II.1. ХРОМОСОМЫ

Как же записана и перерабатывается информация, записанная в геноме? Давайте проследим путь, который проходит наследственная информация от последовательности нуклеотидов до проявления признака.

В ядре расположен генетический материал. Он в большинстве организмов представлен несколькими гигантскими молекулами-гетерополимерами (то есть единички этого полимера разные) дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).

Изначально, во времена господства формальной генетики, хромосомами (цветные тела) назывались хорошо окрашиваемые включения в ядре эукариотической клетки, которые становятся легко заметными в определённых фазах клеточного цикла (во время митоза или мейоза). В хромосомах сосредоточена большая часть наследственной информации.

Хромосомы представляют собой высокую степень конденсации хроматина, постоянно присутствующего в клеточном ядре. Исходно термин был предложен для обозначения структур, выявляемых в эукариотических клетках, но в последние десятилетия все чаще говорят о бактериальных хромосомах. В настоящее время под хромосомой понимается двойная цепочка ДНК, состоящая из дезоксирибонуклеотидов и содержащая некое очень большое количество генов, каждый из которых кодирует белок (это неверно, но я намеренно упрощаю картину).

Это определение существенно отличается от того понятия хромосома, которое использовалось в годы борьбы Лысенко с формальными генетиками. В те годы считалось, что хромосом у бактерий нет, поскольку молекулы ДНК в бактериях не были видны в световой микроскоп. Поэтому формальные генетики были склонны считать, что генов у бактерий нет. Если же принять настоящее определение хромосомы, то окажется, что у бактерий хромосомы есть.

Число хромосом различно у разных организмов. Общая длина 46 хромосом человека 190 см. Каждая хромосома в интерфазном ядре занимает определенное место в ядре. Хромосомы не перевиваются, не перепутываются. Это позволяет им быстро подвергаться спиралевидной трансформации. Хромосомы прикреплены к внутренней стороне ядерной оболочки. Опыт построения хромосомных карт, казалось, твердо указывал, что положение генов на карте устойчиво наследуется. После открытия мобильных элементов генетический материал генома условно разделили на устойчивый и на подвижный (92).

Гигантская двойная спираль ДНК может быть замкнутой в кольцо, как у бактерий или прокариот или линейной, как у эукариот. Линейные молекулы ДНК могут быть скручены особым образом, формируя хромосомы. В интерфазе хроматин не конденсирован, но и в это время его нити представляют собой комплекс из ДНК и белков. ДНК скручена в хромосомы с помощью особых белков, которые проходят в ядро через ядерные поры благодаря наличию специальных сигналов, то есть коротких отрезков в цепи аминокислот, которые как ключ открывают для белка ворота ядерной поры.

Основную роль в процессе спирализации ДНК играют гистоны. Гистоны — основные белки, то есть в них преобладают аминокислоты со щелочными боковыми веточками. Гистоны участвуют в формировании нуклеосомной структуры хроматина. Каждый из 5 видов гистонов (Н1, Н2а, Н2б, Н3 и Н4) кодируется соответствующим геном. В гистоновых (гистонных) белках отсутствуют интроны, то есть последовательности, которые не участвуют в кодировании цепи аминокислот и вырезаются из зрелой мРНК (см. ниже). Макромолекула ДНК обвивает октомеры (структуры, состоящую из восьми белковых глобул) гистоновых белков, образуя структуры, названные нуклеосомами. Похожие на гантельки нуклеосомы образуются в основном гистонами. ДНК делает вокруг гантельки два оборота. В целом вся конструкция несколько напоминает бусы. Последовательность из таких нуклеосом, соединённых белком H1, называется нуклеосомной нитью, диаметром около 10 нм. У человека имеется 35 кластеров (скоплений) генов, кодирующих всю группу гистонов. Это резко ускоряет скорость синтеза гистонов в синтетической фазе клеточного цикла.

Центральные регионы каждой хромосомы называются центромерами. Они содержат большое количество повторяющихся последовательностей ДНК. Центромеры имеют длину миллионы (возможно десятки миллионов) пар нуклеотидов. На ДНК, расположенной в центромерномрайоне хромосомы, не синтезируются РНК.

 

II.2. ТЕЛОМЕРЫ

На концах линейных хромосом находятся специализированные структуры ДНК, называемые теломерами, которые характеризуются тем, что они не спирализуются на гистоновых белках и не могут соединяться с другими хромосомами в процессе обычного клеточного деления или полового деления. У большинства эукариотических организмов теломеры или концевые участки двойной цепи ДНК не кодируют белки или РНК, а состоят из коротких повторяющихся последовательностей нуклеотидов, не содержащих наследственной информации как таковой. Например, у всех позвоночных они состоят из шести нуклеотидов: ТТАГГГ, у насекомых — ТТАГГ, у большей части растений — ТТТАГГГ. Концы нитей ДНК в области теломеров не просто заканчиваются на каком-то нуклеотиде, а они сначала разделены, а потом склеены в противоположном направлении, образуя петли.

ДНК-полимераза, фермент, который синтезирует копию ДНК, не может доходить до самого конца двойной цепи ДНК и поэтому часть молекулы ДНК не копируется (реплицируется), что ведет к тому, что при каждом копировании и последующем делении клеток, ДНК укорачивается.

Существует специальный фермент — теломераза, который синтезирует теломерные повторяющиеся последовательности при помощи встроенной в него молекулы мРНК и удлиняет теломеры.

Эта молекула РНК выполняет роль матрицы, на которой копируются повторяющиеся последовательности так же, как это делает ретровирус (см. ниже). В большинстве созревших (дифференцированных) клеток теломераза заблокирована, однако она функционирует в стволовых и половых клетках. Впервые о наличии теломеразы стало известно по эффекту Хайфлика — прекращение деления клеток после 60–80 делений из-за исчерпания длины теломера.

 

II.3. ПРОЦЕСС РЕПЛИКАЦИИ

А теперь я чуть подробнее остановлюсь на особенностях процесса переработки информации. В ядре происходит два процесса: синтез цепей ДНК и РНК. Первый процесс называется репликация, так как цепь ДНК образуется исходя из одной цепей скрученного двойного полимера ДНК.

Молекулы ДНК (как и РНК) способны к самокопированию, правда, для этого нужны катализаторы — белки или рибозимы, образованные молекулами РНК. Наследственная информация, хранящаяся в ДНК в виде последовательности нуклеотидов, может "переписываться" на РНК (так создаются информационные РНК) и обратно. В двойной цепи ДНК нити не равнозначны. На условно названной первой нити, образуются РНК, а вторая служит, для того, чтобы восстанавливать повреждения, появляющиеся на первой нити.

Точность копирования обеспечивается в значительной мере автоматически, благодаря особому свойству нуклеотидов: против каждого нуклеотида исходной молекулы (матрицы) в синтезируемой копии (реплике) может встать только один строго определенный нуклеотид из четырех возможных (например, напротив гуанина — только цитозин). Когда на этой реплике синтезируется новая реплика, она окажется точной копией исходной молекулы (66/65).

Последовательность нуклеотидов ДНК может использоваться двояким способом. Первый способ — она копируется в процессе репликации. На основе двух нитей ДНК создается ещё одна пара нитей, абсолютно одинаковая с первой. Второй способ — создание на основе главной нити ДНК комплементарной ей нити РНК. Этот процесс называется транскрипцией. Наличие двух комплементарных цепей ДНК обеспечивает дублирование информации и позволяет реализовать два процесса. 1. Восстановление утраченной информации — если одна спираль будет повреждена, то на основе другой, как на матрице, можно будет восстановить первую. 2. На основе одной из спиралей синтезируется комплементарная молекула РНК, которая имеет только одну цепь и затем перемещается из ядра в цитоплазму клетки, где на ее основе синтезируется уже другой гетерополимер, полипептид или белок.

Тем самым последовательность нуклеотидов оказывается стабильной и информация не меняется при делении. Поэтому каждая дочерняя клетка может синтезировать тот же самый набор белков, что и материнская.

Гены записаны так, что перед каждым геном имеется определенная последовательность нуклеотидов, которая может склеиваться с определенными ядерными белками (это не все клеточные белки, а только такие белки, которые несут в своей структуре определенный сигнал, которые распознается стражей, специальными белками, стоящими у ядерных пор).

Когда клетка прошла все множественные контрольные проверки, которые разработаны в природе то активируется работа особых белковых комплексов (то есть агрегатов нескольких белков) расплетать и синтезировать комплементарную цепь ДНК и они начинают работу по репликации ДНК. При этом белковый комплекс захватывает нужный нуклеотид и приклеивает его к растущей цепи ДНК, то же самое происходит и на другой цепи ДНК. На ней тоже образуется комплементарная цепь ДНК. Один белковый комплекс дает нить ДНК, комплементарную первой нити, а второй синтезирует нить ДНК, комплементарную второй, Тем самым формируются две полностью одинаковые нити ДНК, которые тут же образуют двойную спираль.

Приклеивание подобного регуляторного белка ведет к тому, что белковые комплексы, умеющие локально расплетать, приклеивается к старт-кодону и начинает синтезировать цепь незрелой мРНК, которая комплементарна ДНК.

Репликация осуществляется сложными ферментными комплексами, состоящими из 15–20 различных белков. У эукариот имеется 5 видов ДНК-полимераз. Они последовательно включают дезоксирибонуклеотиды в строящуюся цепь ДНК, комплементарно родительской цепи. При полимеризации используются дезоксинуклеозидтрифосфаты, а не дезоксинуклеозидмонофосфаты, входящие в состав ДНК, то есть, гидролиз АТФ дает энергию для полимеризации.

Геликаза — фермент, подготавливающий родительскую ДНК к репликации. Он расплетает двойную спираль ДНК на одноцепотчатые участки. Расплетение спирали на одном участке создает суперспирализацию перед этим участком, что часто вызывает блокирование дальнейшего расширения двойной спирали. Эта проблема решается с помощью фермента топомеразы, который разрывает одну из цепей ДНК, что предупреждает образование супервитков.

У многоклеточных организмов большинство клеток организма содержит полный набор генов, но обычно из этого набора используется крайне незначительный объем информации.

Постоянно информация считывается только с тех гены, которые кодируют структурные белки и ферменты промежуточного метаболизма. Кроме этих постоянно необходимых генов имеется много других генов, активных только в определенных типах клеток, при определенных метаболических условиях или во время дифференцировки. Синтеза белка активируется по мере надобности и регуляция данного процесса чрезвычайно сложна.

 

II.4. МИТОЗ И МЕЙОЗ

У организмов, размножающихся половым путем, имеется два набора хромосом, а значит и генов. Организмы могут содержать не два набора генов и хромосом, а несколько. Такие организмы называются поли(или много)плоидными. При делении клетки (этот процесс называется митозом) хромосомы деспирализуются и на базе каждой полимерной молекулы ДНК синтезируется ее копия. Тем самым в клетке перед делением число хромосом удваивается. Они при делении расходятся в две клетки и из каждой пары хромосом одна идет в одну дочернюю клетку, а другая в другую дочернюю клетку.

Я не буду здесь в деталях описывать, как происходит митоз — это очень сложно и долго. Я сделаю лишь очень краткий набросок. Митоз — это деление тетраплоидной (по содержанию ДНК) клетки на две диплоидные. Митоз реализуется и контролируется через фосфорилирование белков. Во время митоза хромосомы спирализуются и конденсируются. Синтез РНК на ДНК полностью прекращается. Исчезают ядрышки. Ядерная оболочка рвется жесткими хромосомами. Ее жесткость резко снижается после отщепления от ее внутренней мембраны специальных каркасных белков типа ламина. Во время метафазы наблюдается наибольший уровень фосфорилирования. Связи между соединениями сестринскими частями хромосом рвутся. Образуется веретено деления из микротрубочек. Из-за выталкивания микротрубочками с полюсов хромосомы образуют как бы диск в центре клеток (экваториальная пластинка). Затем начинается анафаза. Из-за разрушения спаек между хромосомами они начинают подтягиваться микротрубочками к полюсам. Хромосомы расходятся. На полюсах образуются идентичные наборы хромосом, или 2 дочерние звезды. Все молекулярные механизмы митоза почти полностью расшифрованы.

После расхождения 2 наборов хромосом резко активируется активность белков, отщепляющих от белков фосфорные остатки, а активность ферментов-киназ, которые эти остатки пришивают к белкам и активность которых была очень высокой во время митоза, снижается. Клетки можно стимулировать к митозу путём активации киназ, которые присоединят остаток фосфата к одной из аминокислот полипептидной цепи.

Это ведет к серии событий, в частности происходит раскручивание хромосом. Ядерная оболочка приобретает жесткость за счет прикрепления к ней каркасных белков, в частности ламина, куски ее начинают сливаться и из ее фрагментов образуется полноценная ядерная оболочка. Появление ядерной оболочки способствует деспирализации хромосом. Затем посредине делящейся клетки возникает перетяжка или (в растениях и дрожжах) формируется двойная плазматическая мембрана без перетяжки и затем клетки разделяются.

У животных клеток перетяжка между делящимися клетками образуется за счет активности элементов цитоскелета, но и здесь нужны мембранные вакуоли, которые доставляются к перетяжке из ближайшего пластинчатого комплекса Гольджи. Деление происходит слегка асимметричное, так как плазматическая мембрана формируется на одной из сторон цитоскелетного тяжа, расположенного в центре клетки, и этот тяж отходит в одну или другую из двух новых клеток.

У растений, грибов и дрожжей, у которых нет активного передвижения клеток, вместо перетяжки образуется поперечная клеточная мембрана, Она строится из мембранных мешочков, доставляемых из пластинчатых комплексов Гольджи и из эндосом.

У организмов, использующих половое размножение, имеются специальные половые клетки, которые подвергаются особому типу деления. Перед клеточным делением на базе одного набора синтезируется ещё одна пара наборов. После того, как половые клетки приготовят для дочерних клеток по два набора хромосом, происходит не одно, а два последовательных деления. Во время обычного, не полового деления клетки каждые два набора расходятся в дочерние клетки, которые тем самым получают два набора хромосом каждая. Во время полового деления, на этом половая клетка не останавливается и этот двойной набор делится ещё раз и таким образом половая клетка содержит только один набор хромосом и, следовательно, только один вариант гена. Это приводит к тому, что число хромосом в зрелых половых клетках уменьшается в два раза по сравнению с соматическими клетками. Они содержат не диплоидный, а гаплоидный набор хромосом. Поэтому половая клетка должна слиться с половой клеткой от организма противоположного пола и восстановить свой двойной набор генов. Следовательно, новый организм получает один ген из каждой пары от матери и другой от отца. Данный процесс носит название редукционного деления или мейоза.

Итак, половые клетки человека (яйцеклетки и сперматозоиды) обладают половинным набором хромосом (то есть их 23). 22 из них совпадают у мужчин и женщин. Отличается только последняя пара. У женщин это хромосомы ХХ, а у мужчин XY. После слияния половых клеток, происходящих от мужского и женского организма диплоидный набор восстанавливается. Далее идет довольно длительная стадия эмбрионального (в утробе матери) и постнатального (развитие от момента рождения до созревания) развития до тех пор, пока не получится взрослый организм. Половые и стволовые клетки имеют «минимальный» фенотип: минимум рецепторов и программ для взаимодействия с микроокружением.

Половое размножение — весьма «дорогое удовольствие» с точки зрения естественного отбора. При бесполом размножении вы передаете каждому потомку все свои гены, а при половом — только половину. За половое размножение приходится платить двукратным снижением эффективности передачи генов потомству. Поэтому животные стараются оберегать свои половые клетки от чужого генетического материала, в том числе вирусного.

Как регулируется образование организма? За счет синтеза и транспорта на плазматическую мембрану специальных белков рецепторов и их раздражителей или лигандов. Этот процесс очень сложен. Механизмы работы и активации рецепторы и вообще биология развития всего процесса очень сложны. Все начинается с асимметрии зиготы. Имеются данные о том, что молекулы мРНК двигаются к одному полюсу яйцеклетки по микротрубочкам (229).

В свое время я слушал доклад о результатах работ, выполненных в Европейской молекулярно-биологической лаборатории и в университете города Данди. Там было показано, что короткие полипептиды-лиганды (это белки, содержащие сигналы для белков, которые их детектируют, то есть белков-рецепторов), после секреции во внеклеточное пространство не просто диффундируют по внеклеточному пространству, а активно захватываются и транспортируются клетками через свою цитоплазму.

 

II.5. РНК

В переносе информации, записанной в последовательностях нуклеотидов ДНК, на место синтеза белков в рибосомах принимает участие РНК. РНК — полимер, состоящий из множества похожих химических "кирпичиков" — рибонуклеотидов, соединенных фосфодиэфирной связью и образующих полимеры. В свою очередь, каждый из нуклеозид-фосфатных звеньев собран из трех частей. Первая из них — фосфорная кислота (фосфат) — неорганическое вещество, которого довольно много в земной коре и океанах. Вторая — азотистое основание. В состав РНК входит четыре азотистых основания: аденин, урацил, гуанин и цитозин; соответственно, существует четыре вида рибонуклеотидов. В РНК можно также встретить множество необычных и модифицированных азотистых оснований.

Как видим, молекулы РНК, как и ДНК, формируются из тех же кирпичиков — нуклеотидов. Но кирпичики чуть другие. Чтобы из РНК-кирпичика (рибонуклеотида) сделать ДНК-кирпичик (дезоксирибонуклеотид) достаточно одной простой химической реакции по отщеплению атома кислорода. Но это маленькое

химическое изменение приводит к тому, что двойная цепь ДНК становится более устойчивой, чем двойная цепь РНК. Кроме того, в РНК вместо тимина в качестве кирпичика используется урацил, которые тоже могут превращаться друг в друга.

Последовательность нуклеотидов на ДНК позволяет «кодировать» транскрипции, информацию о различных типах РНК и использовать информацию для их синтеза. ДНК-кодоны идентичны таковым в мРНК, за исключением того, что в мРНК вместо урацила (У), характерного для ДНК, стоит тимин (Т). Мономеры ДНК и РНК очень похожи, и мономер ДНК может соединиться водородными связями с мономером РНК по принципам комплементации (т. е. А-У, Т-А, Ц-Г, ГЦ).

Почти все РНК клетки (кроме митохондриальных и пластидных) синтезируются в ядре. В этом процессе, называемом транскрипцией, используется хранящаяся в ДНК информация. В ядре локализован процесс удвоения ДНК или репликация — катализируемый ферментами. Нуклеотидные блоки, необходимые для репликации и транскрипции в ядре, должны поступать из цитоплазмы. Их включение в ДНК или РНК приводит к образованию первичных продуктов, которые последовательно модифицируются путем расщепления, удаления частей молекулы и включения дополнительных нуклеотидов (созревание РНК).

Опираясь на это свойство, считывающая машинка, которая читает очередное слово, берет рибонуклеотид и проверяет его на комплементарность с записанной на ДНК буквой. Если водородные связи образовались, значит, буква верная и ее присоединяют к синтезирующейся цепочке. Если рибонуклеотид не комплементарен, связей не образуется, буква неверна, он выбрасывается и берется новый. И так пока не найдется нужная буква, которая будет встроена в цепочку. Так шаг за шагом, буква за буквой, строится цепочка РНК, которая полностью комплементарна отрезку ДНК, с которого она считывалась. Читающая машинка, которая называется РНК полимеразой (она полимеризует мономеры РНК), умеет распознавать начало и конец слова, по окончании слова цепочка РНК обрывается. Начинает свое чтение и склеивание перфоленты белковая машинка с промотора. Промотор — это участок ДНК, который служит местом фиксации РНК-полимеразы, синтезирующей РНК на матрице ДНК.

Белки не могут синтезироваться в ядре, и поэтому все ядерные белки должны быть импортированы из цитоплазмы. Это, например, гистоновые и негистоновые белки, связанные в хроматине с ДНК, полимеразы, гормональные рецепторы, факторы транскрипции и рибосомные белки. Рибосомные белки, находясь еще в ядрышке, начинают ассоциировать с рРНК, образуя рибосомные субчастицы.

Процесс транскрипции тщательно контролируется на предмет ошибок. Для этого природой созданы сложнейшие белковые машины с обратной связью.

Среди РНК можно выделить следующие типы: 1) информационные, или матричные (мРНК), 2) рибосомальные (рРНК), 3) сплайсеосомные РНК (сРНК) и 4) транспортные (тРНК). Все эти типы РНК синтезируются на матрице ДНК за счет копирования последовательности ДНК в последовательность РНК, синтезируемой в процессе транскрипции и принимают участие в биосинтезе белков (процессе трансляции). В последних 3 случаях сами РНК (тРНК, сРНК, и рРНК) являются конечным результатом экспрессии генов, и после ряда ферментативных модификаций они непосредственно используются в клеточных процессах. Синтез рибосомной РНК (рРНК) происходит в ядрышках, в то время как матричные (информационные), транспортные и сплайсеосомные РНК (мРНК, тРНК и сРНК) синтезируются в эухроматине, где ДНК деспирализована. Некоторые исследователи считают, что в геноме имеются также участки, кодирующие малые ядерные РНК (мяРНК), входящие в состав ферментов, и природные антисмысловые РНК. Мне не кажутся эти данные убедительными.

У человека имеется 4421 так называемых некодирующих гена, которые кодируют тРНК, рРНК и сРНК. Цитоплазматические тРНК кодируются у человека 497 генами. В митохондриях человека имеется 22 гена, кодирующих тРНК.

В отличие от ДНК, мРНК, как правило, не образуют двойных спиралей. Однако рРНК, тРНк и сРНК содержат короткие участки со склееными, спаренными основаниями. Это приводит к образованию субструктур, которые при двумерном изображении напоминают 'шпильки' и петли. В таких структурах двухцепочечные участки соединены петлями. Множество фрагментов, в которых чередуются структуры типа шпилька-петля, содержится в высокомолекулярных РНК, таких, например, как одна из рибосомных РНК. Кроме того, эти фрагменты образуют трехмерные структуры; следовательно, РНК подобно белкам имеют четвертичную структуру. Расшифрована трехмерная организация многих, чаще небольших PHK, и прежде всего тРНК.

PHK клетки существенно различаются по размерам, строению и продолжительности существования. Преобладающую часть представляют рибосомные РНК (рРНК), которые в различных формах составляют структурный и функциональные части рибосом. Рибосомные РНК синтезируются в ядре в процессе транскрипции на ДНК, там же подвергаются обработке (процессингу) и ассоциируют с рибосомными белками, образуя рибосому. После созревания мРНК, рРНК и тРНК, образовавшиеся в ядре, транспортируются в цитоплазму для участия в биосинтезе белков (трансляции).

 

II.6. СОЗРЕВАНИЕ мРНК

На первом этапе процесса перевода наследственной в фенотип происходит переписывание генетической информации на матричные (информационные) РНК (мРНК), которые являются местом промежуточного хранения информации. Синтез мРНК происходит в результате сложной последовательности биохимических реакций, называемой транскрипцией.

Транскрипция: комплекс белков под названием РНК-полимераза на основе информации заложенной на одной из цепочек ДНК синтезирует по принципу комплементации одинарную цепочку РНК, состоящую из рибонуклеотидов. Эта изначальная цепочка называется пре-РНК и полностью идентична ДНК, она обрабатывается до получения конечного продукта — мРНК.

В ядре имеются специальные белковые машинки, которые считывают информацию с ДНК и синтезируют новую молекулу незрелую мРНК из нуклеотидов, доставляемых в ядро белками и с помощью диффузии. В процессе прочтения эта машинка создает точную копию слов на ДНК из кусочков-мономеров РНК. Матричная РНК (мРНК, раньше она называлась информационная РНК) переносит генетическую информацию из клеточного ядра в цитоплазму. Промоторные последовательности — это участки ДНК, которые определяют место начала транскрипции (синтеза предшественника мРНК).

Прежде всего, отмечу, что расшифровка последовательностей нуклеотидов в геномах человека и основных видах живых существ обнаружила странный факт — наличие большого количества информации, которая не участвует в кодировании белков и цепей РНК, задействованных в реализации наследственной информации. У человека только 1,5 % — 5 % ДНК участвует в кодировании белков и РНК. Остальные цепи нуклеотидов являются, попросту говоря, шумом. Но это только на самый первый взгляд (подробнее см. Приложение II.6).

Гены отделены между собой интронами, участками цепи ДНК, не несущими наследственной информации. Гены эукариот (а также частично архебактерий) имеют разрывную экзон — интронную структуру гена. Кодирующие участки — экзоны имеют ограниченный размер (в среднем ~ 120–150 н.п.), тогда как интроны могут иметь размер до 50 тыс. н.п. Число экзонов пропорционально длине белка. Экзоны чаще кодируют элементы пространственной структуры В-структуры, 8-листы, промежуточные субструктуры упаковки, сигнальные (лидерные) пептиды и др. Более крупные участки могут кодироваться несколькими экзонами (цит. по 91).

После синтеза незрелые мРНК обрабатываются разными ферментами, локализованными в ядре. У бактерий обычно сразу синтезируется зрелая мРНК, у эукариотов сначала синтезируется незрелая мРНК, которая потом в ядре подвергается интенсивной химической обработке. На начальном конце молекулы образуется так называемая шапочка. Шапочка состоит из метилгуанозина и имеет важное значение для связывания мРНК с рибосомой. Кроме того шапочка предохраняет зрелую мРНК от разрезания РНК-азами.

Из незрелой мРНК вырезаются интроны, часто по разному в разных клетках или даже в той же самой клетке. Этот процесс называется альтернативным сплайсингом. После этого некоторые нуклеотиды в незрелой мРНК могут заменяться на другие. Этот процесс называется редактированием. Тем самым возникает информационный носитель, который не передается по наследству и не существует в геноме. Редактирование может иметь место в одних тканях того же самого организма и не иметь в других.

Незрелая включающая интроны мРНК сильно модифицируется в ядре. Зеркальное изображение записанного на ДНК слова (нужно помнить, что РНК комплементарен, а не идентичен считываемому отрезку ДНК) подвергается обработке. После синтеза на цепочке ДНК комплементарной цепи РНК получается предшественник мРНК. Он содержит интроны. Их надо удалить. Это делается специальными белковыми агрегатами, состоящими из РНК и белков. Они носят название сплайсингосомы. В данных агрегатах из предшественника мРНК удаляются интроны и концы цепочки сшиваются (сплайсинг) в единую цепь. Конечная молекула много короче, иногда в 2–3 раза, изначальной. Процесс такого разрезания и склеивания называется сплайсинг. У прокариотов такого практически не замечено, за очень редким исключением.

Сплайсинг незрелой мРНК катализируется комплексами белков с молекулами РНК, малыми ядерными РНК. Они ассоциированы с рядом белков, образуя "малые ядерные рибонуклеопротеидные частицы" (мяРНП). Эти белковые агрегаты, состоящие из белков и малых молекул РНК, называются сплайсингосомы (сплайсеосомы, сплайсомы). Сплайсомы у эукариотом очень консервативны (185).

В во время сплайсинга в эукариотах из незрелой мРНК вырезаются огромные куски, а оставшиеся склеиваются обратно. Механизм работы сплайсом очень сложен. На первой стадии сплайсинга ОН-группа аденозилового остатка, расположенного в интроне, расщепляет при участии одной из сРНК фосфодиэфирную связь на 5'-конце интрона. Одновременно в интроне образуется новая связь, которая придает ему форму петли. На второй стадии терминальная ОН-группа 5'-концевого интрона разрушает связь в З'-конце интрона. В результате оба экзона соединяются, а интрон освобождается. Остается неясной судьба интронов. В каждой из реакций задействованы несколько белковых молекул и одна молекула РНК. Во время сплайсинга комплексы из различных молекул РНК, участвующих в этом процессе, образуют сплайсеосому.

Приведу очень понятное объяснение понятия сплайсинга из статьи Велькова (16).

"Чтобы эукариотный ген заработал необходимо создать (путем транскрипции) комплементарную незрелую РНК — копию мозаичного гена, состоящую из экзонов и интронов. Затем надо удалить из незрелой РНК интроны, а экзоны объединить. Полученную зрелую мРНК можно уже использовать для трансляции.

Интроны из незрелой мРНК удаляются по очереди, а не все сразу. Вот так:

спеолдрласитьцйсиитбцнгорлю →

сп(еолдрл)аситьцйсиитбцнгорлю →

спласитьцйсиитбцнгорлю + еолдр →

спла(ситьц)йсиитбцнгорлю + еолдр →

сплайсиитбцнгорлю+ еолдр + ситьц →

сплайси(итбц)нгорлю+ еолдр + ситьц →

Сплайсингорлю + еолдр + ситьц + итбц →

Сплайсинг(орлю) + еолдр + ситьц + итбц →

Сплайсинг + еолдр + ситьц + итбц + орлю

Если в гене есть N интронов, то для сплайсинга необходимо N стадий вырезания интронов и сшивания экзонов (16).

Для чего же такая умопомрачительная, весьма дорогостоящая и опасная, в случае ошибок, сложность? А для

Аищалцуюофеьолтжиуекеруюнабюутхаипровбюуньцфыйооопс

В этом “гене” 12 экзонов и 12 интронов. Если в 12 стадий удалить поочередно все интроны, то получится название особого типа сплайсинга:

Альтернативный+

ища+цуюофе+ол+жиу+ке+ую+бюу+ха+про+бюу+ьцф+ооопс

И вот в чем смысл альтернативного сплайсинга: некоторые, четко определенные экзоны вырезаются вместе с интронами. И тогда из

Аищалцуюофеьолтжиуекеруюнабюутхаипровбюуньцфыйооопс

Получится:

Альтернативный+

ища+цуюофе+ол+жиукеую+бюу+ха+про+бюу+ьцф+ооопс

Альт+ища+цуюофе+ол+жиуекеруюнабюутхаипровбюуньцфыйооопс

нативный+Аищалцуюофеьолтжиуекерую+бюу+ха+про+бюу+ьцф+ооопс

наивный+Аищалцуюофеьолтжиуекерую+бюутха+про+бюу+ьцф+ооопс

левый+Аища+цуюофеьолтжиу+керуюнабюутхаипро+бюуньцф+ооопс

лев+Аища+цуюофеьолтжиу+керуюнабюутхаипро+бюуньцфыйооопс

В итоге, из одного, казалось бы, бессмысленного слова, получено шесть вполне осмысленных…"

Возможность вариаций при сшивке (так называемый альтернативный сплайсинг) приводит к тому, что с одного и того же гена и с одной и той же предшественника мРНК может быть получено несколько родственных или совершенно разных белков. Следовательно, один ген может дать начало нескольких родственным белкам или, если изменить формат считывания, например, сдвинуть его на один нуклеотид, то будет синтезирован совершенно другой белок.

В результате сплайсинга из одного гена можно синтезировать множество белков, поскольку путь стыковки экзонов, принадлежащих одному гену, может быть множественным. Некоторые экзоны могут удаляться вместе с интронами. Такой альтернативный сплайсинг приводит к тому, что один и тот же ген может кодировать семейство структурно схожих, но функционально разных белков. На данный момент известное максимальное количество разных белков, которое может кодировать один ген, составляет около 40 000! (Сумма прописью — сорок тысяч). Например, ген дрозофилы, который кодирует один из белков рецептора, аксона за счет альтернативного слайсинга может приводить к образованию 38016 различных информационных РНК. Этот ген содержит 95 альтернативных экзонов. Но все ли гены экспрессируются за счет альтернативного сплайсинга? Согласно текущим знаниям, по крайней мере, 74 % генов человека работает с помощью альтернативного сплайсинга! (16, 206).

При альтернативном сплайсинге порядок расположения экзонов не нарушается. В окончательном варианте сплайсированной РНК некоторые экзоны могут присутствовать или отсутствовать, но местами они не меняются. Например, в окончательно сплайсированной РНК экзоны 1-2-3-4-5-6 могут быть в последовательности 2-4-6, но не в последовательностях 4-2-6 или 6-4-2. Таким образом, из одного и того же трансрипта гена (т. е. незрелой мРНК), используя разные варианты распознавания, вырезания и соединения разных экзонов можно получить множество разных изоформ белков, у которых будут общими некоторые аминокислотные последовательности, но которые будут отличаться по своим функциональным свойствам (16).

Нуклеотидная последовательность эукариотного гена не дает однозначную информацию о том, какой именно белок он кодирует. Нет. Все зависит от пути альтернативного сплайсинга. А этих путей для одного гена может быть почти 40000. Выделить и охарактеризовать все 40000 белков и установить, из-за какой именно изоформы белка происходит патология задача практически не решаемая… (16).

 

II.7. СТРОЕНИЕ ЗРЕЛОЙ мРНК

После всех вышеуказанных преобразований молекула РНК готова к переходу на следующий уровень, синтезу белка. Если ДНК и РНК похожи по строению нуклеотидов, то с аминокислотами у них нет ничего общего. Поэтому перекодирующее устройство много сложнее, хотя если сравнивать количество белков (частей машины), которое участвует в переходах ДНК-РНК и РНК-белок, то оно примерно одинаковое. Это можно объяснить тем, что основная работа этих комплексов состоит не в собственно перекодировке, а в распознавании сигналов когда, что и в каком количестве кодировать. Для того, чтобы решить, надо обрабатывать незрелую тоже существуют свои знаки, если их нет, то слово считано неправильно и подлежит уничтожению, у строителей нет лишнего времени и стройматериалов, от их слаженной работы зачастую зависит жизнь организма.

Зрелая мРНК состоит из колпачка, 5'-нетранслируемого участка, инициирующего кодона (старт-кодона), цепи нуклеотидов, которые кодируют последовательность аминокислот будущего белка, конечного кодона (стоп-кодона), 3'-нетранслируемого участка и поли(А)фрагмента. Первым делом закрепляются концы, без закрепления неустойчивый полимер быстро развалится. У эукариот после завершения собственно транскрипции 5'-конец растущей молекулы РНК блокируется структурой, которая называется шапочкой или кэп (от англ. cap). В случае мРНК шапочка состоит из 7'-метил-ГТФ. Белковый колпачок защищает мРНК от 5'-экзонуклеазами эндонуклеаз, разрушающих нуклеотидные цепи РНК путем гидролиза.

В эукариотах мРНК инициирующий кодон — начальный участок кодирующей части мРНК, одинаков во всех мРНК. Он представляет собой последовательность нуклеотидов АУГ и кодирует аминокислоту метионин.

При наличии всех требуемых знаков в начале цепочки строится молекулярное сооружение под названием «шапка», а в конце цепочки нуклеотидов надстраивается олигомер из аденозинов — в конце транскрипции к 3'-концу присоединяется полиадениловая последовательность (поли(А) фрагмент), которая может включать до 200 звеньев адинозин-монофосфата… К концу незрелой мРНК добавляется хвост из нескольких молекул аденина. Такой хвост важен для предотвращения разрезания мРНК РНК-азами. Он него постепенно отрезаются нуклеотиды, когда он укоротиться до 30 нуклеотидов колпачок на 5 конце распадается и мРНК подвергается деполимеризации РНК-азами и эндонуклеазами. Наличие и длина этого хвоста определяют жизнестойкость всей молекулы мРНК, определяет ее продолжительность жизни.

Иногда за счет склеивания шапочки и хвоста мРНК образует кольцо. Это тоже способ защитить молекулу от разрезания РНК-азами. Перед хвостом имеется так называемая нетранслируемая область, состоящая из нескольких нуклеотидов. 5'-нетранслируемый участок служит для связывания с рибосомой.

Только после этого созревшая мРНК покидает ядро. В эукариотах зрелая мРНК должна быть траснпортирована из ядра в цитоплазму. Белковые машины ядерных пор работают как стражи и выпускают из ядра только полностью зрелую мРНК. Поэтому после созревания мРНК передвигается через ядерные поры в цитоплазму.

Во многих протяженных клетках мРНК должна быть перевезена от ядра к эндоплазматической сети, находящейся далеко от ядра, например, в клеточных отростках. Например, нервные клетки имеют длинные до 1,5–2 м в длину у человека отростки дендриты и аксоны, по которым нервные импульсы идут на периферию и от периферийных тканей к телу нервной клетки. Как и куда будет доставлена мРНК зашифровано как раз в нетранслируемой области мРНК (197, 229).

 

II.8. ТРАНСПОРТНЫЕ РНК

Кроме рибосом, для синтеза белка необходимы особые молекулы-посредники, которые "читают" инструкции, записанные в информационной молекуле РНК, и в соответствии с этими инструкциями присоединяют к синтезируемой молекуле белка нужные аминокислоты. В роли этих посредников выступают опять-таки молекулы РНК (транспортные РНК, или тРНК) (написано на основе 91). Транспортные РНК (тРНК) участвуют в процессе трансляции в качестве промежуточного связующего звена между нуклеиновыми кислотами и белками. Их задача — транспортировать активированные аминокислоты к месту синтеза белка на рибосомах.

На 3'-конце (ЦЦА-3') они несут ту аминокислоту, которая согласно генетическому коду соответствует очередному кодону мРНК.

На долю тРНК приходится примерно 10–15 % общего количества клеточной РНК. Для каждой аминокислоты в клетке имеется, по крайней мере, одна специфическая РНК (для ряда аминокислот открыто более одной, в частности, для серина — 5 разных тРНК, для лизина и глицина — по 4 разных тРНК, хотя и в этом случае каждая тРНК связана со специфической аминоацил-тРНК-синтетазой). Молекула тРНК имеет пространственную структуру в форме кленового листа. Вторичная структура тРНК ("клеверный лист") высоко консервативна, скорость эволюции низка. Молекулы тРНК сохраняют свои кодирующие функции миллиарды лет.

Транспортные РНК являются небольшими по величине молекулами, состоящими из 70–95 нуклеотидов. Молекулярная масса большинства тРНК колеблется от 24 000 до 29 000 Да. Молекула тРНК имеет четыре места склейки нуклеотидов, эти склейки имеют размер от 4 до 6 пар нуклеотидов. В трехмерном виде вся молекула напоминает русскую букву "Г". В результате внутримолекулярной склейки (интерференции) нуклеотидов образуется 5 петель, состоящих из одной цепи нуклеотидов. На одной из таких цепей и располагается так называемый антикодон, который представляет собой три последовательных нуклеотида, комлементарных кодонам аминокислот генетического кода. Очень часто первый нуклеотид антикодона представлен нуклеотидами, которые не входят ни в РНК, ни в ДНК. Наиболее часто такими нуклеотидами являются инозин и псевдоуридин. Эти нуклеотиды могут образовывать водородные связи с несколькими, а не только с комплементарными нуклеотидами.

Если исходить из генетического кода, то требуется 61 тип тРНК. На самом деле многие клетки имеют меньшее число типов тРНК.

Первые нуклеотиды антикодона, которые могут образовывать водородные связи сразу с несколькими нуклеотидами, позволяют уменьшить число разных тРНК до 31 типа. Это показывает, что генетический код является ещё более вырожденным, чем это кажется.

Наличие тРНК предсказал Ф. Крик. Затем тРНК были идентифицированы, их нуклеотидные последовательности и трехмерная организация расшифрованы. Интересно, что все тРНК обладают не только удивительно сходными функциями, но и очень похожей трехмерной структурой. Общей для тРНК оказалась также нативная трехмерная организация, установленная методом рентгеноструктурного анализа и названная первоначально конформацией клеверного листа; на самом деле эта конформация имеет неправильную, Г-образную форму. В плоскости тРНК вроде как образуют фигуру типа "кленового листа". После свертывания в пространстве фигура становится более похожей на букву "Г".

Аминокислоты присоединяются к свободной 3'-ОН-группе концевого мононуклеотида, представленного во всех тРНК АМФ, путем образования эфирной связи. Процесс химического связывания тРНК с соответствующей аминокислотой называется аминоациляцией и процесс этот реализуется с помощью специальных ферментов аминоацил-тРНК-синтетаз. При реакции расходуется одна молекула АТФ. Обычно имеется одна аминоацил-тРНК-синтетаза для каждой из 20 аминокислот. Многие организмы лишены какого-либо из этих 20 ферментов.

тРНК синтезируются в ядре РНК-полимеразой-III, тогда как незрелая мРНК синтезируется РНК-полимеразой-II. Молекулы тРНК синтезируются в виде незрелых тРНК, содержащих интроны. У бактерий при синтезе они сами собой вырезаются. У эукариотов интроны удаляются специальными эндонуклеазами сплайсинга. Кроме удаления интронов незрелые тРНК подвергаются и другим способам химической обработки, чтобы стать зрелыми функциональными тРНК.

Аминоацил тРНК получается в результате реакции между аминокислотами, АТР и тРНК, катализируемой аминоацил-тРНК-синтезатами (ферментами, активирующими аминокислоты). Особая белковая молекула узнает как молекулу специфической тРНК, так и специфической аминокислоты и образует аминоацил-транспортную РНК. Это тРНК с аминоацильной группой, присоединенной к 2'- или 3'- гидроксильной группе концевого остатка аденозина.

Для каждой из 20 аминокислот имеется соответствующий фермент — аминоацил-тРНК-лигаза, которая в цитоплазме соединяет аминокислоту с тРНК. Специальный фермент — кодаза опознает тРНК и присоединяет к "черешку листа" аминокислоту — не какую угодно, а только ту, которая кодируется триплетом. Точность трансляции зависит, прежде всего, от субстратной специфичности аминоацил-тРНК-лигаз. Корректирующий механизм активного центра лигазы обеспечивает немедленное удаление ошибочно присоединенных аминокислотных остатков. В среднем встречается только одна ошибка на 1300 аминокислотных остатков — поразительно высокая точность синтеза, если представить, насколько близки структуры некоторых аминокислот.

 

II.9. РИБОСОМЫ

Биосинтез белка (трансляция), как и активация аминокислот, происходит в цитоплазме. Он осуществляется нуклеопротеидными, то есть состоящими из РНК и белков, частицами, называемыми рибосомами. Этими специальными молекулярными "машинками" — рибосомами все живые организмы по сей день пользуются для синтеза белков.

Рибосомы были впервые описаны в 1950-х годах биологами, изучавшими строение клетки. Рибосомы имеют диаметр около 20 нм и их можно видеть в электронный микроскоп. На цитологических препаратах рибосомы выглядят как небольшие плотные гранулы, рассеянные по всей цитоплазме (внутренняя часть клетки за исключением ядра) (125). Число рибосом в микробной клетке примерно равно 104, а эукариот — около 105. В бактериальных клетках рибосомы могут составлять до 30 процентов сухой массы цитоплазмы (125). И прокариотические и эукариотические клетки содержат рибосомы, причем рибосомы эукариот (клетки животных) примерно в два раза больше рибосом прокариот (бактерии).

С помощью метода рентгеновской кристаллографии была визуализирована структура рибосом с разрешением на уровне менее 1 нм. Как я уже указывал, в 2009 г. за эту работу была присуждена Нобелевская премия по химии (125).

И прокариотические и эукариотические клетки содержат рибосомы, причем рибосомы эукариот (клетки животных) примерно в два раза больше рибосом прокариот (бактерии). Рибосомы состоят из двух различных субчастиц, каждая из которых построена из рибосомной РНК (рРНК) и многих белков. В присутствии мРНК субчастицы рибосомы объединяются с образованием полной рибосомы, масса которой примерно в 650 раз больше массы молекулы гемоглобина.

Рибосомы и их субчастицы обычно классифицируют не по массам, а в соответствии с коэффициентами седиментации, то есть скорости падения на дно пробирки во время центрифугирования растертой клеточной массы. Скорости осаждения рибосом на дно центрифужной пробирки количественно выражается константой седиментации (разделения "центрифугата"), выражаемой в единицах Сведберга S. Величина s зависит не только от размера частиц, но и от формы и плотности, так что она не пропорциональна размеру. Так коэффициент седиментации (осаждения) полной эукариотической рибосомы составляет около 80 единиц Сведберга (80S), а коэффициент седиментации ее субчастиц составляет 40S и 60S. Рибосомы бактерий легче. У 70S рибосом величины S для субчастиц равны 50S и 30S.

Основу рибосом составляют молекулы РНК. РНК рибосом принято называть рибосомными и обозначать рРНК. Рибосомальные РНК имеют гораздо больше мест склейки (интерферирования) комплементаных нуклеотидов, чем молекулы тРНК. Длина мест склейки от 4 до 11 а в некоторых случаях и больше комплементарных нуклеотидов. Между местами склейки располагаются часто участки из нескольких некомплементарных нуклеотидов, что ведет к образованию петли, состоящей из двух половинок. Иногда петля из нуклеотидов выступает вбок, делая более длинными участки склейки.

Белки, входящие в состав рибосом, непростые — маленькие, очень древние, крайне консервативные (в геномах древнейших живых организмов — бактерий и архей — гены рибосомных белков по не вполне ясным причинам обычно располагаются рядом, все вместе, в почти одинаковом порядке, образуя так называемый "рибосомный супероперон". Это резко контрастирует с поведением других бактериальных генов, которые могут гулять по хромосоме, как им вздумается). Однако удалось показать, что рибосомные РНК могут синтезировать белок и сами, без помощников — медленно, с трудом, но все-таки могут" (66).

Клетки, в которых происходит активный синтез белков, часто содержат рибосомы, расположенные одна за другой подобно жемчужинам на нитке, в виде так называемой полисомы. Это объясняется тем, что одна молекула мРНК может транслироваться одновременно несколькими рибосомами. Полисомы состоят из 4-12 монорибосом с присоединенной к ним мРНК.

Относительно происхождения рибосом известно, что рРНК происходит из общего предшественника всех клеточных РНК, в свою очередь синтезирующегося на матрице ДНК в ядре; рибосомные белки имеют цитоплазматическое происхождение, затем они транспортируются в ядрышки, где и происходит спонтанное образование рибосомных субчастиц путем объединения белков с соответствующими рРНК. Объединенные субчастицы вместе или врозь транспортируются через поры ядерной мембраны обратно в цитоплазму, где ряд рибосом вместе с мРНК образуют полисомы или полирибосомы.

 

II.10. ПРОЦЕСС ТРАНСЛЯЦИИ

Во время трансляции рибосома на основе мРНК синтезирует белок, состоящий из аминокислот. В этом ей помогает молекула-посредник тРНК, которая с одной стороны способна к комплементации с мРНК, а с другой несет на себе аминокислоту. Одна и та же мРНК может использоваться для синтеза белка сразу несколькими рибосомами.

Сборка рибосомы из 2 субъединиц предшествует трансляции. Кодирующий комплекс получает в своё распоряжение мРНК и читает ее шаг за шагом, каждый шаг — три нуклеотида. Каким образом проверяется соответствие между кодоном и аминокислотой, ведь здесь нельзя использовать комплементацию — нуклеотиды и аминокислоты говорят на совершенно разных языках? Молекула мРНК проходит через щель около характерной структуры в виде 'рога' на малой субчастице, причем эта щель ориентирована как раз в промежуток между двумя субчастицами. Молекулы тРНК также связываются вблизи этого участка. Для этого существует молекула-посредник. Это маленькая молекула РНК, один конец которой может присоединяться к мРНК по принципам комплементации (антикодон), а к другому прикреплена аминокислота.

Рибосома присоединяется к МРНК в назначенном ей месте, находит первый кодон, и готова воспринимать тРНК. С рибосомой (машина для синтеза белка) контактируют все возможные аминокислоты и только та, которая подходит под триплет нуклеотидов остается и встраивается в цепь аминокислот. Когда т-РНК заходит в отведенное ей место, антикодон проверяется на комплементарность с кодоном, если комплементарен — аминокислота на другом конце молекулы встраивается в цепочку белка, если нет — тРНК выкидывается и принимается новая. Каталитическая активность при синтезе полипептидных цепей определяется не белком, а молекулой мРНК (124, 125).

Так продолжается до тех пор, пока рибосома не дойдет до стоп-кодона. Среди тРНК нет молекулы соответствующей ни одному из стоп-кодонов, т. е. стоп-кодон не кодирует аминокислоту. Дойдя до стоп-кодона, рибосома покидает мРНК и освобождает цепочку аминокислот, т. е. готовый белок.

В настоящее время 50 процентов всех антибиотиков действуют именно на бактериальные рибосомы (125). Антибиотик обычно попадает в отверстия между субъединицами рибосомы и забивает ее.

 

II.11. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД

Как я уже указывал выше, генетическая информация, записанная в ДНК, сначала должна быть "переписана" на молекулу РНК (этот процесс называется транскрипцией). Затем специальные сложные молекулярные комплексы — рибосомы — считывают информацию с молекулы РНК, синтезируя молекулу белка в точном соответствии с записанной в РНК «инструкцией» (этот этап реализации генетической информации называется трансляцией). Затем специальные сложные, состоящие из белков и рибосомальных РНК, молекулярные комплексы — рибосомы — "считывают" информацию с молекулы РНК и переносят информацию в последовательность аминокислот, синтезируя молекулу белка в точном соответствии с записанной в РНК "инструкцией" (этот процесс называется трансляцией, перевод на другой носитель).

Синтез белка представляет собой циклический многоступенчатый энергозависимый процесс, в котором свободные аминокислоты полимеризуются в генетически детерминированную последовательность с образованием полипептидов. В биосинтезе участвуют 20 аминокислот, называемых протеиногенными. Следовательно, "язык" нуклеиновых кислот должен содержать по крайней мере 20 слов (кодонов). Наличие 20 букв приводит к тому, что белки могут быть чрезвычайно разнообразными. Уже 12 различных аминокислот способны построить 10300 видов белков с массой 34000 Д. Если взять по одной молекуле белка каждого вида и сложить их вместе, то они бы весили 10280 г., тогда как вся планета Земля весит 1027 г. Наследственная информация записана в молекулах ДНК особым кодом. Правила, которым следует кодирование аминокислот на ДНК и РНК, называют генетическим кодом, который удалось расшифровать в 1960-е годы.

 

II.12. ОТКРЫТИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОДА

Первая статья Уотсона и Крика была опубликована в апреле 1953 г., а через 5 недель была опубликована их вторая статья "Генетические последствия, вытекающие из структуры дезоксирибонуклеиновой кислоты". Они предположили, что точная последовательность нуклеотидов и есть код, в котором хранится генетическая информация. Она копируется на 2 нитях ДНК.

В 1960-е годы было подтверждено, что наследственная информация записана в молекулах ДНК особым кодом, который был расшифрован в 1960-е годы. Гипотезу о том, как устроен генетический код для аминокислот, предложил русский ученый эмигрант-невозвращенец Гамов, который известен тем, что обосновал гипотезу расширяющейся Вселенной. Гамов понял, что генетический код не может быть одинарным, т. к. нуклеотидов ДНК всего 4, а аминокислот — 20. Кодировать аминокислоты двумя нуклеотидами каждую также недостаточно, т. к. возможно только 42 = 16 вариантов. Следующий логически вариант — кодировать аминокислоту тремя нуклеотидами, т. к. возможно 43 = 64 варианта. Он рассчитал, что поскольку в нуклеотидном "алфавите" имеется только четыре "буквы-нуклеотида" (А, Г, Ц и У или Т), то для получения 20 различных слов каждое должно состоять, по крайней мере, из трех букв. Три нуклеотида, являющиеся единицей кода, называются триплетом, или кодоном. По сути, именно Гамов открыл генетический код.

Дело было так. В 1953 году Гамов был избран в члены национальной академии наук США. В 1954 г. Гамов выдвинул гипотезу, что ДНК кодирует синтез белка, и именно в этом состоит ее физическая сущность, как носителя наследственной информации. Гамов послал статью в ПНАС (PNAS), журнал, где, по положению, любой текст члена национальной АН США должен быть бы напечатан без рецензирования. Однако журнал негласно отверг его статью с расшифровкой генетического кода. Видишь ли, американские биологи были недовольны вторжением Гамова в их епархию. Тогда он послал статью с расчетами генетического кода в труды Датской академии наук, где она была опубликована. В том же году сокращенный вариант статьи был помещен в самый престижный журнал Природа (Nature). Гамов был физиком, а не биологом, и к тому же русским, поэтому его открытие замалчивают, приписывая его иногда Крику, иногда Харано и Ниренебергу. Ни в одной западной книжке по генетике не пишут о гипотезе Гамова. Он хоть и невозвращенец, но свой.

Теоретическая идея Гамова была подтверждена в 1963 г. Идея Гамова была подтверждена в 1961 г. М. Ниеренбергом и Х. Маттхэем (182. С. 52). Они открыли, что три уридина кодируют аминокислоту фенилаланин. Генетики же считают, что генетический код был открыт в 1963-м году Х. Харано и М. Ниренебергом. Затем были открыты коды для других аминокислот. К 1966 г. код, используемый для кодирования аминокислот, был расшифрован полностью.

 

II.13. СВОЙСТВА ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОДА

Белки выполняют огромное множество функций, и, в конечном счете, именно они определяют строение организма (фенотип).

Таким образом, информация передается в одном направлении — от ДНК к РНК и от РНК к белкам. Никаких механизмов переноса информации в обратную сторону — от белков к РНК или от РНК к ДНК — поначалу обнаружено не было, что и укрепило веру в невозможность такого переноса. Потом, правда, оказалось, что в природе существуют вирусы, у которых хранилищем наследственной информации служат молекулы РНК (а не ДНК, как у всех прочих организмов), и у них есть специальные ферменты, которые умеют осуществлять обратную транскрипцию, т. е. переписывать информацию из РНК в ДНК. Созданная таким путем ДНК встраивается в хромосомы клетки-хозяина и размножается вместе с ними. Поэтому с подобными РНК-вирусами очень трудно бороться (печально известный ВИЧ относится к их числу). Но вот обратной трансляции — переписывания информации из белков в РНК — не обнаружено и по сей день.

Генетический код обладает следующими свойствами:

A. Триплетность.

Б. Универсальность.

B. Вырожденность

Г. Отсутствие знаков препинания и наличие "стоп-кодонов"

Д. Неперекрываемость

А. ТРИПЛЕТНОСТЬ

Триплетность — каждая аминокислота кодируется тремя нуклеотидами. Кодон (триплет) — последовательность из трех оснований в ДНК, которая соответствует информационной матричной РНК и кодирует какую-либо аминокислоту. Кодоны действительно включают три азотистых основания (тройка или триплет нуклеотидов). Например, триплет ЦАТ кодирует аминокислоту гистидин.

Б. УНИВЕРСАЛЬНОСТЬ.

Генетический код одинаков, универсален для всех живых организмов на Земле: от Е. соП до человека, т. е. в клетке любого из существ одинаковая последовательность нуклеотидов будет кодировать ту же аминокислоту. Впрочем, правильнее утверждать, что генетический код практически универсален, т. к. в некоторых генетических системах (например, в генах митохондрий и хлоропластов) есть некоторые отличия от стандартного кода, присущего организмам.

При исследовании генетического кода в опытах in vivo были также получены доказательства универсальности кода. Однако в последнее время выяснены некоторые отличия кода в митохондриях эукариот животных, включая человека, отличающегося четырьмя кодонами от генетического кода цитоплазмы, даже тех же клеток. В частности, АУГ, являющийся обычно инициаторным, начинающим, кодоном, кодирует также метионин в цепи, и УГА, являющийся нонсенс-кодоном, кодирует в митохондриях триптофан. Кроме того, кодоны АГА и АГГ являются для митохондрий скорее терминирующими, а не кодирующие аргинин. Как результат этих изменений, для считывания генетического кода митохондрий требуется меньше разных тРНК, в то время как цитоплазматическая система трансляции обладает полным набором тРНК.

В. ВЫРОЖДЕННОСТЬ ИЛИ РАЗМЫТОСТЬ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОДА.

Генетический код для аминокислот является вырожденным. Вырожденность — это когда одна аминокислота может кодироваться несколькими разными триплетами. Это означает, что подавляющее число аминокислот кодируется несколькими кодонами, за исключением метионина и триптофана, по существу, все остальные аминокислоты имеют более одного специфического кодона. Вырожденность кода оказывается неодинаковой для разных аминокислот.

Так, если для серина, аргинина и лейцина имеется по 6 кодовых слов, то ряд других аминокислот, в частности глютаминовая кислота, гистидин и тирозин, имеют по два кодона, а триптофан — только 1. Следует отметить, что вырожденность чаще всего касается только третьего нуклеотида, в то время как для многих аминокислот первые два нуклеотида являются общими.

Вырожденность является следствием триплетности кода, т. к. четыре нуклеотида, взятые по 3, могут закодировать 43 = 64 разных объекта, тогда как аминокислот всего 20. Из 64 кодонов три кодона отведены для прекращения процесса и называются стоп-кодонами. Последовательность первых двух нуклеотидов определяет в основном специфичность каждого кодона, в то время как третий нуклеотид менее существен. В последнее время появились доказательства гипотезы "два из трех", означающей, что код белкового синтеза, возможно, является квази- или псевдодуплетным.

Из 64 триплетов 61 смысловые, то есть они кодируют 20 аминокислот, а три триплета, а именно УАГ, УАА, УГА, являются бессмысленными. Эти три триплета, которые обозначают конец транскрипции (стоп-кодоны). Еще один специальный кодон, стартовый (инициирующий) кодон, маркирует начало трансляции и кодирует метионин.

Для "перевода" с языка азотистых оснований нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) на язык белков (последовательность аминокислот в полипептидной цепи) можно воспользоваться Таблицей генетического кода или онлайновой машиной-переводчиком созданной в Европейском институте биоинформатики.

До последнего времени считалось, что один кодон всегда кодирует одну аминокислоту. Зная последовательность нуклеотидов в матричной РНК, мы всегда можем выстроить последовательность аминокислот в белке. Однако оказалось, что вырожденность, а я бы назвал это свойство размытостью, развита ещё больше и в другую сторону — не только несколько кодонов могут кодировать одну и ту же аминокислоту, но и один и тот же кодон может кодировать несколько аминокислот. Недавно в ядерном геноме инфузории Euplotes crassus найдено целых три гена транспортных РНК, распознающих кодон УГА: селеноцистеиновая тРНК и два варианта цистеиновой тРНК. В митохондриальном геноме Euplotes кодон УГА (соответствует кодону ТГА в ДНК) кодирует триптофан, и в соответствии с этим имеется еще четвертая, митохондриальная триптофановая тРНК, распознающая этот кодон. Чтобы проверить, насколько универсальным является механизм кодирования селеноцистеина у разных организмов, исследователи пересадили селенопротеиновые гены инфузории в человеческие эмбриональные клетки. Оказалось, что человеческий аппарат синтеза белка правильно понимает смысл тех кодонов УГА в генах инфузории, которые кодируют селеноцистеин (46).

Человеческие клетки успешно синтезировали селенопротеины на основе генов инфузории, используя при этом человеческую селеноцистеиновую тРНК. Однако это произошло только с теми селенопротеиновыми генами инфузории, в которых кодон УГА один, и он кодирует селеноцистеин. Наткнувшись на кодон УГА, кодирующий у инфузории цистеин, человеческие клетки интерпретировали его как стоп-кодон и прекращали синтез белковой молекулы. Что и понятно, ведь у человека нет цистеиновых тРНК, распознающих кодон УГА. То есть, один и тот же ген может работать и у человека и у инфузории (230).

Вырожденность генетического кода ведет к возможности непроявляющихся мутаций (см. раздел 6.6).

Г. ОТСУТСТВИЕ ЗНАКОВ ПРЕПИНАНИЯ И НАЛИЧИЕ СТОП-КОДОНОВ

Триплеты не отграничены друг от друга, но есть сочетания нуклеотидов, обозначающих "точку", конец считывания — "стоп-кодоны". Другой отличительной особенностью генетического кода является его непрерывность, отсутствие знаков препинания, то есть сигналов, указывающих на конец одного кодона и начало другого. Другими словами, код является линейным, однонаправленным и непрерывающимся: АЦГУЦГАЦЦ. Если удалить первые два нуклеотида из нашей последовательности, то с данной последовательности будет синтезироваться другой пептид. Стоп-кодоны выполняют важную функцию в синтезе белка в рибосомах — функцию окончания (терминации) синтеза. Если они помещены 3 раза подряд, то полимеризация белка заканчивается.

Д. НЕПЕРЕКРЫВАЕМОСТЬ

Ранее считалось, что каждый участок ДНК хранит информацию не более чем об одном белке. Иными словами, если участок ДНК кодирует белок, то не может кодировать (начиная с какого-нибудь другого нуклеотида) другой белок. Однако открытие альтернативного сплайсинга и возможности редактирования мРНК показывает, что данное свойство устарело.

Итак, природа разработала специальные приемы кодирования информации, что позволяет переходить с одной буквенной системы, каковой являются нуклеотиды, к другой — аминокислотной.

 

II.14. СИНТЕЗ БЕЛКОВЫХ ЦЕПЕЙ

Белковый синтез, или процесс трансляции, может быть условно разделен на два этапа: активирование аминокислот и собственно процесс трансляции, то есть синтез цепи аминокислот. Трансляция требует высоких энергетических затрат. При присоединении одной аминокислоты к растущему полипептиду гидролизуется четыре макроэргические связи. Две молекулы АТФ гидролизуются при активации аминокислоты, и две молекулы ГТФ расходуются во время элонгации. Кроме того, при начале синтеза и его окончании на каждую полимерную молекулу белка расходуется по одной молекуле ГТФ.

Совокупность белковых машин, используемых для синтеза полипептидной цепи с определенной первичной структурой на основе зрелой мРНК, включает около 200 типов макромолекул — белков и нуклеиновых кислот. Среди них около 100 макромолекул, участвующих в активировании аминокислот и их переносе на рибосомы (все тРНК, аминоацил-тРНК-синтетазы), более 60 макромолекул, входящих в состав 70S или 80S рибосом, и около 10 макромолекул (называемых белковыми факторами), принимающих непосредственное участие в системе трансляции.

Синтез белка начинается с N-конца и завершается С-концом, т. е. процесс протекает в направлении NH2 → COOH. Процесс синтеза цепочки аминокислот можно разделить на три стадии. Первой стадией трансляции является связывание рибосомы со стартовым (инициирующим) кодоном мРНК вблизи так называемого 5'-конца мРНК. Затем к стартовому кодону, а это почти всегда у эукариотов триплет, кодирующий метионин, прикрепляется тРНК, несущая метионин. Молекула тРНК связывается в виде комплекса с ГТФ-содержащим белком, называемым фактором удлинения.

Затем вторая тРНК, соединенная с аминокислотой, соответствующей второму кодону, взаимодействует своим антикодоном с кодоном мРНК. Затем рибосомная "пептидилтрансфераза" катализирует (без потребления АТФ) сшивание аминокислот. Пептидилтрансферазная (то есть способносность полимеризовать аминокислоты) активность рибосом не зависит от белка. Эта реакция осуществляется рибосомными РНК. Каталитически активные РНК получили название рибозимов.

Разделение первого комплекса происходит только после того, как связанная с комплексом молекула ГТФ химически расщепляется до ГДФ и иона фосфата. До гидролиза ГТФ взаимодействие тРНК с мРНК относительно слабое. Таким образом, гидролиз ГТФ с участием комплекса служит лимитирующим фактором, дающим время для проверки, правильно ли связана тРНК. Затем следующий белок, фактор элонгации, катализирует обмен ГДФ на ГТФ и таким образом регенерирует способность рибосомы полимеризовать аминокислотную цепь. После передвижения растущей аминокислотной цепи внутри рибосомы свободная аминоацил-тРНК отсоединяется от рибосомы.

С рибосомой связывается другой ГТФ-содержащий фактор удлинения. Гидролиз (химическое разрушение с поглощениме молекул воды) ГТФ этим фактором дает энергию для транслокации рибосомы. Во время этого процесса рибосома сдвигает мРНК на три основания в направлении 3'-конца. Поскольку тРНК, несущая полипептидную цепь, не меняет положения относительно мРНК, она попадает в 2-й участок рибосомы, в то время как следующий кодон мРНК попадает в 1-й участок. Теперь рибосома готова для вступления в следующий цикл удлинения и процесс повторяется. По мере трансляции рибосома движется по направлению к 3'-концу до тех пор, пока не дойдет до терминирующего кодона (стоп-кодона) (УАГ, УАА, УГА). После завершения стадии инициации к растущей полипептидной цепи присоединяются другие аминокислоты до тех пор, пока рибосома не достигнет стоп-кодона на мРНК и процесс не прекратится (терминация). Когда один из стоп-кодонов (УАГ, УАА, УГА) попадает в зону синтеза, удлинение полипептидной цепи заканчивается. Для стоп-кодонов нет соответствующих тРНК. Как только рибосома достигает стоп-кодона, происходит освобождение синтезированного белка и распад рибосомы на отдельные субчастицы.

 

II.15. СИНТЕЗ БЕЛКОВ В ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ СЕТИ

Растворимые, то есть не связанные напрямую с липидной мембраной белки, могут быть предназначены для выведения во внешнюю среду или для доставки в лизосомы, пластинчатый комплекс или они могут оставаться в эндоплазматической сети (ЭС). Эти белки называются секретируемыми. Небольшая часть растворимых белков, оказывающихся в просвете эндоплазматической сети, являются лизосомными ферментами, они предназначены для доставки в лизосомы. Наконец, есть белки, которые остаются в просвете ЭС. К ним относятся некоторые шапероны, белки, ответственные за правильную трехмерную упаковку белковых молекул, а также участники специализированных для ЭС белковых агрегатов, контролирующих выход секретируемых белков и лизосомных ферментов из ЭС.

В гранулярной же ЭС происходит синтез экспортируемых белков, которые, встраиваясь в мембрану ЭС, становятся интегральными мембранными белками. Мембранные белки могут быть следующих типов. Одни переносятся на митохондрии, другие остаются в ЭС или транспортируются в пероксисомы. Наконец, третья часть белков транспортируется в сторону аппарата Гольджи и проходит через него, направляясь либо на плазматическую мембрану, либо в эндосомы, либо в лизосомы. Сходный путь проходят липиды, продуцируемые на цитозольной стороне мембран ЭС.

 

II.16. СИГНАЛЬНЫЙ ПЕПТИД

Белковая машина, ответственная за внедрения секретируемых (растворимых) и экспортируемых (мембранных или растворимых, но предназначенных для других органелл клетки) белков в просвет эндоплазматической сети или (во втором случае) в его мембрану, работает следующим образом. После того, как информационная мРНК проникает из ядра в цитоплазму, она связывается с рибосомой.

Биосинтез белка (трансляция мРНК) всегда начинается в цитоплазме после приклеивания мРНК к рибосоме и сборки рибосомы из двух частиц. Если в мНК нет специальной последовательности нуклеотидов, которая называется сигнальным пептидом, то синтез проходит нормально и аминокислотная цепь оказывается в цитоплазме, где она потом образует трехмерную структуру и подвергается посттрансляционной (то есть уже после синтеза) модификации.

Если же образующийся на рибосоме белок начинается с сигнального пептида, то рибосома вместе с мРНК прикрепляется к эндоплазматической сети. Сигнальный пептид — это короткая цепочка из особой последовательности аминокислот на том конце белка, где началом служит атом азота. За открытие сигнального пептида Блобелю была присуждена Нобелевская премия (1999 г.).

Наличие сигнального пептида определяет судьбу полипептидной (белковой) цепочки, синтезирующейся на базе данной информационной РНК. Если сигнальный пептид у данного белка есть, то комплекс рибосомы и информационной РНК и начинающая полипептидная цепочка присоединяется к специальным белковым машинам, ответственным за перенос полипептидной цепочки через мембрану эндоплазматической сети. В направлении сигнального пептида к мембране эндоплазматической сети участвуют 1) частица, распознающая сигнал (a signal-recognition particle, SRP, СПР) и 2) ее рецептор, известный также как стыкующий белок.

 

II.17. ТРАНСЛОКОН

С сигнальным пептидом связывается РНК-содержащая сигнал-узнающая частица СПР (SRP) и трансляция (синтез белка) временно прерывается. SRP связывает рибосому посредством SRP-рецептора с мембраной ШЭР. SRP плотно захватывает рибосому, присоединяясь и к сигнальному пептиду (как только он появляется на большой субъединице рибосомы), и к рибосомному участку связывания аминоацил-тРНК. В результате трансляция останавливается, поскольку блокируется связывание следующей аминоацил-тРНК с рибосомой.

Пауза в трансляции длится до тех пор, пока захватившая рибосому частица не свяжется с SRP-рецептором, находящемся на цитоплазматической стороне мембраны шероховатой эндоплазматической сети. Он взаимодействует с SRP-связанными рибосомами таким образом, что частица меняет свое положение, и трансляция возобновляется. Одновременно рибосома связывается с мембраной эндоплазматической сети и растущая на ней полипептидная цепь переносится к системе транслокации в мембране. Как только рибосома закрепится на мембране, SRP-частица отщепляется от сигнального пептида и от SRP-рецептора (при этом гидролизуется ГТФ), и на рибосоме вновь начинается процесс трансляции.

Транслокон — пора, образованная мембранными белками эндоплазматической сети в месте нахождения сигнальной последовательности синтезируемого белка. После прикрепления рибосомы к мембране удлинение полипептидной цепи начинается и цепь проходит через пору в просвет цистерны. Полипептидная цепь синтезируется в цитоплазме. Сигнальная последовательность остается фиксированной в области поры. В последующем она отрезается специальными ферментами, находящимися в эндоплазматической сети. У меня нет возможности подробно разбирать функционирование этой сложнейшей белковой машины, которая носит название транслокон. Тех, кто интересуется, отсылаю к прекрасным обзорам (157, 234).

Белковый комплекс, ответственный за перемещение полипептидной цепи через мембрану эндоплазматической сети состоит из нескольких отдельных белков, но его главным компонентом является белок Сек61. После того, как рибосома прикрепилась к мембране эндоплазматической сети, полипептидная цепочка, синтезирующаяся на основе информационной РНК захватывается Сек61 и через образуемый им в мембране эндоплазматической сети гидрофильный канал проталкивается внутрь просвета эндоплазматической сети.

Такая "заякоренная" рибосома с SRP-частицей, блокирующей дальнейший рост полипептидной цепи, взаимодействует с большим белковым комплексом, транслоконом. После связывания рибосомы с транслоконом происходит отделение SRP-частицы и синтезированный первичный пептид входит в канал диметром около 2 нм, который образует транслокон. После этого возобновляется синтез полипептида, он удлиняется и его сигнальная последовательность, вместе с растущей цепочкой оказывается внутри полости цистерны эндоплазматической сети. Таким образом, синтезируемый белок проходит сквозь мембрану эндоплазматической сети во время его синтеза, т. е. котрансляционно, то есть одновременно с его трансляцией.

После того как полипептидная цепь оказывается в просвете эндоплазматической сети, соответствующая пептидаза отщепляет сигнальный пептид. Фермент узнает точку расщепления в составе специфической N-концевой последовательности белка.

 

II.18. МЕМБРАННЫЕ БЕЛКИ

Начальные стадии синтеза мембранных белков похожи на таковые при синтезе растворимых белков. Однако в мембранных белках, в цепи синтезирующегося мембранного белка существует одна или несколько аминокислотных последовательностей, которые образованы из 17–26 (иногда больше) гидрофобных, то есть не имеющих полярных групп, аминокислот. Как правило, подобные гидрофобные участки по краям окружены одной или двумя основными (аргинин, лизин или гистидин) или кислотными аминокислотами, содержащими боковые кислотные группы (аспарагиновая или глютаминовая кислоты). Основные кислоты обычно расположены со стороны цитоплазмы, а кислые остатки со стороны просвета эндоплазматической сети.

Когда данная часть аминокислотной цепи оказывается внутри гидрофильного белкового канала, возникает необходимость вытолкнуть из гидрофильной зоны канала гидрофобную скрученную цепь аминокислот. Канал раскрывается и гидрофобный скрученный участок оказывается внутри липидного бислоя.

При этом синтез белка на рибосоме не останавливается. Это приводит к тому, что весь белок остается встроенным в мембрану. В некоторых белках число альфа-спиральных "заякоревающих" участков может быть от одного до нескольких. Так, например, белок, который переносит молекулу глюкозы через мембрану, имеет 12 таких гидрофобных участков. Похожим образом оказываются в просвете цистерны эндоплазматической сети проферменты лизосом, которые переносятся к лизосомам и по ходу дела от них отщепляется пропептид и они превращаются в лизосомные ферменты-гидролазы.

В этом случае аминокислотная цепь остается погруженной в мембрану и дает начало интегральному мембранному белку. В ходе белкового синтеза возможно многократное прохождение растущей цепи через мембрану и возобновление синтеза вновь при посредстве сигнального пептида. Образующийся по такому механизму мембранный белок будет иметь множество участков, погруженных в мембранный бислой.

Внутри полости эндоплазматической сети с помощью фермента (сигнальной пептидазы) сигнальная последовательность отщепляется. После окончания синтеза вся белковая молекула оказывается в полости эндоплазматической сети и в это время рибосома отделяется от транслокона и диссоциирует. После этого в транслоконе канал закрывается. Во время трансмембранного переноса растущей белковой цепи происходит ее связь с олигосахаридами (гликозилирование — см. ниже). В полости цистерн эндоплазматической сети белки претерпевают ряд дополнительных изменений: образуются дисульфидные связи, происходит их правильное сворачивание, происходит сборка четвертичной структуры белков. Только белки с правильной конформацией (пространственной упаковкой) в дальнейшем будут переноситься в зону аппарата Гольджи.

 

II.19. КАК КЛЕТКА РАЗРУШАЕТ ОДИНОЧНЫЕ И ДВОЙНЫЕ ЦЕПИ РНК?

Если бы мРНК не подвергалась разрушению, клетка бы не могла оперативно реагировать на изменяющиеся условия среды активацией синтеза нужных в данный момент белков. Поэтому для мРНК характерно короткое время жизни, так как они быстро распадаются после трансляции. Молекула мРНК живет от 10 мин до 2 суток. Особенно короткоживущими являются мРНК регуляторных белков. Они разрушаются РНК-азами (белками, режущими РНК на отдельные нуклеотиды) в цитоплазме. Итак, длинная мРНК, не образующая петель и шпилек, разрушается с концов под действием РНК-аз. Выраженность всех этих механизмов по разрезанию РНК определяет насколько долго существует данная мРНК в цитоплазме и как быстро она разрушается.

Источниками двухцепотчатых молекул РНК являются тРНК, рРНК и сРНК, двойные цепи РНК возможно в виде шпилечных структур на незрелой молекуле мРНК при мутациях или при введении в клетку коротких комплементарных цепей РНК для интерферирования с мРНК выбранного белка. Это могут быть также искусственно введённые в клетку молекулы РНК. Источник двуцепочечных РНК в клетке может быть и другим: активность клеточной или вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, синтезирующей незрелые мРНК, которые способны к внутримолекулярному склеиванию …

Для разрушения двойных цепей РНК, имеющихся или образующихся к клетке, имеются специальные белковые машины. Появление в цитоплазме двуцепочечной РНК из-за склеивания мРНК, а также повреждения и вследствие этого выпадение из белково-нуклеиновых комплексов рРНК, тРНК или сРНК запускает специальную белковую машину, приспособленную для разрезания таких двойных РНК. Когда любая короткая цепь РНК, имеющая комплементарность по отношению к одному из участков мРНК, склеивается с ней, то она тоже попадает в тот же самый метаболический путь, что и обычно существующие двойные РНК.

 

II.20. РАЗРЕЗАНИЕ ДВОЙНЫХ ЦЕПЕЙ РНК

Незрелые мРНК генов, у которых имеются участки, способные к склеиванию, образуют склейки в форме шпилек уже в ядре. Эти "шпильки" РНК могут отрезаться от незрелой мРНК также уже в ядре, где от таких незрелых мРНК отрезаются получающиеся в результате такой склейки шпильки или структуры в виде стебелька или петли длиной около 70 нуклеотидов. Пока белковые машины, ответственные за этот процесс и способные проникать в ядро, не выявлены.

Для того, чтобы разрушать ненужные двухцепотчатые РНК, в цитоплазме подавляющего большинства клеток имеется специальный фермент, обладающий рибонуклеазной активностью. Это белок-фермент Дайсер (Dicer). Белок Дайсер связывается лишь с длинными двуцепочечными РНК. Он связывает и разрезает длинные двойные нити РНК на короткие двухцепочечные фрагменты длиной 21–25 пар нуклеотидов, с несколькими неспаренными нуклеотидами на каждом конце. Одна из двух цепей каждого получившегося фрагмента называется ведущей цепью.

Белок Дайсер регулируется другими белками, которые могут усиливать или угнетать его каталитическую активность. Дайсеру помогают в этом особые белки со странными названиями Дроша и Паша.

В растениях система белков, направленная на разрезания и затем деградацию двухцепотчатых РНК, выражена гораздо лучше, чем у животных, так как в растениях опасности получения двойных цепей РНК при перемещении мРНК мутантных белков по плазмодесмам выражены гораздо выше.

Разделение двух цепей коротких (20–25 пар нуклеотидов) двойных цепей ДНК происходит белковым комплексом, который носит название РИСК (RNA-induced silencing complex, RISC). Короткая двойная молекула РНК далее поступает в RISC РИСК независимо от того, где она синтезирована в ядре или вне клетки.

Короткие фрагменты двойной РНК захватываются РИСК-ом и разделяются на одиночные цепи, которые уже затем разрушаются обычными РНК-азами. Разделение цепей короткой двойной молекулы РНК является АТФ-независимым и осуществляется непосредственно белками, входящими в состав RISC.

После интеграции в РИСК короткие двойные цепи РНК разделяются и комплементарно соединяются с мРНК-мишенью. В результате одноцепочечный фрагмент РНК склеивается с комплементарной последовательностью молекулы мРНК.

Каталитической частью РИСКа являются белки-эндонуклеазы семейства Аргонавт (Argonaute), которые разрезают мРНК. Фрагменты, которые образуются после разрезания белком Дайсером, являются двухцепочечными. Потенциально каждая из цепочек может являться малой интерферирующей РНК. Однако, лишь одна из двух цепочек, называемая ведущей цепочкой, связывается с белком Аrgonaute и вызывает сайленсинг гена.

Другая цепочка, называемая цепочкой-спутницей, подвергается деградации.

У эукариот белки Аргонавты обнаружены в высоких концентрациях в районах цитоплазмы клеток, известных как Р-тельца, цитоплазматические тельца, в которых разрушаются мРНК Семейство белков Аргонавт очень древнее. Эти белки есть не только у эукариот, но и у некоторых архей и даже бактерий, что свидетельствует о том, что проблема удаления двойных цепей РНК существовала с незапамятных времен (217)

 

II.21. ГИБРИДИЗАЦИЯ IN SITU

Свойство нуклеиновых кислот образовывать склейки (интерферировать или подвергаться межмолекулярной гибридизации) если последовательности нуклеотидов комплементарны друг другу было использовано в науке одним из первых.

В цитологии, гистологии и патологической анатомии широко применяется так метод так называемой гибридизации ин ситу (in situ). Суть его в том, что если исследователь знает последовательность нуклеотидов в каком-то участке гена, то можно определить положение данного гена в пределах хромосомы. Кроме того путем измерения количества мРНК, синтезированной на основе информации, которая записана в данном гене, можно количественно выявить, на каких генах происходит процесс транскрипции (синтеза молекул РНК на базе комплементарной ДНК) в данной клетке (75).

Гибридизации нуклеиновых кислот используется для мечения ДНК и РНК с помощью видимых в микроскопе маркеров. При этом гибридизация используется для мечения особых последовательностей ДНК и РНК. Если РНК являясь одноцепотчатой доступна для мечения сразу, то для того, чтобы сделать ДНК доступной для гибридизации и мечения надо ее нагреть, чтобы двойная цепь ДНК разошлась на одиночные цепочки.

Для этого ученые синтезируют короткие цепочки ДНК или РНК, комплементарные гену или его мРНК. Затем берутся образцы тканей или органов и готовятся гистологические или электронно-микроскопические срезы. Затем срезы нагреваются.

При этом цепи ДНК из-за резкого увеличения подвижности молекул разрывают водородные связи и расплетаются, превращаясь в одиночные. Они становятся доступными для склеивания с короткими одиночными цепями ДНК, добавляемых к срезу извне. Если срез охладить после добавления, то короткие цепи конкурируют с комплементарными цепями ДНК за места склеивания и гораздо успешнее, чем длинные молекулы, приклеиваются (интерферируют или подвергаются гибридизации) к комплементарным участкам расплетенной молекулы ДНК. Короткие цепи имеют тенденцию приклеиваться к комплементарным участкам. Если участки менее комплементарны, чем длинная комплементарная нить ДНК, то короткие цепи хуже склеиваются и проигрывают соревнование за места склеивания.

Метод осуществляется таким образом — сначала срезы нагревают до температуры плавления ДНК (это температура, при которой происходит отклеивание двух нитей ДНК друг от друга, обычно около 90 °C), затем при чуть более низкой температуре добавляют наш зонд в виде короткой одиночной цепи ДНК, которая мечена либо с помощью внедрения в молекулу радиоактивного изотопа либо путем химического пришивания к цепи нуклеотидов вещества, которое испускает под воздействием света с короткой длиной волны фотоны света с более длинной волной (возникает так называемая флюоресценция). Измеряя радиоактивность в экспериментальных и контрольных образцах, подготовленных абсолютно одинаково, можно судить количественно о том, какие гены есть в данных клетках. Если вместо короткой нити ДНК использовать короткую комлементарную и меченную нить РНК, то можно измерить уровень транскрипции с данного гена.

Введение метода ДНК-ДНК гибридизации позволило доказать, что микоплазмы (самые примитивные бактерии) являются самостоятельной группой, получившей название класс Mollicutes (216).

 

II.22. ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ РНК

Не надо забывать, что у живых организмов идёт постоянный обмен веществ. Поэтому надо знать не только механизм синтеза молекул, но и механизмы их последующей обработки (химической модификации и упаковки в трехмерном пространстве и разрушения), иначе, если будет излишек синтеза, но не будет разрушения, то будет избыток данной молекулы. Двойные спирали РНК существуют в виде рРНК, сРНК, тРНК. Поэтому в клетке должны быть механизмы для их разрушения, так как идёт постоянный обмен веществ и клетка должна постоянно приспосабливаться к изменениям внешней среды.

Имеющиеся в клетке белковые машины, которые клетка использовала и использует для разрушения двойных цепей РНК, были с успехом применены для целей изучения функции белков. Один из первых примеров РНК-интерференции был обнаружен при получении трансгенных растений петунии. Явление РНК-интерференции впервые было обнаружено у круглого червя-нематоды Caenorhabditis elegans (кто не знает, сообщаю, что этот червь относится к категории глист, то есть, червей, живущих в кишечнике у млекопитающих).

В 2006 году Э. Файр и К. Мелло, первый и последний автор статьи, опубликованной в журнале Природа (Nature^ 1998 г., получили Нобелевскую премию в области физиологии и медицины за работы по изучению РНК-интерференции у нематоды C. elegans, опубликованные в 1998 году. Они вводили в клетки одиночные и двойные цепи РНК, комплементарные мНК одного из генов. При введение двойной цепи РНК происходило блокирование специфического, гомологичного ей по нуклеотидной последовательности, гена. РНК-интерференция обнаружена почти во всех эукариотических организмах (за исключением почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae).

Сейчас для удаления продуктов гена из клеток, выращиваемых в пробирке, используют введение в цитоплазму или непосредственно в ядро коротких одиночных или двойных молекул РНК, комплементарным, особым образом отобранным участкам мРНК, которая синтезируется основе выбранного гена. Попадание этих фрагментов ведет к тому, что двойные разделяются на одиночные цепи с помощью белковой машины РИСК, а одиночные цепи действуют непосредственно. Полученные после разделения в РИСКе или непосредственно введенные в цитоплазму цепочки РНК, содержащие 20–25 нуклеотидов, приклеиваются (интерферируют) к комплементарным зонам мРНК производной от выбранного гена (139, 191).

Одну из двух цепочек каждого фрагмента называют ведущей или «направляющей». Ведущая цепь специфически связывается с молекулой мРНК и запускает разрезание белком. Такая длина (порядка 20–21 нуклеотидов) двухцепочечных фрагментов РНК увеличивает специфичность приклеивания ведущей цепи к мРНК. Если взять коплементарный участок большей длины, то склеивание займет больше время, а если его сделать короче, то сила сцепления склеенных участков уменьшится (135).

Приклеивание приводит к тому, что зрелая мРНК не может быть использована рибосомой и после долгого стояния отделяется от нее, разрушается с концов РНК-азами, а двойной участок снова попадает в РИСК и снова наша короткая комплементарная РНК оказывается готова к тому, чтобы инактивировать следующую молекулу мРНК. Процесс идет до тех пор, пока все мРНК не будут инактивированы. Тогда короткие цепочки РНК разрушаются РНК-азами и клетка снова может синтезировать мРНК с нашего белка. То есть введение коротких интерферирующих цепей РНК дает временный эффект по блокированию синтеза выбранного белка.

Другим методом является введение в геном с помощью микроинъекции, перфорирования или инфицирования вирусом генов, содержащих комплементарные участки, которые после синтеза незрелой РНК склеиваются друг с другом, образуя шпильки с петелькой на конце (что напоминает теннисную ракетку). Эта шпилька отрезается белками типа Дайсер и нарезается на короткие фрагменты длиной 20–25 нуклеотидов и затем в цитоплазме РИСК разделяет две цепи и образует одиночную цепь, способную приклеиваться к мРНК от выбранного белка. Обычно ген либо просто вводится, либо встраивается в геном так, чтобы он мог быть активирован особым стимулятором, который вводится в среду, где растут клетки.

Не всегда можно с уверенностью предположить, успеют ли комплементарные мРНК склеиться с короткой РНК или нет, пока ее не захватит рибосома. Насколько сильно наслаиваются склеивающиеся цепи РНК зависит степень нарушения, а также от продолжительности жизни мРНК.

Если длина комплементарной склейки достигает 20 и более нуклеотидов, то прочность склейки становится значительной и склеенные участки не позволяют рибосоме передвигаться вдоль мРНК. Рибосома встает перед местом склейки и затем распадается на две субъединицы. Синтез белка останавливается. После прекращения синтеза белка рибосома распадается и мРНК содержащая склейки, или две склеенные молекулы мРНК становятся жертвами Дайсера и РИСКа. Тем самым блокируется синтез белка. Совершенно не ясно, успеет ли комплементарные мРНК склеиться или нет, пока ее не захватит рибосома. Или же рибосома встает перед местом склейки и затем распадается на две субъединицы.

 

II.23. НОКАУТЫ ГЕНОВ

Вторым способом, использования способности нуклеиновых кислот интерферировать в местах, где цепи нуклеотидов, комплементарных друг другу, стал метод удаления генов или их мРНК. Используется два подхода: нокаут гена и нокдаун гена. Нокаут гена (англ. gene knockout) — это метод при котором из организма удаляют или делают неработоспособными определенные гены. Для нокаута синтезируют такой же ген или его фрагмент, изменённый так, чтобы продукт гена потерял свою функцию. Для получения нокаутных мышей полученную генно-инженерную конструкцию или химерный ген вводят в эмбриональные стволовые клетки, где конструкция замещает нормальный ген, а измененные клетки имплантируют в бластоцист (ранняя стадия эмбриона)суррогатной матери. У плодовой мушки дрозофилы мутации инициируют в большой популяции, в которой затем ищут потомство с нужной мутацией. Сходным способом получают нокаут у растений и микроорганизмов.

Чтобы встроить ген в кольцевую ДНК, которая чаще всего используется для внедрения гена в клетку, применяют ферменты — рестриктазы и лигазы, также являющиеся полезным инструментом генной инженерии. С помощью рестриктаз ген и кольцевую ДНК можно разрезать на кусочки. С помощью лигаз такие кусочки можно «склеивать», соединять в иной комбинации, конструируя новый ген, а затем заключая его в ту самую кольцевую ДНК. Кольцевые ДНК, используемые для введения инородного гена в геном, часто называют векторами.

Ученые научились внедрять в клетки гены, которых у них ранее не было. Делается это обычно путем продырявливания плазматических мембран. Через дырки в цитоплазмы поступают гены в составе кольцевой ДНК. В сущности, процесс введения дополнительных генов таков же, как и при нокауте, но существующие гены не замещаются и не повреждаются.

У эукариот (клеток с ядрами) нокаут гена (разрушение здорового гена) производят путём использования феномена гомологичной рекомбинации (обмена нуклеотидными последовательностями) между сравнительно небольшим участком инородной (экзогенной) и клеточной ДНК.

Трансформированные эмбриональные стволовые клетки вносят в зародыш, и полученных химерных животных скрещивают для получения линии мышей, гомозиготных по полученной мутации.

Вектор, используемый для нокаута, несет клонированную последовательность изучаемого гена, с внесенными в нее необходимыми изменениями. Это может быть: внесение стоп-кодона, приводящее к синтезу короткого неактивного пептида; удаление одного или нескольких экзонов; делеция (удаление) промоторной (стимулирующей) области, расположенной перед самим геном; вставка, приводящая к нарушению нормального функционирования гена и любые другие изменения, приводящие к отсутствию функционального продукта изучаемого гена или значительно снижающие его активность. Также в эту последовательность вносится положительный селективный маркер, на основе которого синтезируется белок, делающий несущие его клетки устойчивыми к антибиотикам неомицину и канамицину. Модифицированная последовательность нуклеотидов должна быть окружена с обеих сторон неизмененными участками, по которым будет проходить рекомбинация (взаимообмен) с ДНК в хромосоме.

При этом существует вероятность, что рекомбинация пройдет не по исследуемым нами участкам генома, а в любой другой сходной области. Эта проблема решается внесением в векторную конструкцию маркера отрицательной селекции. Им может служить ген дифтерийного токсина А (DT-A), продукты которых убивают эукариотические клетки. Клетки, в которых взаимообмен (рекомбинация) прошел неправильно синтезируют данный токсический ген и погибают. Остаются лишь небольшое количество клеток, где рекомбинация прошла там, где надо. Как все это делается подробно описано в методических книжках. Я не буду загружать вашу память. Кто хочет, может найти эти сведения в Интернете.

Эмбриональные стволовые клетки мыши впервые получены в 1981 году, что дало возможность для развития работ по инактивации генов. Внесение нашего вектора в эмбриональные стволовые клетки возможно с помощью микроинъекции, химического (помощью липидов или других веществ) или физического (электропорация) кратковременного перфорирования плазматической мембраны, или с помощью заражения клеток вирусом, в геном которого встроен наш вектор. Наиболее экономичными и достаточно эффективными методами внесения экзогенной ДНК в клетку являются электропорация и ретровирусная инфекция. К их достоинствам, в первую очередь, следует отнести возможность одноразово обработать сотни тысяч клеток, которые благодаря системе позитивной-негативной селекции достаточно быстро проходят отбор.

После того, как линия трансформированных клеток получена и поддерживается, их вносят в эмбрион мыши (как правило, на стадии бластулы). Затем содержащий наши клетки химерный зародыш подсаживают в матку ложно беременной самки. Полученную таким образом химеру скрещивают с нормальным, но имеющим отличия (например, цвет) животным, пока не будет получена гомозиготная линия. Результатом будет получение линии животных, гомозиготных по созданной мутации. Не все гены можно инактивировать на стадии зародыша — для них существуют боле сложные генно-инженерные методы.

 

II.24. РОЛЬ СКЛЕИВАНИЯ (ИНТЕРФЕРЕНЦИИ) РНК

Зачем на самом деле нужны механизмы, служащие для процессинга (разрушения) малых РНК? Пока такие гены найдены только у червя (173). Думаю, что механизм по разрушению двойных цепей РНК в клетке был разработан природой для борьбы с гибридизационными осложнениями. Склеивание двух мРНК или внутримолекулярное склеивание одной мРНК может вести к блокированию синтеза белков в определенных ситуациях, когда сам белок не изменен ни на йоту. Эксперименты на червях лучше всего объясняются с этих позиций.

Гибридизационые мутации накапливаются в экзонах и интронах, которые могут в данный момент не использоваться в данной клетке. Многие гены молчат, но накапливают иммуногенные мутации, которые выявляются иммунной системой. Система РНК-интерференции играет также важную роль в защите клеток от паразитирующих генов и вирусных генов. Считается, что РНК-интерференция является защитным механизмом, предохраняющим клетку от РНК-вирусов и мобильных генетических элементов (транспозонов).

Эксперименты с гибридизацией молекул РНК ин ситу показали, что реакция не требует нагревания. Следовательно, никаких экранирующих белков по ходу мРНК нет. Кроме того белки, как правило, глобулярные и свернуты. Если молекулу мРНК покрыть глобулярными белками, то вес полученного агрегата становится неподъемным для обычной диффузии (взять картинку длины белка в зависимости от структуры и скрутки). Кроме того, нужна молекулярная машина, которая будет регулировать склеивание и отклеивание белков от мРНК. Система становится очень сложной.

Как защитить мРНК от склеивания? 1. Подбором генотипов так, чтобы там не было генов, которые бы давали склеивающиеся мРНК. Вполне вероятно, что если есть гибридизационное склеивание, то организм нежизнеспособен. Тысячи цветков, зигот, мальков и среди них те, которые гибнут из-за гибридизационных осложнений почти не заметны, т. к. как вид уже хорошо поработал и отобрал гены, которые в геноме не дают гибридизационных осложнений.

Эволюция подбирала генотипы, выбраковывая те наборы ДНК, которые при транскрипции давали гибридизационные осложнения. Видимо, изоформы белков нужны для исключения гибридизационных эффектов. Альтернативный сплайсинг тоже нужен для этого.

Эксперименты в короткими молекулами РНК показывают, что в норме осложнений, связанных с гибридизацией нуклеиновых кислот, в клетках одного вида нет. Эволюция миллионы лет подбирала подходящие комбинации нуклеотидов для синтеза белка внутри вида, так, чтобы не было осложнений, связанных с гибридизацией нуклеиновых кислот.

2. После склейки склеенные мРНК могли бы не выходить из ядра. Такого механизма пока не обнаружили, наоборот, гибридизационные шпильки выходят из ядра.

Гипотеза о том, что в процессе жизни в клетках накапливается большое количество гибридизационных мутаций, но они не проявляются, так как не все гены в данной клетке синтезируются. Это объясняет, почему в одних клетках человека метод интерференции РНК работает, а в других нет.

Моя гипотеза дает также совершенно другое толкование роли малых клейких РНК. Это результат адаптации клеток и организмов к возникновению невидимых мутаций, то есть мутаций, которые никак не сказываются на последовательности аминокислот кодируемого белка, мутаций не только в экзонах, но и в интронах (см. раздел 6.4)

Гипотеза о том, что гибридизация ин виво (in vivo) играет большое значение в помогает понять, почему очень часто в экспериментах с пересадками генов выявляются так называемые неспецифические токсические эффекты. ДНК, кодирующая внешний белок, может давать токсический эффект из-за взаимодействия с мРНК внутренних белков.

Скорее всего очень часто наблюдаемый так называемый токсический эффект некоторых белков, которые методами молекулярной биологии внедряются в геном лабораторных клеточных линий и половые клетки животных связан с гибридизационным взаимодействием мРНК пересаженного белка с мРНК какого-либо из внутренних белков.