В данной главе я рассмотрю вопрос, насколько стабильна информация, записанная в последовательности нуклеотидов, будут описаны механизмы изменений в молекуле ДНК, дана их классификация и доказано, что в процессе эволюции организмы научились бороться с нестабильностью генома, используя несколько способов, в частности увеличивая "буферность" и избыточность генома.

В споре формальных и мичуринских генетиков одни преувеличивали роль стабильности, другие ― роль изменчивости. И обе стороны были не правы. Хотя все же мичуринцы были боле правы, чем формальные генетики. Н. К. Кольцов, например, утверждал: "Химически генонема с её генами остаётся неизменной в течение всего овогенеза и не подвергается обмену веществ — окислительным и восстановительным процессам". На самом деле, хотя изменчивость нуклеиновых кислот и белков очень велика, стабильность признаков обеспечивается "буферной емкостью" всего генома, но "буферность" генома не безгранична. Что и утверждал Лысенко. Здесь я буду как раз говорить об изменчивости генома.

 

6.1. СТАБИЛЬНОСТЬ ГЕНОМА

Физиолог, академик Л. А. Орбели как-то в шутку заметил (33), парируя доводы ламаркизма, тысячелетиями евреям режут препуции, однако все их мальчики рождаются необрезанными. То есть обрезание у евреев в течение тысячелетий не привело к исчезновению у них крайней плоти. То же самое можно сказать о женщинах, которые уже миллионы лет лишаются мужчинами невинности, а девственная плева, тем не менее, у них не исчезает.

Лысенко же и мичуринцы говорили, что изменения наследственных признаков под влиянием измененных условий жизни НЕ случайны, а НАПРАВЛЕННЫ. "Современная" молекулярная генетика и здесь сдала позиции, которые защищали Н. И. Вавилов и "классическая" генетика: с точки зрения "современной" молекулярной генетики, мутации не случайны, а зависят от типа подвижного элемента, внедряющегося в ген.

А возьмем знаменитые опыты акад. Ремесло по трансформации пшеницы в озимую. Оказывается, что под влиянием "стресса" (подзимний посев яровой пшеницы ― чем не "стресс"?) мобильный контролирующий аппарат генома так перестраивается, что начинается процесс унаследования нового свойства. Причем этот процесс идет ступенчато ― в 3, 5 поколений ("по Лысенко"!). И возникающие при этом наследственные изменения носят явно приспособительный характер.

Лысенко и мичуринцы говорили, что изменения наследственных признаков под влиянием измененных условий жизни НЕ случайны, а НАПРАВЛЕННЫ и соответственны измененным условиям жизни организмов. "Современная" молекулярная генетика и здесь сдала позиции, которые защищали Н. И. Вавилов и "классическая" генетика: с точки зрения "современной" молекулярной генетики, мутации не случайны, а зависят от типа подвижного элемента, внедряющегося в ген.

Лысенко и мичуринцы, исходя из своей концепции наследственности, говорили, что изменения наследственных признаков ("мутации генов"), прежде всего, происходят под влиянием внешних факторов! И так называемая "современная" генетика ― молекулярная генетика ― ПРИЗНАЛА, что в этом вопросе "классическая" генетика (и Н. И. Вавилов) были НЕПРАВЫ. И по "современной" молекулярной генетике изменения наследственности могут быть обусловлены внедрением в гены внешнего мобильного "контролирующего" элемента ― полностью по Лысенко.

 

6.2. ЧТО ТАКОЕ МУТАЦИЯ?

В связи с различиями во взглядах мичуринцев и формальных генетиков и подобной организацией генетического кода, возникает вопрос, а что же такое мутация. Начну я с определения фенотипа. Фенотип ― это набор признаков, которые характеризуют результат, полученный в процессе реализации имеющейся наследственной информации во время эмбриогенеза или перевода имеющегося в клетке генетического кода в набор белков данной клетки. Для обозначения резких изменений в фенотипе изначально и был предложен термин мутация.

Мутации были открыты довольно давно, но понимали их тогда довольно своеобразно, не так, как сейчас. Термин «мутация» ввел голландец ДеФриз, который, выращивая цветы примулы (evening primrose), обнаружил, что в потомстве даже совершенно чистосортных линий появляется очень небольшое число особей — скажем, две или три на десятки тысяч с малыми, но скачкообразными изменениями. ДеФриз обнаружил, что иногда семена дают много новых вариаций цветков. Он назвал эти внезапно возникшие изменения «мутациями». Однако ДеФриз лишь озвучил то, что было у других на языке. Ещё в 1899 году русский ботаник С. Коржинский (1861–1900) писал в Петербурге о внезапных скачкообразных «гетерогенных» отклонениях. Как обычно, мутационная гипотеза ДеФриза была принята не сразу.

Итак, обратите внимание начальное понятие мутация снова было связано с внешними ПРИЗНАКАМИ, а не с геном. Признаки эти проявлялись на уровне фенотипа.

 

6.3. ПЕРВАЯ ТАЙНАЯ ПОДМЕНА

Мутации по ДеФризу означали скачкообразные изменения фенотипа. Следовательно, изначально мутация ― это резкое изменение признака или фенотипа в целом. А теперь следите за руками. Ни с того, ни с сего нынешние генетики начинают подменять это понятие и вместо слова ПРИЗНАКОВ, вставляют слово ДНК ― в настоящее время мутацией (от лат. mutatio — изменение, перемена) называется любое изменение в первичной последовательности ДНК, все устойчивые наследуемые изменения в последовательности нуклеотидов ДНК, независимо от их функциональной значимости, локализации и влияния на жизнеспособность особи.

Следовательно, сейчас понятие мутации является более широким по сравнению с понятием мутантного гена-аллеля. Тем самым верная в целом и понятная в то время идея ДеФриза была тихой сапой подменена. Тем самым нынешние молекулярные генетики переопределили термин мутация, что, кстати, запрещено в науке, и теперь называют мутацией изменения в последовательности НУКЛЕОТИДОВ ДНК или РНК, если речь идет о вирусах, хранящих наследственную информацию в РНК. Но до сих пор эта подмена не афишируется молекулярными биологами. Но вот цитата "Мутации наследуются так же хорошо, как первоначальные неизменённые признаки…" Так мутация это фенотипический признак или изменения последовательности ДНК? Хорошо бы генетикам определиться.

Но такое определение мутаций ведет без соответствующих объяснений к конфузам, и, по сути, не верно? Причина не только в том, что такая подмена привела к резкому искажению сути дела, причина в том, что в результате такого переопределения термина мутация генетики совсем запутались. Произошло это по следующим причинам.

 

6.4. КЛАССИФИКАЦИЯ МУТАЦИЙ

Мутации, то есть изменения последовательности нуклеотидов в ДНК, могут быть чрезвычайно разнообразны. Для обозначения мутаций, которые ведут к замене в белке одной аминокислоты на другую, обычно используют однобуквенный аминокислотный код, например: R560T означает замену аргинина (R) на треонин (Т) в положении 560, G542X ― замену глицина (G) на терминирующий кодон в положении 542, а дельтаР508 ― отсутствие фенилаланина (F) в положении 508. Может быть замена двух аминокислот, но в разных участках белка или в разных доменах.

Для классификации мутаций можно использовать разные признаки.

А. Где располагаются мутации, в каком белке, в какой хромосоме, в начале или конце аминокислотной цепи. Мутации могут быть в соматических или в половых клетках.

А1. Мутации могут быть в пределах интронов. Такие мутации важны с точки зрения молекулярной гибридизации мРНК ин виво (in vivo), то есть склеивания или интерференции мРНК. Кроме того нельзя исключить, что мутации внутри интрона могут давать сдвиг рамки считывания.

А2. Мутации могут быть в пределах экзонов и влиять на строение и функцию получаемого белка. Мутации в экзонах могут быть вне активного центра белка, что функционально проявляется довольно мало, и в активном центре белка, что может давать фенотипические проявления.

Б. Мутации можно классифицировать на основании того, как и что изменилось в самой ДНК. Мутации могут захватывать участки ДНК разной длины (от хромосомных инверсий и аберраций до изменения на уровне единичного нуклеотида). Встречаются удаления нуклеотидов, их вставки, замены нуклеотидов или их цепочек.

Б1. Мутации могут захватывать и всего лишь один нуклеотид (его удаление, вставка или замена нуклеотида). Если это единственный нуклеотид, тогда обычно говорится о точковой (точечной) мутации. Удаление или добавление одного или двух нуклеотидов обычно ведет к сдвигу рамки считывания (см. чуть ниже).

При замене одного нуклеотида в кодирующей области гена, то есть в экзоне или цистроне, возможны следующие точечные мутации:

1) несмысловая мутация, при которой замена нуклеотида в ДНК и соответствующее изменение кодона мРНК не приводит к изменению последовательности аминокислот в молекуле белка (например, замена кодона УУУ на кодон УУЦ, который тоже соответствует фенилаланину),

2) так называемая миссенс-мутация, при которой замена нуклеотидов в ДНК и соответствующее изменение кодона мРНК приводит к замене одной из аминокислот в молекуле белка (например, появление кодона лейцина УУА вместо кодона фенилаланина УУУ),

3) нонсенс-мутация, при которых замена нуклеотида превращает кодон в один из терминирующих кодонов (например, появление терминирующего кодона УАА вместо кодона тирозина УАУ).

Мутации могут быть без изменения белка и без гибридизационных осложнений, без изменения белка, но с гибридизациопнными осложнениями, с гомологичными изменениями белка. Гибридизационные осложнения могут быть сильными и слабыми. Гибридизационные осложнения могут удалять белок, но при этом обычно ничего не случается или снижать его синтез.

Удаление или добавление одного нуклеотида, что, как правило, ведет к сдвигу рамки считывания. Если один нуклеотид убрать или добавить, то будет сдвиг рамки считывания и будет синтезироваться совсем другой белок. Эффект подобной мутации зависит от того, сколько копий данного гена имеется в генотипе и каково состояние его комплементарного гена-аллеля, то есть комплементарного гена в диплоидном наборе хромосом.

Б2. Мутации могут захватывать протяженный участок молекулы: удаление группы нуклеотидов, замена группы нуклеотидов, вставка группы нуклеотидов. При удалении большой части цепи нуклеотидов (так называемых крупных делециях) затрагивают часть гена, весь ген или группу соседних генов. Удаление группы соседних генов особенно опасны.

Удаление куска ДНК может также привести к слиянию кодирующих последовательностей двух генов и образованию химерного белка. Такие мутации часто происходят при обмене парных хромосом гомологичными кусками. Потеря части нуклеотидной цепи прерывают или приводят к потере кодирующей части гена, и синтеза соответствующего белка не происходит. Кроме того в ДНК могут быть вставлены крупные куски инородной ДНК. Перемещения и удаления кусков ДНК изменяют окружение гена и могут таким образом содействовать его вовлечению в новые контролирующие взаимодействия. Исчезновение всей последовательности нуклеотидов, ответственных за данный белок, ― редкое событие, хотя и возможное.

Б3. Те же принципы же можно отнести к участкам хромосом.

Замена нескольких аминокислот обычно происходит при видимых хромосомных изменениях (аберрациях). Крупные блоки хромосом и их обмен ― имеют название хромосомные мутации или аберрации. Если идет замена более чем одной аминокислоты, подряд, то обычно изменения пространственной конфигурации белка и его каталитической активности.

Хромосомные мутации посредством больших изменений в ДНК, например, удалений (делеций), вставок, перемещений (транслокаций), или удвоений (дупликаций). Такие большие изменения называются хромосомные нарушения (аберрации). Изменения в хромосомах могут происходить в результате штатных ("законных") рекомбинаций между длинными гомологичными последовательностями. Вставки чужеродного материала в геном облегчают горизонтальный перенос генов. Дупликации поставляют дополнительные копии генов, которые могут накапливать мутации.

Инверсии ― это крупномасштабные изменения структуры хромосом (затрагивающие миллионы нуклеотидов); к ним относят удвоения больших цепочек нуклеотидов, удаление участков нуклеотидных цепочек и перенос фрагментов из одной хромосомы на другую. Мутации могут затрагивать как весь геном (3 млрд. пар нуклеотидов), например при триплоидии, когда появляется третий набор хромосом. Трисомия, удаление какой-нибудь хромосомы или добавление лишней, например, игрек-хромосомы. Например, YYX, будет сверхмужчина.

В. Мутации могут быть классифицированы по тому, когда они возникают.

В1. Во время копирования при удвоении ДНК

В2. Во время ремонта цепей ДНК после их повреждения

В3. При переносе информации с РНК на ДНК

В4. Во время митоза или мейоза.

В5. Химические радикалы, в особенности окислительные радикалы (оксирадикалы).

В6. Радиационные: свет, гамма бета и альфа лучи.

В7. Вирусные инфекции

В8. Во время поглощения из среды чужеродной ДНК

Г. Мутации классифицируются и по тому, кто или что является инициатором мутаций их можно разделить на Г1) спонтанные (они происходят сами, спонтанно, без участия человека и клетки, случайно), Г2) индуцированные (человек специально их вызывает) и Г3) направленные (клетка или организма сами ищут нужную мутацию, например, во время иммуногенеза).

Д. Мутации могут быть классифицированы по вызвавшей их причине.

Д1. Ошибки функционирования белковых или нуклеиновых машин

Д2. Химические повреждения, в том числе окси-радикалами.

Д3. Физические повреждения или свето-химические, вызванные светом и другими видами излучений, в том числе ионизирующая радиация.

Д4. Биологические причины, обработка, транскрипция, перенос мРНК.

Е. Мутации можно классифицировать и по результатам мутаций, то есть по фенотипическому эффекту, который вызывает мутация.

Е1. Так называемые несмысловые или, по моей терминологии, непроявляемые или изогенные мутации. Это замена нуклеотида(ов), не ведущая к замене аминокислоты. Изогенные мутации ― это такие мутации, при которых происходит замена нуклеотида таким образом, что один кодон той или иной аминокислоты заменяется на другой кодон, кодирующий ту же аминокислоту. Результат несмысловых (изогенных) мутаций зависит от генотипа. Могут быть мутации, ведущие к возможности склеивания (гибридизации или интерференции) мРНК двух белков. Фенотип будет зависеть от значимости данных двух белков, от наличия функционально параллельных белков и т. д. Изогенные мутации не видимы, если нет гибридизационных осложнений.

Е2. Невидимые или гомогенные мутации ― это такие мутации, когда одна аминокислота в белке заменяется на гомологичную аминокислоту, то есть сходную по химической структуре и свойствам. Такие мутации могут детектироваться иммунной системой (см. Приложение VII), но функционально они, как правило, не проявляются.

Е3. Замена аминокислоты на негомологичную аминокислоту может давать разные последствия. Мутации можно разделить на малозначимые и значимые. Если замена локализована в неактивном центре белка, то проявления будут минимальными.

Если мутации нарушают функцию белка, то обычно такие мутации должны быть в тех участках белка, которые важны для его функции. 1) нарушающие каталитические способности белка, 2) изменяющие его трехмерную структуру, а значит и ряд функций, 3) затрагивающие сигналы, определяющие локализацию белка и пути его транспорта, 4) затрагивающие участки, обеспечивающие взаимодействие данного белка с другими белками во время выполнения белком своих функций.

При этом могут быть мутации, дающие видимый фенотип при нагрузке. Обычно это мутации в активном центре белка и с формированием доминантной негативности, но при этом, если имеется много функционально параллельных белков. Наконец, существуют мутации, видимые фенотипически, без нагрузки.

Обычно это мутации в активном центре белка и с формированием доминантной негативности, если при этом нет функционально параллельных белков и количество копий данного белка ограничено.

Ж. Мутации могут вести к возникновению альтернативного сплайсинга, ― при этом будет синтезироваться несколько другой белок. Удаление старт кодона приведет к тому, что белок не будет синтезироваться и данная цепь нуклеотидов будет просто хаотичным набором аминокислот. Их фенотипическое проявление зависит от генома.

З. Мутации можно классифицировать на рецессивные и доминантные. Но об этом чуть ниже.

 

6.5. МУТАЦИИ, НАРУШАЮЩИЕ РАМКУ СЧИТЫВАНИЯ

Выше я уже упоминал значение рамок считывания троек нуклеотидов (кодонов) при синтезе мРНК и белка. Но в данном случае мне придется разобрать это более подробно. Причина в том, что нарушение рамок считывания в результате точковых мутаций имеет гораздо больше значение, чем выбивание целого экзона. В Интернете я нашел интересный пример, иллюстрирующий данный механизм.

Вы видите две последовательности букв.

матьматьматьматьмать

тьматьматьматьматьма

Первая последовательность содержит 5 слов мать. Вторая пять слов тьма. Разница состоит в том, что сдвигается рамка считывания.

Ещё один пример. Ниже приведены две последовательности букв.

РЕКАМАШАРЫБАЗАРЯДЫРЫБА

КАМАШАРЫБАЗАРАДЫРЫБА

Первая из них состоит из слов.

РЕКА МАША РЫБА ЗАРЯ ДЫРЫ

БА остается вне рамки.

Вторая последовательность имеет сдвинутую рамку считывания и мы воспроизводим в уме слова

КАМА ШАРЫ БАЗА РЯДЫ РЫБА

Теперь давайте посмотрим, а что происходит с генетическим кодом при точковых мутациях. Напомню, что это замена, удаление или добавление одного нуклеотида в цепи нуклеотидов ДНК.

Замена одного нуклеотида в пределах тройки нуклеотидов, образующих кодон, ведет к замене одной аминокислоты или не ведет к такой замене, если аминокислота кодируется несколькими триплетами нуклеотидов. Такой же результат дает и замена двух и даже трех нуклеотидов подряд в пределах кодона (тройки нуклеотидов) той схемы считывания, когда замена трех нуклеотидов происходит после триплета другой аминокислоты, а не распространяется на три триплета. Если одна, две или три замены нуклеотидов располагаются в пределах одного кодона, то есть цепочки из трех нуклеотидов, кодирующих одну аминокислоту, то происходит замена только одной аминокислоты. Если измененные нуклеотиды распространяются на два последовательных кодона, то будут заменены две, следующие одна за другой аминокислоты. Замена нуклеотидов в старт-кодоне может изменить начало считывания и вместо одного будет синтезироваться совсем другой белок.

Изредка замена нуклеотида в кодирующей области изменяет сплайсинг незрелой мРНК, либо образуя скрытый участок или сайт сплайсинга (последовательность нуклеотидов, которая запускает в данном месте сплайсинг), либо нарушая функцию нормального сайта сплайсинга.

Делеции (удаления) или вставки одного или двух нуклеотидов в кодирующей области вызывают мутации со сдвигом рамки считывания, то есть они изменяют разбиение мРНК на кодоны так, что каждый следующий кодон этого гена считывается неправильно. Эти мутации меняют аминокислотную последовательность в белке и часто вызывают преждевременное окончание его синтеза, если сдвиг рамки считывания приводит к образованию терминирующего кодона. Кроме того, небольшие делеции (удаления) или вставки влияют на транскрипцию, сплайсинг или обработку мРНК.

Как и в случае мутаций, сохраняющих рамку считывания, влияние всех этих мутаций может быть минимальным, если имеется функциональный ген-аллель или имеется масса функционально параллельных белков. Если же возникает гибридизационые осложнения из-за появления комплементарных участков, то тут все зависит от того, какие гибридизационные осложнения. Внутримолекулярные не будут проявляться, а межмолекулярные зависит от того, с мРНК какого белка будет происходить склеивание. Гибридизация с мРНК незаметного белка не даст никакого фенотипа. Но если имеется много функционально параллельных белков, то повреждение "заметного" белка тоже скорее всего не даст ничего, так как его ген-аллель и функционально параллельные белки справятся. Мутация обычно проявляется, если возникает доминантно-негативный фенотип.

 

6.6. НЕСМЫСЛОВЫЕ, НЕВИДИМЫЕ И ЗНАЧИМЫЕ МУТАЦИИ

Как я уже писал выше, появление мутаций в ДНК ещё не значит, что при этом будут изменены последовательности аминокислот в белке. Если принять за определение мутации изменение последовательности нуклеотидов в ДНК, то огромное количество мутаций окажутся невидимыми исследователю.

1. В геноме человека 95 % ДНК не кодируют белки. Изменения последовательности нуклеотидов в цепях ДНК, которые располагаются внутри интронов и в области ДНК, не имеющей смысла, в большинстве случаев никак не отражаются на последовательностях цепей аминокислот и никак не отражаются на фенотипе организма. В молекулярной биологии они называются несмысловыми. Я бы предложил назвать такие мутации молчащими.

2. Миллионы отличающихся друг от друга последовательностей нуклеотидов в ДНК могут кодировать одну и ту же последовательность аминокислот. Генетики их называют несмысловыми. Я бы предложил назвать такие последовательности изогенными. Мутации, не ведущие к изменению последовательности цепи аминокислот, я тоже предлагаю называть изогенными мутациями.

3. Очень часто замена кодонов, которые кодируют одну аминокислоту, на другой кодон, который кодирует другую аминокислоту, почти никак не отражается на функции получаемого в результате аминокислотной цепи. Дело в том, что, как я уже говорил ранее, очень много аминокислот очень структурно похожи друг на друга и замена одной аминокислоты на ей гомологичную не ведет к существенному изменению функции белка. Или изменения настолько незначительны, что огромная буферирующая система белков со сходными функциями, система изоформ белка, система белков со сходными функциями, ведет к тому, что полученные функциональные нарушения или отсутствуют вообще или перекрываются биологическим разнообразием и не могут быть зарегистрированы. В рамках современного определения мутаций я бы предложил назвать такие мутации ДНК гомогенными.

4. Имеется много случаев, когда удаление обеих аллелей вариантов генов не дает эффекта. Выбивание одного гена (если синтезируется случайный белок или белок вообще не синтезируется или синтезируется тот же белок, но с мутацией, которая не мешает работе тех же белков, полученных от нормальных генов) в случае наличия нескольких абсолютно идентичных (конечно, с оговоркой — функционально идентичных) не дает вообще никакого фенотипа.

Это происходит при множественности гена или изогенно-буферируемые мутации за счет наличия изогена (то есть белка, выполняющего сходную функцию). Эти мутанты называют нулевыми (см. подробнее раздел 6.4). Я бы назвал такие мутации незаметные.

5. Выбивание только одного гена из двух имеющихся может не дать никакого эффекта, если для выполнения данной функции у клетки имеется несколько независимых друг от друга белков, кодируемых различными генами. Они могут быть и при наличии только одного гена, но при функциональном перекрытии его работы независимыми генами. Я бы назвал тоже такие мутации незаметные мутации или гомогенно буферируемые мутации.

Итак, во всех перечисленных случаях в результате мутации никаких изменений в фенотипе не будет. Более того, их не будет и при получении гомозиготов по данной мутации. Указанные механизмы демонстрируют, как организм приспособился к тому огромному количеству мутаций, которые на самом деле встречаются в природе. Все это свидетельствует, что утверждение формальных генетиков о стабильности генотипа есть не более чем миф.

Рассмотрим такой пример. Если заменить глицин на фенилаланин в том участке белка ERGIC53 (данный белок участвует в транспорте белков между эндоплазматической сетью и аппаратом Гольджи), который направлен внутрь цитоплазмы, то транспорт белков по транспортной системе клетки будет чуть замедлен. Тот же результат можно получить, заменяя аминокислоты гомологически в нескольких других белках, расположенных в цитоплазме клетки.

Эти мелкие изменения суммируются и могут даже умножаться и давать фенотип, свойственный замене аминокислот на негомологичные им в главных участках белка. Следовательно, накопление таких невидимых мутаций может давать тот же эффект, как и мутации видимые (регистрируемые фенотипически).

Изменение последовательности нуклеотидов может не вести даже к изменению последовательности аминокислот в белке, то есть, вообще при этом нет изменений в генотипе… Огромное число мутаций не вызывает изменений аминокислотной последовательности белков. Могут быть мутации, не нарушающие состав белков. Это когда один триплет, кодирующий одну аминокислоту превращается в другой триплет, который кодирует ту же аминокислоту. Они носят название несмысловые мутации. Я их называю непроявляющимися мутациями. При таких мутациях имеет место феномен идентичности аминокислотного состава белков.

Если принять, что 95 % генома состоит из интронов, что 50 % замен нуклеотидов в экзонах вообще не ведут к изменению строения белков, то возникает вопрос, так что же такое мутации? 96–97 % замен нуклеотидов вообще не видны никому, кроме ученых занимающихся секвенированием ДНК, то есть определяющих последовательность нуклеотидов в ДНК. Вот такие мутации я и назвал непроявляющимися.

Очень важно осознавать, что многие аминокислоты похожи друг на друга и при замене их друг на друга свойства получаемого белка почти не меняются. Это свойство называется гомологией аминокислот. Если идет замена аминокислоты гомологичной ей, то она никак не проявляется. Аланин на глицин или лейцин на изолейцин или аспаргиновую кислоту на глутаминовую кислоту и наоборот или лизин на аргинин… ничего не дает в плане функции белка. Или же изменения настолько незначительны, что определить их очень трудно. Следовательно, есть огромное количество мутаций, ничего не делающих с функцией белка. Это бывает тогда, когда происходит замена одной или нескольких аминокислоты на другую ей гомологичную(ые).

Имеются специальные компьютерные программы, которые распознают виды белков, учитывая, что гомологичные замены аминокислот существенных изменений в функции белка не вызывают. Одним из побочных эффектов гомологической замены может стать то, что начинают хуже синтезироваться и работать другие белки, если пойдет гибридизация новой мРНК с другой мРНК.

Далее. Очень важно понять, что такое фенотипическое (видимое экспериментатору) изменение. Обычно в качестве мутаций регистрируют существенные изменения в последовательности аминокислот, которое становится видимым фенотипически, т. е. таким, которое замечено экспериментатором, потому что «отклонение от нормы» превышает ошибку измерения. Таких мутаций достаточно мало, они редки. Если же учесть, что очень многие аминокислоты гомологичны, подобны по химической структуре, то число изменений нуклеотидных цепей, которые детектируются на фенотипическом уровне будет ещё меньше. Хотя при этом они будут детектироваться иммунологически, хотя и по-разному.

Видимые исследователю мутации ― это такие, которые существенно изменяют функцию активных, консервативных в эволюции участков цепочки аминокислот в белке, осуществляющих сам процесс присоединения одного белка к другому на основе электростатических сил, или непосредственно участвующих в переносе электронов между участком белка и присоединенным органическим субстратом, то есть выполняют каталитическую функцию. В этом случае изменение последовательности аминокислот или трёхмерной организации данного участка, или его окружения ведёт к существенному (то есть, регистрируемому) нарушению функции белка. Именно поэтому такие участки (назовём их функциональными) белка являются наиболее неизменяемыми в эволюции. Другие участки, которые вносят меньший вклад в функцию белка, сильно варьируют между собой внутри разных видов живых существ. Однако варьируют всё же в определённых пределах, таких, чтобы это не затронуло функцию основного участка белка.

В большинстве этих изменений замена одной аминокислоты не влияет на функцию белка и не регистрируется. Например, замена аминокислот гомологичными им в неконсервативных участках белка практически не имеет видимого проявления на уровне фенотипа.

Тем самым, эти другие мутации (те, которые вызывают замену аминокислот аминокислотами, очень сходными по химическому строению, или меняют аминокислоты белка, которые не имеют существенного функционального значения) просто невидимы генетику. Поэтому назовём такие мутации невидимыми мутациями. Однако такие невидимые мутации не остаются бесследными. Хотя они не влияют значительно на функцию белка, тем не менее, они всё же оказывают влияние на процессы в клетке, особенно те, что так или иначе связаны с данным белком. Однако несколько невидимых мутаций в разных белках могут иметь кумулятивный эффект. В научной литературе часто встречающиеся в популяциях варианты последовательностей генов, не приводящие к заметным нарушениям функций, обычно рассматриваются как нейтральные мутации или полиморфизмы, тогда как понятия "мутация" и "мутантный аллель" зачастую употребляются как синонимы.

Мутации нарушают функцию белков, только если они затрагивают главные их центры, те участки, которые определяют главную функцию белков. Поэтому "многобелковые" признаки, то есть зависящие от функции многих белков, не передаются по наследству согласно правилам Менделя, поэтому нет благоприобретения признака отсутствия хвоста ж опытах Вейсмана или препуциума у мужчин-евреев. Значимые, видимые мутации дают симптомо-комплекс, если мутации в нефункциональной части или замена аминокислотой гомологичной, то возникают невидимые мутации.

Только некоторые высококонсервативные аминокислоты в тех частях белка, которые выполняют главные функции, будут давать изменение этой функции и только определенные замены, а не все дадут серьезные нарушения. Самое интересное, что если просто выбить белок, то из-за огромного резервирования функций, опять можно вообще ничего не увидеть. Например, у человека имеется 4 гена, кодирующих первый коллаген. Причем, как правило, молекулы мРНК синтезируются в избытке. Поэтому если выбить один ген, то будет достаточно и одного. Более того, кроме первого коллагена имеется еще с десяток других коллагенов с перекрывающимися функциями и они могут возместить функцию 25 % не хватающих молекул первого коллагена.

Итак, из огромного числа возможных мутаций, если считать мутацией изменение последовательности нуклеотидов, только ничтожно малая часть будет отражаться на фенотипе, то есть внешних и внутренних признаках полученного организма. Одни мутации летальны, и они не могут передаваться следующему поколению, а другие не столь опасны и сохраняются в потомстве.

Если мутации происходят в геноме клеток зародышевой линии человека, все соматические клетки организма-потомка, который развивается из мутантной зиготы, образовавшейся от слияния мутантных гамет, будут содержать эту мутацию. Чем позже в онтогенезе возникает соматическая мутация, тем меньше размер клона мутантных клеток во взрослом организме. Мутации в соматических клетках, возможно, вызывают процессы старения, рак и другие, менее существенные изменения в организме. Если мутация произошла в половых клетках, или при образовании половой клетки, то она может отразиться только на фенотипе последующих поколений ― мутация передается по наследству. Мутации в половых клетках родителей наследуются детьми.

Обычно считается, что такие мутации происходят совершенно случайно. Так возникает изменчивость, служащая материалом для естественного отбора. Но мутации могут происходить при делении любых клеток тела, а не только при образовании яйцеклеток и сперматозоидов. Такие мутации называются соматическими (от "сома" ― тело) и приводят к возникновению участков измененных тканей. Соматические мутации могут быть вызваны различными воздействиями внешней среды. Классическая генетика отрицает возможность наследования соматических мутаций. Считается, что изменения клеток тела (в том числе и мутации) не могут отразиться на генах половых клеток (68).

Мутации тоже удобно рассматривать на модели компьютерной бумажной перфоленты. Итак, хотя перфолента и сделана из прочной бумаги, то, тем не менее, она легко повреждается. Если будет разорвана перемычка между дырками, то белковая машинка, синтезирующая или ремонтирующая ДНК не заметит разницы меду 2 и 3 дырками и тогда вместо оригинальных 3 дырок на комплементарной ленте будет пробиты только две. К чему это приведет? К тому, что на перфоленте мРНК будет другой триплет.

На магнитной ленте уже будет другой кусочек магнитного пластика.

 

6.7. КАК ОБНАРУЖИВАЮТСЯ МУТАЦИИ

Чтобы понять, почему имеются расхождения в оценке скорости мутаций, надо иметь представление о том, как мутации обнаруживаются. О наличии тех или иных аллелей часто судят на основании анализа аминокислотной последовательности соответствующих белков. Но такой анализ очень дорог и конечно, пока никто не сравнивал по аминокислотной последовательности хотя бы два аллельных гена у одного и того же человека.

Вообще же поиск неизвестных мутаций и выявление известных мутаций ― это разные диагностические задачи. Крупные неизвестные мутации обнаружить легче. Для выявления точечных мутаций нужны методы с более высоким разрешением. Для выявления неизвестных мутаций лучше всего подходят следующие методы: электрофорез (то есть, разгонка белков под действием слабого электрического тока) в денатурирующем градиентном геле, модификация карбодиимидом, химическое или ферментативное расщепление некомплементарных сайтов, анализ конформационного полиморфизма (определение того, как она скручена) одноцепочечной ДНК, гетеродуплексный (на предмет поиска неоднородных особых последовательностей нуклеотидов) анализ и наконец, определение полной нуклеотидной последовательности данной ДНК.

Для анализа мутантных генов-аллелей, прежде всего, необходимо иметь изолированные последовательности мутантного гена, которые могут быть получены либо путем клонирования или амплификации (встраивают ДНК в кольцевидную ДНК (плазмиду), затем плазмиду встраивают в бактерию и выращивают бактерии, а затем ДНК изолируют из бактерий) мутантной ДНК или ее частей.

На практике чаще проводят предварительный отбор более простыми методами, а иногда клонированных фрагментов ДНК, предположительно содержащих мутации, а затем секвенируют (определяют последовательность нуклетидов) только эти участки ДНК.

Для поиска мутаций при анализе мРНК и ДНК в пробирках широко используются короткие цепи РНК. Например, гибридизация в "блотах", то есть в отдельных скоплениях белков после разгонки смеси белков в электрическом поле. С помощью гибридизации можно выделить мРНК данного белка и провести ее анализ на предмет последовательности нуклеотидов.

Любые типы мутаций могут быть обнаружены путем прямого секвенирования (то есть определения последовательности нуклеотидов) мутантной ДНК или отдельных экзонов. Обнаружение нарушений в первичной нуклеотидной последовательности ДНК, является самым точным методом молекулярной диагностики наследственных заболеваний. Для этого проводится сложнейшая процедура разбивания ДНК на отдельные фрагменты, а потом компьютер, наслаивая концы фрагментов друг на друга и сопоставляя полученную цепь с количеством того или иного нуклеотида, позволяет составить всю цепь нуклеотидов. Но это довольно дорогая процедура. Для некоторых генов, имеющих небольшие размеры, метод прямого секвенирования (расшифровка последовательности нуклеотидов) с успехом применяется как основной метод поиска мутаций. Так, в частности, особенно удобным оказалось его применение для поиска мутаций в сравнительно небольших по размеру генах, таких, например, как ген фактора IX свертывания крови (гемофилия В).

На деле, если нет фенотипа, то никто искать мутации не будет. Приведу знакомый мне пример выявление мутаций, пример того, как была найдена мутация в одном из белков, образующих рассмотренный выше коатомерный комплекс белков. Исследователи задались целью найти все те мутации, которые ведут к уменьшению числе белков-рецепторов так называемых липопротеидов низкой плотности (тех которые переносят в плазме крови холестерин (правильнее холестерол) на плазматической мембране. Для этого стандартные клетки, культивируемые в большинстве лабораторий мира подвергали определенным воздействиям, которые резко увеличивали скорость возникновения мутаций. Увеличив мутагенез, ученые регистрировали такой признак, как уменьшение доставки нашего белка-рецептора на плазматическую мембрану. В результате ими был обнаружен клон клеток, который при чуть пониженной температуре мог расти, а при нормальной температуре человека погибал, обнаруживая странные изменения аппарата Гольджи. Генетический анализ показал, что в эта-субъединице коатомера заменена одна аминокислота (161). Если повреждались другие субъединицы коатомера, то клетки просто-напросто гибли (223).

В целом молекулярная биология разработала эффективные методы для работы с генетическим материалом. Методы определения последовательности нуклеотидов довольно разработаны и требуют для своего описания многих и многих страниц, но они мало что дают для обоснования основной мысли данной книги и я их для краткости опускаю.

На плодовых мушках, на рыбах зебрах, на глистах сейчас широко распространен так называемый генетический скрининг (поиск). Любой генетический поиск (скрининг) это создание условий, в которых желательная мутация белка (речь идет о видимых мутациях) будет полезна, например, поиск генов ответственных за наведение растущих отростков нейронов на цель. Вот как описываются эти эксперименты на форуме С. Г. Кара-Мурзы: "В качестве модели взяли нейроны, проводящие сигналы от мозга к ногам. Взяли штамм дрозофил со скрюченными крыльями и нервных, обработали мутагеном, а потом банку с мушками перевернули над сосудом с кипящим маслом и стали мух рукой пугать. Те, у которых с нейронами передающими сигнал в ноги, было все в порядке, с перепугу прыгали и падали в масло тысячами ― летать-то не могут, крылья скрюченные. А парализованные оставались сидеть на стенках банки.

Полезная у них мутация была или вредная? Может где и вредная, а в данных условиях она им жизнь спасла. Ну конечно много таких мутаций может быть, не только нужные. Мух били током по глазам и смотрели, прыгнет ли. Если прыгает, то значит, в масло не свалилась, потому что слепая, руки не видела и не боялась ― таких отдать в соседнюю лабораторию, где зрение изучают. Если не прыгает, то бьют током по ногам. Ежели не прыгает, значит, что-то с суставами или с мышцами ― в морилку. Ну а если прыгает, то значит что-то не то с передачей сигнала от мозга к мышцам. Отросток нейрона заблудился и до мышц не дошел. Таких и брали для дальнейшей работы. Красили нужный нейрон внутриклеточной инъекцией красителя и смотрели, действительно ли отросток нейрона заблудился и не дорос до мышцы. Если да, то определяли, в каком гене мутация. Причем совершенно не важно, что 90 % мух надо заморить мутагеном. Оставшиеся с полезными мутациями быстро восстановят численность".

Если поиск мутаций ведется на основе анализа фенотипов, то невозможно выявить жизненно важные гены, мутации по которым летальны. Кроме того, скрининг не позволяет идентифицировать гены с дублированными функциями, т. к. в этом случае мутация по одному гену компенсируется нормальной работой другого.

1. Как правило, мутации не ищутся и не выявляются, в интронах и в изогенах. Никто не додумался сравнить нуклеотидные последовательности близнецов из одних и тех же типов соматических клеток.

2. Выявляются, но не все проявляются гибридизационными проявлениями. Часть изогенных мутаций не выявляются, так как они не дают гибридизации. Какова минимальная величина склейки.

3. Замена аминокислот ― выявляется иммунной системой. Какова чувствительность иммунной системы, будет ли замена одной аминокислоты детектироваться? Они могут проявляться функционально и не проявляться.

4. Мутации, которые проявляются функционально, когда они подавляют функции других белков, или когда они не имеют изоформ и параллельных белков, Сек13 и синтеза с одной копии гена не хватает для функции.

5. Мутации, которые ведут к выбиванию гена, обычно у человека не проявляются. Так как в большинстве случаев имеется множество функционально параллельных белков, а с одной копии гена количество образуемой мРНК хватает для синтеза достаточного количества белка.

Никаких положительных мутаций, улучшающих приспособительность к внешней среде, нет. Есть только отрицательные мутации. Любая мутация может быть чревата гибридизацией мРНК с мРНК другого белка.

При анализе же менделевского расщепления обычно рассматривают только наличие или отсутствие признака, а если он количественный, то границу "есть-нет" устанавливают по принятому порогу. Если же выявить, какова степень проявления признака, обнаружится очень сильное варьирование результатов.

 

6.8. ЧАСТОТА МУТАЦИЙ

Стабильность генетического кода определяется появлением ошибок. И частотой возникновения мутаций. Считается, что генетическая информация исключительно стабильна. Но я не нашел в литературе убедительных подтверждений данной гипотезы. Миф о стабильности наследования очень похож на случай с колдуном или с гадающей вам цыганкой ― отрицательные результаты отбрасываются, а остаются только положительные.

Наоборот, идет постоянный обмен веществ в генетическом материале. ДНК каждой клетки человеческого организма теряет за сутки около 5000 остатков аденина и гуанина, компонентов нуклеотидов. И это только вследствие температурного разрыва гликозидных связей между пурином и дезоксирибозой (127). Частота мутаций увеличивается под действием радиации.

Создание пород и сортов это не отбор полезных мутаций, а отбор комбинаций генов. Отбор мутаций и рекомбинаций генов (без мутаций) которые могут дать новую комбинацию признаков. Постоянно идут мутации, но они не заметны. Породы домашних животных, собак, кошек и т. д. Быстрое выведение новых сортов роз и т. д. и т. п. …

В последнее время твердо установлено, что разные участки геномов мутируют с разной скоростью, причем у каждого из них эта скорость довольно постоянна. Частота событий, относящихся к одиночным мутациям, различна. Наивысшая частота спонтанных изменений генома наблюдалась у живых организмов — стрептомицетов, где делеции (удаления нуклеотидов), инактивирующие ген Mel, были обнаружены в 1-30 % колоний. Будто бы эволюционные исследования говорят о том, что видимые исследователю мутации в среднем гене возникают один раз каждые 200000 лет (127).

Как часто возникают мутации? Почему-то считается, что уровень мутаций генов низкий. На самом деле это не так. Мне до сих пор не понятно, почему считается, что частота мутаций небольшая.

Видимо, потому, что обнаруживаются только те мутации, которые нарушают функцию белка таким образом, что это отражается на фенотипе. Но ведь огромное количество мутаций вообще не меняет строение цепи белка, и ещё большее количество мутаций меняя строение цепей, не меняет функции белка. Все эти мутации не видны исследователям. Никто не знает, каков уровень невидимых мутаций, когда идет замена на гомологичные аминокислоты. Измерить можно лишь уровень мутаций, которые ведут к фенотипическим проявлениям.

То, что уровень мутаций на порядки превышает тот, который описывают генетики, свидетельствуют следующие факты. 1.

Высокая частота мутаций вирусов. 2. Иммунная реакция организмов на чужие белки. У вирусов обнаружено, что копирование вирусного генома не должна быть абсолютно точной. Уровень допустимых ошибок должен находиться в пределах определенного коридора: если он слишком мал ― ограничиваются возможности адаптации (и эволюции), если слишком велик ― возникают проблемы с сохранением наследственных свойств. Но ведь копирование осуществляется на копировальных машинах хозяина. Это означает, что не меньшее количество ошибок происходит и в других эукариотах. Вирусы, используя естественную высокую способность генотипа хозяина к мутациям, заменяют аминокислоты и ускользают от иммунного контроля, хотя функция его белков не меняется в связи с гомогенными заменами (1).

Доказательством высокого числа мутаций является тот факт, что большинство белков взятых у другого человека и введенных во внутреннюю среду данного человека вызывают образование антител. Даже инсулин может давать выработку антител у некоторых людей. Следовательно, все белки очень разные, но разница либо в нефункциональных особо важных участках либо она связана с заменой аминокислот на гомологичные, не изменяющие функцию, но меняющие антигенность, то есть получаются короткие цепи аминокислот, которые отсутствуют среди белков человека и вызывают образование антител, склеивающихся с этими участками полипептидной цепи.

Огромное количество белков и белковых доменов и все они при перенесении в организм другого человека вызывают производство антител. Но функция белков, синтезированных на генах аллелях, почти не отличается. Значит, человеческие белки отличаются функционально невидимыми мутациями, то есть теми, которые не проявляются функционально, но проявляются на уровне иммунной реакции распознавания иммунной системой. Раз чужеродные белки дают образование антител, значит, они отличаются наборами "невидимых", гомологичных аминокислот. Существенную роль играет возраст. Чем старше беременная женщина, тем выше вероятность мутации, изменяющей число хромосом у ее будущего ребенка. Вероятность некоторых мутаций повышается с возрастом отца.

Итак, настоящая частота мутаций, не тех, которые обнаруживаются фенотипически, а всех, очень велика. Особенно изогенных, гомогенных, незначимых изогенных и гомогенных. Гораздо реже встречаются мутации значимые, которые и обнаруживают генетики. Утверждение генетиков о том, что мутации формируются достаточно редко, следует поставить под сомнение. Следовательно, изменчивость самой молекулы ДНК очень и очень велика, что опять говорит в пользу представлений Лысенко, который считал, что наследственная информация не стабильна, и что она стабильно реализуется только через взаимодействие большого числа белков.

 

6.9. ПРИЧИНЫ МУТАЦИЙ

Процесс возникновения или внесения изменений в нуклеотидную последовательность ДНК (мутаций) называют мутагенезом. Различают 1) естественный (спонтанный) и 2) искусственный (индуцированный) мутагенез. Между спонтанными и индуцированными мутациями нет существенных различий. Спонтанные мутации возникают самопроизвольно на протяжении всей жизни организма в нормальных для него условиях окружающей среды. Спонтанные мутации в эукариотических клетках возникают с частотой от 10-9 до 10-12 на нуклеотид за клеточную генерацию (поколение). Большинство спонтанных мутаций возникает в результате мутагенного воздействия, которое не регистрируется экспериментатором. Р. И. Салганик предложил, что длительная сильная функциональная нагрузка через положительную обратную связь приводит к амплификации соответствующего локуса, которая сохраняется в соматических тканях в индивидуальной жизни (цит. по 91).

Одним из важнейших механизмов мутагенеза является кроссинговер. Это обмен участками комплементарных хромосом при мейозе, то есть, половом делении. Если в результате кроссинговера из хромосомы вырван кусок с начальной последовательностью белка или старт-кодоном, то в результате, не будет синтезироваться данный белок. При этом до сих пор не ясно, каков механизм сцепления хромосом, по каких признакам клетка определяет, что при кроссинговере не будет изменена рамка считывания белка. Возможно, одной функций интронов является предупреждение нарушения рамки считывания белков в результате постоянно происходящего у клеток высших организмов кроссинговера. Возможно, кроссинговер нужен для быстрого перемещения аллельных генов в позиции на хромосоме, нужные для правильного митоза. Для этих же целей, наверное, и служат открытые Мак-Клинток мобильные элементы хромосом.

 

6.10. ОШИБКИ В РАБОТЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАШИН

Много мутаций возникают из-за ошибок в работе молекулярных машин.

Перед каждым клеточным делением все молекулы ДНК в клетке удваиваются: специальные белки-ферменты синтезируют точные копии имеющихся ДНК, которые потом распределяются между дочерними клетками. Однако при копировании иногда возникают ошибки ― мутации. Кроме мутаций в результате ошибок мутации возникают и под влиянием внешней среды.

Если мутация возникает при образовании половой клетки, она, естественно, передается по наследству. Обычно считается, что такие мутации происходят совершенно случайно. Так возникает изменчивость, служащая материалом для естественного отбора. Но мутации могут происходить при делении любых клеток тела. Такие мутации, как и клетки, тоже называются соматическими и приводят к возникновению участков измененных тканей. Понятно, что соматические мутации могут быть вызваны различными воздействиями внешней среды и в какой-то мере, возможно, содержат информацию об этих воздействиях, которая могла бы оказаться полезной для будущих поколений.

Каждый организм характеризуется уникальным набором белков. Фенотипические признаки и многообразие функций обусловлены специфичностью объединения этих белков, во многих случаях в виде надмолекулярных и мультимолекулярных структур, в свою очередь определяющих ультраструктуру клеток и их органелл.

Давайте теперь вспомним, какое количество стадий, ступеней проходит наследственная информация по пути ген-функционирующий белок-признак.

1. Имеется цепь нуклеотидов. В ней записана информация. Двойная цепь дает только 75 % гарантии того, что ремонт цепи даст восстановление той информации, которая там была до повреждения. В 50 % случаев повреждается одна цепь, но в 25 % случаев может одновременно быть повреждена и вторая цепь нуклеотидов, причем очень вероятно, что будет выбит нуклеотид, который комплементарен поврежденному на первой цепи.

2. При копировании этой информации во время митоза сохраняется почти 100 % информации. Почти то же самое происходит при копировании от одной половой клетки к другой.

3. На цепи нуклеотидов синтезируется белок. Синтез белка дает больше ошибок из-за накапливания ошибок кодирования аминокислот. Когда два и более различных триплета могут представлять одну и ту же аминокислоту или один и тот же триплет давать две разные аминокислоты.

4. Белки и их синтез зависят от доступности аминокислот. Если мало одной аминокислоты, то белки могут давать много ошибок при синтезе из-за возможных ошибок в триплетном коде.

Имеется множество других возможностей для искажения информации. Вот главные из них.

1. Молекулы ДНК постоянно подвергаются воздействию лучистых повреждений, оксирадикалов и других повреждающих воздействий

2. Ошибки починки ДНК. ДНК каждой клетки человеческого организма теряет за сутки около 5000 остатков аденина и гуанина, компонентов нуклеотидов, вследствие температурного разрыва гликозидных связей между пурином и дезоксирибозой. При этом постоянно идет ремонт разрушенных участков молекулы ДНК, но ремонт этот не обладает 100 % точностью. Возможны ошибки в отношении триплетов, которые кодируют не очень важные аминокислоты или в тех участках гена, которые не оказывают существенного влияния на его функцию. В этом случае мутации не заметны генетикам и биологам. Если же ошибка оказывается в участке белка, который является определяющим в реализации функции белка, то мутация детектируется биологами и генетиками (127).

3. Ошибки считывания. Обычно ДНК точно копируется при процессе репликации и сохраняется неизменной между двумя последовательными репликациями. Но изредка происходят ошибки и последовательность ДНК меняется.

Самое интересное, что старт-кодоны иногда не считываются и клетка может начать синтез информационной РНК не с того места. Тоже самое может быть тогда, когда белок получает сигнал о появлении шума и перескакивает на другой участок ДНК. Здесь тоже могут быть ошибки. Из-за этих возможных разночтений в считывании информации у каждого белка имеется несколько изоформ.

4. Ошибки сплайсинга

5. Ошибки кодирования, когда аминокислота имеет несколько нуклеотидных сочетаний и они могут быть сходны с рядом расположенной аминокислотой. Клетка не имеет возможность проверить и все просто выбрасывается.

6. Ошибка выхода мРНК из ядра.

7. Ошибки взаимодействия с рибосомой и тРНК.

Во время рекомбинационного обмена цепями ДНК, индуцированного двухцепочечными разрывами, происходит синтез новых цепей ДНК-полимеразой III, сопровождаемый ошибочным включением нуклеотидов. Но и это ещё не все. Ошибки могут возникать и из-за процесса метилирования ДНК. Наконец, внешняя среда может оказывать воздействие на все эти рубежи, где возможны ошибки и вызывать синтез не совсем тех белков.

Передача информации от гена к признаку должна быть абсолютно не точна ещё и по следующим причинам.

1. Количество синтезирующихся молекул белка может уменьшаться или увеличиваться в зависимости от функциональных условий, которые не записаны в гене.

2. Все клетки животных имеют практически одинаковый фенотип, а ткани разные. Сравните кость и нервную ткань.

3. Уровень экспрессии одного и того же белка разнится между различными тканями органами и клетками.

4. Уровень внутриклеточного транспорта и посттрансляционной модификации белков резко варьирует. Он зависит от совершенно других белков, их экспрессии и регуляции синтеза.

5. Уровень посттрансляционной модификации разный. Он определяется функцией дифференцировкой, экспрессией и т. д. и поэтому гликозилирование белков, например, может быть разным. Очень разным.

Генетики заявляют, что генетика ― точная наука. Но это они явно преувеличивают. У млекопитающих не более 1–5 % ДНК приходится на долю ДНК, кодирующей белки (127). Математика говорит, что при 95 % надежности передачи информации после 12 ступеней вероятность составляет уровень "орел-решка" (51 %). При 90 % надежности уровень "орла и решки" (53 %) достигается уже через 5 ступеней.

Как вы видно из предыдущего изложения, молекулярные механизмы работы аппарата наследования более или менее расшифрованы, а вот то, как информация пробивается, не искажаясь, через десятки, а то и сотни ступеней и взаимодействий, остается не ясным. Если мы посмотрим на дорожку, по которой проходит считываемая с гена информации при ее реализации в виде белка, то окажется, что все процессы на этом пути не точные и все они носят вероятностный характер. А поскольку процесс носит вероятностный характер, то везде совершаются ошибки, поэтому требуются специальные механизмы компенсации ошибок. Внешняя среда может оказывать воздействие на все эти этапы считывания и починки наследственной информации. Поэтому везде возможны ошибки… Ещё раз подчеркну, что каждая ступень на этой дорожке имеет вероятностный характер. С другой стороны, как я показал, копирование организмов ― генетически опосредованный процесс с участием внешней среды. Причем в отличие от компьютера, где исходная и воспроизведенная информация сверяется на точность, во время всех этих все эти взаимодействий, считываний и синтезов не происходит сверки исходной и скопированной информации. Проверяется только общее соответствие.

Предположим, что у нас есть клетка. Она использует ген. На нем синтезируется информационная РНК. Она идет в цитоплазмы и делает белок, который восстанавливает ДНК. ДНК часто ломается и белки в ядре ее чинят, используя информацию с другой цепочки ДНК. Но дело в том, что возможны ошибки в починке. Если у нас нормальный набор аминокислот, то вероятность наследования поломки невелика. Но вот мы насытили клетку аланином. При синтезе белка-ремонтника у нас начинает все больше аминокислот заменяться аланином. Это медленно ведет к изменению свойств белка-ремонтника. Он начнает делать вся больше ошибок при ремонте и тем самым внешние условия способствуют наследованию приобретенных изменений. Именно поэтому все клонированные животные быстро стареют. ДНК же половых клеток не раскручена и она защищена от ламарковского типа наследования.

Хотя по ходу процесса возникает идет огромное количество ошибок, но все это почти не проявляется за счет огромной "буферной способности" генома. Идет как бы буферирование системы на основе аттрактора. Ошибок при синтезе белка возникает так много, что клетка запаслась особой системой проверки их качества и только после этой проверки белки могут выполнять свою функцию.

Нуклеотидный код (определяющий порядок соединения аминокислот в белке) и белковые устройства для считывания информации сами по себе содержат существенную возможность неправильного считывания. При считывании возможны ошибка и замена штатной (полагающейся по коду) аминокислоты на аминокислоту, похожую на штатную. Эта замена, как правило, не влияет на функцию белка существенно.

Существуют два вида ошибок считывания, возникающих при копировании: включение некомплементарных нуклеотидов (точковые или точечные мутации) и геномные перестройки (удаления, вставки, перенос протяженных участков за счет рекомбинации) (1).

Кроме того, имеются вещества, нарушающие точное копирование последовательностей нуклеотидов, а также нарушающие точное воспроизведение информации при синтезе белков. Например, большинство антибиотиков представляют собой малые молекулы, которые проникают внутрь бактериальной клетки и закупоривают дырку между двумя субъединицами рибосомы прокариотов. Синтез белка при этом блокируется. Организм может сталкиваться с такими веществами и, естественно, частота ошибок резко увеличивается.

Если в какой-нибудь стадии сплайсинга произойдет ошибка, например, при вырезании интронов будет вырезан один нуклеотид из экзона ― это приведет к тому, что ген свою функцию не выполнит и "наказанием" за такую неточность будет или смерть, или тяжелое нарушение жизнеспособности, что в ряду поколений кончится тем же летальным исходом.

Итак, ошибки и огромнейшая вариабельность переноса наследственной информации заложена уже в самом генетическом коде. Ошибки компенсируются на основе дублирования функций и на основе введения специальных проверок, аналогических тем, которые клетка проходит во время митоза. Но главным являются специальные белковые машины, которые чинят повреждения. Половые клетки защищены от мутаций, так как после прохождения через тесты эмбриогенеза они не делятся до самого момента, когда начинается созревание какой-нибудь из них. Кроме того, половые клетки практически не используют гены для целей синтеза белков, то есть для осуществления своих жизненных потребностей, которые минимальны. Соматические клетки делятся или, по крайней мере, используют гены для выполнения своих функций. Поскольку в этом случае участки ДНК деспирализованы, то они имеют гораздо больше шансов быть поврежденными либо из-за ошибок копирования, либо из-за воздействия факторов внешней среды.

 

6.11. КАК КЛЕТКИ ЧИНЯТ ДНК И УДАЛЯЮТ ОШИБКИ КОПИРОВАНИЯ?

Накопление слишком много ошибок несовместимо со стабильностью генотипа. Стабильность структуры гена, а точнее генома, есть результат не его химической стабильности и сто процентной воспроизводимости при копировании, а есть следствие прекрасно организованного процесса проверки и контроля повреждений и их немедленной починки (182). Любая биологическая система делает достаточно много ошибок. Следовательно, нужны белковые системы, исправляющие ошибки. Поэтому природа создала механизм по исправлению ошибок копирования и других. Имеется система мониторинга (отслеживания), проверки полученных копий и при необходимости их починки. Клетки имеют специальные механизмы для починки повреждений ДНК.

Для того чтобы процесс не давал ошибок, требуются следующие механизмы: 1) нужно найти правильный нуклеотид, подходящий для комплементарного склеивания; 2) необходимо проверить, насколько только что добавленный нуклеотид соответствует правилу комплементарности и немедленно его удалить, если это не так, если он не прошел тест комплементарности; 3) необходима починка ошибок (отсутствие комплементарности), если они все же случились, несмотря на существование двух первых механизмов. Имеющаяся для этого контрольно-ремонтная белковая "машина" включает множество ферментов, организованных в сложнейшую метаболическую сеть. Она реагирует, регулирует и гарантирует стабильность ДНК и высокую точность ее копирования и воспроизводства. Стабильность гена есть скорее результат биохимической динамики, а не статической структуры молекулы ДНК. Например, специфический белок-нуклеаза удаляет небольшой сегмент ДНК, включающий поврежденный участок. Удаленный участок восстанавливается ДНК-полимеразой, использующей в качестве матрицы комплементарную цепь. Наконец, оставшийся одноцепочечный разрыв закрывается (соединяется) ДНК-лигазой.

Если ультрафиолетовый свет за счет фотохимического процесса повреждает один или 2 нуклеотида, то в клетках имеются механизмы, которые химически восстанавливают эти нуклеотиды путем обратного процесса, на основе комплементарной цепи нуклеотидов. Тиминовые димеры могут быть удалены фотореактивацией. Специфический фермент фотолиаза связывается с дефектным участком ДНК и после облучения расщепляет димер с образованием отдельных нуклеиновых оснований.

Третий механизм ― это ремонт в результате рекомбинации. В этом процессе участок, содержащий повреждение, пропускается во время репликации. Образующаяся брешь закрывается путем сдвига соответствующего сегмента из правильно реплицированной второй цепи. Новая брешь ликвидируется с участием особых ферментов — ДНК-полимераз и ДНК-лигаз. ДНК-полимераза I имеет вид кольцеобразной структуры, состоящая из нескольких одинаковых молекул белка. Она чинит повреждённую цепь ДНК. В завершение первоначальный дефект устраняется путем вырезания.

Без помощи белковой системы отслеживания, контроля и починки ошибок, копировальная машина дает 1 ошибку на 100 нуклеотидов, с помощью белковой системы контроля ошибок точность достигает до 1 ошибка на 10 миллионов нуклеотидов (182).

 

6.12. МУТАГЕНЕЗ

Естественный, или спонтанный, мутагенез происходит вследствие воздействия на генетический материал живых организмов мутагенных факторов окружающей среды, таких как ультрафиолет, радиация, химические мутагены.

Мутации могут вызываться рядом факторов. 1. Ошибки по ходу реализации и регуляции использования наследственной информации.

2. Химические воздействия, нарушающие код, синтез или обработку белка.

3. Физические воздействия, нарушающие код, синтез или обработку наследственной информации.

Мутации могут возникать в результате либо воздействия физических или химических факторов, либо ошибок в процессе репликации и рекомбинации ДНК. Среди важнейших мутагенных факторов, прежде всего, необходимо отметить химические мутагены ― органические и неорганические вещества, вызывающие мутации. Коротковолновый ультрафиолетовый свет также оказывает мутагенное действие, особенно на клетки кожи. Одним из наиболее важных физических мутагенов является ионизирующая радиация. Она приводит к образованию в клетке свободных радикалов, которые исключительно реакционно способны и могут повредить ДНК. Может быть, отщепление нуклеотидов друг от друга, может быть химическое сшивание двух последовательных нуклеотидов оксирадикалами и масса других возможностей, ведущих к изменению наследственной информации.

Наиболее распространенным химическим изменением, вызванным ультрафиолетовым облучением, является образование тиминовых димеров, когда два соседних тиминовых оснований ковалентно связываются друг с другом. Это приводит к ошибкам при считывании ДНК во время репликации и транскрипции.

Рибозные остатки нуклеотидов могут подвергаться метилированию. Например, метилнитрозамины распадаются с образованием реакционноспособного метилкатиона (СН3-), который метилирует группы ОН и NH2 в ДНК. Метилирование цитозина резко повышает вероятность превращения этого цитозина в тимин, т. е. точечной мутации. Метилированные цитозины становятся "горячими мутационными точками". Уридин может восстанавливаться с образованием дигидроуридина.

Азотистая кислота вызывает точковые мутации. Азотистая кислота (HNO2) и гидроксиламин (NH2OH) дезаминируют азотистые основания, т. е. превращают цитозин в урацил, а аденин в инозин. Алкилирующие соединения имеют реакционные группы, которые могут образовывать ковалентные связи с азотистыми основаниями, входящими в ДНК. Когда Ц превращается в У, то У в следующем цикле репликации образует пару с А (вместо Г). После этого изменение принимает необратимый характер. Мутации типа вставки или выпадения некоторого числа нуклеотидов, не кратного трем, ведут к ошибочной трансляции всей ДНК, поскольку они сдвигают рамку считывания. При трансляции измененная мРНК будет интерпретироваться рибосомами по-другому, приводя к совершенно иной аминокислотной последовательности.

Ароматический углеводород бензопирен сам по себе безвреден, но в результате метаболической трансформации образует производные, обладающие канцерогенным действием. За счет гидроксилирования одного из колец он превращается в реакционноспособный эпоксид, который алкилирует аминогруппу гуанина и других азотистых оснований.

 

6.13. ИСКУССТВЕННЫЙ МУТАГЕНЕЗ

Индуцированными называют мутации, возникающие в результате мутагенных воздействий в экспериментальных условиях или при неблагоприятных воздействиях окружающей среды.

Возможность искусственного получения мутаций с помощью воздействия рентгеновского излучения и повышенной температуры была показана русским генетиком Надсоном, но широко известна стала посредством работ Г. Мёллера.

Искусственный мутагенез широко используют для изучения белков и создания у них определенных свойств. Методом ненаправленного мутагенеза в последовательность ДНК вносятся изменения с определенной вероятностью. Мутагенными факторами (мутагенами) могут быть различные химические и физические воздействия — мутагенные вещества, ультрафиолет, радиация. После получения мутантных организмов производят выявление (скрининг) и отбор тех, которые удовлетворяют целям мутагенеза. Ненаправленный мутагенез более трудоемок и его проведение оправдано, если разработана эффективная система скрининга мутантов.

Разработаны методы, позволяющие вызывать мутации в точно определенном месте гена ― сайт-направленный мутагенез. Удаление гена из генотипа может быть осуществлено путем выбивания (нокаута). Такие методы сейчас широко используются в эксперименте и для выведения сортов и пород скота или лабораторных животных.

Итак, имеются разные виды мутаций и если учитывать мутации, которые обычно из-за высокой способности генома на уровне фенотипа сопротивляется изменениям в генотипе частота мутаций неожиданно оказалась очень высокой. Следовательно, ни о какой стабильности наследственной информации как таковой речи быть не может. Стабильность передачи наследственной информации реализуется не через один ген, а через генотип в целом, как и полагал Лысенко.