О том, что концепция программы развития точнее отражает механизмы наследования, чем концепция гена, говорит и судьба овечки Долли. Долли (англ. Dolly) — самка овца, первое млекопитающее, успешно клонированное из клетки другого взрослого существа. Эксперимент был поставлен в Великобритании (Roslin Institute, Мидлотиан, Шотландия), где она и родилась 5 июля 1996 года. Клонирование произвела группа учёных, возглавляемая Я. Уилмутом и К. Кэмпбелом. Пресса объявила о её рождении лишь через 7 месяцев — 22 февраля 1997 года (237). Прожив 6,5 лет, овца Долли умерла 14 февраля 2003 года.
Однако Уилмут и Кэмпбелл не были первыми. Возможность клонирования эмбрионов позвоночных впервые была показана в начале 50-х годов в опытах на амфибиях. Первый успех в индуцировании эмбрионального развития высшего организма путем пересадки ядра в яйцеклетку был получен американскими исследователями Бриггсом и Кингом в 1952 г. (137). Бриггс и Кинг разработали микрохирургический метод пересадки ядер эмбриональных клеток с помощью тонкой стеклянной пипетки в лишенные ядра (энуклеированные) яйцеклетки. Они получили лягушку из соматического ядра, пересаженного в яйцеклетку.
Бриггс и Кинг в 1952 г. пересадили ядро из клетки кишечного эпителия в яйцеклетку лягушки, лишенную ядра. Получился организм. Но здесь случились странности. Если ядро эпителиальной клетки бралось от взрослой лягушки, то новая особь останавливалась в своем развитии на уровне головастика. Если ядро бралось от головастика, то получалась взрослая лягушка (231). По сути, они были первооткрывателями, а не создатели Долли. Но более воспроизводимые результаты были чуть позже получены Гёдоном (164).
Большой вклад в эту область внес английский биолог Гёдон (164). Он первым в опытах с южноафриканскими жабами Xenopus laevis в качестве донора ядер использовал не зародышевые клетки, а уже вполне специализировавшиеся клетки эпителия кишечника плавающего головастика (162). Ядра яйцеклеток реципиентов он не удалял хирургическим путем, а разрушал ультрафиолетовыми лучами. В большинстве случаев реконструированные яйцеклетки не развивались, но примерно десятая часть их них образовывала эмбрионы. 6,5 % из этих эмбрионов достигали стадии бластулы, 2,5 % — стадии головастика и только 1 % развился в половозрелых особей. В последующих работах как сам автор, так и многие другие исследователи не смогли подтвердить данные этих первых опытов.
Позже Гёдон модифицировал эксперимент (163). Поскольку большинство реконструированных яйцеклеток (с ядром клетки кишечного эпителия) погибают до завершения стадии гаструлы, он попробовал извлечь из них ядра на стадии бластулы и снова пересадить их в новые энуклеированные яйцеклетки (такая процедура называется “серийной пересадкой” в отличие от “первичной пересадки”). Число зародышей с нормальным развитием после этого увеличивалось, и они развивались до более поздних стадий по сравнению с зародышами, полученными в результате первичной пересадки ядер.
Таким образом, во многих работах показано, что в случае амфибий донорами ядер могут быть лишь зародыши на ранних стадиях развития. Опыты с амфибиями показали, что ядра различных типов клеток одного и того же организма генетически идентичны и в процессе клеточной дифференцировки постепенно теряют способность обеспечивать развитие реконструированных яйцеклеток, однако серийные пересадки ядер и культивирование клеток in vitro (в пробирке) в какой-то степени увеличивает эту способность.
Некоторые авторы называют подобные эксперименты клонированием амфибий, хотя правильнее называть их клонированием эмбрионов амфибий, так как в этом случае мы размножаем бесполым путем не взрослых животных, а зародышей.
Сама по себе идея клонирования Долли была проста — берется яйцеклетка того же самого вида и в нее пересаживается ядро соматической клетки (141, 237). Ядро клетки молочной железы было пересажено в яйцеклетку, у которой было удалено ее собственное ядро. Было проведено 277 экспериментов и все неудачные, кроме последнего. В процессе «создания» Долли, в 277 яйцеклеток были перенесены ядра, взятые из вымени животного-донора. Из них образовалось 29 эмбрионов, один из которых, Долли, выжил. Успешным был как раз тот эксперимент, где клетки молочной железы содержались в условиях резкой нехватки питательных веществ, что вызвало почти что апоптотическую (когда клетка убивает сама себя) трансформацию ядра.
В популярной литературе имеются искажения того, что на самом деле было сделано. Например, считается, что из яйцеклетки второй "мамы" было удалено ядро. Вместо него в яйцеклетку поместили ядро из клетки молочной железы "мамы" номер один. Полученный гибрид пересадили в матку третьей приемной "мамы". Рожденная от нее Долли явилась точной генетической копией первой овцы. Здесь все три утверждения не верны. 1. Поместили не одно ядро, а слили клетки. Для Долли, однако, не стали пересаживать ядро, а просто индуцировали слияние яйцеклетки с соматической клеткой, которая долгое время подвергалась голоданию, с помощью электрического импульса. Если пересаживать только ядро, то надо было добиваться пересадки и центриоли (182). При этом клетки культивировали в среде с резко пониженной концентрацией сыворотки крови, видимо, клетки при этом готовились к апоптозу (самоубийству).
Тем самым моделировалось поведение ДНК в сперматозоиде. 2. Скорее всего, в качестве источника ядра была взята не соматическая клетка от животного, а стволовая клетка из молочной железы взрослой овцы и уже из нее произошла та клетка, которую использовали после долгого выращивания в культуре клеток. 3. Долли — это не точная генетическая копия, а результат взаимодействия точно того же набора нуклеотидов, что и у первой генетической мамы, и наследственных факторов цитоплазмы от второй мамы — продуцента яйцеклетки.
Не правильно журналисты описывают и приоритеты. Первым ученым, который в 1986 г. опубликовал результаты клонирования млекопитающих, был эмбриолог С. М. Уиллэдсен (236). Он предложил вместо клеток раннего эмбриона, куда раньше пересаживались ядра соматических клеток при создании клонов, использовать яйцеклетку (235).
До клонирования Долли уже предпринимались попытки создать полноценные клоны. Среди них — овцы Мэган (англ. Megan) и Мораг (англ. Morag), созданные той же группой исследователей из эмбриональных клеток (а не клеток взрослых животных). Статья о них была опубликована в журнале Природа (Nature) в 1996 г. (141). Вскоре после Долли из клеток взрослых животных удалось вырастить мышь, козу, свинью, корову, кошку.
Работа с реконструированными яйцеклетками крупных домашних животных, коров или овец, идет несколько по-другому. Их сначала культивируют не in vitro, а in vivo — в перевязанном яйцеводе овцы — промежуточного (первого) реципиента. Затем их оттуда вымывают и трансплантируют в матку окончательного (второго) реципиента — коровы или овцы соответственно, где их развитие происходит до рождения детеныша. Уилэдсен предложил заключать реконструированные яйцеклетки в агаровый цилиндр, который он затем трансплантировал в перевязанный яйцевод овцы (235). Культивирование соматических клеток в среде с резко пониженным содержанием сыворотки крови оказалось несущественным элементом метода (231).
Далее метод включает следующие этапы (231). 1. Удаление ядра из яйцеклетки с помощью микропипетки. 2. Внедрение в цитоплазму оставшейся яйцеклетки ядра соматической клетки (сейчас принята другая методика, которая оправдала себя в случае с Долли — соматическая клетка с помощью микроманипулятора помещалась под блестящую оболочку и затем под воздействием электрического импульса обеспечивалось ее слияние с яйцеклеткой). 3. Активация полученной зиготы с целью стимулировать ее деление. Для этого на зиготу воздействуют таким образом, чтобы вызвать повышение концентрации ионов кальция в ее цитоплазме. Кроме того с помощью лекарств блокируется синтез белков. 4. Культивирование в пробирке начавшего делиться эмбриона. 5. Подсадка эмбриона суррогатной матери.
Если при манипуляциях с яйцеклеткой сохраняется ее блестящая оболочка, состоящая из внеклеточного вещества, то соматическая клетка просто внедряется в пространство между плазматической мембраной безъядерной яйцеклетки и блестящей оболочки и затем вызывается с помощью определенного электрического импульса слияния яйцеклетки и соматической клетки. Затем повышают содержание ионов кальция в цитоплазме зиготы и добавляют блокаторы синтеза белка. Эти два стимула достаточные для того, чтобы заставить зиготу делиться (дробиться).
Проверка способности ядер разных соматических клеток (взятых от разных тканей, а их около 200 у человека) обеспечивать создавать после пересадки в лишенную ядра яйцеклетку создание целого организма обнаружила, что только около 12 тканей из 200 обладают этими свойствами, то есть их ДНК дифференцирована (изменена в процессе созревания) обратимо (231).
Пока выход положительных результатов очень невелик. Поскольку в серии опытов с клетками молочной железы из 277 реконструированных яйцеклеток был получен только один живой ягненок, то это говорит об очень низкой результативности такого рода экспериментов (0,36 %). Что касается этической стороны дела, клонирование человека вызывает еще больше возражений. Во-первых, становление человека как личности, базируется не только на биологической наследственности, оно определяется также семейной, социальной и культурной средой. При клонировании индивида невозможно воссоздать все те условия воспитания и обучения, которые сформировали личность его прототипа (донора ядра).
С момента рождения Долли биологи создали массу самых разнообразных зверей. В 2009 году на свет появились "копии" буйвола, козы и верблюда. В Америке клонирование собак вообще поставили на поток. Но, по сути, Долли не является клоном. Клоном является группа организмов, имеющих идентичный геном, после бесполого размножения от одного предшественника. Долли имеет другие генетические факторы цитоплазмы, не такие как ее генетическая мама, от которой взято соматическое ядро. Долли — это генетическая копия.
IV.1. ДОЛЛИЕВЫ ПРОБЛЕМЫ
Опыты на Долли показали, что геном млекопитающих не подвергается необратимым изменениям во время клеточной и тканевой дифференцировки и эмбрионального развития.
Цитоплазма обычной клетки не может обеспечить развития целого организма (231, 238), а у растений может, но нужны направители и индукторы в виде гормонов или других клеток. Но главным лимитирующим фактором является видовая специфичность. С яйцеклетками, взятыми от другого вида животных клонирование не получается. Другой вид, даже с тем же числом хромосом, видимо, не работает, так как там цитоплазматические факторы не прошли тест на "негибридизационность", как это делается во время видообразования. Кроме того однотипные гены у другого вида могут располагаться в разных хромосомах.
Однако сам по себе метод вызывает множество вопросов. Конечно, при этих очень грубых манипуляциях с яйцеклеткой теряется часть цитоплазмы яйцеклетки, при удалении ядра яйцеклетки остается часть ее ДНК или наоборот засасывается в микропипетку и удаляется избыточная часть цитоплазмы яйцеклетки. Куски оставшейся ДНК могут захватываться в новые ядра, которые формируются во время деления, а точнее дробления, оплодотворенной яйцеклетки, которая после оплодотворения носит название зиготы. Это потом ведет к нарушениям в реализации программы развития. В яйцеклетке остается масса мРНК от прошлого хозяина. Здесь возможна молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот. В яйцеклетке остается белковая наследственность от предыдущего животного. Именно этим, по-видимому, объясняется очень малая воспроизводимость получения гибридов млекопитающих из соматических клеток.
По сути, долгое время (277 опытов) авторы искали соматическую клетку, которая пройдет фильтр эмбриогенеза. Все остальные не прошли, комбинация генов оказалась нежизнеспособной из-за накопления невидимых или видимых, то есть затрагивающих жизненные функции белков мутаций. Исследователи брали ядро из соматической клетки после ее долгого голодания (старвации), когда из-за отсутствия питательных веществ (неблагоприятных факторов), видимо, вся ДНК оказывалась спирализированной, как в ядре сперматозоида. Только тогда система реагировала на условия яйцеклетки, где после внедрения ядра со спирализованной ДНК, вся ДНК "расспирализировалась" и гены проверялись на соответствие друг другу. Если хотя бы одна часть из-за метилирования ДНК не спирализировалась, то этот участок избегал контроля и мешал развитию, или же вообще исключался и клетке не хватало части генов, который был заключен в данном участке.
Долли быстрее состарилась и объяснения этому феномену у генетиков нет. Одной из возможных причин могут быть гибридизационные осложнения, связанные с комплементарным склеиванием мРНК. Гибридизационный механизм легко объясняет преждевременное старение Долли. Старение овечки Долли могло быть вызвано мутациями, которые не нарушали состав белковых молекул, но нарушали функцию мРНК. Тот факт, что овечка Долли быстро состарилась, как раз и говорит о том, что соматические клетки накопили массу мутаций, которые не изменили ни одного признака, но ускорили старение. То есть овечка Долли ещё раз показала огромную роль эпигенетических факторов в наследовании.
Недавно было продемонстрировано (181), что мыши женского пола, появившиеся на свет при помощи комбинации двух материнских генов без отца, живут значительно дольше, чем нормальные мыши с комбинацией материнских и отцовских генов. Мыши, не имевшие отцовских генов были выращены из клеток, геном которых формировался из полностью созревшей яйцеклетки одной мыши и из нерастущей яйцеклетки новорожденной мыши. Мышь, порожденная с помощью оплодотворения мыши модифицированными генами другой женской особи, прожила в среднем на 186 дня дольше, чем мышь, возникшая при помощи нормальной комбинации женских и мужских генов. Средний срок жизни мышей, использовавшихся в исследовании, составляет 600700 дней, то есть, модифицированная мышь прожила практически на треть дольше, чем обычная. Одной из интерпретаций данного эксперимента может быть утверждение, что не мужские гены плохи, а хороши гены, взятые у новорожденной особи.