Структура молекулы ферментов

По строению ферменты могут быть простыми и сложными белками. Фермент, являющийся сложным белком называют холоферментом. Белковая часть фермента называется апоферментом, небелковая часть – кофактором.

Различают два типа кофакторов:

1. Простетическая группа – прочно связана с апоферментом, часто ковалентными связями.

2. Кофермент – небелковая часть, легко отделяемая от апофермента. Часто коферментами служат производные витаминов.

К коферментам относятся следующие соединения:

1. производные витаминов;

2. гемы, входящие в состав цитохромов, каталазы, пероксидазы, гуанилатциклазы, NO-синтазы и являющиеся простетической группой ферментов;

3. нуклеотиды – доноры и акцепторы остатка фосфорной кислоты;

4. убихинон или кофермент Q, участвующий в переносе электронов и протонов в цепи тканевого дыхания;

5. фосфоаденозилфосфосульфат, участвующий в переносе сульфата;

6. глутатион, участвующий в окислительно-восстановительных реакциях.

Таблица 3.1. Коферментные функции витаминов

Кофакторы – ионы металлов

Более 25 % всех ферментов для проявления полной каталитической активности нуждается в ионах металлов. Рассмотрим их роль в ферментативном катализе.

Роль металлов в присоединении субстрата в активном центре фермента.

Ионы металла выполняют функцию стабилизаторов молекулы субстрата, активного центра фермента и конформации белковой молекулы фермента, а именно третичной и четвертичной структур.

Ионы металлов – стабилизаторы молекулы субстрата.

Для некоторых ферментов субстратом служит комплекс превращаемого вещества с ионом металла. Например, для большинства киназ в качестве одного из субстратов выступает не молекула АТФ, а комплекс Mg2+-АТФ. В этом случае ион Mg2+ не взаимодействует непосредственно с ферментом, а участвует в стабилизации молекулы АТФ и нейтрализации отрицательного заряда субстрата, что облегчает его присоединение к активному центру фермента.

Схематично роль кофактора при взаимодействии фермента и субстрата можно представить как комплекс E-S-Me, где Е – фермент, S – субстрат, Ме – ион металла.

Ионы металлов – стабилизаторы активного центра фермента.

В некоторых случаях ионы металлов служат «мостиком» между ферментом и субстратом. Они выполняют функцию стабилизаторов активного центра, облегчая присоединение к нему субстрата и протекание химической реакции. В ряде случаев ион металла может способствовать присоединению кофермента. Перечисленные выше функции выполняют такие металлы, как Mg2+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Mo2+. В отсутствие металла эти ферменты активностью не обладают. Такие ферменты получили название «металлоэнзимы».

К металлоэнзимам относят, например, фермент пируваткиназу.

Роль металлов в стабилизации структуры фермента.

Ионы металлов обеспечивают сохранение вторичной, третичной, четвертичной структуры молекулы фермента. Такие ферменты в отсутствие ионов металлов способны к химическому катализу, однако они нестабильны. Их активность снижается и даже полностью исчезает при небольших изменениях рН, температуры и других незначительных изменениях внешнего окружения. Таким образом, ионы металлов выполняют функцию стабилизаторов оптимальной конформации белковой молекулы.

Иногда в стабилизации вторичной и третичной структуры принимают участие ионы щёлочноземельных металлов. Так, для поддержания третичной конформации пируваткиназы необходимы ионы К+.

Для стабилизации четвертичной структуры алкогольдегидрогеназы, катализирующей реакцию окисления этанола, необходимы ионы цинка.

Роль металлов в ферментативном катализе

Не менее важную роль отводят ионам металлов в осуществлении ферментативного катализа.

Участие металлов в электрофильном катализе.

Наиболее часто эту функцию выполняют ионы металлов с переменной валентностью, имеющие свободную d-орбиталь и выступающие в качестве электрофилов. Это, в первую очередь, такие металлы, как Zn2+, Fe2+, Mn2+, Cu2+. Ионы щелочных металлов, такие так Na+ и К+, не обладают этим свойством.

В ходе электрофильного катализа ионы металлов часто участвуют в стабилизации промежуточных соединений.

Участие металлов в окислительно-восстановительных реакциях. Ионы металлов с переменной валентностью могут также участвовать в переносе электронов. Например, в цитохромах (гемсодержащих белках) ион железа способен присоединять и отдавать один электрон.

Благодаря этому свойству цитохромы участвуют в окислительно-восстановительных реакциях.

 

Активный центр фермента

Участок молекулы фермента, который специфически взаимодействует с субстратом, называется активным центром. Активный центр – это уникальная комбинация аминокислотных остатков в молекуле фермента, обеспечивающая непосредственное взаимодействие её с молекулой субстрата и принимающая прямое участие в акте катализа. У сложных ферментов в состав активного центра входит также кофактор. В активном центре условно различают каталитический участок, непосредственно вступающий в химическое взаимодействие с субстратом и участок связывания, который обеспечивает специфическое сродство к субстрату и формирование его комплекса с ферментом.

Свойства активных центров ферментов:

1. На активный центр приходится относительно малая часть общего объема фермента.

2. Активный центр имеет форму узкого углубления или щели в глобуле фермента.

3. Активный центр – это трехмерное образование, в формировании которого участвуют функциональные группы линейно удаленных друг от друга аминокислот.

4. Субстраты относительно слабо связываются с активным центром.

5. Специфичность связывания субстрата зависит от строго определенного расположения атомов и функциональных групп в активном центре.

У некоторых регуляторных ферментов имеется еще один центр, называемый аллостерическим или регуляторным. Он пространственно разделен с активным центром.

Аллостерический центр – это участок молекулы фермента, с которым связываются определенные обычно низкомолекулярные вещества (аллостерические регуляторы), молекулы которых не сходны по строению с субстратом. Присоединение регулятора к аллостерическому центру приводит к изменению третичной и четвертичной структуры молекулы фермента и, соответственно, конформации активного центра, вызывая снижение или повышение ферментативной активности.

 

Механизм действия ферментов

В любой ферментативной реакции выделяют следующую стадийность:

E + S ↔ [ES] ↔E + P

где Е – фермент, S – субстрат, [ES] – фермент-субстратный комплекс, Р – продукт.

Механизм действия ферментов может быть рассмотрен с двух позиций: с точки зрения изменения энергетики химических реакций и с точки зрения событий в активном центре.

Энергетические изменения при химических реакциях

Любые химические реакции протекают, подчиняясь двум основным законам термодинамики: закону сохранения энергии и закону энтропии. Согласно этим законам, общая энергия химической системы и её окружения остаётся постоянной, при этом химическая система стремится к снижению упорядоченности (увеличению энтропии). Для понимания энергетики химической реакции недостаточно знать энергетический баланс входящих и выходящих из реакции веществ. Необходимо учитывать изменения энергии в процессе данной химической реакции и роль ферментов в динамике этого процесса.

Чем больше молекул обладает энергией, превышающей уровень Еа (энергия активации) тем выше скорость химической реакции. Повысить скорость химической реакции можно нагреванием. При этом увеличивается энергия реагирующих молекул. Однако, для живых организмов высокие температуры губительны, поэтому в клетке для ускорения химических реакций используются ферменты. Ферменты обеспечивают высокую скорость реакций при оптимальных условиях, существующих в клетке, путём понижения уровня Еа. Таким образом, ферменты снижают высоту энергетического барьера, в результате чего возрастает количество реакционноспособных молекул, и, следовательно, увеличивается скорость реакции.

Роль активного центра в ферментативном катализе

В результате исследований было показано, что молекула фермента, как правило, во много раз больше молекулы субстрата, подвергающегося химическому превращению этим ферментом. В контакт с субстратом вступает лишь небольшая часть молекулы фермента, обычно от 5 до 10 аминокислотных остатков, формирующих активный центр фермента. Роль остальных аминокислотных остатков состоит в обеспечении правильной конформации молекулы фермента для оптимального протекания химической реакции.

Активный центр на всех этапах ферментативного катализа нельзя рассматривать как пассивный участок для связывания субстрата. Это комплексная молекулярная «машина», использующая разнообразные химические механизмы, способствующие превращению субстрата в продукт.

В активном центре фермента субстраты располагаются таким образом, чтобы участвующие в реакции функциональные группы субстратов находились в непосредственной близости друг к другу. Это свойство активного центра называют эффектом сближения и ориентации реагентов. Такое упорядоченное расположение субстратов вызывает уменьшение энтропии и, как следствие, снижение энергии активации (Еа), что определяет каталитическую эффективность ферментов.

Активный центр фермента также способствует дестабилизации межатомных связей в молекуле субстрата, что облегчает протекание химической реакции и образование продуктов. Это свойство активного центра называют эффектом деформации субстрата.

 

Молекулярные механизмы ферментативного катализа

Механизмы ферментативного катализа определяются ролью функциональных групп активного центра фермента в химической реакции превращения субстрата в продукт.

Выделяют 2 основных механизма ферментативного катализа:

1. кислотно-основной катализ

2. ковалентный катализ.

Кислотно-основной катализ

Концепция кислотно-основного катализа объясняет ферментативную активность участием в химической реакции кислотных групп (доноры протонов) и/или основных групп (акцепторы протонов). Кислотно-основной катализ – часто встречающееся явление. Аминокислотные остатки, входящие в состав активного центра, имеют функциональные группы, проявляющие свойства как кислот, так и оснований.

К аминокислотам, участвующим в кислотно-основном катализе, в первую очередь относят Цис, Тир, Сер, Лиз, Глу, Асп и Гис. Радикалы этих аминокислот в протонированной форме – кислоты (доноры протона), в депротонированной – основания (акцепторы протона). Благодаря этому свойству функциональных групп активного центра ферменты становятся уникальными биологическими катализаторами, в отличие от небиологических катализаторов, способных проявлять либо кислотные, либо основные свойства.

Ковалентный катализ

Ковалентный катализ основан на атаке нуклеофильных (отрицательно заряженных) или электрофильных (положительно заряженных) групп активного центра фермента молекулами субстрата с формированием ковалентной связи между субстратом и коферментом или функциональной группой аминокислотного остатка (как правило, одной) активного центра фермента.

Действие сериновых протеаз, таких как трипсин, химотрипсин и тромбин, - пример механизма ковалентного катализа, когда ковалентная связь образуется между субстратом и аминокислотным остатком серина активного центра фермента. Термин «сериновые протеазы» связан с тем, что аминокислотный остаток серина входит в состав активного центра всех этих ферментов и участвует непосредственно в катализе. Рассмотрим механизм ковалентного катализа на примере химотрипсина, осуществляющего гидролиз пептидных связей при переваривании белков в двенадцатиперстной кишке. Субстратами химотрипсина служат пептиды, содержащие аминокислоты с ароматическими и циклическими гидрофобными радикалами (Фен, Тир, Три), что указывает на участие гидрофобных сил в формировании фермент-субстратного комплекса.

 

Специфичность действия ферментов

Ферменты обладают более высокой специфичностью действия по сравнению с неорганическими катализаторами. Различают специфичность по отношению к типу химической реакции, катализируемой ферментом, и специфичность по отношению к субстрату. Эти два вида специфичности характерны для каждого фермента.

Специфичность по отношению к субстрату – это предпочтительность фермента к субстрату определенной структуры в сравнении с другими субстратами.

Различают 4 вида субстратной специфичности ферментов:

1. Абсолютная специфичность – способность фермента катализировать превращение только одного субстрата. Например – глюкокиназа фосфорилирует только глюкозу, аргиназа расщепляет только аргинин, уреаза – мочевину.

2. Относительная специфичность – фермент катализирует превращение нескольких субстратов, имеющих один тип связи. Например – липаза расщепляет сложноэфирную связь в триацилглицеролах.

3. Относительная групповая специфичность – фермент катализирует превращение нескольких субстратов, имеющих один тип связи, но требуется наличие определенных функциональных групп, входящих в состав субстратов. Например, все протеолитические ферменты расщепляют пептидную связь, но пепсин – образованную аминогруппами ароматических аминокислот, химотрипсин – образованную карбоксильными группами этих же аминокислот, трипсин – пептидную связь, образованную карбоксильной группой лизина, аргинина.

4. Стереохимическая специфичность – фермент катализирует превращение только одного стереоизомера. Например, бактериальная аспартатдекарбоксилаза катализирует декарбоксилирование только L-аспартата и не действует на  D-аспарагиновую кислоту.

Специфичность по отношению к реакции

Каждый фермент катализирует одну реакцию или группу реакций одного типа. Часто одно и то же химическое соединение выступает как субстрат для разных ферментов, причем каждый из них катализирует специфическую для него реакцию, приводящую к образованию разных продуктов. Специфичность по типу реакции лежит в основе единой классификации ферментов.