978).

125. Thompson K. V. A., Holliday R . Expl. Cell. Res., 96, 1–6 (1975).

126. Thompson K. V. A., Holliday R . Expl. Cell. Res., 112, 281–287 (1978).

127. Walburg H. E., Cosgrove G. E., Upton A. C . In: Radiation and Aging (P. J. Lindop and G A. Sacher, Eds.), 361–365, Taylor and Francis Ltd., London (1966).

128. Warren S. J . Amer. Med. Assoc, 162, 464–468 (1956)

129. Wilson D. L., Hall M. E., Stone G. C . Gerontology, 24, 426–433 (1978).

130. Wodinsky J . Science, 198, 948–951 (1977).

131. Yagil G . Expl. Gerontol., 11, 73–78 (1976).

132. Yang W. K . Cancer Res., 31, 639–643 (1971).

133. Zeelon P., Gershon H., Gershon D . Biochemistry, 12, 1743–1750 (1973).

134. Zuckerkandl E . Scient. Amer., 212, 110–118 (1965).