Введение

Вся биологическая информация в живых организмах заключена в генетическом материале, т. е. в ДНК. Поэтому любое повреждение структуры и нарушение функций генетического материала может привести к изменениям структуры и функций организма. В процессе развития многоклеточных организмов в генетическом материале наблюдаются функциональные изменения двух типов. Во-первых, несмотря на то что все клетки образуются из единственной зиготы, на ранних стадиях развития происходит их дифференцировка, вследствие чего определенные клетки производят специфические белки, которые не продуцируются другими клетками. Вот несколько примеров такой специфичности: гемоглобин образуется в эритроцитах, иммуноглобулины — в лимфоцитах, инсулин — в β-клетках островков Лангерганса, казеин — в молочной железе и т. п. Эти белки закодированы в специфических генах, которые присутствуют в клетках всех типов. Однако в результате дифференцировки эти гены активны только в специфических клетках и неактивны в других. В противоположность этому гены гистонов, негистоновых хромосомных белков, ферментов гликолиза и т. п. активны во всех видах клеток, благодаря чему эти белки имеются во всех клетках.

Во-вторых, хотя на ранних стадиях развития репликация ДНК, а затем деление клеток происходят во всех клетках, после некоторого периода увеличения числа клеток и развития организма на определенных стадиях дифференцировки в клетках некоторых типов синтез ДНК и деление клеток прекращаются. В качестве примера можно привести нейроны, а также клетки скелетной и сердечной мышцы позвоночных, которые перестают делиться вскоре после рождения, т. е. становятся постмитотическими. Некоторые из них по окончании периода развития стареют и умирают, но большая часть продолжает функционировать в течение всей жизни. Так, в клетках костного мозга, эпителия и т. п. синтез ДНК и деление продолжаются на протяжении всей жизни, т. е. эти клетки остаются премитотическими.

Каково же значение этих двух функциональных изменений в ДНК для организма и для процесса старения? Все многоклеточные организмы начинают стареть после достижения половой зрелости. Являются ли причиной старения дифференцировка и (или) постмитотическая природа клеток? Будет ли предотвращено старение, если остановить одно или оба изменения ДНК? Являются ли эти функциональные изменения ДНК необратимыми? Известно, что ДНК в клетках не находится в изолированном состоянии. Она связана в комплекс с белками двух типов: гистонами и негистоновыми хромосомными белками (НГБ), которые вместе с ДНК образуют надмолекулярный комплекс, называемый хроматином и представляющий собой генетический аппарат эукариотов. Три компонента присутствуют в комплексе приблизительно в равных пропорциях. Здесь же обнаружена и РНК, однако полагают, что она является продуктом транскрипции ДНК, а не структурным компонентом. Функция ДНК известна, роль же белков в функционировании хроматина определена недостаточно. Изменяются ли они в течение жизни? Для того чтобы выяснить, вносят ли вклад в процесс старения изменения в одном или нескольких компонентах хроматина, необходимо установить его химический состав и структуру. Структура и функции хроматина описаны в нескольких обзорах [12, 57, 74, 112, 116, 199,354].

Гистоны

Гистоны — белки с малой молекулярной массой — обнаружены в хроматине всех эукариотов. Их впервые открыли в 1943 г. Стедман и Стедман [330]. Эти белки имеют основной характер и положительно заряжены при физиологических значениях рН, поскольку они богаты лизиновыми и аргининовыми остатками. Они не содержат триптофана и присутствуют в клетках в отношении 1:1 с ДНК. Имеется пять основных типов гистонов: Н1, H2A, H2B, Н3 и Н4, которые различаются по величине соотношения лизина и аргинина. Их легко разделить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (рис. 2.1). Некоторые характеристики гистонов из тимуса теленка приведены в табл. 2.1.

Таблица 2.1. Параметры гистонов из тимуса теленка

Рис. 2.1. Электрофореграмма гистонов в полиакриламидном геле

Важное свойство всех гистонов состоит в том, что их положительно заряженные лизиновые и аргининовые остатки образуют кластеры в особых областях полипептидной цепи. Этим и объясняется наличие во вторичной структуре гистонов вытянутых β-структур. Очевидно, эти положительно заряженные β-структуры связываются с отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК сильнее, чем с другими группами. Нейтрализация положительных зарядов в гистонах должна приводить к их отделению от ДНК. Из табл. 2.1 видно, что гистоны H2A, H2B, Н3 и Н4, находящиеся внутри нуклеосом, имеют больше вытянутых β-структур, чем гистон Н1, расположенный между нуклеосомами.

Прокариоты не имеют гистонов. Появление гистонов совпало с возникновением ясно выраженных ядер, хромосом и процесса дифференцировки. Гистоны подавляют синтез РНК [167] и ДНК [142] in vitro. При полном или частичном удалении гистонов из хроматина сильно увеличивается его матричная активность. Однако маловероятно, чтобы гистоны контролировали или регулировали транскрипцию генов, так как: а) имеется только пять основных видов гистонов, тогда как геном эукариотов содержит несколько тысяч генов; б) количество гистонов обычно постоянно в клетках всех типов и во всех периодах жизни; в) количество гистонов одинаково в метаболически активных и метаболически неактивных клетках. Следовательно, можно предположить, что гистоны включены в структуру и организацию хроматина и действуют как общие репрессоры его активности.

Гистон Н1

Гистон Н1 очень богат лизином — около 25 % входящих в его состав аминокислотных остатков составляет лизин. Он отделяется от ДНК гораздо легче других гистонов. Этому гистону свойствен полиморфизм, т. е. в одной ткани может быть несколько видов гистона Н1 с различными последовательностями аминокислот. В тимусе и печени крыс обнаружены пять изогистонов Н1. Относительное содержание изогистонов Н1 в разных тканях одного и того же организма различно [58, 114, 189, 190] и изменяется в течение клеточного цикла [160]. Показано, что различные подфракции гистона Н1 морского ежа синтезируются на разных стадиях развития яйца. В некоторых яйцах одна фракция гистона Н1 заменяется на другую во время перехода от бластулы к гаструле; в других это изменение происходит во время вылупления. Разные фракции гистона Н1 из тимуса кролика дают различные спектры кругового дихроизма с ДНК фага Т7 [370]. Отсюда следует, что различные подфракции гистона Н1 имеют различные функции [8, 307].

При изучении последовательности аминокислот подфракций гистона Н1 было показано, что в отличие от остальных четырех гистонов он имеет основной концевой COOH-участок. Концевая NH2-область (1-40) также имеет основной характер (24–39). В концевой NH2-области изогистонов Н1 найдено большое число аминокислотных замен. Эти замены, по-видимому, определяют функциональные различия изогистонов Н1 во взаимодействии с НГБ и эффекторами, а также в связывании с ДНК. Концевая NH2-область представляет собой неупорядоченную спираль. Центральный участок [(39±4)-(116±4)] кроме большого числа аминокислот кислотного характера и двух ароматических аминокислот содержит неполярные аминокислоты. Этот участок способен к образованию вторичной глобулярной структуры. Он в основном инвариантен и весьма консервативен, т. е. все гистоны Н1 различных организмов имеют в этой области практически одну и ту же последовательность аминокислот. По-видимому, она играет существенную роль в структуре хроматина.

Концевая COOH-область является сильно основной из-за наличия большого числа лизиновых остатков и весьма консервативна внутри одного вида. Поэтому она может играть общую роль во всех гистонах Н1. Она также представляет собой неупорядоченную спираль. Эта область в основном ответственна за связывание с ДНК. Предполагают, что основные области гистона Н1 связываются с ДНК, а неполярная и глобулярная центральная область взаимодействует с другими молекулами [77, 89, 154]. Стафилококковая дезоксирибонуклеаза специфически расщепляет хроматин между нуклеосомами, в результате чего образуются фрагменты ДНК, связывающие две соседние нуклеосомы. Показано, что гистон Н1 соединяется приблизительно с 30–60 парами оснований этих фрагментов ДНК, т. е., по-видимому, гистон Н1 не участвует в образовании структуры нуклеосомы, а располагается в областях между нуклеосомами. Положительный заряд гистона Н1 выше, чем у других гистонов. Он первым вытесняется из хроматина кислотой или щелочью и в большей степени подвержен разрушению протеазами, когда еще находится в связанном состоянии в комплексе хроматина [26, 263]. Если гистон Н1 добавить к хроматину с недостаточным содержанием этого гистона, то хроматин сжимается [46, 47]. Если же гистон Н1 смешать с двухцепочечной ДНК, то образуются структуры, имеющие форму бублика (тора) [166]; другие гистоны в подобных условиях участвуют в образовании глобул, похожих на нуклеосомы. Таким образом, гистон Н1, вероятно, участвует в образовании структур хроматина высшего порядка, а именно способствует закручиванию нитей нуклеосом в сверхспиральный виток с диаметром ~20 нм [47]. Аналогичные структуры образует с ДНК гистон Н5. Вероятно, различные подфракции гистона Н1 могут быть связаны с различными межнуклеосомными (линкерными) областями хроматина и участвуют в образовании разных сверхспиралей. В интерфазном хроматине ДНК свернута в несколько тысяч раз, благодаря чему она умещается по длине метафазной хромосомы. Определенную роль в этой конденсации ДНК может играть гистон Н1.

Гистон Н1 отличается от остальных гистонов быстрым обменом в культуре клеток [16]. В то время как синтез остальных четырех гистонов связан с синтезом ДНК и происходит только в S-фазе, синтез Н1 в клетках штаммов Friend и HeLa может происходить и в отсутствие синтеза ДНК, т. е. в G1-фазе [385]. В клетках ВНК синтез гистона Н1 также частично происходит в G1-фазе,[343].

Таблица 2.2. Сравнение свойств гистона Н1 и нуклеосомных гистонов

Гистоны Н2А, Н2В, Н3 и Н4

В процессе расщепления хроматина стафилококковой дезоксирибонуклеазой образуются глобулярные структуры, называемые нуклеосомами. Анализ нуклеосом показывает, что четыре гистона — Н2А, Н2В, Н3 и Н4 — присутствуют только в них. В ходе эволюции их структуры оказались гораздо более консервативными, чем структура гистона Н1, причем структуры гистонов Н3 и Н4 более консервативны, чем структуры гистонов Н2А и Н2В. Гистон Н3 содержит цистеин в положении 110, который сохранялся в течение всей эволюции. Показано, что гистон Н3 димеризуется путем образования дисульфидного мостика [280]. Он фосфорилируется при переходе из G2-фазы в М-фазу и быстро дефосфорилируется в течение фазы G1. Таким образом, фосфорилирование предшествует образованию дисульфидного мостика.

Очищенные гистоны Н3 и Н4 образуют в растворе тетрамеры, в формировании которых принимают участие концевые COOH-участки цепи. В опытах по реконструкции с использованием частично расщепленных гистонов Н3 и Н4 показано, что первые от NH2-конца 41 и 37 остатков гистона Н3 и гистона Н4 соответственно несущественны для образования тетрамеров. Удаление 45 и 18 остатков с COOH-конца этих гистонов препятствует образованию тетрамеров. Областями, ответственными за образование тетрамеров, являются остатки 42-120 гистона Н3 и 38-102 гистона Н4 [43, 371]. Что касается гистона Н2В, то его центральная область, по-видимому, необходима для взаимодействия гистон — гистон [197].

Гистон Н5

Кроме гистонов пяти типов, которые присутствуют во всех клетках и тканях, имеющие ядро эритроциты низших позвоночных, рыб, амфибий, рептилий и птиц содержат другой гистон, Н5, который во многом похож на гистон Н1. Он был впервые обнаружен в эритроцитах цыпленка в 1961 г. [266], и позднее его существование было подтверждено [159]. Гистон Н5 содержит приблизительно 197 аминокислотных остатков, дает полосу рядом с гистоном Н1 при электрофорезе в полиакриламидном геле и имеет молекулярную массу ~23000. Ему свойствен молекулярный полиморфизм, а расположен он между нуклеосомами. Гистон Н5 связан с А-Т-областью ДНК и, так же как гистон Н1, оказывает стабилизирующее влияние на хроматин. Он тоже богат лизином, который составляет 23 % его аминокислотных остатков. С помощью метода ЯМР установлено, однако, что он отличается от гистона Н1, и, возможно, его эволюция происходила самостоятельно [78]. Лизиновые остатки гистона Н5 ацетилированы в большей степени, чем у гистона Н1, но не так сильно фосфорилированы. Он содержит большое число сериновых остатков (21), и у него, в отличие от гистона Н1, не наблюдается специфического образования кластеров из основных аминокислот на NH2-конце. В противоположность гистону Н1 его NH2-конец имеет структуру глобулы.

Информационная РНК (мРНК) гистона Н5 не содержит полиадениловой кислоты на 3′-конце, как это имеет место в случае других гистонов. У птиц на ранних стадиях развития клеток эритроидного ряда содержится мало гистона Н5. По мере развития этих клеток его количество увеличивается и, как следствие, уменьшается транскрипционная активность хроматина, хотя содержание РНК — нуклеотидилтрансферазы не меняется. В неделящихся зрелых эритроцитах синтез гистона Н5 продолжается даже тогда, когда другие пять гистонов уже не синтезируются [336]. Если гистон Н5 удалить из хроматина, то подавление транскрипционной активности ослабляется. Его синтез не координирован с синтезом других гистонов и не синхронизирован с синтезом ДНК: он синтезируется после других гистонов. Поскольку на ранних стадиях развития эритроцитов гистон Н5 отсутствует и появляется только на стадии эритробласта, когда он постепенно накапливается и подавляет при этом транскрипционную активность, было высказано предположение, что подавление происходит в результате конденсации хроматина, ведущей к его инактивации. Если ввести гистон Н5 не в эритроциты, а в другие клетки, то транскрипция также подавляется. Другое важное обстоятельство заключается в том, что вновь синтезированный гистон Н5 в развивающихся клетках эритроидного ряда фосфорилирован, а впоследствии, в ходе созревания клеток и ослабления транскрипции, дефосфорилируется. Таким образом, гистон Н5 играет, по-видимому, важную роль в поддержании сильно репрессированного состояния хроматина в имеющих ядра эритроцитах [35, 49, 168, 336]. Интересно отметить, что экспрессия гена гистона Н5 происходит только в клетках эритроидного ряда на специфической стадии, но как начинается его экспрессия и как она запрограммирована — неизвестно.

Протамины

Протамины представляют собой основные белки с малой молекулярной массой; они присутствуют в хроматине спермы вместо гистонов. Протамины появляются на стадии сперматиды и заменяют гистоны хроматина. Для них характерен полиморфизм. В сперме форели содержатся протамины трех типов, состоящие из 31–33 аминокислот. Протамины спермы млекопитающих длиннее — в их цепях ~45 аминокислот. Они богаты аргинином и не содержат лизина и триптофана; аргинин составляет две трети всех аминокислот. Собирающиеся в кластеры аргининовые остатки образуют длинные участки, с помощью которых протамины связываются с ДНК сперматид. После образования этой связи транскрипционная активность хроматина полностью подавляется. Если удалить протамины, то хроматин принимает вид бусинок и становится чувствительным к микрококковой нуклеазе. При добавлении протаминов эта структура исчезает и хроматин становится невосприимчивым к нуклеазе. Сериновые остатки протаминов могут быть фосфорилированы и дефосфорилированы. Полагают, что эта ковалентная модификация необходима для правильного связывания протаминов с ДНК [105], Ниже показана структура типичного протамина рыб:

Протамины, как и гистоны, синтезируются в цитоплазме. Их короткие мРНК транслируются на дирибосомах. Эти РНК в отличие от мРНК гистонов содержат на 3′-конце полиадениловую кислоту [169]. На 5′-конце они имеют 7-метилгуанин. Хотя в семенниках форели протамины синтезируются на стадии сперматиды, транскрипция их мРНК происходит значительно раньше, а именно на стадии первичного сперматоцита [170]. мРНК так же, как и рибонуклеопротеидные частицы, до наступления стадии сперматиды остается неактивной. Аналогичная ситуация наблюдается и в случае гистонов. Ооциты Xenopus содержат мРНК материнских гистонов в неактивной форме, которые активируются и транслируются во время деления яйца. Протамины содержатся только в сперматоцитах, однако неизвестно, почему экспрессия их генов происходит только в этих клетках и как она начинается на соответствующей стадии развития этих клеток.

Гены гистонов

Гистоны синтезируются в S-фазе клеточного цикла. Это обстоятельство помогло выделить мРНК гистонов из быстро делящихся эмбрионов для идентификации и локализации генов гистонов путем молекулярной гибридизации и клонирования [39, 51, 187, 373]. На ранней стадии дробления эмбриона морского ежа гистоны составляют 25–30 % вновь синтезируемых белков, а мРНК гистонов — почти 70 % всех мРНК. Кроме того, мРНК гистонов гибридизуются с ДНК в несколько сотен раз быстрее, чем многие другие мРНК. Это указывает на наличие большого числа копий генов гистонов. При исследовании шести видов морских ежей было показано, что гены гистонов повторяются в гаплоидном геноме 300-1000 раз. У Drosophila, Xenopus, человека и цыплят повторяемость составляет 100, 10–20, 10–20 и 10 раз соответственно. Такие большие различия в количестве этих генов могут быть связаны с тем, что гистоны необходимы на ранней стадии дробления. Яйца Xenopus содержат большое количество материнских гистонов, тогда как в яйцах морского ежа их очень мало. По-видимому, в первом случае у клеток нет необходимости синтезировать на ранней стадии быстрого деления большое число гистонов. Во втором случае нужно быстро синтезировать гистоны, чтобы не отставать от темпа быстрого деления клеток, и большое количество генов способствует этому.

В исследованиях на Drosophila показано, что гены гистонов расположены в хромосоме II. Пять структурных генов пяти гистонов богаты парами G-C и тандемно повторяются. Они разделены участками, богатыми парами А-Т, которые не транслируются. Вся область кодирования генов гистона содержит 6000–7000 пар оснований ДНК. Ниже показаны расположение и длина генов в яйце морского ежа вместе со спейсерными участками (S) [39].

Структурные гены гистонов не содержат интронов, или нетранслируемых областей, как гены глобина, яичного альбумина и иммуноглобулина, а также не транскрибируются как более длинные предшественники РНК [312]. Спейсерные области не имеют небольших повторяющихся последовательностей оснований, как это наблюдается у генов рРНК и 5S-PHK. У всех видов морских ежей порядок расположения и направления транскрипции гистоновых генов одинаковы, тогда как у разных видов Drosophila они различны [230]:

Синтез и обновление гистонов

Гены гистонов транскрибируются в направлении 5′→3′ с помощью РНК-полимеразы II, так как процесс транскрипции чувствителен к α-аманитину [225]. По-видимому, мРНК пяти гистонов транскрибируются отдельно, а не как единая полицистронная мРНК [205]. Они имеют коэффициент седиментации приблизительно 9S и могут быть разделены в полиакриламидном геле [187]. На 3′-конце мРНК гистонов нет полиадениловой кислоты [5], а на их 5′-конце присутствуют последовательности m7G(5′)pppNm или m7G(5′)pppNmpN [260].

Синтез гистонов тесно связан с синтезом ДНК. мРНК гистонов синтезируются в начале S-фазы, а затем переходят в цитоплазму, где они соединяются с рибосомами для синтеза гистонов [293, 303, 310, 331]. мРНК гистонов существуют приблизительно столько же времени, сколько длится S-период, т. е. 10–12 ч. Есть сообщение, что для транскрипции мРНК гистонов необходимы фосфорилированные НГБ [194], но оно требует подтверждения.

Если синтез ДНК затормозить с помощью цитозинарабинозида или оксимочевины, то синтез мРНК гистонов также прекращается, уже образовавшиеся мРНК разрушаются и синтез гистонов останавливается. Как только это происходит, прекращается также синтез ДНК [188, 366, 379]. Таким образом, клетка обладает механизмом, "включающим" и "выключающим" гены гистонов в соответствии с синтезом ДНК. Стехиометрическое соотношение синтезированных гистонов Н1:Н2А:Н2В:Н3:Н4 равно 0,5:1:1:1:1. Это свидетельствует о том, что четыре гена нуклеосомных гистонов транскрипционно связаны, и их трансскрипция, вероятно, скоординирована. По-видимому, матрица для гистона Н1 не связана с другими генами, поскольку количество синтезированного гистона Н1 составляет только половину количества других гистонов. У Drosophila, расположение гистоновых генов у которой отличается от расположения генов у морского ежа, ген гистона Н1 отделен от гена гистона Н3 1200 парами оснований ДНК. Следовательно, он может иметь самостоятельный промотор [230]. Более того, синтез гистона Н1 в фазе G1 в три раза интенсивнее синтеза других гистонов [343].

Известно несколько исключений из общего правила сопряжения синтеза гистонов с синтезом ДНК. Например, у лягушки Xenopus laevis при эмбриогенезе не наблюдается упомянутой синхронности на ранних стадиях дробления [3]. В зародышах Vicia faba гистоны появляются в фазах G1 и S [123]. На ранних стадиях эмбриогенеза морского ежа синтез гистонов начинается в фазе G1 и продолжается до фазы G2. Однако в начале дифференцировки их синтез становится синхронным с синтезом ДНК [17]. Обусловлена ли эта синхронизация каким-либо фактором, появляющимся на стадии дифференцировки, неизвестно. В клетках HeLa мРНК гистонов транскрибируется в течение всего клеточного цикла, но их трансляция происходит только в S-фазе [250]. Таким образом, в клетках HeLa с синтезом ДНК координирована трансляция, а не транскрипция. Очевидно, синтез гистонов регулируется на двух этапах — трансляции и транскрипции — с помощью двух разных сигналов. Поскольку молекулы мРНК гистонов малы, их трансляция происходит на дирибосомах. После синтеза гистоны переходят из цитоплазмы в ядро [366].

Судьба четырех нуклеосомных гистонов в процессе деления клетки изучалась с помощью 3Н-лизина и других меченых аминокислот [220]. На примере культуры in vitro миобластов цыпленка показано, что, когда клетка делится, уже существовавшие нуклеосомные гистоны остаются в одной из дочерних клеток, а вновь синтезированные гистоны переходят в другую клетку. Таким образом, новые гистоны, по-видимому, не смешиваются со старыми, и какое-то время их состав сохраняется неизменным. Последовательно синтезирующиеся нуклеосомы располагаются в основном рядом друг с другом. Более того, гистоны в них существуют в неизменном виде в течение трех-четырех поколений. Каким образом это достигается, неизвестно. По-видимому, существует механизм, с помощью которого дифференцированное состояние материнской клетки может передаваться дочерним. В работе с использованием 3Н-аргинина и 125I-иоддезоксиуридина в культуральной среде, содержащей клетки мыши [153], было показано, что нуклеосомные гистоны сохраняются в течение многих поколений. Этот факт очень важен, так как ново-синтезированные гистоны связаны с новообразованной ДНК [353]. Высказано предположение, что некоторые НГБ также сохраняются в процессе деления клетки [122]. Такая консервация нуклеосом и НГБ вместе с последующей транскрипционной специфичностью может служить тем механизмом, с помощью которого достигается и сохраняется дифференцировка клетки. Гистон Н1, однако, в течение одного клеточного поколения обновляется на 15 % [141]. Кроме того, он интенсивно фосфорилируется в конце фазы G2 клеточного цикла, что совпадает по времени с конденсацией хромосомы [48]. Быть может, фосфорилирование является пусковым механизмом митоза.

Структура хроматина

Химический состав хроматина был установлен несколько лет назад. Однако функции его составных частей, способ их организации, механизм конденсации хроматина во время митоза и последующего разрыхления, способ, с помощью которого происходит экспрессия определенных генов в клетках какого-либо типа и репрессия в других, механизм экспрессии генов в определенные периоды жизни и их репрессии в другое время стали проясняться лишь недавно. Для того чтобы понять механизм экспрессии генов и способы его регулирования, необходимо знать структуру и организацию хроматина.

Тщательные биохимические и биофизические исследования с использованием электронной микроскопии, начатые в 1973 г., позволили установить структуру и функции хроматина. Когда хроматин тимуса теленка гидролизовали ДНКазой, появлялись частицы размером 200 пар оснований или кратным ему [157]. Это свидетельствует о том, что хроматин имеет повторяющиеся участки. Олинс и Олинс [272] выдерживали интерфазные ядра тимуса и печени крысы и эритроциты цыпленка в гипотонической среде и изучали их под электронным микроскопом после соответствующего окрашивания. Хроматин выглядел как цепочка бусинок диаметром 7 нм, связанных друг с другом тяжами ДНК диаметром 1,5 нм (рис. 2.2). Одновременно было показано [163], что при расщеплении хроматина микрококковой или стафилококковой нуклеазами, которые разрывают обе цепи ДНК, образуются частицы диаметром 7 нм, содержащие 200 пар оснований. В работе с использованием биохимических методов и дифракции рентгеновских лучей [200] также установлено, что частицы, получаемые в процессе расщепления нуклеазой, содержат 200 пар оснований ДНК; это составляет почти 85 % общего содержания ДНК в хроматине. Каждая из этих частиц содержит по две молекулы гистонов Н2А, Н2В, Н3 и Н4, образующих октамер. Таким образом, эти частицы, позднее названные нуклеосомами [139], содержат восемь молекул гистонов и 200 пар оснований ДНК. Показано также [139], что при соединении гистонов четырех типов и ДНК появляются частицы, похожие на те, которые образуются из хроматина после расщепления нуклеазой. Гросс-Беллард и Шамбон ([139] высказали предположение, что центральную роль в формировании нуклеосомы играют богатые аргинином гистоны Н3 и Н4. Гистон Н1 отсутствует в этих частицах, он расположен между нуклеосомами.

Рис. 2.2. А. Электронная микрофотография хроматина из Oncopeltus fasciatus. В областях, свободных от волокон рибонуклеопротеида, виден хроматин в виде бусин; × 67000 [120]. Б. Схематическое изображение структуры хроматина

На основе описанных выше исследований было высказано предположение [198], что основная структура хроматина состоит из повторяющихся частей, содержащих октамеры гистонов четырех типов и 200 пар оснований ДНК. Во всех изученных до сих пор организмах соотношение количества ДНК и гистонов равно приблизительно 1 и везде имеются повторяющиеся участки октамеров гистонов, связанных приблизительно с 200 парами оснований ДНК, которые образуют линейную цепь нуклеосом диаметром 10 нм. Количество ДНК в нуклеосомах различных органов и организмов варьирует от 140 до 240 пар оснований [116]. Межнуклеосомная, или линкерная, ДНК более чувствительна к микрококковой нуклеазе, а нуклеосомная ДНК — к панкреатической ДНКазе I. Микрококковая нуклеаза и ДНКаза I и II расщепляют находящуюся внутри нуклеосомы нуклеосомную ДНК (или ДНК сердцевины), образуя фрагменты ДНК длиной 10 пар оснований или кратные им, но разрывают ее в разных местах [329]. Когда нуклеосомы из разных тканей и организмов расщепляют микрококковой нуклеазой, чтобы удалить линкерную ДНК, получают стабильные нуклеосомы с мол. массой 200000 и коэффициентом седиментации 11S, содержащие октамер гистонов и ДНК длиной 140 пар оснований [328]. Таким образом, размер ДНК, входящей в состав нуклеосомы, у всех организмов одинаков. Длина межнуклеосомной, или спейсерной, области, которая разделяет соседние нуклеосомы, зависит от функционального состояния хроматина. Транскрипционно активный хроматин имеет укороченную спейсерную область [225, 262].

При определении местоположения гистонов и ДНК в нуклеосомных мономерах хроматина тимуса теленка с помощью метода ЯМР было показано, что радиусы вращения ДНК и белка составляют 5 и 3 нм соответственно. Это свидетельствует о том, что ДНК расположена вне гистоновой сердцевины [21]. Внутренняя белковая сердцевина нуклеосомы имеет диаметр 6,4 нм; она окружена оболочкой из ДНК толщиной 2 нм, так что общий диаметр нуклеосомы составляет 10,4 нм. Эти данные были подтверждены иммунологическими исследованиями. Ни одна из сывороток против четырех гистонов, кроме анти-Н2В, не реагирует с нуклеосомой [2]. Это доказывает, что только гистон Н2В взаимодействует со своим антителом.

В растворе гистоны разных типов связываются попарно [94], причем наиболее сильная связь наблюдается между гистонами Н3 и Н4. Нуклеосома имеет ось симметрии второго порядка. В детальных рентгеноструктурных и электронно-микроскопических исследованиях кристаллических препаратов нуклеосом [117] показано, что сердцевина нуклеосомы представляет собой плоский клинообразный диск размером 5,7×11×11 нм. Полагают [117], что 140 пар оснований ДНК составляют 1,75 витка спирали, диаметр витка равен 9 нм, а его шаг — 2,8 нм (рис. 2.3). Это соответствует приблизительно 80 парам оснований на сверхспиральный виток В-формы ДНК. Гистоны частично погружены в большую бороздку ДНК, а малая бороздка остается открытой. Брем [50] считает, что сердцевина нуклеосомы имеет клинообразную форму, ее размеры 5,5×10×12 нм, а 140 пар оснований ДНК расположены в виде витка. Длина 140 пар оснований ДНК в 6–7 раз превышает размеры нуклеосомной сердцевины. Таким образом, ДНК конденсирована в 6–7 раз, что обусловлено ее связыванием с основными участками цепей восьми молекул гистонов и закручиванием вокруг сердцевины сверхспирали [337]. Это обеспечивает защиту нуклеосомной ДНК от микрококковой и стафилококковой ДНКаз. Однако панкреатическая ДНКаза I расщепляет эту ДНК с образованием фрагментов, состоящих из десяти нуклеотидов. Из-за спиральной структуры ДНК разные участки ее цепи отличаются друг от друга по чувствительности к ДНКазе I [238]. По-видимому, внутри нуклеосомы имеются отдельные центры, по которым происходит расщепление под действием ДНКазы. ДНКаза II расщепляет нуклеосомную ДНК с образованием двух фрагментов по 100 пар оснований [15]. С помощью гидродинамических методов показано [135], что нуклеосома претерпевает два конформационных перехода, зависящих от концентрации соли. Это служит дополнительным доказательством того, что нуклеосома включает две субчастицы, или половины.

Рис. 2.3. Предполагаемое закручивание суперспирали ДНК вокруг сердцевины нуклеосомы. Отмечены места расщепления ДНК нуклеазой [117]

Сердцевина нуклеосомы содержит по две молекулы каждого из Н2А-, Н2В-, Н3- и Н4-гистонов, которые образуют октамер. Положительно заряженные вытянутые цепи этих гистонов электростатически связаны с отрицательно заряженной ДНК. Полагают, что четыре гистона расположены относительно ДНК следующим образом:

Два гистона, Н3 и Н4, богатые аргинином, вероятно, взаимодействуют с двумя концами фрагмента ДНК. Когда эти гистоны добавляют к двухцепочечной ДНК, они образуют характерную структуру типа бублика, видимую в электронный микроскоп [129]. При воссоединении гистонов сердцевины со 140 парами оснований ДНК образуются частицы, имеющие тот же самый коэффициент седиментации, что и нуклеосомы, полученные из хроматина [36, 345]. Было также показано, что одни гистоны Н3 и Н4 образуют с ДНК структуры, похожие на сердцевины нуклеосом, устойчивые к трипсину [64, 327] и дающие картину дифракции рентгеновских лучей, похожую на картину для нативных нуклеосом [261]. Когда гистоны Н3 и Н4 добавляют к ДНК, они связываются со 140 парами оснований ДНК, которая имеет 1,5 сверхспиральных оборота вокруг тетрамера [195]. Образующаяся структура представляет собой цилиндр с размерами 45×8×8 нм. При последующем добавлении гистонов Н2А и Н2В цилиндр сжимается и становится похожим на нативную нуклеосому. Аналогичные явления наблюдал Картер [70]. Это согласуется с высказанным ранее [198] предположением, что гистоны Н3 и Н4 играют существенную роль в образовании структуры нуклеосомы. Эти два гистона наиболее консервативны, содержат большое количество β-структур и взаимодействуют друг с другом сильнее, чем с другими гистонами. По степени связывания с ДНК гистоны располагаются в следующем порядке: Н3 и Н4>Н2А>Н2В>Н1 [283]. При изучении поперечных сшивок показано, что связаны следующие пары: Н3-Н4, Н2А-Н2В и Н2В-Н4 [84].

Согласно одной из точек зрения, сначала 2 молекулы гистона Н3 и 2 молекулы гистона Н4 образуют тетрамер и связываются со 140 парами оснований ДНК, формируя основную сердцевину нуклеосомы. На втором этапе в эту структуру включаются по две молекулы гистонов Н2А и Н2В, чем и завершается образование нуклеосомы [42, 64, 258, 372]. При изучении сборки новореплицированного хроматина Drosophila показано, что гистоны Н3 и Н4 соединяются с ДНК в течение или вскоре после ее синтеза, гистоны Н2А и Н2В — на 2-10 мин позже, а гистон Н1 — через 10–20 мин, и в результате образуется зрелый хроматин [375]. По-видимому, во взаимодействие с ДНК вовлечены COOH-концы четырех гистонов, так как удаление ЫН2-концевых участков цепей гистонов не влияет на структуру нуклеосомы [371]. Гистоны Н2А и Н2В образуют димеры, взаимодействуя своими центральными неполярными областями, так что NH2- и COOH-концы остаются свободными. Гистоны Н3 и Н4 образуют димеры путем образования связей между их центральными неполярными областями и COOH-концами, так что основные NH2-концевые области нуклеосомных гистонов доступны для взаимодействия с кислотными группами ДНК [72]. Роль NH2-концевых областей четырех гистонов пока не установлена, хотя известно, что они связываются с ДНК. Мирзабеков и др. [252] путем ковалентных сшивок гистонов с 5′-концевыми фрагментами ДНК показали, что каждый гистон связан с 10 парами оснований ДНК. Сборка нуклеосом, по-видимому, контролируется НГБ. Так, очищенный препарат этих белков, выделенный из яиц Xenopus laevis, в бесклеточной системе в присутствии гистонов и очищенной ДНК катализирует образование нуклеосом [217].

Таким образом, основная структура хроматина представляет собой цепь линейно расположенных нуклеосом диаметром 10 нм, которую называют нуклеосомной фибриллой. Это низший уровень организации хроматина. Структуру более высокого порядка образуют нуклеосомы, свернутые в спираль, которая имеет диаметр 20–30 нм и шаг 10 им. Свертывание нуклеосом в спираль, по-видимому, обеспечивается богатым лизином гистоном Н1, который, как было показано, соединяется с линкерной ДНК между соседними нуклеосомами. Этот вывод следует из того, что после расщепления мононуклеосом стафилококковой нуклеазой размер ДНК уменьшается с 200 до 140 пар оснований, причем одновременно освобождается 35-парный фрагмент ДНК, связанный с гистоном Н1 [20]. Когда гистон Н1 добавляли к хроматину, который был его лишен, увеличение сродства к нему наблюдалось только до стадии образования октануклеосомы, но не далее [301]. Связывание с гистоном Н1 не только стабилизирует ДНК в линкерной области, но вызывает также ее дальнейшую конденсацию и свертывание [75]. Более высокий порядок структуры хроматина (по сравнению с цепочкой бусин) представляет собой спираль из частиц октануклеосом, образование которой обеспечивается гистоном Н1 или гистоном Н5 (в случае эритроцитов, содержащих ядра). Это согласуется с результатами, согласно которым полинуклеосомы, содержащие около шести нуклеосом, являются, по-видимому, основными матрично активными единицами хроматина, связывающимися с эндогенной РНК-полимеразой [344]. Олигонуклеосомы служат лучшими матрицами для транскрипции, чем мононуклеосомы, и на них синтезируются более длинные транскрипты [318].

Нуклеосома — динамическая единица как в структурном, так и в функциональном отношении. Как сказано выше, она состоит из двух половин, что может быть определено путем специфического связывания восьми молекул гистонов с ДНК. То, что нуклеосомы в транскрипционно активном состоянии подвержены конформационным изменениям, становится очевидным при изучении их чувствительности к ДНКазе I. Этот фермент преимущественно воздействует на те последовательности ДНК, которые активно транскрибируются. Он удаляет ДНК, кодирующую глобин, из ядер эритроцитов цыпленка, но не действует на ядра клеток мозга или фибробластов [125, 282, 367]. На ДНК яичного альбумина эритроцитов и фибробластов, в которой этот ген не транскрибируется, фермент также не действует. Стафилококковая нуклеаза, которая, как известно, расщепляет ДНК в межнуклеосомной области, не расщепляет ДНК глобина из эритроцитов цыпленка. Если мономерные нуклеосомы, полученные из этих клеток действием стафилококковой ДНКазы, обработать затем ДНКазой I, то преимущественно удаляются гены глобина. Показано [125], что ген яичного альбумина предпочтительно расщепляется ДНКазой в клетках яйцевода курицы и не расщепляется в других клетках, в которых он не транскрибируется. В клетках хомяка, трансформированных аденовирусом, последовательности ДНК аденовируса, которые легко расщепляются ДНКазой I, представляют собой участки, с которых транскрибируется мРНК. Другие вирусные последовательности резистентны к этой нуклеазе [119]. Из приведенных наблюдений следует, что во время транскрипции происходят конформационные изменения в хроматине, так что ДНК становится более чувствительной к ДНКазе I, но ее чувствительность к стафилококковой нуклеазе остается прежней. Полученные результаты подтверждаются данными электронной микроскопии [313]. Показано, что в процессе развития ооцитов трех видов Xenopus транскрипционно активный ядрышковый хроматин выглядит гладким, нуклеосомы в нем присутствуют в небольшом количестве или вообще отсутствуют. Неактивный хроматин имеет вид бусин. Пониженная транскрипционная активность хроматина коррелирует с появлением бусин в его структуре, тогда как транскрипционно активный хроматин содержит больше мононуклеосом, чем транскрипционно неактивный, что и означает увеличение той области хроматина, которая активна при транскрипции [223]. Электронно-микроскопическое изучение активно транскрибируемых рибосомных генов Physarum polycephalum показывает, что ДНК в транскрибируемом участке имеет вытянутую конформацию [179]. Таким образом, структура хроматина и, в особенности, нуклеосом подвержена конформационным изменениям в процессе транскрипции, а возможно, и репликации. Не исключено, что это вызвано связыванием с НГБ. Для ковалентной модификации гистонов различных типов, па-пример фосфорилирования, ацетилирования, метилирования и ADPрибозилирования, необходимы эффекторы.

Негистоновые хромосомные белки

Белки, связанные с ДНК эукариотов и отличающиеся от гистонов, называют негистоновыми хромосомными белками (НГБ). Они были открыты в 1946 г. Мирским и Поллистером [251]. От ДНК их отделяют с помощью смеси 2 М NaCl и 5 М мочевины. К ним относятся белки, ответственные за экспрессию и репрессию генов хроматина, а также за метаболизм и модификации хромосомных белков [112]. Они имеют изоэлектрические точки от 3,7 до 9,0. Эти белки весьма неоднородны по размеру — их молекулярная масса может составлять от ~8000 до нескольких сотен тысяч. Период полужизни НГБ сильно варьирует, но в целом он много короче, чем у гистонов. Как и гистоны, они синтезируются в цитоплазме и затем переходят в ядра, где образуют комплексы с ДНК [366]. Если ввести НГБ в цитоплазму, они быстро проникают в ядра [378]. Клетки с более высокой метаболической активностью содержат большее количество НГБ, и этим последние отличаются от гистонов, содержание которых одинаково в клетках всех типов. НГБ присутствуют в хроматине всех тканей, но структура их в разных тканях различна как в количественном, так и в качественном отношении, т. е. эти белки ткане- и видоспецифичны. С помощью методов с высоким разрешением показано, что в каждой ткани имеются сотни типов НГБ. В глиальных клетках с помощью изоэлектрофокусирования и микродиск-электрофореза было обнаружено почти 1500 НГБ [211]. По всей вероятности, некоторые из них представляют собой модифицированные НГБ, причем они синтезируются в течение всего клеточного цикла, тогда как гистоны синтезируются только в S-фазе.

После обработки хроматина тимуса теленка 0,3 М NaCl НГБ по подвижности в геле делятся на две группы: высокоподвижная группа (HMG, от англ. high mobility group) с мол. массой менее 30000 и малоподвижная группа с мол. массой более 30000 [176–178]. К HMG-белкам относятся четыре белка с большим зарядом: HMG1 HMG2, HMG14 и HMG17. Они включают 25 % основных и 30 % кислотных остатков и составляют только 3 % веса ДНК; они присутствуют во всех тканях и не являются тканеспецифичными [297]. Белки HMG ассоциированы с нуклеосомой [134]. Белки HMG1 и HMG2 имеют мол. массу около 26000. Они взаимодействуют с ДНК своими основными остатками [382, 383]. Около 50 % остатков HMG1 заряжены. Необычным является то, что его COOH-концевая область содержит последовательность из 41 чередующихся остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот. Каждое ядро из тимуса теленка содержит ~106 молекул белков HMG1 [59, 361]. По-видимому, белки HMG играют в хроматине структурную, а не регуляторную роль. Белок HMG1 в отличие от трех остальных не содержит ароматических аминокислот. Он включает последовательность из 89 остатков и имеет мол. массу 9247. Его карбоксильный конец представляет собой цепь кислотных остатков, а NH2-конец — цепь основных остатков; центральная область богата остатками лизина. HMG17 не имеет вторичной и третичной структуры, а по последовательности входящих в него аминокислотных остатков он гомологичен гистонам Н1 и Н5. Его уникальная первичная структура с цепями кислотных и основных остатков указывает на то, что он может быть структурным белком. Показано, что белок HMG17 связывается приблизительно с 57 нуклеотидами ДНК из тимуса теленка и вызывает конформационные изменения в ДНК, сходные с теми, которые производит гистон Н1 [174], причем с ДНК связываются остатки с 15 по 40 [1]В дальнейшем для удобства мы будем называть возраст, соответствующий периоду развития, молодым, или незрелым; возраст, соответствующий репродуктивному периоду, — средним, или зрелым, и возраст, соответствующий периоду старения, — старым, или старческим. — Прим перев.
.

Поскольку белки HMG имеют кислотные и основные остатки, образующие кластеры, они могут связываться с гистонами. своими кислотными группами, а с ДНК — основными остатками. Белки HMG1 и HMG2 ассоциированы с нуклеосомой [29]. Они стабилизируют двойную спираль ДНК, поскольку при ассоциации с ними ее Тm увеличивается на 20 °C [382, 383]. Таким образом, имеются достаточные основания полагать, что белки HMG играют в хроматине структурную роль. При воздействии ДНКазы I на активную часть хроматина белки HMG удаляются. По-видимому, эти белки связаны с нуклеосомами [326]. Дефер и др. [98] также сообщают, что НГБ связаны с нуклеосомами. Существуют экспериментальные доказательства структурной роли некоторых НГБ [7, 8]. Метафазные хромосомы клеток HeLa сохраняют свою морфологию даже после того, как удалены все гистоны и большинство НГБ. Структура поддерживается лишь с помощью ~30 % НГБ, причем в их число входит около 30 типов НГБ с мол. массой ~75000. Каждая хроматида находится в спаренном состоянии, как в метафазе, и остается стабильной даже в 2 М NaCl. Установлено также, что после удаления гистонов из метафазных хромосом их общий размер уменьшается на 50 %, и это не приводит к заметным нарушениям в их морфологии [175]. Отсюда следует, что НГБ ответственны за поддержание метафазной структуры хромосом, а, возможно, также и структур других фаз клеточного цикла. Есть сообщения [44, 265], что НГБ участвуют в процессе закручивания ДНК в сверхспираль и в образовании структуры хроматина высшего порядка. В связи с этим было высказано предположение, что НГБ образуют "строительные леса", или каркас, определяя таким образом основную форму метафазной хромосомы, и в соответствии с этим каркасом ДНК сворачивается в петли.

НГБ очень неоднородны, число их велико, и некоторые из них ткане- и видоспецифичны. Общее содержание НГБ в разных тканях соответствует следующему ряду: мозг>печень>>почки>>селезенка>тимус [255]. Некоторые НГБ специфичны для каждой ткани, а относительные количества индивидуальных НГБ варьируют от ткани к ткани. Они претерпевают количественные и качественные изменения при различных физиологических условиях, а также в процессе эмбриогенеза, дифференцировки клеток и клеточного цикла. Некоторые НГБ слабо связаны с ДНК и легко экстрагируются, другие связаны сильнее. Благодаря своим свойствам они участвуют в регуляции экспрессии генов в целом [202, 285, 325, 332, 347] и в контроле транскрипции в частности [27, 186, 193]. Показано [347], что фракция НГБ из печени крысы стимулирует транскрипцию in vitro. Когда НГБ добавляют к хроматину эмбриона морского ежа, увеличивается число участков инициации синтеза РНК [245]. Аналогичные наблюдения сделаны на клетках асцитного рака Эрлиха: фракция слабо связанных НГБ избирательно ассоциирует с гомологичной ДНК и стимулирует транскрипцию специфических структурных генов в присутствии РНК-полимеразы эукариот [202, 203]. Удалось идентифицировать [203] фосфорилированный НГБ с мол. массой 11000, который ингибирует инициацию транскрипции и играет регуляторную роль в экспрессии генов. Сообщалось также об участии в регуляции специфической активности генов сильно связанных НГБ [40, 82]. Катино и др. [73] изолировали НГБ с мол. массой 31000, который в большом количестве содержится в неделящихся клетках, но в малом количестве — в делящихся, как, например, в гепатоме Новикова. Когда НГБ выделяли из хроматина с помощью 5 М мочевины (М0), смеси 5 М мочевины и 1 М NaCl (M1) и смеси 5 М мочевины и 3 М NaCl (M3) и изучали роль каждой полученной фракции в транскрипции комплекса ДНК — гистон из печени кролика, оказалось, что функции этих трех фракций различны [30]. Фракция М0 стимулирует транскрипцию, связываясь с хроматином и изменяя общую конформацию комплекса ДНК — гистон. Фракция М3 связывается более специфическим образом и раскрывает новые центры для связывания РНК-полимеразы. Фракция M1 включает, по-видимому, структурные компоненты хроматина.

Метаболически более активные клетки содержат большее число НГБ. Обычно НГБ локализованы в тех областях хроматина, которые более активны в процессе синтеза РНК [90, 376]. НГБ способны прекращать репрессию матричной активности, вызываемую гистонами [110, 319]. Некоторые фосфорилированные НГБ специфически взаимодействуют с гистонами Н1 и Н2В и поэтому могут удалять их и открывать участки ДНК для транскрипции [247]. НГБ способны переводить неактивные покоящиеся клетки, находящиеся в фазе G0, в активно растущие в стадии G1. В процессе этого перехода происходит синтез специфических типов НГБ и одновременно увеличивается матричная активность [158, 222, 305]. Отсюда был сделан вывод, что эти белки участвуют в дерепрессии или в положительной регуляции экспрессии генов, особенно в контроле транскрипции в течение клеточного цикла.

При введении цыпленку эстрадиола или прогестерона синтез НГБ в яйцеводе стимулируется. НГБ в яйцеводе крыс, принимавших гормональные препараты, качественно отличны от белков контрольных животных [156]. Полагают, что в ядре акцептором для прогестерон-рецепторного комплекса является НГБ. Глюкокортикоид-рецепторный комплекс лучше связывается с хроматином печени, чем с хроматином тимуса, простаты и матки. Если из хроматина удалить гистоны, то в оставшемся хроматине связывание комплекса увеличивается вдвое. Если же удалить все хромосомные белки, то связывание рецепторного комплекса глюкокортикоида с ДНК уменьшается на 50 %. Отсюда следует, что НГБ ответственны за связывание рецепторного комплекса гормона с ДНК [151]. Синтез НГБ стимулируется кортизоном [14] и глюкагоном [113]. Стероидные гормоны, индуцирующие фосфорилирование НГБ в яйцеводе [88], а также кальцитонин и гормоны паращитовидной железы, которые оказывают противоположное действие на метаболизм кальция в костных клетках, стимулируют фосфорилирование различных НГБ [60].

Экдизон — стероидный гормон, ответственный за развитие насекомых — вызывает образование пуффов в хромосомах слюнных желез у личинок Sciara [133]. Возникновение пуффа указывает на то, что в данном участке происходит транскрипция. В месте пуффа, вызванного действием экдизона, не наблюдается увеличения содержания гистонов или ДНК, в то время как содержание НГБ почти удваивается. Пуффы образуются лишь после окончания определенной стадии развития, когда клетки становятся компетентными (17-дневные личинки); они не появляются у 4-дневных личинок. Это свидетельствует о том, что для действия экдизона необходим какой-то цитоплазматический фактор, вероятно белок. Следовательно, прежде чем экдизон сможет оказать воздействие на специфические гены, должен быть активирован определенный ген, ответственный за синтез этого белка. При возникновении пуффов в политенных хромосомах Drosophila отношение белков к ДНК увеличивается с 6 до 16, количество РНК увеличивается вдвое, а Тm данного участка понижается на 10 °C [281]. Кроме того, около пуффов накапливаются НГБ. В содержании ДНК и гистонов, связан дается никаких изменений, а большая часть гистонов, связанных с ДНК, оказывается дестабилизированной. Эти наблюдения подтверждаются результатами, полученными с помощью иммунофлуоресценции, согласно которым пуффы, индуцированные в политенных хромосомах Drosophila тепловым ударом, содержат новые НГБ. Очевидно, НГБ ответственны за активацию генов.

Воздействие НГБ на экспрессию специфических генов изучалось рядом исследователей [173, 284, 351]. Когда НГБ клеток HeLa добавляли к хроматину этих клеток в фазе G1, начиналась транскрипция генов гистонов, хотя обычно в этой фазе их экспрессии нет. При воссоединении хроматина в S-фазе клеток W1-38 с S-фазными НГБ наблюдается 500-кратная стимуляция транскрипции генов гистонов, в то же время при воссоединении хроматина печени мыши с S-фазными НГБ клеток HeLa транскрипции генов глобина не происходит. Эксперименты по реконструкции с использованием хроматина эритроцитов цыпленка показали: для того чтобы вызвать транскрипцию генов глобина, определенная фракция НГБ должна связываться с ДНК раньше, чем с гистоном [124]. После того как удалось разделить хроматин клеток тимуса теленка и костного мозга на ДНК, гистоны и НГБ, полученные компоненты были использованы в опытах по реконструкции [131]. Оказалось, что в случае клеток тимуса синтезированные РНК похожи на РНК тимуса, а мРНК глобина не синтезируются. Когда же был реконструирован и использован для транскрипции хроматин костного мозга, мРНК глобина синтезировались. Вместе с тем если в реконструкции участвовали ДНК и гистон тимуса и НГБ костного мозга, то также происходил синтез мРНК глобина. Отсюда следует, что НГБ, вероятно, участвуют в регуляции специфических генов. В культуре клеток мышц НГБ активно фосфорилируются главным образом во время дифференцировки [221]. Установлено также, что НГБ принимают участие в положительном контроле экспрессии генов. Однако для того, чтобы идентифицировать специфические компоненты НГБ, участвующих в контроле, и установить точный механизм контроля, необходимы дальнейшие исследования.

Модификации хромосомных белков

Посттрансляционная ковалентная модификация происходит в боковых группах аминокислотных остатков нескольких белков [357]. Хромосомные белки — как гистоны, так и НГБ — синтезируются в цитоплазме и затем переходят в ядро, где они связываются с ДНК. Эти белки, особенно гистоны, подвергаются разнообразным посттрансляционным ковалентным модификациям: фосфорилированию, ацетилированию, метилированию и ADPрибозилированию. Ацетилирование NH2-концевого серинового остатка гистонов Н1, H2A и Н4 происходит во время трансляции и представляет собой стабильную модификацию [229]. Ацетилирование внутренних лизиновых остатков гистонов Н3 и Н4 и фосфорилирование внутренних сериновых остатков происходит в цитоплазме. Затем эти гистоны переходят в ядра и связываются с ДНК [308]. Ацетилирование внутренних лизинов обратимо. Кроме того, обратимая модификация лизиновых остатков происходит уже после связывания гистонов с ДНК. Путем ковалентных модификаций четырех типов изменяются ионный состав гистонов и их стерические свойства, а следовательно, и взаимодействие с ДНК (рис. 2.4).

Рис. 2.4. Структура хроматина с указанием центров связывания гистонов и НГБ с ДНК. Представлены ковалентные модификации гистонов, в результате которых изменяется их связывание с ДНК

При таких модификациях, как фосфорилирование и ADPрибозилирование, число отрицательных зарядов на гистонах увеличивается, и это может привести к их отделению от ДНК, в результате чего становится возможной ее транскрипция или репликация. При ацетилировании общий положительный заряд на гистонах уменьшается. Это также может приводить к их отделению от ДНК. Вместе с тем при метилировании положительный заряд на молекулах гистонов может увеличиваться, что приводит к более сильному связыванию их с ДНК и, как следствие, к подавлению активности генов. Специфические аминокислоты подвержены специфическим модификациям. Определенные модификации преимущественно происходят в определенных гистонах и к тому же на специфических фазах клеточного цикла и роста клетки. Таким образом, не исключено, что модификации боковых групп хромосомных белков являются механизмом тонкой регуляции экспрессии генов. В табл. 2.3 приведены некоторые характеристики этих модификаций.

Таблица 2.3. Параметры ковалентных модификаций цепей гистонов

Фосфорилирование

Фосфорилирование хромосомных белков представляет собой энергозависимую постсинтетическую модификацию. Оно происходит как в цитоплазме, так и в ядре [273, 276, 308]. Орд и Стокен [275] продемонстрировали включение в гистоны 32P in vivo. Позднее было показано, что гистон Н1 фосфорилируется в большей степени, чем другие гистоны [23]. Главными центрами фосфорилирования с помощью специфических с АМР-зависимых протеинкиназ являются боковые группы сериновых и треониновых остатков гистонов и НГБ. Лизиновые, гистидиновые и аргининовые остатки фосфорилируются в малой степени. Киназы присутствуют во фракции НГБ хроматина. В фосфорилировании специфических центров, по-видимому, участвуют специфические гистоновые киназы. Из хроматина тимуса быка удалось выделить АМР-зависимую киназу, которая фосфорилирует единственный центр в гистоне Н3 [321]. Дефосфорилирование этих остатков производится фосфатазами, которые также присутствуют во фракции НГБ. Надежно установлено, что фосфорилирование и дефосфорилирование ферментов являются одним из основных механизмов регулирования их активности, поскольку эти модификации, вызывая конформационные изменения, переводят ферменты из активного состояния в неактивное, и наоборот [137]. При подобных модификациях в молекулах хромосомных белков происходят структурные изменения, которые могут приводить к функциональным изменениям хроматина. Реакция фосфорилирования — дефосфорилирования гистона показана ниже:

В молекулах хромосомных белков обнаружены два типа присоединения фосфатных групп [79]. Один из них, включающий связь Р-О, характерен для сериновых и треониновых остатков, причем эта связь устойчива по отношению к кислоте. Второй тип включает связь P-N, которая образуется в лизиновых, гистидиновых и аргининовых остатках. Эта связь неустойчива в кислых средах.

Фосфорилирование гистонов

Процесс фосфорилирования — дефосфорилирования внутренних остатков хромосомных белков совершается с большой скоростью. Быстрое фосфорилирование наблюдается не только в делящихся, но и в неделящихся клетках после их стимуляции различными эффекторами. В основном фосфорилированию подвержен гистон Н1, т. е. фосфорилирование гистонов, по-видимому, не влияет на транскрипционную активность хроматина.

Центры фосфорилирования гистона Н1 различны на разных стадиях клеточного цикла. Ser-37 фосфорилируется в фазе G1, Ser-114 в фазах S и G2, Ser-180 — в фазе М [206]. По-видимому, это объясняется множественностью Н1-киназ, каждая из которых специфична. Было показано, что быстрорастущие клетки содержат специфичную гистон-киназу, которая катализирует фосфорилирование треониновых остатков, но не Ser-37 и Ser-105 [216]. При фосфорилировании одного из остатков Ser-37 и Ser-105 или обоих степень связывания гистона Н1 с ДНК значительно уменьшается [299]. Такие различия в свойствах разных центров фосфорилирования могут объяснять функциональную роль гистона Н1 в конденсации хроматина. При фосфорилировании различных центров хроматин деконденсируется различным образом, благодаря чему открываются разные участки ДНК.

Показано, что фосфорилирование гистонов связано с изменениями в структуре хроматина особенно во время митоза [140, 143, 144]. Высокая скорость фосфорилирования наблюдается во время митоза клеток яичника китайского хомячка. Такие же модификации наблюдаются в клетках HeLa [209, 210]. Центры фосфорилирования гистона Н1 при митозе (Him) отличаются от центров во время интерфазы (НИ) [25, 162., 209]. Было выдвинуто предположение, что фосфорилирование гистона Н1 необходимо для конденсации интерфазного хроматина в хромосомы. Это совпадает с данными, согласно которым трижды фосфорилированный гистон Н1 связывается с ДНК сильнее, чем дефосфорилированный [196]. У слизистого гриба Prysarum polycephalum фосфорилирование гистона Н1 увеличивается в середине фазы G2 и резко нарастает вплоть до профазы [253]. Дефосфорилирование происходит в последней стадии митоза.

Фосфорилирование различных центров наблюдается также у гистона Н3, но оно не обнаружено у гистонов Н2А, Н2В и Н4. В детальных исследованиях фосфорилирования гистонов Н1 и Н3 из яичника китайского хомячка в процессе митоза было показано, что у большинства клеток эукариот 2–4 центра в гистоне Н1 фосфорилируются в фазе S и дополнительные центры во время митоза (М) [25]. Центры фосфорилирования в фазах S и М, по-видимому, независимы. Более того, эти центры отличаются от тех, которые участвуют в ответе на действие гормона [216]. На ранних стадиях препрофазы, когда начинается агрегация хроматина, гистон Н1 имеет 1–3 фосфатные группы на молекулу, а гистон Н3 не фосфорилируется [95, 140]. Во время промета- и анафазы, когда хроматин агрегирует, все молекулы гистона Н1, а также Н3 суперфосфорилируются и имеют 3–6 фосфатных групп на молекулу. Это может быть обусловлено 6-10-кратным увеличением в митотических клетках содержания специфической АТР-гистон-фосфотрансферазы [209, 210]. Благодаря суперфосфорилированию фибриллы хроматина способны скручиваться в сверхспирали. В телофазе, когда хроматин дезагрегирует, оба гистона, Н1 и Н3, дефосфорилируются. Когда клетки вступают в фазу G1, гистон Н1 полностью дефосфорилируется. Таким образом, суперфосфорилирование гистона Н1m и фосфорилирование гистона Н3 являются митотическими событиями, которые происходят только тогда, когда хромосомы полностью конденсированы. Следовательно, для конденсации хроматина во время митоза необходима высокая степень фосфорилирования гистонов Н1 и Н3, тогда как дефосфорилирование ограничивает этот процесс в интерфазе. Удивляет, однако, тот факт, что при высокой степени фосфорилирования, когда, казалось бы, должна была происходить диссоциация комплекса гистонов Н1 и Н3 с ДНК из-за увеличения отрицательных зарядов на них, наблюдается увеличение конденсации. Для того чтобы выяснить фундаментальный механизм, с помощью которого происходят конденсация и деконденсация хромосом, необходимы дальнейшие исследования. В печени крысы в период развития фосфорилирование гистона Н1 значительно, но оно пренебрежимо мало в печени взрослых животных [22]. Однако фосфорилирование усиливается, когда клетки печени делятся после частичной гепатэктомии [24]. Показано, что в этих условиях отношение числа связей P-O к P-N в печени меняется [79]. P-N-связи обнаруживаются главным образом в гистонах Н1 и Н4. Содержание Hl-киназы на протяжении клеточного цикла не меняется, но количество Н4-киназы увеличивается во время синтеза ДНК. Гистон Н4 также максимально фосфорилируется в фазе S, примем центрами атаки являются гистидиновые остатки. Таким образом, в результате фосфорилирования гистон Н4 может отделяться от ДНК, что способствует ее репликации. Отсюда можно, по-видимому, заключить, что фосфорилирование гистонов необходимо для репликации ДНК, за которой следует деление клетки [26, 161]. Показано, что транскрипция изолированных нуклеосом печени крысы после фосфорилирования усиливается [278]. Фосфорилированный и нефосфорилированный гистоны Н1 отличаются друг от друга по способности подавлять матричную активность хроматина [365]. С помощью метода кругового дихроизма было обнаружено, что фосфорилированные гистоны обладают измененной конформацией [6]. Этим может объясняться тот факт, что модифицированные гистоны вызывают дерепрессию хроматина.

Гистон Н5 также подвержен фосфорилированию. В эритроцитах птиц гистон Н5 фосфорилируется вскоре после его синтеза и затем дефосфорилируется по мере созревания клетки [335]. В отличие от других гистонов гистон Н5 дефосфорилируется в период инактивации генома и конденсации хромосом. Фосфорилированный гистон Н5 не так эффективно вызывает изменение конформации ДНК, как его дефосфорилированная форма. Фосфорилированные остатки (серии) обнаруживаются в областях гистона Н5, имеющих сильноосновный характер и связанных с ДНК. 50 % фосфатов находится в области 1-28, а остальные — на участке 100–200. В процессе сперматогенеза у некоторых видов млекопитающих протамины претерпевают фосфорилирование — дефосфорилирование, что, по-видимому, необходимо для упаковки ДНК [242].

Фосфорилирование НГБ

НГБ фосфорилированы в высокой степени и содержат как P-O-, так и P-N-связи. Полагают, что их фофорилирование катализируют киназы, отличные от тех, которые катализируют фосфорилирование гистонов. Существенным для фосфорилирования является содержание протеинкиназ и сАМР [180]. Кальцитонин стимулирует фосфорилирование НГБ костных клеток в культуре, особенно белков с малой молекулярной массой (10000-45000), но подавляет фосфорилирование НГБ с большой молекулярной массой. Вместе с тем гормон паращитовидной железы стимулирует фосфорилирование НГБ с большой молекулярной массой. Таким образом, два пептидных гормона, противоположным образом влияющие на метаболизм кальция, могут реализовать свое действие с помощью фосфорилированных НГБ. Стероидные гормоны также индуцируют фосфорилирование НГБ [88, 183].

Фосфорилирование НГБ зависит от типа клеток и их физиологического состояния [191]. Скорость этого процесса в синхронизированных клетках HeLa in vitro меняется, причем самая большая скорость наблюдается в фазах G1 и S. Когда покоящиеся клетки LC начинают быстро размножаться, одним из самых ранних событий является фосфорилирование НГБ. При добавлении к ядрам клеток печени крыс полиаминов, спермина и спермидина активность протеинкиназы ядер повышается в 2–3 раза, а скорость фосфорилирования НГБ — во много раз [115]. У Physarlum полиамины стимулируют фосфорилирование нескольких уникальных НГБ [19].

В отличие от фосфорилированных гистонов, которые влияют на структуру хроматина, фосфорилированные НГБ участвуют в экспрессии генов [284, 306, 332, 351]. Фосфорилированные НГБ клеток HeLa в фазе G1 стимулируют транскрипцию генов гистона в фазе G1, хотя в данной фазе эти гены не активны. Фосфорилированные НГБ усиливают транскрипцию, а дефосфорилированные уменьшают ее [85, 270]. Механизм этого воздействия, вероятно, заключается в непосредственном взаимодействии белков с ДНК. Такой вывод вытекает из следующих наблюдений: НГБ обладают различной способностью к фосфорилированию, способ их фосфорилирования зависит от типа ткани; при изменениях в их фосфорилировании изменяются структура хроматина и активность генов, а фосфорилированные НГБ специфически связываются с ДНК. НГБ клеток карциномы молочной железы в стадии зависимого от гормона роста и во время регрессии фосфорилируются по-разному [83]. Когда хроматин фибробластов W1-38 человека реконструируют из ДНК и нефосфорилированных или фосфорилированных НГБ, в последнем случае степень транскрипции много больше [295].

Ацетилирование

Есть сообщение о наличии у гистонов ацетильных групп [288]. Ацетилирование гистонов в изолированных ядрах впервые было описано Олфри с сотрудниками [13]. В гистонах обнаружены ацетилированные аминокислотные остатки двух типов: а) NH2-концевой серии гистонов Н1, Н2А и Н4 ацетилируется в N-ацетилсерин; это необратимая постсинтетическая модификация, катализируемая ферментом, содержащимся в цитозоле; б) ацетилированные внутренние лизиновые остатки образуются в результате постсинтетической реакции, протекающей в цитозоле [308] и в ядре после того, как гистоны переходят из цитозоля в ядро и связываются с ДНК [65]. Ацетилирование внутренних остатков в гистоне Н1 либо незначительно, либо вообще отсутствует. Ацетилируется один центр в гистоне Н2А и по четыре центра в каждом из гистонов Н2В, Н3 и Н4. Ацетилирование лизиновых остатков катализируется ацетилтрансферазой, являющейся компонентом НГБ. ε-NH2-группы внутренних лизиновых остатков, расположенных на NH2-концах половины гистонов, ацетилируются с образованием ε-N-ацетиллизина [11, 101, 130], причем в одной молекуле может содержаться до четырех ацетильных групп. Это энергозависимая реакция, в которой источником ацетильной группы является ацетил-CoA. Деацетилирование катализируется деацетилазой, которая также присутствует в хроматине. Схема реакции приведена ниже:

Ацетилируются внутренние лизиновые остатки 9, 14, 18 и 23 гистона Н3 и 5, 8, 12 и 16 гистона Н4 [67, 99]. Эти остатки расположены в NH2-концевой области полипептидной цепи, которая является сильно основной и взаимодействует с кислотными группами ДНК. Ацетилированные гистоны связываются с ДНК менее эффективно, чем деацетилированные [6]. Ацетилирование внутренних лизиновых остатков — процесс обратимый и происходит весьма быстро при самых разных условиях. Период полупревращения реакции ацетилирования очень мал и составляет всего около 3 мин [172, 267]. Были изолированы две гистон-ацетилтрансферазы, имеющие различные оптимумы рН. Ацетилирование ингибируется ионами Mn2+. Этот факт представляется важным, поскольку двухвалентные катионы необходимы для функционирования ДНК-зависимой РНК-полимеразы. сАМР, влияющая на фосфорилирование, не действует на ацетилирование [33]. Максимальная скорость ацетилирования достигается в интерфазе, по мере вхождения клеток в митоз она уменьшается. Минимальная скорость реакции наблюдается в профазе и метафазе, когда хромосомы в наибольшей степени конденсированы [95]. По мере того как клетки входят в телофазу и хромосомы увеличиваются в размере, скорость ацетилирования гистона Н4 увеличивается. Минимальный синтез РНК наблюдается в профазе и метафазе, когда хромосомы сильно конденсированы. Важно, что ацетилирование гистона Н4 также минимально именно в этих двух фазах клеточного цикла [33]. Ацетилирование гистонов Н3 и Н4 в эритробластах птиц уменьшается по мере их превращения в зрелые эритроциты, в которых хроматин сильно конденсирован и неактивен ни в транскрипции, ни в репликации [309]. Таким образом, деацетилирование гистонов коррелирует с ингибированием транскрипции, и наоборот, ацетилирование стимулирует транскрипцию. Так как при ацетилировании нуклеосомных гистонов уменьшается их положительный заряд, они могут отделяться от ДНК, благодаря чему ДНК делается доступной для транскрипции.

Если хроматин депротеинизируется, то его транскрипция усиливается [167]. Показано, что при стимуляции синтеза РНК в лимфоцитах митогенами [289], в тканях-мишенях — гормонами [228] и в печени — после частичной гепатэктомии [290] сначала происходит ацетилирование гистонов. В результате ацетилирования нуклеосомных гистонов усиливается транскрипция хроматина тимуса теленка [241]. Если гистоны Н2А и Н2В добавить к ДНК, лишенной хроматина, то транскрипция подавляется. Однако если эти два гистона затем ацетилируются, то репрессия прекращается. При ацетилировании гистонов Н3 и Н4 также наблюдается стимуляция транскрипции. Показано, что ацетилирование предшествует увеличению синтеза РНК [308]. Ацетилирование гистонов происходит не только в делящихся, но и в неделящихся клетках, в которых значительная часть хроматина неактивна в отношении транскрипции [66]. Ацетилирование гистонов стимулирует удлинение цепей при транскрипции [241]. Возможно, что транскрипция генов, которые специфически "включаются" эффекторами, контролируется степенью ацетилирования гистонов и (или) НГБ.

Приведенные выше заключения подтверждаются следующими фактами. Транскрипционно неактивный гетерохроматин инфузорий имеет низкую степень ацетилирования, тогда как эухроматин транскрипционно активен и сильно ацетилирован [232]. Транскрипционно активные макроядра Tetrahymena pyriformis содержат ацетилированные гистоны, тогда как в репрессированных микроядрах их нет [136]. Активные материнские хромосомы червеца содержат значительно больше ацетильных групп, чем неактивные отцовские хромосомы [34]. В исследованиях, выполненных на клетках Drosophila в культуре [227], показано, что 14С-ацетат включается главным образом в гистоны Н3, Н4 и Н2В, а 32Р-фосфат — в гистоны Н1, Н3 и Н4. Самое высокое содержание как 14С-ацетата, так и 32Р наблюдается в гистоне Н3. Когда матрично активные и матрично неактивные области хроматина разделяли после его переваривания ДНКазой II, было обнаружено, что первые содержат большее количество обеих меток (14С и 32Р). Эти данные подтверждают предположение, что различия между транскрибируемыми и нетранскрибируемыми областями хроматина отчасти объясняются специфическими модификациями гистонов в определенных локусах.

Степень ацетилирования гистонов из клеток семенника форели изучали путем инкубирования их с 14С-ацетатом [96]. Гистоны Н2А, Н2В и Н3 ацетилируются в одном положении, в то время как гистон Н4 — в одном, двух, трех и четырех положениях. Когда нуклеосомы, полученные после ацетилирования, обрабатывали трипсином, при этом удаляли NH2-концевые области четырех гистонов, содержащие лизиновые остатки и связанные с ДНК. Эти лизиновые остатки как раз и были ацетилированы. Если нуклеосомы затем расщепляли нуклеазой, то освобождались фрагменты ДНК, обычно при наличии NH2-концевых областей устойчивые к нуклеазе [368]. Ацетилирование приводит к увеличению скорости расщепления хроматина ДНКазой I [268, 362]. Хроматин, содержащий высокоацетилированные гистоны, легче расщепляется ДНКазой I, но не микрококковой нуклеазой [244]. Когда хроматин из семенника форели гидролизовали ДНКазой II, получали транскрипционно активную фракцию, содержащую высокоацетилированный гистон Н4 [97]. Гистоны Н3 и Н4 клеток HeLa сильно ацетилируются при выращивании в бутирате. Нуклеосомная ДНК таких клеток гидролизуется ДНКазой I в 5-10 раз быстрее. При этом ДНК специфически расщепляется в сайте, где в нормальных условиях разрыва не происходит [324]. Показано также [268, 315, 316], что ДНКаза I предпочтительно расщепляет ДНК в тех областях хроматина, которые сильно ацетилированы. По-видимому, нуклеосомы в этих областях после ацетилирования подвергаются конформационным изменениям. Поскольку такие изменения необходимы для того, чтобы РНК- и ДНК-полимеразы могли использовать ДНК в качестве матрицы, не исключено, что ацетилирование представляет собой один из. способов, с помощью которого гистоны частично отделяются от ДНК, благодаря чему последняя становится доступной для ферментов. Таким образом, ацетилирование важно как для функционирования хроматина, так и для его структуры и конформации. Высказано предположение, что гистон Н4 связывается с ДНК по механизму, на первых стадиях которого происходит ацетилирование [236]. Затем может произойти деацетилирование, приводящее к электростатическим взаимодействиям, в результате которых закрепляется конформация. В сперматиде морского ежа, не синтезирующей РНК, гистон Н4 полностью деацетилирован, тогда как в эмбрионе, где наблюдается высокая активность генов, он ацетилирован [53]. Таким образом, между ацетилированием гистона Н4 и активностью хроматина наблюдается прямая корреляция.

Изучению роли ацетилирования гистонов в функционировании хроматина способствовало обнаружение того факта, что в присутствии бутирата эта модификация усиливается и гистоны Н3 и Н4 специфически гиперацетилируются [68, 302, 315], так как бутират ингибирует гистон-деацетилазу. Бутират ингибирует предпочтительно эндогенную деацетилазу гистонов Н3 и Н4 [287], и при этом он не влияет на скорость ацетилирования [41, 68, 300]. По-видимому, гистон-деацетилаза может играть важную роль в метаболическом контроле ацетилирования. При гиперацетилировании гистонов связанная с ними ДНК в клетках HeLa становится более доступной для ДНКазы I, но не для стафилококковой нуклеазы. ДНКаза I способствует также удалению из комплекса гистонов Н3 и Н4 [359]. Одновременно подавляется синтез ДНК [146]. Можно предположить, что ацетилирование гистонов специфически необходимо для транскрипции и не нужно для репликации. В отличие от фосфорилирования, которое характерно для гистона Н1 и только делящихся клеток, ацеталирование протекает главным образом в гистонах Н3 и Н4 и в делящихся, а также неделящихся клетках, которые метаболически активны. Это подтверждает предположение, согласно которому ацетилирование нуклеосомных гистонов играет важную роль в транскрипции. Об ацетилировании НГБ известно очень мало; в одной из работ сообщается, что ацетилируются белки HMG из ядер тимуса теленка и эритроцитов утки [333].

Метилирование

Метилирование гистонов является постсинтетической необратимой модификацией, которая катализируется гистон-метилтрансферазой III, присутствующей во фракции НГБ хроматина. Эта модификация была впервые обнаружена Олфри и сотрудниками [13]. Гистон-метилтрансфераза III катализирует переход СН3-группы из S-аденозилметионина в ε-NH2-группу лизинового остатка, как показано ниже:

Эта модификация гистонов происходит после их связывания с ДНК. Метальные группы гистонов в отличие от фосфорильных и ацетильных групп не вступают в дальнейшие реакции [62, 63]. Вследствие этого метилирование является стабильным процессом. Цитоплазматический фермент — метилаза I метилирует аргинин прежде, чем гистон проникает в ядро [363]. НГБ метилируются особым ферментом. С атомом ε-N-лизинового остатка могут быть связаны одна, две или три метальные группы, которые последовательно вводятся одним и тем же ферментом. Поэтому метиллизиновые остатки могут представлять собой моно-, ди- или триметиллизин. В основном метилируются гистоны Н3 и Н4. В гистоне Н3 соотношение моно-, ди- и триметиллизинов составляет 1,8:1,0:0,45. В гистоне Н4 отношение моно- к диметиллизину равно 0,7:1,0. Таким образом, гистон Н3 метилирован в большей степени, чем гистон Н4. Очищенные гистоны в противоположность гистонам, связанным с хроматином, являются неподходящими субстратами для метилирования. Метилированные гистоны Н3 и Н4 после выделения могут метилироваться и дальше по центрам, отличным от тех, по которым идет реакция для гистонов, связанных с хроматином. Очевидно, эти дополнительные центры недоступны для метилирования из-за специфической конформации в хроматине. Метиллизины расположены вблизи ацетилированных лизинов.

Метилирование гистонов Н3 и Н4 происходит только в NH2-концевой области. Гистон Н3 из тимуса теленка метилируется в Lys-9 и Lys-27, а гистон Н4 — в Lys-20. Оба лизина в гистоне Н3 могут быть моно-, ди- и триметилированы, но в гистоне Н4 триметиллизин не образуется [100, 107, 164]. Гистон Н3 имеет дополнительный центр метилирования — Lys-4. Центры метилирования гистонов Н3 и Н4 так же, как их последовательности аминокислот, чрезвычайно консервативны. Kм и Vmax для метилирования гистонов Н3 и Н4 различны. S-аденозилгомоцистеин — продукт реакции, которую катализирует метилтрансфераза III, — является конкурентным ингибитором субстрата [109, 363].

Метилирование гистонов клеток HeLa происходит главным образом в S-фазе [219]. В культуре ткани метилирование протекает в течение всего клеточного цикла, но максимальная скорость наблюдается между S- и G2-фазами перед началом митоза [320, 350, 352]. Возможно, метилирование необходимо для подготовки хроматина к митозу. После частичной гепатэктомии метилирование гистонов происходит во время важного для клетки периода после S-фазы [218]. Степень метилирования гистонов Н3 и Н4, по-видимому, одна и та же во всех органах, но изменяется с возрастом [107]. У десятидневных крыс молярное соотношение моно-, ди- и триметиллизинов в гистоне Н3 составляет 0,55:1,0:0,35. Молярное соотношение моно- и диметиллизинов в гистоне Н4 в том же возрасте равно 0,1:0,9. С увеличением возраста наблюдается постепенный сдвиг в сторону более метилированных форм. Гистоны Н3 и Н4 в мозгу взрослых крыс не обновляются, так же как не обновляются и их метальные группы независимо от полипептидных цепей [108]. Хонда и др. [165] показали, что метилирование гистонов необратимо и в других тканях. Когда молодым крысам вводили меченый лизин и метионин, значительные количества каждой метки обнаруживали в гистонах мозга. Однако у взрослых особей находили лишь следы этих меток. Если ядра из клеток мозга взрослых крыс инкубировать с S-аденозилметионином, то ни одна метильная группа не включается в гистоны Н3 и Н4. Эти результаты свидетельствуют о том, что метилирование гистонов заканчивается перед наступлением зрелости. Метилированные гистоны могут иметь несколько функций. 1) При метилировании лизиновых остатков, в частности при образовании трифениллизинов, повышается pK ε-NH2-группы лизина и увеличивается основность гистонов. Это может усиливать связь гистонов с ДНК. 2) Метилирование гистонов Н3 и Н4 может играть важную роль в структуре нуклеосом. 3) Метилированные гистоны могут необратимо "запирать" ДНК и препятствовать репликации. Возможно, этим объясняется переход клеток в постмитотическое состояние. 4) Метилированные гистоны могут ингибировать транскрипцию. Для оценки роли метилирования гистонов в структуре и функциях хроматина необходимы дальнейшие исследования.

ADPрибозилирование

Есть сообщения, что поли-ADPрибоза ковалентно связывается с ядерными белками [269, 279]. Было показано, что эта реакция катализируется поли-ADPрибозополимеразой, ассоциированной с хроматином [334]. Молекула фермента из тимуса быка состоит из одной полипептидной цепи с мол. массой 130000; этот фермент полностью активен только в присутствии ДНК [380]. Он связан с межнуклеосомной областью хроматина и, по-видимому, способствует образованию структур хроматина высшего порядка [55]. Субстратом в этой реакции служит NAD+ [56]. Фермент ингибируется никотинамидом, тимидином, цитокининами и метилксантином [226]. В основном ADPрибозилированию как in vivo, так и in vitro подвергается гистон Н1 и до некоторой степени гистон Н2В. Другие нуклеосомные гистоны в печени крыс модифицируются чрезвычайно слабо (если вообще модифицируются) [277, 356]. Центр ADPрибозилирования в гистоне Н1 все еще окончательно не идентифицирован. Было высказано предположение, что он присоединен эфирной связью к глутамату [106]. С помощью фермента в гистон последовательно внедряется от двух до одиннадцати молекул ADPрибозы. Сообщалось о наличии в ядрах клеток из печени крысы разветвленных цепей ADPрибозы, состоящих из 65 остатков [339]. Модификация, по-видимому, происходит следующим образом:

Фосфорилирование серина препятствует ADPрибозилированию [69]. Серии также может быть ADPрибозилирован [277]. Гистон Н6 (белок HMG спермы форели), протамины и некоторые компоненты НГБ также ADPрибозилируются [271, 374, 381]. Связь с ADPрибозой неустойчива в щелочной среде [155]. Поли-(ADPрибозо)гликогидролаза отщепляет полимер от гистона [254]. ADPрибозилированные гистоны легче отделяются от хроматина, чем другие модифицированные гистоны. По-видимому, после ADPрибозилирования связь гистонов с ДНК ослабевает. Это происходит из-за увеличения отрицательных зарядов гистонов и, кроме того, из-за большого размера молекулы, которая способна деформировать структуру хроматина [286]. Функция полимеров ADPрибозы, ковалентно присоединяющихся не только к гистонам, но и к НГБ, еще не установлена. Предполагается, что они участвуют в синтезе и репарации ДНК, в образовании структуры хромосом и в дифференцировке клеток. Содержание ADPрибозополимеразы увеличивается в 3–4 раза в G1-фазе и в процессе дифференцировки эритролейкозных клеток мышей [298]. В клетках HeLa наиболее интенсивное поли-ADPрибозилирование наблюдается в фазе G1, а самое слабое — в фазе S. В результате ADPрибозилирования ядерных белков может происходить их отделение от ДНК, что содействует ее репликации в S-фазе. Таким образом, рассматриваемая модификация может быть необходимой для репликации ДНК. Это подтверждается тем фактом, что синтез ДНК в ядрах, выделенных из печени куриного эмбриона, после ADPрибозилирования увеличивается [341].

Полиамины — спермин, спермидин и путресцин — стимулируют ADPрибозилирование ядерных белков в упомянутом порядке. Стимулирующим эффектом обладает также Mn2+ [340]. ADPрибозилирование гистонов Н1 в клетках HeLa увеличивается в присутствии полиаминов почти в 3 раза [61]. Спермин стимулирует ADPрибозилирование НГБ клеток в культуре, а Mn2+ стимулирует ADPрибозилирование гистонов. Если в инкубационной среде присутствуют и спермин, и Mn2+, то НГБ модифицируются в большей степени, чем гистоны. Таким образом, полиамины и ионы металлов оказывают, по-видимому, регулирующее действие на ADPрибозилирование ядерных белков.

Подводя итоги, можно сказать, что ковалентные модификации хромосомных белков, в частности гистонов, могут оказывать значительное влияние на структуру и функции хроматина. Основные характеристики модифицирующих реакций показаны на рис. 2.4 и заключаются в следующем. 1) Фосфорилирование и ADPрибозилирование происходят в основном в гистоне Н1, а ацетилирование и метилирование — в нуклеосомных гистонах. 2) Фосфорилирование, ADPрибозилирование и ацетилирование приводят к уменьшению общего положительного заряда гистонов и к отделению их от ДНК, тогда как метилирование ведет к увеличению положительного заряда, что делает связь с ДНК более сильной. 3) Гистоны могут претерпевать все эти изменения одновременно, что приводит к значительным изменениям их ионной структуры. 4) Фосфорилирование, очевидно, представляет собой общее явление: оно менее специфично по сравнению с другими модификациями и происходит в делящихся клетках в течение всего клеточного цикла. По-видимому, фосфорилирование необходимо для репликации ДНК и деления клеток. Три другие модификации, вероятно, более специфичны. Ацетилирование происходит главным образом в метаболически активных клетках и, по-видимому, включено в процесс транскрипции. Метилирование, будучи необратимым процессом, может быть важным для репрессии активности генов и для дифференцировки. 5) Все эти модификации специфически модулируются специальными эндогенными эффекторами, в том числе гормонами. Специфические и дифференциальные модификации хромосомных белков могут происходить в разные периоды жизни и приводить к избирательной экспрессии генов.

В то время как накоплено значительное количество данных о ковалентных модификациях гистонов, о подобных модификациях НГБ известно относительно мало. Скудна также информация о скоростях и последовательности дефосфорилирования, деацетилирования и де-ADPрибозилирования.

Модуляция модификаций хромосомных белков

Описанные выше реакции хромосомных белков катализируются специфическими ферментами. Поэтому факторы, изменяющие содержание, и активность этих ферментов, могут также изменять степень этих модификаций и, следовательно, структуру и функции хроматина. Кроме того, скорость и глубина модификаций, особенно тех, которые, подобно фосфорилированию и ацетилированию, характеризуются высокой обратимостью, могут регулироваться фосфатазами и деацетилазами соответственно. Содержание и активность этих ферментов в свою очередь контролируются набором других эффекторов.

Фосфорилирование хромосомных белков осуществляется протеинкиназами, которые обычно активируются сАМР. По-видимому, эти протеинкиназы имеют различную специфичность не только по отношению к гистонам и НГБ, но и по отношению к различным центрам гистонов. Протеинкиназы активируются сАМР, который синтезируется с помощью аденилатциклазы. Содержание сАМР зависит от фосфодиэстеразы (рис. 5.2). Таким образом, изменения в содержании и активности одного или нескольких ферментов влияют на скорость и уровень фосфорилирования [137]. Кроме того, уровень фосфорилирования регулируется также содержанием фосфатаз. Свойственна ли фосфатазам специфичность, как протеинкиназам, неизвестно.

Фосфорилирование хромосомных белков катализируется специфическими протеинкиназами, которые стимулируются сАМР in vitro [213] и in vivo [214]. сАМР-зависимая протеинкиназа из молочной железы коровы фосфорилирует гистоны, богатые лизином, но неактивна в отношении гистонов, богатых аргинином [28]. Кальций ингибирует аденилатциклазу, и поэтому в его присутствии содержание сАМР уменьшается [38]. Вместе с тем он стимулирует гуанилатциклазу и увеличивает содержание cGMP [132]. Поэтому изменение содержания кальция может приводить к изменению содержания циклических нуклеотидов, что в свою очередь может оказывать влияние на активность протеинкиназ и, следовательно, на степень фосфорилирования белков [204]. Содержание кальция в крови и тканях в различных физиологических условиях различно, причем оно изменяется с возрастом [246]. От него зависит фосфорилирование хромосомных белков. В экспериментах in vitro показано, что кальций ингибирует фосфорилирование гистонов из полушарий большого мозга и стимулирует фосфорилирование НГБ [182]. Кальций, будучи катионом, способен вытеснять гистоны из хроматина, взаимодействовать с отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК [76] и, таким образом, изменять ее матричную активность. Как одновалентные, так и двухвалентные катионы (Na+, K+ и Mg2+) ингибируют фосфорилирование гистонов [256], причем ингибирование Mg2+ следует из того, что он связывается с АТР. Было показано, что Zn2+ способствует образованию аномально высокого количества фосфорилированного гистона Н1, ингибируя активность Н1-гистон-фосфатазы [324].

На фосфорилирование хромосомных белков влияют некоторые стероиды [234]; гидрокортизон, например, стимулирует их фосфорилирование [364], причем он усиливает фосфорилирование гистонов, богатых как лизиновыми, так и аргининовыми остатками [264]. Дексаметазон стимулирует фосфорилирование гистонов Н1 и Н2А клеток HeLa в G1- и S-фазах. Стимулирующий эффект в большей степени проявляется у гистона Н2А [292]. Гидрокортизон повышает степень фосфорилирования НГБ в дискретных хромосомных локусах, вслед за чем увеличивается синтез РНК [314]. Эстрадиол стимулирует синтез специфических НГБ в матке [346]. Это подтверждается экспериментами [88], в которых обнаружено, что увеличение фосфорилирования НГБ происходит, по крайней мере частично, в результате повышения активности ядерной протеинкиназы.

Под действием пептидных гормонов увеличивается содержание сАМР, и поэтому стимулируется фосфорилирование Ser-37 гистона Н1 [43, 215]. В результате такого специфического фосфорилирования гистона Н1 усиливается транскрипция хроматина из тимуса теленка [121]. Тиротропин также стимулирует фосфорилирование гистона Н1 [212].

Полиамины — спермин и спермидин, принимающие участие в делении и росте клеток, стимулируют фосфорилирование НГБ [171]. Когда с помощью фитогемагглютинина стимулировали деление лимфоцитов, на начальных стадиях происходило фосфорилирование НГБ [192].

Установлено, что гистон Н1 из печени плода фосфорилирован в большей степени, чем у взрослой особи [22]. Клетки печени плода делятся быстрее, чем клетки взрослой особи. Таким образом, имеется, по-видимому, корреляция между фосфорилированием гистона Н1 и делением клеток. Эти результаты подтверждаются тем фактом, что в регенерирующей печени гистон Н1 фосфорилируется в большей степени, чем другие гистоны [317].

Ацетилирование хромосомных белков также модулируется некоторыми факторами. Гидрокортизон стимулирует ацетилирование гистонов и одновременно усиливает синтез РНК [9, 10]. Таким образом, имеется хорошая корреляция между ацетилированием гистонов и активностью генов. Есть данные о том, что эстрадиол усиливает ацетилирование богатых аргинином гистонов из матки крыс [228], а также стимулирует синтез РНК [152]. Так как известно, что эстрадиол стимулирует транскрипцию в некоторых тканях, а ацетилирование гистонов, возможно, необходимо для транскрипции, было изучено влияние эстрадиола на ацетилирование гистонов из срезов головного мозга in vitro [349]. Было показано, что эстрадиол стимулирует ацетилирование как гистонов, так и НГБ, причем особенно сильно он стимулирует ацетилирование гистона Н4.

Гормоны, действие которых реализуется с помощью сАМР, также стимулируют ацетилирование гистонов. Эритропоэтин стимулирует ацетилирование гистонов и синтез РНК в клетках селезенки у мышей с полицитемией [338]. Адреналин также стимулирует ацетилирование гистонов, причем только гистонов Н3 и Н4 [349]. Двухвалентные катионы ингибируют активность гистон-ацетилтрансферазы и, следовательно, ацетилирование гистонов [33, 237]. Этот результат вызывает недоумение, так как хорошо известно, что двухвалентные катионы необходимы для активности ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Есть данные, что цистеин сильно ингибирует ацетилирование гистонов [33]. ЛСД (диэтиламид лизергиновой кислоты) усиливает ацетилирование гистонов из мозга крыс [52].

Показано, что бутират — промежуточный продукт метаболизма жирных кислот — вызывает гиперацетилирование гистонов, причем он специфичен в отношении гистонов Н3 и Н4 [302]. Это осуществляется путем ингибирования гистон-деацетилазы [41, 68], так что если ацетатная группа введена в гистон, то она уже не удаляется. При этом, по-видимому, происходят конформационные изменения в нуклеосомах и увеличивается восприимчивость ДНК к ДНКазе I. Отсюда следует, что стимулирование транскрипции, наблюдающееся после ацетилирования, может объясняться такими конформационными изменениями в нуклеосомах, благодаря которым РНК-полимераза более эффективно связывается с ДНК. Показано также, что с увеличением ацетилирования гистонов Н3 и Н4 синтез ДНК подавляется [146]. Таким образом, ацетилирование гистонов, по-видимому, необходимо для транскрипции, но не для репликации.

Очень мало известно о модуляции метилирования хромосомных белков. Метилирование — процесс стабильный. Так как оно происходит главным образом в гистонах Н3 и Н4 и метильные группы не вступают в дальнейшие превращения, метилирование может играть роль в репрессии специфических генов, которая происходит на стадии дифференцировки. Было бы интересно выяснить, стимулируется ли при деметилировании гистонов активность специфических областей генома.

Есть сообщение, что кортизон усиливает метилирование НГБ в специфических хромосомных локусах [314], тогда как эстрадиол не влияет на метилирование гистонов [348]. Чрезвычайно важно, однако, что эстрадиол сильно ингибирует метилирование ДНК. Цитозин ДНК метилируется с образованием 5-метилцитозина. Такое метилирование может вызвать более сильное связывание ДНК с белками. Следовательно, ингибирование метилирования ДНК эстрадиолом может вызывать отделение ДНК от этих белков и усиливать транскрипцию. Изменения в структуре и функциях хроматина, вызываемые метилированием, требуют дальнейших исследований.

ADPрибозилирование гистонов представляет собой модификацию, в результате которой не только вводятся отрицательные заряды, но может также деформироваться комплекс хроматина. О возможности модуляции этой модификации известно мало. Поскольку это необратимый процесс, как и метилирование, он может быть необходим для дифференцировки и перевода клетки в постмитотическое состояние. Изучение этой модуляции поможет пролить свет на механизм дифференцировки и экспрессии генов.

Возрастные изменения в структуре и функциях хроматина

Схема потока информации у эукариот выглядит следующим образом: ДНК→РНК→Белок. Скорость образования и количество различных белков, необходимых для осуществления специфических функций, может регулироваться на одном или на нескольких этапах: а) транскрипция гетерогенных ядерных РНК(гяРНК) — предшественников на хроматине; б) процессинг гяРНК-предшественников до зрелых мРНК, способных к трансляции; в) трансляция мРНК на рибосомах и г) разрушение белков различными факторами. Кроме того, количество активных и неактивных белков, способных к активированию, может регулироваться путем непосредственной модуляции активности белков, например их фосфорилированием и аденилированием. Транскрипция, которая является первым и главным этапом в приведенной выше последовательности событий, может модулироваться с помощью изменений в структурной организации хроматина. Эти изменения, по-видимому, могут касаться: а) образования нужной конформации ДНК, б) доступности ДНК для ДНК-полимеразы, в) степени ассоциации гистонов и НГБ с ДНК, г) модификаций гистонов и НГБ, изменяющих их ассоциацию с ДНК.

Изменения транскрипции и, следовательно, активности хроматина происходят во время дифференцировки. Когда активно делящиеся миобластные клетки сливаются, чтобы образовать многоядерную неделящуюся клетку мышцы, изменяется структура синтезируемой РНК и уменьшается ее общее количество [377], а образование рибосомной РНК (рРНК) сильно падает [87]. Это подтверждается тем фактом, что количество РНК, гибридизованной с ДНК после слияния клеток, значительно меньше, чем в делящихся клетках. Процентное содержание РНК с уникальными последовательностями оснований после слияния выше. Это указывает на то, что в дифференцированных клетках экспрессия специфических генов выше, чем других генов, в отличие от делящихся, недифференцированных клеток. Таким образом, во время и после дифференцировки происходят как качественные, так и количественные изменения активности хроматина. По-видимому, имеются контролирующие механизмы, воздействующие как на уникальные, так и на повторяющиеся последовательности ДНК. Клетки сердечной мышцы после рождения перестают делиться, и это сопровождается уменьшением транскрипции. Их ДНК становится менее восприимчивой к ДНКазе I, и температура ее плавления повышается [231].

Описанным выше наблюдениям не противоречат данные, согласно которым слияние миобластов сопровождается сильным увеличением активности креатинфосфокиназы (КФК), что указывает на более интенсивную транскрипцию ее мРНК [257, 259, 317а]. Показано, что активность КФК у цыпленка увеличивается в период дифференцировки в 20 раз, и причиной этому служит увеличение количества ММ-изофермента. Отсюда следует, что транскрибируется преимущественно ген М-субъединицы [235]. Другим важным изменением, происходящим во время дифференцировки сердечной мышцы, является полное прекращение синтеза ДНК-полимеразы [86].

Подобные изменения в транскрипционной активности хроматина происходят на стадии эмбриогенеза у амфибий [102] и морских ежей [118]. Качественные изменения наблюдаются и при индуцированной гормонами дифференцировке молочной железы [355]. Механизм, с помощью которого осуществляется дифференциальная экспрессия генов, неизвестен. Вопрос заключается в том, возникают ли изменения в хроматине — структурные и функциональные — после достижения зрелости и ведут ли эти изменения к старению организма. Для того чтобы найти ответ на эти вопросы, многие исследователи изучали разные свойства хроматина в зависимости от возраста.

В ряде работ измеряли температуру плавления (Tm) хроматина из печени и тимуса, и во всех случаях было обнаружено в старческом возрасте увеличение Tm [31,32, 149,208, 274, 296]. С помощью ЭВМ был изучен профиль температуры плавления хроматина; было обнаружено, что гиперхромизм и Tm в старости увеличиваются [297]. Это может объясняться увеличением с возрастом числа ковалентных связей между хромосомными белками и ДНК [147–150]. Данная точка зрения согласуется с тем, что количество белка, которое можно экстрагировать из хроматина с помощью солевого раствора, с возрастом уменьшается [274], а количество одноцепочечных разрывов в ДНК увеличивается [80], так как включение 3Н-тимидина в ДНК с возрастом увеличивается [143, 294, 311]. Показано, что ДНК печени старой мыши (20 мес) более чувствительна к S1-нуклеазе, чем ДНК мыши в возрасте от 1 до 15 мес [81]. При седиментации ДНК из мозга мыши в градиенте щелочной сахарозы образуются четыре полосы для старых животных и одна для молодых, что свидетельствует о деградации ДНК в старческом возрасте в результате одноцепочечных разрывов. Такие разрывы в ДНК могут обеспечивать центры для ее ковалентного связывания с хромосомными белками. Одним из факторов, который, по-видимому, способствует образованию разрывов, является диметилирование цитозина. Сообщается, что небольшая доля (3- 10 %) цитозина ДНК постсинтетически метилируется с образованием 5-метилцитозина [54, 322]. Эта модификация предохраняет данный сайт ДНК от расщепления ферментом рестрикции [37, 128, 304], в частности ферментом Нра II [240, 323]. В результате деметилирования цитозинов эти сайты могут стать восприимчивыми к расщеплению, что приведет к увеличению числа разрывов в ДНК. Известно, что содержание 5-метилцитозина в печени рыб с возрастом уменьшается [358]. Однако показано, что метилирование ДНК, выделенной из полушарий головного мозга крыс, в старости увеличивается [348]. Это может усиливать связь ДНК с гистонами и не только увеличивать Tm хроматина, но и уменьшать его матричную активность. Стабильны ли метильные группы ДНК — неизвестно, но весьма вероятно, что метилирование ДНК осуществляется ферментами, отличными от тех, которые метилируют гистоны.

Изучение гибридизации ДНК — РНК в печени мышей показало, что доля ДНК, которая гибридизуется с уникальными и повторяющимися последовательностями РНК, с возрастом уменьшается [92]. Как отсюда следует, с возрастом уменьшается доля транскрибируемой ДНК, что в свою очередь указывает на увеличение связывания и маскировки ДНК хромосомными белками. С помощью того же метода измерялось число транскрибированных рибосомных генов на гаплоидный геном мыши [126, 127]. В возрасте более 2 лет наблюдалось резкое уменьшение числа транскрибированных генов. Однако у человека подобные изменения не обнаруживаются. Аналогичные методы использовались для количественной оценки процентного содержания транскрибированной сателлитной ДНК в различных тканях мыши [291]. В селезенке, почках и в мозгу изменений не наблюдалось, но в печени с возрастом ее количество увеличивалось.

Несколько исследователей изучали транскрипцию РНК на хроматине в зависимости от возраста. В экспериментах in vitro с использованием срезов печени и мозга было показано, что синтез РНК в этих тканях в старческом возрасте уменьшается [103, 145]. Причиной этого может являться уменьшение количества РНК-полимеразы [51, 239]. Обнаружено, что транскрипционная активность различных тканей в старости уменьшается [274, 296]. Результаты, полученные в опытах in vivo, свидетельствуют о том, что синтез РНК в печени, мозгу, сердце и селезенке крыс в старческом возрасте понижается [181]. С возрастом претерпевают качественные изменения типы синтезируемых РНК, а отношение РНК: белок уменьшается [92]. РНК некоторых типов, синтезируемые в организме в среднем возрасте, в старости исчезают, и появляются молекулы новых типов, которые не синтезируются в репродуктивном периоде. Это напоминает возрастные изменения в наборе изоферментов, например аланинаминотрансферазы и лактатдегидрогеназы (гл. 3).

Содержание гистонов в клетке каждой ткани остается приблизительно постоянным на протяжении всей жизни [71]. В нуклеосомных гистонах печени и селезенки крыс и мышей количественных и качественных изменений не происходит, но изменяются три субфракции гистона Н1 [248, 249]. Так, в старческом возрасте специфически увеличивается количество субфракции гистона Н1, содержащей метионин. Предстоит выяснить, как это влияет на структуру и функции хроматина. Сообщается, что содержание НГБ и РНК в хроматине крыс с возрастом уменьшается [104, 207].

Хотя гистонов всего несколько и они играют структурную роль, изменения в степени их ассоциации с ДНК могут иметь значение как при транскрипции, так и при репликации. Благодаря различным ковалентным модификациям их ассоциация с ДНК может меняться. Канунго и его сотрудники исследовали in vitro зависимость ковалентных модификаций гистонов от возраста и модуляции этих модификаций различными эндогенными факторами. В опытах использовали срезы коры головного мозга крыс разного возраста. Схема этих исследований показала на рис. 2.5. Было обнаружено, что фосфорилирование гистонов полушарий большого мозга с возрастом уменьшается [182]. В частности, резко уменьшается фосфорилирование гистонов Н1 и Н4. Кальций ингибирует фосфорилирование гистонов, особенно гистонов Н1 и Н4. Этот эффект в старческом возрасте уменьшается (рис. 2.6). Эстрадиол стимулирует фосфорилирование гистонов [183], особенно у взрослых животных, но этот эффект в старости исчезает (рис. 2.7). При уменьшении фосфорилирования гистонов может усиливаться их связь с ДНК благодаря уменьшению числа отрицательных зарядов.

Рис. 2.5. Схема проведения in vitro ковалентных модификаций хромосомных белков и модуляции матричной активности хроматина в срезах коры головного мозга крыс

Рис. 2.6. Влияние кальция на включение 32 P в гистоны коры головного мозга крыс-самок разного возраста [182].

А . Норма. Б . Добавлен Са 2+

Рис. 2.7. Влияние эстрадиола на включение 32 P в гистоны коры головного мозга крыс-самок разного возраста [183].

А . Норма. Б . Добавлен эстрадиол

Ацетилирование гистонов играет роль в транскрипционной активности хроматина. Показано, что ацетилирование гистонов из мозга крыс с возрастом уменьшается [349]. При этом специфическое уменьшение наблюдается для гистонов Н3 и Н4, а ацетилирование гистона Н1 не меняется. Адреналин стимулирует ацетилирование гистона Н1, а эстрадиол — гистона Н3. Эти модулирующие эффекты в старческом возрасте уменьшаются. Кальций не оказывает значительного влияния на ацетилирование гистонов (рис. 2.8).

Рис. 2.8. Влияние кальция и эстрадиола на ацетилирование отдельных гистонов коры головного мозга крыс-самок разного возраста [348, 349].

А . Норма. Б . Добавлен Са 2+ . В . Добавлен эстрадиол

Было изучено влияние ацетилирования гистонов и его модуляций, вызываемых бутиратом и эстрадиолом, на функции хроматина из коры головного мозга крыс [184]. Как бутират, так и эстрадиол, добавленные в инкубационную среду, содержащую 14С-ацетат и срезы головного мозга, стимулировали ацетилирование гистонов у молодых крыс. Этот эффект сильно уменьшался у взрослых особей и вообще не наблюдался у старых животных (110 нед). Если из этих срезов выделяли ядра и использовали их для транскрипции при инкубировании с 3H-UTP и другими нуклеотидтрифосфатами, то наибольшее стимулирование транскрипции наблюдалось у молодых крыс, а у взрослых этот эффект сильно уменьшался. Изучаемые модуляторы ее оказывают никакого влияния на транскрипцию у старых крыс (рис. 2.9). Полученные данные указывают не только на корреляцию между ацетилированием гистонов и транскрипцией хроматина, но и на уменьшение в старческом возрасте модулирующего влияния бутирата и эстрадиола. Это может быть обусловлено структурными и конформационными изменениями хроматина, появляющимися при увеличении возраста.

Рис. 2.9. Включение 3 H-UMP в РНК из ацетилированных ядер коры головного мозга крыс-самок разного возраста и действие масляной кислоты и эстрадиола [184].

1 — срез; 2 — срез после ацетилирования; 3 — срез после ацетилирования + масляная кислота; 4 — срез после ацетилирования + эстрадиол

Изучение метилирования гистонов из мозга крыс показало, что эта модификация с возрастом также замедляется, особенно в случае гистонов Н3 и Н4 (рис. 2.10) [348]. Однако метилирование является стабильной модификацией, и поэтому несмотря на то, что с возрастом происходит замедление включения групп 14СН3, общее число метальных групп в гистонах увеличивается, так как те группы, которые были введены в более раннем возрасте, уже не удаляются. При метилировании гистонов, особенно при образовании триметиллизиновых остатков гистона Н3, их связь с ДНК усиливается. Эстрадиол стимулирует метилирование гистона Н2В, а кальций — гистона Н3. Эти модуляционные эффекты в старческом возрасте отсутствуют. Ковалентные модификации определенных гистонов специфическими эффекторами, несомненно, меняют не только структуру, но и функции хроматина.

Рис. 2.10. Влияние кальция и эстрадиола на метилирование отдельных гистонов коры головного мозга крыс-самок разного возраста [348].

А . Норма. Б . Добавлен Са 2+ . В . Добавлен эстрадиол

Содержание НГБ с возрастом уменьшается [208, 384]. Метаболически активные ткани содержат больше этих белков, чем неактивные. По-видимому, с уменьшением их количества активность тканей снижается. Электрофорезом НГБ мозга в полиакриламидном геле были показаны не только качественные, но и количественные возрастные изменения во фракциях НГБ [185]. Ковалентные модификации НГБ и их модуляция различными эндогенными эффекторами также зависят от возраста [182, 183, 185, 349]. Показано, что фосфорилирование, ацетилирование и метилирование НГБ мозга в старости очень сильно замедляются. Кальций стимулирует их фосфорилирование как в среднем, так и в старческом возрасте. Однако стимулирующий эффект эстрадиола, наблюдающийся в среднем возрасте, в старости не проявляется (рис. 2.11, 2.12). Кальций не стимулирует ацетилирование НГБ, а эстрадиол и адреналин стимулируют его у молодых крыс, но не оказывают влияния в случае крыс среднего возраста и старых крыс (рис. 2.13). Ни кальций, ни эстрадиол не влияют на метилирование НГБ. Показано, что эти эффекторы модулируют модификацию специфических НГБ [185]. Вероятно, фосфорилирование НГБ более важно для экспрессии генов, чем их ацетилирование и метилирование. Как позволяют предположить эти данные, замедление ковалентных модификаций НГБ в старческом возрасте может происходить из-за того, что соответствующие центры становятся малодоступными. Это в свою очередь может быть обусловлена конформационными изменениями в хроматине вследствие более сильного связывания НГБ с ДНК.

Рис. 2.11. Влияние кальция на фосфорилирование отдельных НГБ коры головного мозга крыс-самок разного возраста [185].

 А. Норма. Б . Добавлен Са 2+

Рис. 2.12. Влияние эстрадиола на фосфорилирование отдельных НГБ белков коры головного мозга крыс-самок разного возраста [185].

А . Норма. Б . Добавлен эстрадиол

Рис. 2.13. Влияние кальция и эстрадиола на ацетилирование отдельных НГБ коры головного мозга крыс-самок разного возраста [185].

А . Норма. Б . Добавлен Са 2+ . В . Добавлен эстрадиол

Функции хроматина самым тесным образом связаны с его структурной организацией, и если структура меняется, то, несомненно, меняются и функции. К функциям хроматина относятся репликация и транскрипция. Показано, что у свободноживущей нематоды Turbatrix aceti, клетки которой не делятся, активность ДНК-полимеразы с возрастом уменьшается [45].

Есть сообщение, что синтез ДНК в постмитотических тканях — в мозгу, сердце и печени — у старых крыс усиливается [294]. Клетки этих тканей не вступают в митоз. Поэтому предполагают, что синтез ДНК в них происходит только в целях репарации ДНК, которая в старческом возрасте в большей степени подвергается расщеплению [80, 81]. В клетках слюнной железы крыс синтез ДНК индуцируется изопротеренолом (изадрином), но лагпериод индукции с возрастом увеличивается, а степень индукции уменьшается [4].

Исследования, выполненные in vitro на клетках фибробластов в культуре, показали, что с уменьшением способности клеток к делению и с увеличением продолжительности клеточного цикла в поздних пассажах (фаза III) активность ДНК-полимеразы уменьшается [360]. Кроме того, в таких клетках наблюдается уменьшение количества репараций ДНК [233].

Резюме

Вся информация в организме заключена в ДНК, которая в комплексе с гистонами и НГБ образует генетический аппарат клетки, называемый хроматином. Гистоны представляют собой основные белки с малой молекулярной массой, богатые лизиновыми и (или) аргининовыми остатками, сконцентрированными в NH2- и COOH-концевых участках. Их структура в ходе эволюции оставалась неизменной. Почти все ткани содержат одни и те же типы и количества гистонов, которые не изменяются на протяжении всей жизни. Имеется пять основных типов гистонов: Н1, Н2А, Н2В, Н3 и Н4. Их гены в хромосоме повторяются несколько раз и сцеплены. Гистоны синтезируются в цитоплазме в течение S-фазы и затем переходят в ядро. Будучи основными, они связываются с ДНК. Гистоны необходимы для структурной организации хроматина. Основная структура хроматина представляет собой цепочку нуклеосом диаметром ∼10 нм. Нуклеосомы имеют внутреннюю сердцевину, состоящую из октамера, включающего по две молекулы каждого из гистонов Н2А, Н2В, Н3 и Н4, вокруг которого "обернута" ДНК. Гистон Н1 связан с межнуклеосомной ДНК, соединяющей две нуклеосомы, и участвует в создании структуры хроматина более высокого порядка.

НГБ чрезвычайно разнородны, их насчитывают несколько сотен. Эти белки богаты кислыми аминокислотами и обладают видо- и тканеспецифичностью. Метаболически более активные ткани содержат больше типов и большие количества НГБ. Они синтезируются в течение всего клеточного цикла. НГБ участвуют как в структурной организации хроматина, так и в положительной регуляции экспрессии генов.

И гистоны, и НГБ подвергаются различным постсинтетическим модификациям — фосфорилированию, ацетилированию, ADPрибозилированию и метилированию. Если первые три модификации уменьшают положительный заряд гистонов и вызывают их отделение от ДНК, то метилирование усиливает их связывание с ДНК. Эти модификации происходят в определенных гистонах на специфических фазах клеточного цикла и развития организма. Они могут изменять структурную организацию хроматина и его матричную активность. Фосфорилирование относится к процессам, связанным с делением клетки, а ацетилирование — к процессам, связанным с транскрипцией. Метилирование и ADPрибозилирование, по-видимому, происходят во время дифференцировки клеток. Ряд эндогенных эффекторов, таких, как гормоны и ионы металлов, модулируют эти модификации и таким образом модулируют матричную активность хроматина.

С возрастом в хроматине происходят структурные изменения. Его температура плавления (Tm) увеличивается, а экстрагируемость хромосомных белков уменьшается, что указывает на более сильное связывание белков с ДНК. Кроме того, уменьшается степень ковалентных модификаций белков, а также модулирующее влияние эффекторов на эти модификации. Причиной подобных изменений могут быть конформационные изменения, имеющие место в старости. Вследствие этих изменений в некоторых тканях с возрастом трансляционная активность хроматина уменьшается. Эти данные показывают, что структурные изменения хроматина, особенно в постмитотических тканях, в которых он не обновляется, приводят к снижению его матричной активности, а также его реакции на модуляторы. Это может вызывать постепенное ухудшение различных функций организма и вести к старению.

Литература

1.  Aberchrombie B. D., Kneale G. G., Crane-Robinson C., Bradbury E. M., Goodwin G. H., Walker J. M., Johns E. W. Eur. J. Biochem ., 84, 173–177 (1978).

2.  Absolom D., Regenmortel M. H. V . FEBS Lett., 85, 61–64 (1978).

3.  Adamson E. D., Woodland H. R. J . molec. Biol., 88, 263–285 (1974).

4.  Adelman R. C., Stein G., Roth G. S., Englander D . Mech. Age. Dev., 1, 49 59 (1972).

5.  Adesnik M., Darnell J. E . J. molec. Biol., 67, 397–406 (1972).

6.  Adler A. J., Fashman G. D., Wangh W., Allfrey V. G . J. biol Chem., 249, 29Ц 2914 (1974).

7.  Adolph K. W., Cheng S. M., Laemmli U. K . Cell, 12, 805–816 (1977).

8.  Adolph K. W., Paulson J. R., Laemmli U. K . Cell, 12, 817–828 (1977).

9.  Allfrey V. G . In: Regulatory Mechanisms for Protein Synthesis in Mammalian Cells (A. San Pietro, M. R. Lamborg and F. T. Kenney, Eds.), Vol. II, 65-100, Academic Press, New York and London (1965).

10.  Allfrey V. G . Can. Res., 26, 2026–2040 (1966).

11.  Allfrey V. G . Fed. Proc, 29, 1447–1460 (1970).

12.  Allfrey V. G . In: Histones and Nucleohistones (Phillips D. M. P., Ed.), pp. 241–294, Plenum Press, New York (1971).

13.  Allfrey V. G., Faulkner R., Mirsky A. E . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 51, 786–794 (1964).

14.  Allfrey V. G . Shelton K. Nature, 228, 132–134 (1970).

15.  Altenburger W., Horz W., Zachau H. G . Nature, 264, 517–522 (1976).

16.  Appels R., Ringertz N. R . Cell Diif., 3, 1–8 (1974).

17.  Arceci R. J., Gross P. R . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 74, 5016–5020 (1977).

18.  Arceci R. J., Senger D. R., Gross P. R . Cell, 9, 171–178 (1976).

19.  Atmar V. J., Daniels G. R., Keuhn G. D . Europ. J. Biochem, 90, 29–37 (1978).

20.  Bakayev V. V., Bakayeva T. G., Varshavsky A. J . Cell, 11, 619–629 (1977).

21.  Baldwin J. P., Boseley P. G., Bradbury E. M . Nature, 253, 245–249 (1975).

22.  Balhom R., Balhorn M., Chalkley R . Devi. Biol, 29, 199–203 (1972).

23.  Balhorn R., Chalkley R., Granner D . Biochemistry, 11, 1094–1098 (1972).

24.  Balhorn R., Reike W. O., Chalkley R . Biochemistry, 10, 3952–3958 (1971).

25.  Balhorn R., Jackson V., Granner D., Chalkley R . Biochemistry, 14, 2504–2511 (1975).

26.  Bartley J., Chalkley R. J . biol. Chem, 245, 4286–4292 (1970).

27.  Baserga R . Life Sci, 15, 1057–1071 (1974).

28.  Bear J. L., Zalitis J. G., MacKinlay A. G . Biochem. Biophys. Res. Commun., 84, 450–457 (1978).

29.  Beatriz L. W., Dixon G. H . Can. J. Biochem, 56, 480–491 (1978).

30.  Bekhor J., Samal B . Arch. Biochem. Biophys, 179, 537–544 (1977).

31.  Berdyshev G. D . Interdisciplinary Topics in Gerontology, 10, 70–82, S. Karger, Basel (1976).

32.  Berdyshev G. D., Zelabovskaya S . Expl. Gerontol, 7, 321–330 (1972).

33.  Berkovic S. F., Mauritzen C. M . Biochim. Biophys. Acta, 475, 160–167 (1977).

34.  Berlowitz L., Pallotta D . Expl. Cell. Res, 71, 45–48 (1972).

35.  Billett M. A., Hindley J . Eur. J. Biochem, 28, 451–462 (1972).

36.  Bina-Stein M. J . biol. Chem, 253, 5213–5219 (1978).

37.  Bird A. P., Southern T. M . J. molec. Biol, 118, 27 (1968).

38.  Birnbaumer L . Biochim. Biophys. Acta, 300, 129–158 (1973).

39.  Birnsteil M. L., Gross K, Schaffner W., Portmann R., Probst E . In: Molecular Biology of the Mammalian Genetic Apparatus (P. O. P. Ts'o, Ed.), 87–98, North-Holland, Amsterdam (1977).

40.  Bluthmann H., Mrozek S., Gierer A . Eur. J. Biochem, 58, 315–326 (1975).

41.  Boffa L. C., Vidali G., Mann R. S., Allfrey V. G . J. biol. Chem, 253, 3364–3366 (1978).

42.  Böhm L, Hayashi H., Cary P. D., Moss T., Crane-Robinson C, Bradbury E. M . Eur. J. Biochem, 77, 487–493 (1977).

43.  Böhm J., Keil G., Knippers R . Eur. J. Biochem, 78, 251–266 (1977).

44.  Bokhonko A. I., Razumova V. V . Eur. J. Biochem, 85, 115–120 (1978).

45.  Bolla R., Brot N. Arch. Biochem. Biophys., 169, 227–236 (1975).

46.  Bradbury E. M . Ciba Foundation Symp, 25, 131–142 (1975).

47.  Bradbury E. M., Danby S. E., Rattle H. W. E., Giancotti V . Eur. J. Biochem., 57, 97-105 (1975).

48.  Bradbury E. M., Inglis R. J., Mathews H. R., Sarner N . Eur. J. Biochem, 33, 131–139 (1973).

49.  Bradbury E. M., Molgaard H. V., Stephens R. M . Eur. J. Biochem, 31, 474–482 (1972).

50.  Bram S . Biochem. Biophys. Res. Commun, 81, 684–691 (1978).

51.  Britton V. J., Frederick G. S., Florini J. R . J. Gerontol, 27, 188–192 (1972).

52.  Brown I. R., Liew C. C . Science, 188, 1122–1123 (1975).

53.  Burdic C. J., Taylor B. A . Expl. Cell. Res, 100, 428–433 (1976).

54.  Burdon R. H., Adams R. L. P . Biochim. Biophys. Acta, 174, 322–329 (1969).

55.  Butt T. R., Brothers J. F., Giri C. P., Smulson M. E . Nucl. Acid Res, 5, 2775–2788 (1978).

56.  Burzio L., Koide S. S . Biochem. Biophys. Res. Commun, 42, 1185–1190 (1971).

57.  Busch H . (Ed.). The Cell Nucleus. Chromatin Parts A and B, Vol. IV, Academic Press, New York and London (1978).

58.  Bustin M., Cole R. D . J. biol. Chem, 243, 4500–4505 (1968).

59.  Bustin M., Hopkins R. B., Isenberg I . J. biol. Chem, 253, 1694–1699 (1978).

60.  Bustos S. E., Schuster G. S, Dirksen T. R., McKinney R. V., Lai D. Y. L . J. Cell. Physiol, 92, 43–48 (1977).

61.  Byrne R. H., Stone P. R., Kidwell W. R . Expl. Cell Res, 115, 227–283 (1978).

62.  Byvoet P . Biochim. Biophys. Acta, 160, 217–223 (1968).

63.  Byvoet P., Shepherd G. R., Hardin J. M., Noland B. J . Arch. Biochem Biophys, 148, 558–567 (1972).

64.  Camerini-Otero R. D., Sollner-Webb B., Felsenfeld G . Cell, 8, 333–347 (1976).

65.  Candido E. P. M., Dixon G. H . J. biol. Chem., 247, 3868–3873 (1972).

66.  Candido E. P. M., Dixon G. H . J. biol. Chem., 247, 5606–5510 (1972).

67.  Candido E. P. M., Dixon G. H . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 69, 2015–2019 (1972).

68.  Candido E. P. M., Reeves R., Davie J. R . Cell, 14, 105–113 (1978).

69.  Caplan A., Ord M. G., Stocken L . A. Biochem. J., 174, 475–483 (1978).

70.  Carter C. W., Jr . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 75, 3649–3653 (1978).

71.  Carter D. B., Chae C. J . Gerontol., 30, 28–32 (1975).

72.  Cary P. D., Moss T., Bradbury E. M . Eur. J. Biochem., 89, 475–482 (1978).

73.  Catino J. J., Yeoman L. C, Mandel M., Busch H . Biochemistry, 17, 983–987 (1978).

74.  Chambon P . Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 42, 1209–1234 (1978).

75.  Champoux J. J . Ann. Rev. Biochem., 47, 449–479 (1978).

76.  Chang K. Y., Can C. W . Biochim. Biophys. Acta, 157, 127–139 (1968).

77.  Chapman G. E., Aviles F. J., Crane-Robinson C., Bradbury E. M . Eur. J. Biochem., 90, 287–296 (1978).

78.  Chapman G. E., Hartman P. G., Cary P. D., Bradbury E. M., Lee D. R . Eur. J. Biochem., 86, 35–44 (1978).

79.  Chen C. C., Bruegger B. B., Kern C. W., Lin Y. C, Halpern R. M., Smith R. A . Biochemistry, 16, 4852–4855 (1977).

80.  Chetsanga C. J., Boyd V., Peterson L., Rushlow K . Nature, 253, 130–131 (1975).

81.  Chetsanga C. I., Tuttle M., Jacoboni A., Johnson C . Biochim. Biophys. Acta, 474, 180–187 (1977).

82.  Chiu J. F., Tsai Y. H., Sakuma K., Hnilica L. S . J. biol. Chem., 250, 9431–9433 (1975).

83.  Cho-Chung V. S., Redler B. H . Science, 197, 272–275 (1977).

84.  Chung S., Hill W. E., Doty P . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 75, 1680–1684 (1978).

85.  Chung D. M., Hollenbeck R., Costa E . Science, 193, 60–62 (1976).

86.  Claycomb W. C . Biochem. J., 171, 289–298 (1978).

87.  Clissold P., Cole R. J . Expl. Cell. Res., 80, 159–169 (1973).

88.  Cohen M. E., Kleinsmith L. J . Biochim. Biophys. Acta, 435, 159–166 (1976).

89.  Cole R. D . In: Molecular Biology of the Mammalian Genetic Apparatus (P. O. P. Ts'o, Ed.), Vol. 1, 93-104, North-Holland, Amsterdam (1977).

90.  Comings D. E., Harris D. C., Okada T. A., Holmquist G . Expl. Cell. Res., 105, 349–365 (1977).

91.  Crawford R. J., Krieg P., Harvey R. P., Hewish D. A., Wells J. R. E . Nature, 279, 132–136 (1979).

92.  Cutler R. C . Expl. Gerontol., 10, 37–60 (1975).

93.  D'Anna J. A., Gurley L. R., Deaven L. L . Nucl. Acid. Res., 5, 3195–3207 (1978).

94.  D'Anna J. A., Isenberg I . Biochemistry, 13, 4992–4997 (1974).

95.  D'Anna J. A., Tobey R. A., Barnam S. S., Gurley L. R . Biochem. Biophys. Res. Commun., 77, 187–194 (1977).

96.  Davie J. R., Candido E. P. M . J. biol. Chem., 252, 5962–5966 (1977).

97.  Davie J. R., Candido E. P. M . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 75, 3574–3577 (1978). o

98.  Defer N., Kitzis A., Levy F., Tichonicky L., Sabatier M. N., Kruh J . Europ. J. Biochem., 88, 583–691 (1978).

99.  DeLange R. J., Farnbrough D. M., Smith E. L., Bonner J . J. biol. Chem., 244, 319–344 (1969).

100.  DeLange R. J., Hooper J. A., Smith E. L . J. biol. Chem., 248, 3261–3274 (1973).

101.  DeLange R. J., Smith E. L., Bonner J . Biochem. Biophys. Res. Commun., 40, 989–993 (1970).

102.  Denis H. J . molec. Biol., 22, 285–304 (1966).

103.  Devi A., Lindsay N. K., Raina R. L., Sarkar N. K . Nature, 212, 474–475 (1966).

104.  Dingman C. W., Sporn M. B . J. biol. Chem., 239, 3483–3492 (1964).

105.  Dixon G. H., Davies P. L., Ferrier L. N., Gedamu L., Iotrov K . In: Molecular Biology of the Mammalian Genetic Apparatus (P. O. P. Ts'o, Ed.), Vol. 1, 335–379, North-Holland, Amsterdam (1977).

106.  Dixon G. H., Wong N., Poirier G. G . Fed. Proc, 35, 1623 (1976).

107.  Duerre J. A., Chakrabarry S. J . biol. Chem., 252, 8457–8461 (1977).

108.  Duerre J. A., Lee C. T . J. Neurochem., 23, 541–547 (1974).

109.  Duerre J. A., Wallwork J. C., Quick D. P., Ford K. M . J. biol. Chem., 252, 5981–5985 (1977).

110.  Elgin S. C. R., Froehner S. C., Smart J. E., Bonner J . Adv. Cell molec. Biol., 1, 1-57 (1971).

111.  Elgin S. C. R., Serunian L. A., Silver L. M. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 42, 839–849 (1978).

112.  Elgin S. C. R., Weintraub H . Ann. Rev. Biochem., 44, 725–774 (1975).

113.  Enea V., Allfrey V. G . Nature, 242, 265–267 (1973).

114.  Evans K., Hohmann P., Cole R. D . Biochim. Biophys. Acta, 221, 128–131 (1970).

315.  Farron F. F., Lightholder J. R . Biochem. Biophys. Res. Commun., 83, 94-100 (1978).

116.  Felsenfeld G . Nature, 271, 115–122 (1978).

117.  Finch J. T., Lutter L. C., Rhodes D., Brown R. S., Ruston B., Levitt M., Klug A . Nature, 269, 29–36 (1977).

118.  Fitzmaurice L. C., Baker R. F . Biochim. Biophys. Acta, 272, 510–517 (1972).

119.  Flint S. J., Weintraub H . Cell, 12, 783–794 (1977).

120.  Foe V. E., Wilkinson L. E., Laird C. D . Cell, 9, 131–146 (1976).

121.  Fontana J. A., Lovenberg W . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 70, 755–758 (1973).

122.  Freedlender E. F., Taichman L., Smithies O . Biochemistry, 16, 1802–1808 (1977).

123.  Fukuei K., Yakura K., Tanifuji S . Biochim. Biophys. Acta, 518, 390–400

124.  Gadski R. A., Chae C. B . Biochemistry, 17, 869–874 (1978).

125.  Garel A., Axel R . Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 73, 3966–3970 (1976)

126.  Gaubatz J., Cutler R. G . Gerontology, 24, 179–207 (1978).

127.  Gaubatz J., Prashad N., Cutler R. G . Biochim. Biophys. Acta, 418, 358–375 (1976).

128.  Gautier F., Bunemann H., Grotjahn L. Europ. J . Biochem., 80, 175 (1977)

129.  Germond J. E., Hirt B., Oudet P., Gross-Bellard M., Chambon P . Proc nat Acad. Sci. (USA), 72, 1843–1847 (1975).

130.  Gershey E. L., Vidali G., Allfrey V. G . J. biol. Chem., 243, 5018–5022 (1968).

131.  Gilmour R. S., Paul J . In: Chromosomal Proteins and their role in the Regulation of Gene Expression (G. S. Stein and L. J. Kleinsmith, Eds.), 19–33, Academic Press, New York and London (1975).

132.  Goldberg N. D., O'Dea R. F., Haddox M. K . Adv. Cyclic Nucl. Res 3 155–223 (1973).

133.  Goodman R. M., Schmidt E. C., Benjamin W. B . Cell Diff., 5, 233–246 (1977).

134.  Goodwin G. H., Woodhead L., Johns E. W . FEBS Lett., 73, 85–88 (1977)

135.  Gordon V. C., Knobler C. M., Olins D. E., Schumaker V. N . Proc. nat Acad Sci. (USA), 75, 660–663 (1978).

136.  Gorovsky M. A., Pleger G. L., Keevert J. B., Johmann C. A . J. Cell Biol 57, 773–781 (1973).

137.  Greengard P . Science, 199, 146–152 (1978).

138.  Gronenborn B., Messing J . Nature, 272, 375–377 (1978).

139.  Gross-Bellard M., Chambon P . Cell, 4, 281–300 (1975).

140.  Gurley L. R., D'Anna J. A., Barham S. S., Deaven L. L., Tobey R. A . Eur. J. Biochem., 84, 1-15 (1978).

141.  Gurley L. R., Hardin J. M . Arch. Biochem. Biophys., 130, 1–6 (1969).

142.  Gurley L. R., Irvin J. L., Holbrook D. J . Biochem. Biophys. Res Commun., 14, 527–532 (1964).

143.  Gurley L. R., Walters R. A., Tobey R. A . J. Cell Biol., 60, 356–364 (1974).

144.  Gurley L. R., Walters R. A., Tobey R. A . J. biol Chem., 250, 3936–3944 (1975).

145.  Guroff G., Brodsky M. J . Neurochem., 18, 2077–2084 (1971).

146.  Hagopian H. K., Riggs M. G., Swartz L. A., Ingram V. M . Cell, 12, 855–860 (1977).

147.  Hahn H. P. von . Gerontologia, 8, 123–131 (1963).

148.  Hahn H. P. von . Gerontologia, 10, 174–182 (1964, 1965).

149.  Hahn H. P. von, Fritz E. C . Gerontologia, 12, 237–250 (1966).

150.  Hahn H. P. von . Expl. Gerontol., 5, 323–334 (1970).

151.  Hamana K., Iwai K. J . Biochem., 83, 279–286 (1978).

152.  Hamilton T. H., Widnell C. C., Tata J. R . J. biol. Chem., 243, 408–417 (1968).

153.  Hancock R . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 75, 2130–2134 (1978).

154.  Hartman P. G., Chapman G. E., Moss T., Bradbury E. M . Eur. J. Biochem., 77, 45–51 (1977).

155.  Hayaishi O . Trends Biochem. Sci., 1, 9-10 (1976).

156.  Hemminki K., Bolund L . Cell Diff., 3, 347–359 (1977).

157.  Hewish D. R., Burgoyne L. A . Biochem. Biophys. Res. Commun., 52, 504–510 (1973).

158.  Hill B. T., Baserga R . Biochem. J., 141, 27–34 (1974).

159.  Hnilica L. S . Experientia, 20, 13–14 (1964).

160.  Hohmann P., Cole R. D . J. molec. Biol., 58, 533–540 (1971).

161.  Hohmann P., Tobey R. A., Gurley L. R . Biochem. Biophys. Res. Commun., 63, 126–133 (1975).

162.  Hohmann P., Tobey R. A., Gurley L. R . J. biol. Chem., 251, 3685–3692 (1976).

163.  Holde K. E. Van, Sahashrabudhe C. G., Shaw B. R., Bruggen E. F. J. Van, Arnberg A. C . Biochem. Biophys. Res. Commun., 60, 1365–1370 (1974).

164.  Honda B. M., Candido E. P. M., Dixon G. H . J. biol. Chem., 250, 8686–8689 (1975).

165.  Honda B. M., Dixon G. H., Candido E. P. M . J. biol. Chem., 250, 6881–8685 (1975).

166.  Hsiang M. W., Cole R. D . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 74, 4852–4856 (1977).

167.  Huang R. C., Bonner J . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 48, 1216–1222 (1962).

168.  Huang P. C., Branes L. A., Mura C., Quagliarello V., Bohdan P. K . In: Molecular Biology of the Mammalian Genetic Apparatus (P. O. P. Ts'o, Ed.), Vol. 1, 105–126, North-Holland, Amsterdam (1977).

169.  Iatrou L., Dixon E. M . Fed. Proc, 37, 2526–2533 (1978).

170.  Iatrou K., Spira A. W., Dixon D. H . Devi. Biol., 64, 82–98 (1978).

171.  Imai H., Shimayama M., Yamamoto S., Tanigawa Y., Ueda I . Biochem. Biophys. Res. Commun., 66, 856–862 (1975).

172.  Jackson V., Shires A., Chalkley R., Granner D. K . J. biol. Chem., 250, 56–63 (1975).

173.  Jansing R. L., Stein J. L., Stein G. S . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 74, 173–177 (1977).

174.  Javaherian K., Amini S . Biochim. Biophys. Acta, 478, 295–304 (1977).

175.  Jeppesen P. G. N., Bankier A. T., Sanders L . Expl. Cell. Res., 115, 293–302 (1978).

176.  Johns E. W . Biochem. J., 92, 55–59 (1964).

177.  Johns E. W., Goodwin G. H., Hastings J. R. B., Walker J. M . In: Organisation and Expression of Eukaryotic Genome (E. M. Bradbury and K. Javaherian, Eds.), 3-19, Academic Press, London and New York (1977).

178.  Johns E. W., Goodwin G. H., Walker J. M., Sanders C . Ciba Found Symp., 28, 95-112 (1975).

179.  Johnson E. M., Allfrey V. G., Bradbury E. M., Mathews H. R . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 75, 1116–1120 (1978).

180.  Jungmann R. A., Kranias E. G . Int. J. Biochem., 8, 819–830 (1977).

181.  Kanungo M. S., Koul O., Reddy K. R . Expl. Gerontol., 5, 261–269 (1970).

182.  Kanungo M. S., Thakur M. K . Biochem. Biophys. Res Commun., 79, 1031–1036 (1977).

183.  Kanungo M. S., Thakur M. K . J. Steroid Biochem., 11, 879–887 (1979).

184.  Kanungo M. S., Thakur M. K . Biochem. Biophys. Res. Commun., 87, 266–271 (1979).

185.  Kanungo M. S., Thakur M. K . Biochem. Biophys. Res. Commun., 86, 14–19 (1979).

186.  Karn J., Johnson E. M., Vidali G., Allfrey V. G . J. biol. Chem., 249, 667–677 (1974).

187.  Kedes L. H . Cell, 8, 321–331 (1976).

188.  Kedes L. H., Gross P. R . Nature, 223, 1335–1339 (1969).

189.  Kincade J. M., Jr., Cole R. D . J. biol. Chem., 241, 5790–5797 (1966).

190.  Kincade J. M., Jr., Cole R. D . J. biol. Chem., 241, 5798–5805 (1966).

191.  Kleinsmith L. J . J. Cell Physiol., 85, 459–475 (1975).

192.  Kleinsmith L. J., Stein J., Stein G . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 73, 1174–1178 (1976).

193.  Kleinsmith L. J., Heidema J., Carroll A . Nature, 226, 1025–1026 (1970).

194.  Kleinsmith L. J., Stein G. S . Science, 194, 428–431 (1976).

195.  Klevan L., Datta Gupta N., Hogan M., Crothers D. M . Biochemistry, 17, 4533–4540 (1978).

196.  Knippers R., Otto B., Bohme R . Nucl. Acid Res., 5, 2113–2131 (1978).

197.  KoostraA., Bailey G. S . Biochemistry, 17, 2504–2510 (1978).

198.  Komberg R. D . Science, 184, 868–871 (1974).

199.  Komberg R. D . Ann. Rev. Biochem., 46, 931–954 (1977).

200.  Komberg R. D., Thomas J. O . Science, 184, 865–868 (1974).

201. Kostraba N. C., Loor R. M., Wang T. Y. Biochem. Biophys. Res. Commun., 79, 347–351 (1977).

202.  Kostraba N. C., Montagna R. N., Wang T. Y . J. biol. Chem., 250, 1548–1555 (1975).

203.  Kostraba N. C., Montagna R. N., Wang T. Y . Biochem. Biophys. Res. Commun., 72, 334–338 (1976).

204.  Krebs E. G . Curr. Topics Cell Regulation, 5, 99-133 (1972).

205.  Kunkel N. S., Hemminki K., Weinberg E. S . Biochemistry, 17, 2591–2598 (1978).

206.  Kurochkin S. N., Trakht I. N., Severin E. S., Cole R. D . FEBS Lett, 84, 163–166 (1978).

207.  Kurtz D. I., Russell A. R., Sinex F. M . Mech. Age. Dev., 3, 37–49 (1974)

208.  Kurtz D., Sinex F. M . Biochim. Biophys. Acta, 145, 840–842 (1967).

209.  Lake R. S . Nature (New Biol.), 242, 145–146 (1973).

210.  Lake R. S., Salzman N. P . Biochemistry, 11, 4817–4826 (1972).

211.  Lambropoulos H. L., Follow K . Biochem. Biophys. Res. Commun., 80, 773–780 (1978).

212.  Lamy F., Lecocq R., Dumont J. E . Eur. J. Biochem., 73, 529–555 (1977)

213.  Langan T. A . Science, 162, 579–580 (1968).

214.  Langan T. A . J. biol. Chem., 244, 5763–6765 (1969).

215.  Langan T. A . Ann. N. Y. Acad. Sci., 185, 166–180 (1971).

216.  Langan T. A., Hohmann P . Fed. Proc, 33, 1597 (1974).

217.  Laskey R. A., Honda B. M., Mills A. D., Finch J. T . Nature, 275, 416–420 (1978).

218.  Lee H., Paik W. K . Biochim. Biophys. Acta, 277, 107–116 (1972).

219.  Lee H., Paik W. K., Borun T. W . J. biol. Chem., 248, 4194–4199 (1973).

220.  Leffak M., Grainger R., Weintraub H . Cell, 12, 837–845 (1977).

221.  Leibovitch M. P., Tichonicky L., Kruh J . Biochem. Biophys. Res. Commun., 81,623–629 (1978).

222.  Le Stourgeon W. M., Rusch H. P . Science, 174, 1233–1235 (1971).

223.  Letnansky K . FEBS Lett., 89, 93–97 (1978).

224. Levi V., Jacobson E. L., Jacobson M. K. FEBS. Lett., 88, 144–146 (1978).

225.  Levy A., Jakob K. M . Cell, 14, 259–267 (1978).

226.  Levy S., Childs G., Kedes L . Cell, 15, 151–162 (1978).

227.  Levy-Wilson B., Gjerset R. A., McCarthy B. J. Biochim. Biophys. Acta, 475, 168–175 (1977).

228.  Libby P. R . Biochem. Biophys. Res. Commun., 31, 59–65 (1968).

229.  Liew C. V., Haslett G. W., Allfrey V. G . Nature, 226, 414–417 (1970).

230.  Lifton R. P., Goldberg M. L., Karp R. W., Hogness D. S . Cold Spring Harbor Sym. Quant. Biol., 42, 1047–1052 (1978).

231.  Limas C. J., Limas C . Nature, 271, 781–783 (1978).

232.  Lipps H. J . Cell Dili., 4, 123–129 (1975).

233.  Little J. B . Gerontology, 22, 28–55 (1976).

234.  Liu A. Y.-C, Greengard P . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 73, 568–572 (1976).

235.  Lough J., Bischoff R . Devi. Biol., 57, 330–344 (1977).

236.  Louie A. J., Dixon G. H . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 69, 1975–1979 (1972).

237.  Lue P. F., Gornall A. G., Liew C. C . Can. J. Biochem., 51, 1177–1194 (1973).

238.  Luiter L. C . J. Molec. Biol., 124, 391–420 (1978).

239.  Mainwaring W. I. P . Biochem. J., 110, 79–86 (1968).

240.  Mann M. B., Smith H. O . Nucl. Acid. Res., 4, 4211 (1977).

241.  Marushige K . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 73, 3937–3941 (1976).

242.  Marushige Y., Marushige T . Biochim. Biophys. Acta, 518, 440–449 (1978).

243.  Massie H. R., Baird M. B., Nicolosi R. J., Samis H. V . Arch. Biochem. Biophys., 153, 736–741 (1972).

244.  Mathis D. J., Oudet P., Wasylyk B., Chambon P . Nucl. Acid Res., 5, 3523–3547 (1978).

245.  Mauro E. D., Deone F., Pomponi M . Biochem. J., 174, 95-102 (1978).

246.  McBroom M. J., Weiss A. K . J. Gerontol., 28, 143–151 (1973).

247.  McCleary A. R., Nooden L. D., Kleinsmith L. J . J. biol. Chem., 253, 5199–5205 (1978).

248.  Medvedev Zh. A., Medvedeva M. N., Huschtscha L. I . Gerontology, 23, 334–341 (1977).

249.  Medvedev Zh. A., Medvedeva M. N., Robson L . Gerontology, 24, 286–292 (1978).

250.  Melli M., Spinelli G., Arnold E . Cell, 12, 167–174 (1978).

251.  Mirsky A. E., Pollister A. W . J. Gen. Physiol., 30, 117–148 (1946).

252.  Mirzabekov A. D., Shick V. V., Betyavsky A. V., Bavykin S. G . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 75, 4184–4188 (1978).

253.  Mitchelson K., Chambes T. L., Bradbury E. M., Mathews H. R . FEBS Lett., 92, 339–342 (1978).

254.  Miwa M., Tanaka M., Matsushima T., Sugimura T . J. biol. Chem., 249, 3475–3482 (1974).

255.  Miyazaki K., Hagiwara H., Nagao Y., Matuo Y., Horio T. J . Biochem., 84, 135–143 (1978).

256.  Moll G. W., Jr., Kaiser E. T . J. biol. Chem., 252, 3007–3011 (1977).

257.  Morris G. E., Cooke A., Cole R. J . Expl. Cell Res., 74, 582–584 (1972).

258.  Morris G. E., Lewis P. N . Eur. J. Biochem., 77, 471–477 (1977).

259.  Morris G. E., Piper M., Cote R . Nature, 263, 76–77 (1976).

260.  Moss B., Gersowitz A., Weber L., Baglioni C . Cell, 10, 113–120 (1977).

261.  Moss T., Stephens R. M., Crane-Robinson L., Bradbury E. M . Nucl. Acid Res., 4, 2477–2485 (1977).

262.  Murphy R. F., Wallace R. B., Bonner J . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 75, 5903 5907 (1978).

263.  Murray K. J . molec. Biol., 15, 409–419 (1966).

264.  Murthy L. D., Pradhan D. E., Sreenivasan A . Biochim. Biophys. Acta, 199, 500–510 (1970).

265.  Nakane M.t Ide T., Anzal K., Ohara S., Andoh T. J . Biochem., 84, 145–157 (1978).

266.  Neelin J. M., Butler G. C . Can. J. Biochem, 39, 485–491 (1961).

267.  Nelson D. A., Perry M., Sealy L., Chalkley R . Biochem. Biophys. Commun, 82, 1346–1353 (1978).

268.  Nelson D. A., Perry M., Sealy L., Chalkley R . Biochem. Biophys. Res. Commun, 82, 1346–1353 (1978).

269.  Nishizuka Y, Ueda K., Honjo T., Hayaishi O . J. biol. Chem, 243, 3765–3767 (1968).

270.  Offerbacher S., Klein E. S . Biochem. Biophys. Res. Commun, 66, 375–382 (1975).

271.  Okayama H., Ueda K., Hayaishi O . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 75, 1111–1115 (1978).

272.  Olins A. L, Olins D. E . Science, 183, 330–332 (1974).

273.  Oliver D., Balhorn R., Granner D. R., Chalkley R . Biochemistry, 11, 3921–3925 (1972).

274.  O'Meara A., Herrmann R . Biochim. Biophys. Acta, 269, 419–427 (1972).

275.  Ord M. G., Stocken L. A . Biochem. J, 98, 888–897 (1966).

276.  Ord M. G., Stocken L. A . Proc. FEBS Symp. 9th, 34, 113–125 (1975).

277.  Ord M. G., Stocken L. A . Biochem. J, 161, 583–592 (1977).

278.  Ord M. G., Stocken L. A . Biochem. J, 176, 615–618 (1978).

279.  Otake H., Miwa M., Fujumura S., Sugimura T. J . Biochem, 65, 145–150 (1969).

280.  Otero R. D., Felsenfeld G . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 74, 5519–5523 (1977).

281.  Pages M., Alonso C . Nucl. Acid. Res, 5, 549–562 (1978).

282.  Palmiter R. D., Mulvihill E. R., McKnight G. S., Senear A. W . Cold Spring-Harbor Symp. Quant. Biol, 42, 639–648 (1978).

283.  Paponov V. D., Gromov P. S., Sokolov N. A., Spitkovsky D. M., Tseitlin P. I . Biochem. Biophys. Res. Commun, 82, 674–679 (1978).

284.  Park W., Jansing R., Stein J., Stein G . Biochemistry, 16, 3713–3721 (1977).

285.  Paul J., Gilmour R. S . J. molec. Biol, 34, 305–316 (1968).

286.  Perrella F. W., Lee M. A . Biochem. Biophys. Res. Commun, 82, 575–581 (1978).

287.  Perry M., Nelson D., Moore M., Chalkley R . Biochim. Biophys. Acta, 561 517–525 (1979).

288.  Phillips D. M. P . Biochem. J, 87, 258–263 (1963)

289.  Pogo B. G. T., Allfrey V. G., Mirsky A. E . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 55, 805–812 (1966).

290.  Pogo B. G. T., Pogo A. O., Allfrey V. G., Mirsky A. E . Proc. nat. Acad-Sci. (USA), 59, 1337–1344 (1968).

291.  Prashad N., Cutler R. G . Biochim. Biophys. Acta, 418, 1-23 (1976).

292.  Prentice D. A., Taylor S. E., Newmark M. Z., Kitos P. A . Biochem. Biophys. Res. Commun, 85, 541–550 (1978).

293.  Prescott D. M . J. Cell. Biol., 31, 1–9 (1966).

294.  Price G. B., Modak S. P., Makinodan T . Science, 171, 917–920 (1971).

295.  Pumo D. E., Stein G. S., Kleinsmith L. J . Cell Diff., 5, 45–52 (1976).

296.  Pyhtila M. J., Sherman F. G . Biochem. Biophys. Res. Commun., 31, 340–344 (1968).

297.  Rabbani A., Goodwin G. H., Johns E. W . Biochem. J., 173, 497–505 (1978).

298.  Rastl E., Swetly P . J. biol. Chem., 253, 4333–4340 (1978).

299.  Rattle H. W. E., Langan T. A., Danby S. E., Bradbury E. M . Eur. J. Biochem., 81, 499–505 (1977).

300.  Reeves R., Candido E. P. M . FEBS Lett., 91, 117–120 (1978).

301.  Rem M., Nehls P., Hozier J . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 74, 1879–1883 (1977).

302.  Riggs M. G., Whittaker R. G., Neumann J. R., Ingram V. M . Nature, 268, 462–464 (1977).

303.  Robbins E., Borun T. W . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 57, 409–416 (1967).

304.  Roizes G . Nucl. Acid Res., 3, 2677 (1976).

305.  Rovera G., Farber J., Baserga R . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 68, 1725–1729 (1971).

306.  Rubin C. S., Rosen O. M . Ann. Rev. Biochem., 44, 831–887 (1975).

307.  Ruderman J. V., Gross P. R . Devi. Biol., 36, 286–298 (1974).

308.  Ruiz-Carrillo A., Wangh L. J., Allfrey V. G . Science, 190, 117–128 (1975).

309.  Ruiz-Carrillo A., Wangh L. J., Littau V. C., Allfrey V. G . Arch. Biochem. Biophys., 174, 273–290 (1976).

310.  Sadgopal A., Bonner J . Biochim. Biophys. Acta, 186, 349–357 (1969).

311.  Samis H. V., Wulff V. J., Falzone J. A . Biochim. Biophys. Acta, 91, 223–232 (1964).

312.  Schaffner W., Kunz G., Daetwyler H., Telford J., Smith H. O., Birnsteil M. L . Cell, 14, 655–671 (1978).

313.  Scheer V . Cell, 13, 535–549 (1978).

314.  Schmidt E. C., Goodman R. M . Differentiation, 6, 177–186 (1976).

315.  Sealy L., Chalkley R . Cell, 14, 115–121 (1978).

316.  Sealy L., Chalkley R . Nucl. Acid Res., 5, 1863–1876 (1978).

317.  Seibert G., Ord M. G., Stocken L. A . Biochem. J., 122, 721–725 (1971).

317a. Shainberg A., Yagil G., Yaffe D . Devi. Biol., 25, 1-29 (1971).

318.  Shaw P. A., Sahasrabudhe C. G., Hodo H. G., Saunders G. F . Nucl. Acid Res., 5, 2999–3012 (1978).

319.  Shea M., Kleinsmith L . J. Biochem. Biophys. Res. Commun., 50, 473–477 (1973).

320.  Shepherd G. R., Noland B. J., Hardin J. M., Byvoet P . Biochemistry of Geno Expression in Higher Organisms, 164–176, Australia and New Zealand Book Company, Sydney (1973).

321.  Shoemaker C. B., Chalkley R . J. biol. Chem., 253, 5802–5807 (1978).

322.  Simon D., Grunert F., Acken U., Doring H. P., Kroger H . Nucl. Acid Res, 5, 2153 (1978).

323.  Singer J., Roberts-Ems J., Riggs A. D . Science, 203, 1019–1021 (1979).

324.  Simpson R. T . Cell, 13, 691–699 (1978).

325.  Spelsberg T. C., Hnilica L. S . Biochem. J., 120, 435–437 (1970).

326.  Spiker S., Mardian J. K. W., Isenberg I . Biochem. Biophys. Res. Commun., 82, 129–135 (1978).

327.  Söllner-Webb B., Camerini-Otero R. D., Felsenfeld G . Cell, 9, 179–193 (1976).

328.  Söllner-Webb B., Felsenfeld G . Biochemistry, 14, 2915–2920 (1975).

329.  Söllner-Webb B., Mechior W., Felsenfeld G . Cell, 14, 611–627 (1978).

330.  Stedman E., Stedman E . Nature, 152, 556–557 (1943).

331.  Stein G. S., Park W., Thrall C, Mans R., Stein J . Nature, 257, 764–767 (1975)

332.  Stein G. S., Spelsberg T. C., Kleinsmith L. J . Science, 183, 817–824 (1974).

333.  Sterner R., Vidali G., Heinnikson R. L., Allfrey V. G . J. biol. Chem., 253, 7601–7604 (1978).

334.  Sugimura T . Prog. Nuc Acid Res. Mol. Biol., 13, 127–151 (1973).

335.  Sung M. T., Freedlender E. F . Biochemistry, 17, 1884–1890 (1978).

336.  Sung M. T., Harford J., Bundman M., Vidalakas G . Biochemistry, 16, 279–285 (1977).

337.  Sussman J. L., Trifonov E. N . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 75, 103–107 (1978).

338.  Takaku F., Nakao K., Ono T., Terayama H . Biochim. Biophys. Acta, 195, 396–400 (1969).

339.  Tanaka M., Hayashi K., Sakura H., Miwia M., Matushima T., Sugimura T . Nucl. Acid Res., 5, 3183–3194 (1978).

340.  Tanigawa Y., Kawamura M., Shimoyama M . Biochem. Biophys. Res. Commun., 76, 406–412 (1977).

341.  Tanigawa Y., Kitamura A., Kawamura M., Shimoyama M . Eur. J. Biochem., 92, 261–269 (1978).

342.  Tanphaichitr N., Chalkley R . Biochemistry, 15, 1610–1614 (1976).

343.  Tarnowka M. A., Baglioni C., Basilico C . Cell, 15, 163–171 (1978).

344.  Tata J. R., Baker B . J. molec. Biol., 118, 249–272 (1978).

345.  Tatchell K., Holde K. E. Van . Biochemistry, 16, 5295–5303 (1976).

346.  Teng C., Hamilton T. H . Biochem. Biophys. Res. Commun., 40, 1231–1238 (1970).

347.  Teng C. S., Teng C. T., Allfrey V. G . J. biol. Chem., 246, 3597–3609 (1971).

348.  ThakurM. K . Biochemistry of Aging: Modifications of chromosomal proteins of the brain of the rat, Ph. D. Thesis, Banaras Hindu University (1978).

349.  Thakur M. K., Das R., Kanungo M. S . Biochem. Biophys. Res. Commun., 81, 828–831 (1978).

350.  Thomas G., Lange H. W., Hempel K . Eur. J. Biochem., 51, 609–615 (1975).

351.  Thompson J. A., Stein J. L., Kleinsmith L. J., Stein G. S . Science, 194, 428–430 (1976).

352.  Tidwell T., Allfrey V. G., Mirsky A. E . J. biol. Chem., 243, 707–715 (1968).

353.  Tsanev R., Russev G . Europ. J. Biochem., 43, 257–263 (1974).

354.  Ts'o P. O. P . (Ed.) Molecular Biology of the Mammalian Genetic Apparatus, Vols. I and II, North-Holland, Amsterdam (1977).

355.  Turkington R. W . Biochim. Biophys. Acta, 213, 478–483 (1970).

356.  Ueda K., Omachi A., Kawachi M., Hayaishi O . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 72,205–209 (1975).

357.  Uy R., Wold F . Science, 198, 890–896 (1977).

358.  Yanyushin B. F., Nemirovsky L. E., Klimenko V. V., Vasiliev V. K., Belozersky A. N . Gerontologia, 19, 138–152 (1973).

359. Vidali G., Boffa L. C, Bradbury E. M., Allfrey V. G. Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 75, 2239–2243 (1978).

360.  Vincent R. A., Huang P. C . Expl. Cell. Res., 102, 31–45 (1976).

361.  Walker J. M., Hastings J. R. B., Johns E. W . Nature, 271, 281–282 (1978).

362.  Wallace R. B., Sargent T. D., Murphy R. F., Bonner J . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 74, 3244–3248 (1977).

363.  Walwork J. C., Quick D. P., Duerre J. A . J. biol. Chem., 252, 5977–5980 (1977).

364.  Wang T. Y . Expl. Cell Res., 61, 455–460 (1970).

365.  Watson G., Langan T. A . Fed. Proc, 32, 588 (1973).

366.  Weintraub H . Nature, 240, 449–453 (1972).

367.  Weintraub H., Groudine M . Science, 193, 848–856 (1976).

368.  Weintraub H., Lente F. Van . Proc. nat. Acad. Sci. (USA), 71, 4249–4253 (1974).

369.  Weintraub H., Worcel A., Alberts B . Cell, 9, 409–417 (1976).

370.  Welch S. L., Cole R. D . J. biol. Chem., 254, 662–665 (1979).

371.  Whitlock J. P., Stein A . J. biol. Chem., 253, 3857–3861 (1978).

372.  Wilhelm F., Wilhelm M. L., Erard M., Daune M. P . Nucl. Acid. Res., 5, 505–521 (1978).

373.  Wilson M. C., Melli M. J. molec. Biol., 110, 611–535 (1977).

374.  Wong N. C. W., Poirier G. G., Dixon G. H . Eur. J. Biochem., 77, 11–21 (1977).

375.  Worcel A., Han S., Wong M. L . Cell, 15, 969–977 (1978).

376.  Yabuki H., Iwai K . J. Biochem., 82, 679–686 (1977).

377.  Yaffe D., Fuchs S . Devi. Biol., 15, 33–50 (1967).

378.  Yamaizumi M., Uchida T., Okada Y., Furusawa M., Mitsui H . Nature, 273, 782–784 (1978).

379.  Yarbo J. W . Biochim. Biophys. Acta, 145, 531–534 (1967).

380.  Yoshihara K., Hashida T., Tanaka Y., Ohgushi H., Yoshihara H., Kamiya T . J. biol. Chem., 253, 6459–6466 (1978).

381.  Yoshihara K., Tanigawa Y., Koide S. S . Biochem. Biophys. Res. Commun., 59, 658–665 (1974).

382.  Yu S. S., Li H. J., Goodwin G. H., Johns E. W . Eur. J. Biochem., 76, 461–468 (1977).

383.  Yu S. S., Li H. J., Goodwin G. H., Johns E. W . Eur. J. Biochem., 78, 497–502 (1977).

384.  Zhelabov S. M., Berdyshev G. D . Expl. Gerontol., 7, 313–320 (1972).

385.  Zlatanova J., Swetly P . Nature, 276, 276–277 (1978).