Генетика развития изучает реализацию наследственной информации в ходе онтогенеза, т. е. путь от гена к признаку. Это направление в 1920-х гг. заложили исследования немецкого зоолога В. Хеккера, который назвал его феногенетикой. У истоков феногенетики стояли такие выдающиеся ученые, как Т. Морган (США), Р. Гольдшмидт (Германия), Э. Хадорн (Швейцария), С. Уодингтон (Англия), Н. К. Кольцов (Россия).

Основной вопрос генетики развития был сформулирован еще Т. Морганом: «Каким образом молекулярно-генетические события в ходе онтогенеза детерминируют формообразовательные процессы?». Для биологии развития проблема детерминации имеет исключительное значение.

 

13.1. Детерминация

В процессах органогенеза и гистогенеза у высших животных и человека образуется около 200 видов клеток, которые формируют различные ткани и органы, имеют морфофизиологические особенности, расположены строго определенным образом.

Отличается ли геном разных типов клеток? Поскольку разные клетки обладают разными наборами генных продуктов, можно предположить, что они обладают и разными генами, утрачивая «ненужные» гены в ходе онтогенеза. Однако целый ряд исследований показал, что клетки почти всех типов содержат одинаковый полный геном, который образуется в зиготе.

Убедительное подтверждение этому было получено в 1962 г. английским генетиком Дж. Гердоном. В энуклеированные яйцеклетки лягушки Xenopus laevis инъецировали ядро кишечного эпителия головастика. Около 1 % яиц, в которые были пересажены ядра, дали взрослых лягушек. Таким образом, возникновение различий между клетками обусловлено, как правило, не изменениями в геноме. Только у некоторых организмов отмечено уменьшение количества генетического материала в ходе онтогенеза – это интересное явление получило название диминуции хроматина. В подавляющем большинстве других случаев разные клетки, имея одинаковый геном, различаются экспрессией своих генов, т. е. в разных клетках гены по-разному «включаются» и «выключаются». Порядок этих «включений» и задается в результате детерминации.

Детерминация – это ограничение возможностей последующих дифференцировок, определяющее развитие клетки по специализированному пути. Выбор программы развития клетки происходит задолго до проявления морфофизиологических различий, т. е. до самой дифференцировки.

Как и на какой стадии развития клетки происходит этот выбор, т. е. детерминация? Это непростой вопрос. Многоступенчатый характер детерминации затрудняет определение ее «начала». В настоящее время большинство ученых считают, что исходный выбор направления развития обусловлен воздействием на эквипотенциальные ядра разной цитоплазмы. Поэтому в объяснении механизма детерминации большое значение придается системе ядерно-цитоплазматических отношений. Более того, еще Т. Морган предлагал считать началом онтогенеза не момент оплодотворения, а созревание яйцеклетки.

В неоплодотворенной яйцеклетке в цитоплазме уже содержится позиционная информация, которая играет решающую роль в процессах детерминации клеток будущего зародыша. Эта информация реализуется в результате экспрессии генов ооцита и питательных клеток материнского организма, окружающих ооцит. Продукты таких генов (белки), поступающие в ооцит до оплодотворения, получили название морфогены, а сами гены называют генами с «материнским эффектом».

Морфогены распределены в цитоплазме неравномерно. Процесс формирования гетерогенности цитоплазмы яйцеклетки в ходе ее развития называется оопластической сегрегацией. В результате этого процесса формируются три градиента:

– анимально-вегетативный;

– дорсовентральный;

– терминальных структур (головного и хвостового отделов).

Влияние системы градиентов яйцеклетки на последующее развитие зародыша называется предетерминация. Оопластическая сегрегация на химическом уровне «преформирует» план строения будущего организма, что является основой для последующей дифференциальной экспрессии регуляторных генов, т. е. реализации программы дифференциации клеток.

После оплодотворения и начала дробления морфогены взаимодействуют с регуляторными генами зиготы. Если клетка возникает в зоне локализации морфогена, то она будет испытывать его влияние. Если она возникает вне зоны действия данного морфогена, то будет развиваться иначе. Влияние оказывается через взаимодействие специфических областей морфогенов (доменов) и определенных участков регуляторных генов.

Наглядным примером могут служить эксперименты с так называемой полярной плазмой яиц насекомых. Ядра, попавшие в эту область, дают начало половым клеткам. Если полярную плазму инъецировать в другую область, то половые клетки разовьются в этом новом необычном месте.

Оопластическая сегрегация исследовалась в основном на яйцеклетках дрозофилы и амфибий. Детали этого процесса у млекопитающих изучены пока недостаточно.

Решающую роль в последующих этапах детерминации играют регуляторные гены. Формирование специфичного для данной ткани набора активных регуляторных генов и составляет суть клеточной детерминации. Стабильность детерминации во многом обусловлена стабильностью репрессии неактивных регуляторных генов. Активность регуляторных генов предопределяет тканевую специфичность клеток, реализуемую в процессе дифференциации.

 

13.2. Дифференциация

Дифференциация – это процесс специализации клеток, обусловливающий их морфофизиологические различия. Другими словами, это реализация программы, которая была намечена детерминацией.

Различные виды клеток эукариотического организма синтезируют как одинаковые белки, так и специфические. В зависимости от типа клеток и стадии их развития может варьироваться и уровень продукции любого белка. В связи с этим в биологии развития различают два вида эукариотических генов:

1. Гены «домашнего хозяйства» (housekeeping genes) связаны с поддержанием универсальных клеточных функций. Проявляются во всех клетках. У млекопитающих и человека доля таких генов составляет примерно 20 %.

2. Гены «роскоши» связаны с осуществлением специализированных клеточных функций, специфичных для отдельных типов клеток. Такие гены функционируют (экспрессируются) в одних клетках и не функционируют в других.

Высокий уровень активности генов «домашнего хозяйства» является обычно предварительным этапом дифференциации, следующим после установления детерминации. Этот этап, вероятно, не имеет тканевой специфичности. Известно, что клеточная детерминация происходит задолго до формообразовательных процессов.

Дифференциальная экспрессия генов «роскоши» обусловливает дифференциацию клеток в определенном направлении. В результате дифференциальной активности генов формируются различные клеточные линии, а на их основе – ткани и органы.

По мере развития зародыша усиливаются связи между клетками и увеличивается их влияние друг на друга. Влияние клеточных структур, определяющее развитие других клеточных структур, называется эмбриональной индукцией. Наиболее наглядно ее действие можно наблюдать во время формирования нервной системы. На дифференцировку нервной ткани влияют экспрессия ее собственных генов, генов смежных нейронов, генов удаленных нейронов, отростки которых достигают этой клетки, а также дифференциальная экспрессия генов, окружающих глиальных клеток, генетические системы эндокринных и нейроэндокринных органов. На первоначальном этапе происходит образование нервной пластинки из эктодермы. Индуктором этого процесса является группа клеток дорсальной губы бластопора – так называемый гензеновский узелок. Именно исследование этой области и послужило толчком к созданию основателем экспериментальной эмбриологии Г. Шпеманом (1869–1941) учения об «организаторах». В клетках «гензеновского узелка» активируются гены, кодирующие белковые факторы, направляющие развитие эктодермы по нейральному пути. В свою очередь, закладка самого «гензеновского узелка» инициируется β-катенином, градиент которого устанавливается в ходе оопластической сегрегации.

Дифференциация, как и детерминация, у всех животных протекает в несколько этапов. Можно ли выделить какие-либо закономерности во всем многообразии онтогенезов? Оказывается, можно.

Для онтогенезов почти всех животных, включая человека, характерен процесс разделения зародыша на сегменты. Этот процесс называется сегментацией. Его контролируют две группы генов. Сегрегационные гены – определяют количество будущих сегментов. Они последовательно активируются в процессе развития. Мутации по сегрегационным генам обычно несовместимы с ходом эмбриогенеза и вызывают гибель зародыша на разных стадиях.

Другую группу составляют особые регуляторные гены, контролирующие морфогенетические процессы внутри сегментов, т. е. направление развития каждого сегмента. Наиболее хорошо изучены в этой группе регуляторные гены дрозофилы – гомеозисные гены. Это название происходит от термина «гомеозис», который ввел еще У. Бэтсон в 1894 г. для феномена превращения одной части тела в другую.

У дрозофилы гомеозисные гены контролируют развитие различных структур на головном, грудном и брюшном сегментах. Пониманию их роли помогло изучение гомеозисных мутаций. Гомеозисные мутации приводят к появлению не свойственной данному сегменту структуры. Так, на грудных сегментах могут возникать структуры головы, и наоборот. Таким образом, гомеозисная мутация – это изменение направления детерминации.

Все гомеозисные гены имеют общие нуклеотидные последовательности, которые получили название гомеобокс, а коллинеарный им фрагмент белковой молекулы – гомеодомен. Именно область гомеодомена ответственна за соединение регуляторного белка с ДНК. Гомеобокс был открыт Мак-Гиннисом в начале 1980-х гг.

Хотя гомеозисные гены наиболее основательно изучены у дрозофилы, все представители животного мира, имеющие стадию сегментированного зародыша (в том числе человек), имеют гомеобокссодержащие гены. Структура гомеобокса (180 п. н.) оказалась исключительно консервативна у самых дальних филогенетических групп. Так, из 60 аминокислот гомеодомена лягушки и мухи 55 оказались одинаковыми. Такая консервативность характерна для структур, определяющих самые ранние стадии развития. Действительно, гомеозисные гены дрозофилы начинают экспрессироваться уже через 2 ч после оплодотворения.

У млекопитающих выявлено 38 гомеобокссодержащих генов (Корочкин Л. И., 2002). Они получили название НОХ-генов. Как гомеозисные гены дрозофилы, так и НОХ-гены формируют компактные группы – кластеры. У человека 4 кластера расположены на хромосомах 2, 7, 12, 17. В отличие от дрозофилы, у млекопитающих определенная структура контролируется не отдельными НОХ-генами, а специфичной для этой структуры совокупностью экспрессий нескольких НОХ-генов. Одним из интересных явлений, наблюдаемых в генетике развития, является феномен «коллинеарности» (соответствия) между последовательностями гомеобокссодержащих генов в кластере и зонами их экспрессии вдоль оси тела.

Поскольку дифференцированные клетки утрачивают митотическую активность, в каждой ткани существует резерв клеток, сохранивших способность к делению. К таким клеткам принадлежат стволовые клетки – недифференцированные клетки-предшественники других клеток, сохраняющие высокий потенциал развития. В связи с этим один из классиков биологии развития швейцарский ученый Э. Хадорн, рассматривая детерминацию как сложный и многоступенчатый процесс, разделил ее на два вида:

1) детерминация, ведущая к дифференциации;

2) детерминация, ведущая к воспроизведению недифференцированных клеток, служащих своеобразным резервом для различных дифференцировок.

Эмбриональные стволовые клетки зародыша обычно тотипотентны. Тотипотентность (эквипотенциальность) – это способность клетки развиваться в любом направлении. У взрослого организма стволовые клетки мультипотентны, т. е. способны дифференцироваться в различные виды клеток, но не в любые. Однако можно допустить, что ядра некоторых из этих клеток сохраняют тотипотентность. Такая возможность представляет определенный интерес для решения проблемы обратимости детерминации.

 

13.3. Проблема обратимости детерминации

Одним из важнейших и интереснейших вопросов биологии развития является вопрос «прочности» детерминации. Наличие стойкой детерминации к определенным направлениям дифференцировки – одна из фундаментальных характеристик тканевой системы. Можно ли изменить детерминированность, переключить развитие клетки в новом направлении?

Одним из направлений поиска ответа на этот вопрос являются эксперименты по клонированию. Клоном называется клеточная популяция, возникающая из одной исходной соматической клетки, а процесс получения клона называется клонированием. Примером клонирования являются эксперименты с трансплантацией ядер, которые показали принципиальную возможность обратимости изменений при дифференцировке.

Однако проблема тотипотентности, т. е. сохранение клетками способности давать целый организм, не настолько проста, чтобы прийти к однозначному решению.

После успешных опытов Дж. Гердона опыты по трансплантации ядер были продолжены на млекопитающих. До стадии 8 бластомеров клетки зародышей млекопитающих тотипотентны, что подтверждают удачные опыты по развитию организмов из одного бластомера. Другим подтверждением является обратное явление – объединение клеток двух эмбрионов. Организмы, полученные агрегацией генетически различных клеток, называются химерами. Химер можно также получить, вводя клетки ранних эмбрионов (даже одну клетку) в чужеродную бластоцисту. Бластоциста представляет собой стадию эмбриогенеза млекопитающих. Введенные клетки включаются в состав клеточной массы эмбриона-реципиента. У такой химеры клетки перемешаны случайным образом, поэтому ее ткани и органы тоже химерны. Это показало, что каждый тип тканей образуется не из одной клетки-предшественницы, а из группы клеток.

Эксперименты по трансплантации ядер млекопитающих в энуклеированные яйцеклетки вначале были неудачными. Всего 5 % ядер 4-клеточных эмбрионов и около 20 % ядер 2-клеточных зародышей мышей развивались до стадии морулы. Это указывает на быструю потерю тотипотентности в ходе эмбриогенеза. Поэтому сообщение о рождении клонированной овечки Долли в 1997 г. стало настоящей сенсацией. Английский эмбриолог Я. Вильмут использовал ядра клеток молочной железы взрослой овцы, вводя их в энуклеированную яйцеклетку и перенося их затем в овцу-реципиента. Из 250 экспериментов успехом увенчался один. В 1998 г. была разработана методика клонирования мышей с вероятностью успеха около 2 % путем воздействия на яйцеклетку специальных стимулирующих веществ.

Однако изучение молекулярно-генетических механизмов клеточной дифференцировки заставляет некоторых ученых усомниться в возможности получения клона из ядер дифференцированных клеток. У многих животных наблюдались изменения определенных участков ДНК в разных тканях. Как уже говорилось выше, показано уменьшение теломерных участков хромосом в ходе онтогенеза в соматических клетках. Таким образом, изменения генома в процессе дифференцировки достаточно глубоки. Причем, чем более высокое место в эволюционной лестнице занимает организм, тем обычно глубже эти изменения.

Как же тогда можно объяснить успешные результаты клонирования: от лягушек Гердона до овечки Долли? Вероятно, успех достигался именно тогда, когда в яйцеклетку случайно попадало ядро стволовой клетки (Корочкин Л. И., 2002). Как оказалось, они представлены в организме шире, чем считалось ранее. Частота их наличия в тканях (0,5–1,5 %) хорошо сопоставима с процентом выхода в экспериментах по клонированию.

Многие важные закономерности биологии развития позволили выявить исследования на классическом объекте экспериментальной генетики – дрозофиле.

У дрозофилы гомеозисные гены направляют развитие особых личиночных структур – имагинальных дисков (ИД). Из ИД образуется тело взрослой мухи. Популяции личиночных и имагинальных клеток разделяются очень рано. Образно говоря, личинку можно рассматривать как капсулу для хранения и питания имагинальных клеток. Дрозофила имеет 19 ИД. После метаморфоза они преобразуются в различные органы мухи. Внешне клетки разных ИД отличить друг от друга невозможно, хотя они различаются биохимически.

В экспериментах по пересадке ИД другим личинкам в различные части тела пересаженный диск на новом месте дифференцировался в структуру, соответствующую его первоначальному положению, т. е. ИД демонстрировал жесткую детерминацию. Пересаженный в тело взрослой мухи ИД не претерпевает изменений, поскольку нет соответствующего гормонального воздействия. Такие ИД при последовательных пересадках живут очень долго, не претерпевая дифференцировки. После любого числа пересадок введенные личинкам ИД дифференцируются в соответствии с их первоначальным происхождением. Это показывает, что состояние детерминации может наследоваться в ряду клеточных поколений неопределенно долго.

Однако иногда пересаженные ИД дифференцируются в структуры, отличные от первоначальных. Например, ИД антенн развивается в конечность. Такое явление, открытое Э. Хадорном, получило название трансдетерминация. Оно похоже на гомеозисные мутации. Феномен трансдетерминации до конца не разгадан, но он демонстрирует возможность изменения детерминации. Процесс трансдетерминации подчиняется определенным закономерностям и происходит в тех же направлениях, что и гомеозисные мутации.

 

13.4. Апоптоз

Огромное практическое и теоретическое значение имеет изучение такого явления, как апоптоз. Апоптоз – запрограммированная смерть клеток, которая реализуется генетической программой «самоубийства». Можно предположить, что эта генетическая программа весьма консервативна и универсальна для всех живых систем. Благодаря апоптозу происходит регуляция количества клеток в органах и удаление лишних и потенциально опасных клеток.

Апоптоз часто сопровождается расщеплением ДНК на все более и более мелкие фрагменты. Примером гена апоптоза может служить ген rpr (жнец) у дрозофилы, способный аккумулировать внутренние и внешние сигналы для своей экспрессии и вызывать смерть клетки.

Экспрессия гена bcl-2 у человека, наоборот, блокирует программу апоптоза в опухолевых клетках. В настоящее время торможению апоптоза придается большое значение в процессе малигнизации клеток. В норме клетки регистрируют нарушения экспрессии генов, контролирующих деление, и в таких клетках включается программа апоптоза. При малигнизации такая регуляция нарушается. В этом случае апоптоз выступает как механизм защиты организма от клеток с генетическими нарушениями.

Однако при других заболеваниях человека (например, нейродегенеративных) происходит интенсификация физиологической гибели клеток.

Успехи геномики позволяют все более четко идентифицировать гены, влияющие на продолжительность жизни. За фундаментальные исследования апоптоза С. Бреннеру, Дж. Салтону и Р. Хорвицу была присуждена Нобелевская премия 2002 г.

 

13.5. Общие закономерности регуляции онтогенеза

Молекулярно-генетические механизмы онтогенеза во многом похожи у организмов разного филогенетического уровня и основываются на фундаментальных процессах активации и репрессии. Стартовым сигналом ко многим процессам развития служит позиционная информация яйцеклетки материнского организма.

В процессах детерминации и дифференциации, приводящим к многообразию клеток и тканей, ключевым фактором является дифференциальная экспрессия генов. У эукариот она носит многоуровневый характер. Гены, регулирующие развитие, представляют собой систему, организованную по иерархическому принципу. Активация одних генов включает экспрессию других, а регуляция экспрессии может происходить на любом уровне. Такая сложная морфогенетическая цепочка может быть запущена одним геном, который «включает» комплекс последовательных формообразовательных событий. Гены, запускающие такой «каскад», получили в биологии развития название «гены-господа» (Master Genes), а структурные гены последнего уровня – «гены-рабы» (Slaves Genes). Между ними располагаются многочисленные регуляторные гены, к которым принадлежат и гомеозисные. Существуют регуляторные гены, контролирующие гомеозисные гены, также как и гены, контролируемые ими. Дифференциальная экспрессия обеспечивается взаимодействием многих регуляторных генов. Схематично это можно представить следующим образом:

Гены «материнского эффекта» → «Гены-господа» → Система регуляторных генов → Структурные гены

Молекулярно-генетические механизмы онтогенеза весьма сложны, не все детали в настоящее время понятны. Эти сложности послужили причиной многочисленных спекуляций. В околонаучной среде с давних пор широкую популярность имеет понятие «биополе», подразумевающее внешний фактор развития организма неизвестной физической природы. В прежние времена концепцию «биополя» разделяли и некоторые ученые-эмбриологи. «Биополю» разные авторы приписывают различные функции, но одной из основных является функция формообразования.

Однако изучение морфогенетических закономерностей показывает, что формообразовательные процессы обусловлены спецификой последовательностей экспрессии разных генов, запускаемых обычно одним геном. Это лишний раз убеждает в необоснованности теории «биополя» как особого фактора онтогенеза. Формообразовательные процессы зависят от молекулярно-генетических процессов, так же как и другие онтогенетические процессы. Весьма наглядно демонстрируют это гомеозисные мутации.

* * *

Таким образом, мы можем видеть, что современная эмбриология столь тесно связана с генетикой, что фактически стала ее разделом. Успехи генетики формируют современный облик биологии развития. Однако не надо забывать и возможности других наук.

Фундаментальные законы мироздания в настоящее время неизбежно рассматриваются в рамках системного подхода. Вероятно, в природе существует единый способ построения сложных систем, обусловливающий все формообразовательные процессы, от молекулярного до организменного уровня.

Биологию развития ждут революционные открытия, которые, возможно, радикально изменят наши представления об онтогенезе.