Транспорт веществ в клетке является центральным процессом, объединяющим многие клеточные события и поэтому я надеюсь, что его описание будет полезно не только для иллюстрации того факта, что связь между геном и признаком опосредована множеством ступеней и белковых систем, но и представит интерес для тех, кто просто интересуется биологией клетки. Тем более, что изложенные в российских учебниках сведения о том, как этот процесс организован в клетке, уже значительно устарели. Большинство сведений, которые были использованы при написании данного раздела, я взял из новейшей книги Миронова и Павелки про пластинчатый аппарат Гольджи и внутриклеточный транспорт (200). Кроме того я пользовался имеющимися русскоязычными работами (8, 76, 104, 105, 1 10).

В клетке существует несколько транспортных путей для активного перемещения клеточных органелл от одного места в клетке к другому. Они основаны на работе микротрубочек и актиновых микронитей, состоящих из белка актина и взаимодействующих с белком миозином. Микротрубочки — это как бы канаты, которые постоянно полимеризуются, а потом снова распадаются на отдельные первичные кирпичики-блоки. В виде канатовидных полимеров они используются в качестве рельс для передвижения по ним специальных моторных белков с прикрепленными к ним органеллами или агрегатами белков.

Микротрубочки и актиновые нити могут служить для перемещения органелл, например, митохондрий, пластид, пигментных гранул и др. в ответ на внешние стимулы. Кроме того они задействованы в перемещении синтезированных или поглощенных извне белков и липидов в те места, где они подвергаются конечной обработке, выполняют свои функции или выделяются в окружающую клетку среду (Я здесь не касаюсь поглощения веществ клеткой путем их диффузии через плазматическую мембрану). Эта часть транспортных путей и называется секреторными транспортным путями.

Липиды, большая часть белков, интегрированных в липидные мембраны, белки, которые клетка выделяет во окружающую среду, а также белки, которые остаются в просвете органелл, синтезируются в эндоплазматической сети. Среди белков, которые могут покинуть пределы эндоплазматической сети, можно выделить так называемые растворимые "просветные" (то есть располагающиеся внутри просвета) белки, мембранные белки, то есть белки, у которых один из участков располагается внутри липидного двойного слоя, а также белки, ассоциированные с мембраной эндоплазматической сети со стороны внутреннего просвета. Кроме того со стороны цитоплазмы к мембранам эндоплазматической сети могут приклеиваться белковые молекулы, которые синтезированы в цитоплазме, на рибосомах, которые не были присоединены к эндоплазматической сети.

При этом часть растворимых и мембранных белков не может покинуть эндоплазматическую сеть. Это либо белки, которые предназначены для обеспечения работы самой эндоплазматической сети, либо белки, не отвечающие критериям качества сборки. У первых из них есть специальные механизмы для того, чтобы задерживаться здесь — они не покидают ее пределы, так как у них есть сигналы, которые либо ведут к возврату молекулы, если она покинула пределы сети, либо к приклеиванию к другим белковым агрегатам или другим нетранспортируемым структурам, включая липидные мембраны. К таким белкам относится, например, белок Сек61 и другие ассоциированные с ним мембранные и растворимые люминальные (находящиеся в просвете и не имеющие связей с мембраной) белки, которые обеспечивают проникновение белков, синтезированных на мембранно-ассоциированных рибосомах, в просвет вакуолей и трубок эндоплазматической сети. Обычно белки, функционирующие на уровне эндоплазматической сети, образуют агрегаты с участием ионов кальция или имеют механизмы, которые обеспечивают возврат белков, если эти белки выходят из эндоплазматической сети.

Некоторые белки удерживаются в эндоплазматической сети и аппарате Гольджи в качестве постоянных компонентов. Белок-рецептор SRP встречается только в мембране эндоплазматической сети, а ферменты, обрабатывающие, олигосахариды, расположены только в мембранах определенных цистерн Гольджи и т. д. Это связано с наличием специальных сигналов сортировки для каждого этапа продвижения продукта через эндоплазматический ретикулум и АГ. Каждый постоянный компонент эндоплазматической сети. АГ, других органелл по ходу секреторного и эндоцитозного пути должен иметь специальный сигнал, отвечающий за его сохранение в этом компоненте мембраны эндоплазматической сети и каждого типа цистерн АГ должны иметь специальные механизмы для сохранения своей уникальности. Сигналы могут быть двух типов, удерживающие и возвращающие. В первом случае белок прикрепляется к какой-нибудь структуре, или использует какое-нибудь свойство данного участка органеллы для того, чтобы из него никуда не двигаться. Во втором случае, белок использует механизмы, обеспечивающие его возврат назад — рециклирование.

Наконец, молекула белка может покинуть пределы эндоплазматической сети только после того, как она прошла контроль правильности своей трехмерной упаковки (что часто включает такие начальные этапы как Н-гликозилирование с образованием цепочки моносахаров и ее последующим частичным обрезанием). Если молекула не отвечает критериям качества, то она задерживается в сети.

 

V.1. ТРАНСПОРТ МЕЖДУ ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ СЕТЬЮ И АППАРАТОМ ГОЛЬДЖИ

На участке транспорта от эндоплазматической сети к аппарату Гольджи можно выделить три этапа: 1) собственно выход из эндоплазматической сети, 2) централизация и доставка к аппарату Гольджи и 3) вход в него.

Для того чтобы выйти из эндоплазматической сети, белки и липиды используют так называемые места выхода из эндоплазматической сети. Эти участки выхода имеют своеобразное строение. В области выходов из эндоплазматической сети имеются так называемые «тубулярно-везикулярные кластеры» (200). Это совокупность трубчатых и везикулярных структур. На цистерне (в наших аналогиях — макаронине) гранулярной (покрытой рибосомами) эндоплазматической сети имеются мембранные почки. Рядом находятся несколько анастомозирующих трубок и пузырьков. Пузырьки довольно редкие. Они имеют диаметр 60–70 нм и, как правило, их мембрана не имеет выраженного белкового покрытия.

Трубки часто содержат локальные сферические расширения. Иногда на цистерне макаронины, то есть эндоплазматической сети, образуется мембранная почка. Эта почка имеет хорошо заметное под электронным микроскопом белковое покрытие. Покрытие формируется коатомером-2, образует сплетение типа такого, что было на советской сетке-авоське, сплетенной из веревок. Только отверстия, образуемые покрытием, шестиугольные и пятиугольные. Если мячик поместить в такую авоську и положить на стол, то он будет похож на подобную мембранную почку, на которой имеются выступающие перемычки, образующие сетчатый рисунок на поверхности мяча. Рисунок веревок состоит из шестиугольников и пятиугольников, что соответствует рисунку футбольной камеры.

 

V.2. МЕХАНИЗМЫ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ ПРИ ВЫХОДЕ ИЗ ЭР

Для увеличения эффективности работы системы перед выходом из эндоплазматической сети мембранные белки подвергаются концентрированию. Все экспортируемые из эндоплазматической сети мембранные белки делятся на такие, которые подвергаются концентрированию на выходе из эндоплазматической сети и те, что концентрированию не подвергаются или этот процесс происходит уже в аппарате Гольджи.

Одним из непременных условия для эффективного концентрирования мембранных белков в эндоплазматической сети является их способность образовывать димеры или тримеры, то есть склеиваться попарно или по трое. Склеивание происходит, как правило, в области того участка белка, который обращен в просвет вакуоли эндоплазматической сети (то есть внутрь нашей макаронины). Та же часть аминокислотной цепи, которая обращена в цитоплазму имеет небольшие участки, которые способны приклеиваться к мелким единицам, образующим коатомер-2.

Коатомер-2 составлен из 5 субъединиц, 4 из которых в свою очередь попарно склеены. Сек23 склеен с Сек24. Сек13 склеен с Сек31. В приклеивании экспортируемого белка к коатомеру 2 участвует небольшой белок Сар1 п, который способен гидролизировать (расщепить) ГТФ. Он бывает в двух состояния: 1) когда к нему приклеена ГДФ, 2) когда к нему приклеена ГТФ. В первом случае он не приклеивается к мембране. Во втором его трехмерная структура изменяется и он стремится приклеиться к мембране эндоплазматической сети. После его приклеивания к мембране он также склеивается с парой Сек23-Сек24, а та, в свою очередь, присоединяется к нашему экспортируемому мембранному белку.

Приклеивание экспортируемого мембранного белка к комплексу, состоящему из Сар1п и Сек23/24, ведет к тому, что последняя белковая пара склеивается также с парой Сек13-Сек31. Образуется линейный гетерополимер, состоящий и следующей цепи разнородных мономеров: белок/Сар1 п/Сек23/Сек24/Сек13/Сек31. Сек31 может приклеиваться к другой такой же цепи. В результате образуется полимер, который не только состоит из разных белков, но так же, как нитка при прошивании ткани, ныряет туда и обратно через мембрану: просветная часть нашего белка — трансмембранный участок (проход через мембрану) — участок, смотрящий в цитоплазму — Сар1 п — Сек23 — Сек24 — Сек13- Сек31 — Сек31-Сек13 — Сек24 — Сек23 — Сар 1 п — цитоплазматический участок — трансмембранный участок (обратный проход через мембрану) — просветный участок — (где имеется склеивание двух молекул нашего белка) просветный участок — трансмембранный участок и т. д. В результате экспортируемые мембранные белки оказываются включенными в эти длинные полимеры, которые могут ветвиться. Тем самым мембранные белки подвергаются концентрированию.

Возникающие гетерополимеры и приводят к тому, что экспортируемые мембранные белки концентрируются в месте выхода из эндоплазматической сети. Сходным образом осуществляет концентрирование белков-СНАРЕ. Таким образом, белки СНАРЕ и экспортируемые белки в зонах выхода из эндоплазматической сети имеют более высокую концентрацию, чем в остальных участках эндоплазматической сети.

Когда наш белок сконцентрирован, начинается процесс удаления покрытия. При этом пара: Сек13-Сек31 активирует пару

Сек23-Сек24. Она в свою очередь активирует Сар 1 п, который без этой активации может гидролизировать ГТФ, но делает это очень и очень медленно. В результате Сар1 п отщепляет фосфорный остаток от ГТФ, лишается способности заякориваться в мембране и все покрытие распадается и отщепляется от мембраны. Но наш белок уже сконцентрирован в сравнительно изолированной мембранной структуре, что мешает его обратной диффузии в цистерны эндоплазматической сети.

 

V.3. КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ РАСТВОРИМЫХ СЕКРЕТИРУЕМЫХ И ЛИЗОСОМНЫХ БЕЛКОВ

Несколько по-другому происходит концентрирование растворимых секретируемых белков или проферментов лизосом, предназначенных для переноса в лизосомы. Как же достигается концентрирования растворимых белков, предназначенных на экспорт из эндоплазматической сети?

Секретируемые белки и ферменты лизосом имеют сигнальную последовательность, которая отрезается при проходе цепи аминокислот через мембрану эндоплазматической сети. Затем растворимые белки либо получают свои моносахаридные цепочки, либо нет и свертываются в глобулярные или овоидные структуры так, чтобы убрать внутрь гидрофобные аминокислоты и обеспечить наиболее оптимальное выполнение функции данным белком. После контроля правильности упаковки они получают возможность выйти из эндоплазматической сети.

Как и в случае мембранных белков, секретируемые просветные белки могут концентрироварться на уровне выходов из эндоплазматической сети или на уровне аппарата Гольджи. Например, такие как белки, секретируемые клетками печени альбумин и альфа-анти-трипсин, не концентрируются существенным образом на уровне выходов из эндоплазматической сети, но концентрируются во время прохода через аппарат Гольджи. Напротив, белки амилаза или химотрипсиноген концентрируются как на уровне выхода из цитоплазматической сети, так и на уровне аппарата Гольджи.

Концентрирование секретируемых белков и предшественников ферментов лизосом основано на особенностях физико-химических свойств данных белков. Суть концентрационного механизма с помощью закисления раствора можно проиллюстрировать, если вспомнить, как устроен белок. Как известно, белок состоит не только из нейтральных аминокислот, но также из большого количества аминокислот несущих отрицательный или положительный заряд в водной среде. Если в среду добавить избыток протонов, то некоторое время рН среды меняться не будет, поскольку избыток протонов вначале будет поглощаться отрицательными зарядами белка, которые тем самым нейтрализуются. Именно поэтому белки обладают свойствами буфера.

Разные белки имеют разное содержание аминокислот, которые содержат щелочные и кислотные группировки. Если в цепи больше аминокислот со щелочными группировками, то белок имеет свойства щелочи, если больше аминокислот с кислотными группировками, то белок имеет свойства кислоты. Гистоны очень щелочные белки, поэтому они и прочно связываются с нуклеиновыми кислотами. Напротив, большая часть цитоплазматических белков имеет кислотный характер. Эту разницу использует клетка для концентрирования данных белков в переносчиках, которые функционируют на участке трассы эндоплазматическая сеть — пластинчатый аппарат Гольджи.

Нейтрализованные белки могут агрегироваться в растворе с низким рН. Другим механизмом концентрирования может быть кальций, концентрация которого в эндоплазматической сети и особенно в просвете цистерн аппарата Гольджи существенно повышена. В таком случае, концентрирование белков на выходе из эндоплазматической сети может быть легко объяснено с помощью концентрирования мембранных белков-насосов протонов в местах выходов из эндоплазматической сети. Поскольку каждый данный белок имеет свое значение pI, точки при которой он становится нейтральным, то можно предположить, что разные белки имеют разную чувствительность к разным значением рН. Одни начинают агрегировать уже при минимальном закислении раствора, другие требуют более значительного снижения рН.

Начальная стадия концентрирования белков в соответствии с механизмом рН-зависимого агрегирования происходит в специальных участках эндоплазматической сети, расположенных рядом с трубчатыми сплетениями или непосредственно в них. В этих зонах с помощью коатомера-2 концентрируются белки-переносчики протонов. Коатомер-2 выполняет поэтому не только функцию концентратора мембранных белков (двоек-диметров или троек-тримеров), но и участвует в концентрировании в зоне выходных мест также таким белков, как ионные насосы.

С помощью энергии макроэргов протоны накачиваются этими белками-насосами в просвет данного участка эндоплазматической сети. Если же в зоне выхода из эндоплазматической сети поставить насос, который прокачивает ионы водорода из цитоплазмы в просвет вакуоли, то в просвете вакуоли будет чуть большая кислотность. Поэтому белки, содержащие больше кислотных остатков, будут здесь осаждаться, то есть концентрироваться, особенно если вход в зону с кислой средой очень узкий и пропускающий только белки в мономерной форме и не пропускающий их, если они образуют более крупные агрегаты. Например, альбумин, наиболее распространенный белок крови, имеет тенденцию к агрегации в кислой среде и он поэтому концентрируется в дисках пластинчатого аппарата Гольджи. То же самое происходит с коллагеном, основным белком соединительной ткани.

Закисление среды ведет к снижению отрицательного заряда секретируемых белков и их агрегации в просвете данного сегмента цистерны эндоплазматической сети или трубчатого сплетения. Затем данный участок вычленяется из цистерны эндоплазматической сети и превращается в переносчик готовый к транспорту по направлению к аппарату Гольджи. Экспортируемый белок оказывается в почти готовых мембранных переносчиках, вагончиках, которые затем должны доставляться к пластинчатому аппарату Гольджи.

Итак, на уровне мест выхода происходит коатомер-2 зависимое прямое концентрирование мембранных белков и непрямое, с участием ионных насосов, концентрирование некоторых растворимых белков. Часть белков на местах выхода не концентрируется, они концентрируются уже в области пластинчатого комплекса. Концентрация экспортируемых белков внутри переносчиков имеет большой биологический смысл — концентрирование мембранных белков в переносчиках резко увеличивает эффективность транспорта и позволяет клетке не возить воду.

 

V.4. ВЫХОД ИЗ ЭР

Итак, мы оставили наш созревающий переносчик-вагончик, который содержал повышенную концентрацию растворимых и мембранных белков, около выхода из эндоплазматической сети. После того, как экспортируемый белок сконцентрируется в области выхода из эндоплазматической сети, образуются зрелые переносчики. Они имеют форму либо дисков, либо уплощенных цилиндров неправильной формы. Их особенностью является большая, чем в других вакуолях остальной эндоплазматической сети, концентрация экспортируемых белков. Кроме того в переносчиках происходит концентрирование белков СНАРЕ, ответственных за слияния органелл секреторного пути. После завершения созревания переносчика от него отщепляется коатомерное-2 покрытие. После концентрирования и созревания наш переносчик готов к отправке в сторону аппарата Гольджи.

Если пластинчатый аппарат Гольджи располагается недалеко от созревшего переносчика, то велика вероятность, что расположенные на переносчике и на ближайшей части дисков пластинчатого комплекса белки СНАРЕ дотронутся друг до друга во время их свободной диффузии и склеятся. После этого начинается скручивания этих четырех молекул, образующих так называемый комплекс СНАРЕ (см. ниже). Если же аппарат Гольджи располагается в центре клетки, а переносчики формируются на периферии, то требуется централизация переносчиков. Для этого клетка имеет специальные механизмы.

В области аппарата Гольджи имеется особое трехмерное сплетение, образованное из анастомозирующих между собой трубок. Когда аппарат Гольджи отдыхает, данное трубчатое сплетение отсоединяется от стопки дисков, напротив, когда пластинчатый комплекс активно функционирует, то часть тубулярного сплетения становится плоской и в виде резко перфорированного диска приклеивается к начальному (цис) полюсу стопки дисков. Данное трубчатое сплетение содержит внедренные в свою мембрану моторные белки: кинезин и динеин. Первый, используя энергию гидролиза АТФ, может двигаться по микротрубочкам от центра к периферии. Второй, используя тот же принцип, может двигаться наоборот, от периферии к центру. Для того, чтобы осуществить централизацию вагончиков, то есть доставить белок к центру клетки, необходимо какое-то мембранное слияние.

Используя этот моторный белок, кинезин трубчатое сплетение, расположенное в начала пластинчатого комплекса (так называемая сеть на цис стороне), посылает трубчатые выросты в сторону созревшего переносчика. Эти трубки на своем слепом конце содержат увеличенную концентрацию СНАРЕ. Попадая в переносчик, который расположен, как правило, около микротрубочки, растущие мембранные трубки сливаются с ним и тем самым доставляют на его мембрану динеин. Теперь динеин активируется на мембране переносчика и тащит переносчик по направлению к пластинчатому комплексу, как бы шагая по микротрубочке с помощью энергии АТФ.

Постепенное созревание переносчика на эндоплазматической сети может приводить к тому, что он присоединяет к своей мембране специальный белковый комплекс, включающий моторный белок динеин, который с участием гидролиза АТФ быстро перемещает мембранный переносчик вдоль микротрубочки по направлению к центросоме, вокруг которой расположен пластинчатый комплекс. При этом связь переносчика с цистерной эндоплазматической сети может не прерываться, что ведет к вытягиванию вслед за данной органеллой тонкой мембранной трубочки эндоплазматической сети, которая может существовать какое-то время и после прибытия переносчика к аппарату Гольджи. Это объясняет, почему в ряде работ обнаружена прямая мембранная связь между эндоплазматическим ретикулумом и пластинчатым комплексом. На сверхбыстро замороженных, а затем замещенных в замороженном состоянии клетках были убедительно продемонстрированы непрерывные соединения между эндоплазматическим ретикулумом и пластинчатым комплексом.

Скорость перемещения переносчиков от эндоплазматической сети к АГ составляет около 1 мкм/с, причем перемещение часто осуществляется возвратно-поступательно с преобладанием суммарного перемещения к аппарату Гольджи. Прибыв к АГ, переносчик сливается с цистернами средней части этого пластинчатого комплекса. Тем самым переносчик доставляется к пластинчатому комплексу. Здесь он сливается с самым начальным (ближе к цис стороне) диском. Слияние обеспечивается тем фактом, что переносчик содержит увеличенную концентрацию белков СНАРЕ.

 

V.5. СОВРЕМЕННАЯ МОДЕЛЬ ТРАНСПОРТА БЕЛКОВ ЧЕРЕЗ АГ

Сформированный переносчик сливается с трубчатой сетью, расположенной на цис-стороне стопки пластинчатого комплекса и оказывается включенным в состав этой сети. После слияния с другими мембранами цис-сплетения, экспортируемые белки оказываются в цис-тубулярное сплетении. Тем самым переносчик оказывается соединенным с двумя первыми цистернами Гольджиевой стопки цистерн. При этом в составе цис-тубулярного сплетения можно обнаружить два мембранных участка. В одном концентрируется секретируемый белок или мембранных экспортируемый белок, в другом этих белков нет и находятся там белки отдела, что расположен перед аппаратом Гольджи. После того, как происходит слияние мембранного домена, содержащего секретируемый или экспортируемый белок с цистернами среднего отдела Гольджи, происходит выход ионов кальция из рядом лежащих цистерн эндоплазматической сети и из мешочков аппарата Гольджи.

Следующим этапом транспорта является слияние мембранного домена, заполненного переносимыми белками, с так называемым средним отделом аппарата Гольджи. Когда вагончик, нагруженный экспортируемыми из эндоплазматической сети белками, оказывается полностью созревшим, требуется механизм, который бы его доставил к пластинчатому комплексу Гольджи. Если в клетке нет слияния стопок в единую ленту аппарата Гольджи, то обычно стопки пластинчатого комплекса располагаются в непосредственной близости от выходов из эндоплазматической сети. И для того, чтобы доставить вагончики к пластинчатому комплексу требуется наличие только белков, которые сближают мембраны друг с другом до такого малого расстояния, когда ионы кальция, соединяясь с заряженными головками липидов, вызывают слияние двух мембран. Эти белки называются СНАРЕ, я не буду здесь расшифровывать, почему они названы так, а не иначе, отмечу лишь, что для того, чтобы данные белки смогли осуществлять свою функцию, в мембрану одной органеллы должен был быть внедрен один из 4 белков, образующих функциональный комплекс, белок, который носит название Р-СНАРЕ. Остальные 3 белка (они называются Кью-СНАРЕ) должны быть сконцентрированы на другой из двух органелл, подвергающихся слиянию. Чем выше по эволюционной лестнице стоит организм, тем большее количество таких белковых квартетов существует в клетках. Если в дрожжах имеется только 6 или 7 таких квартетов, то у человека их число более 15.

Один из концов данных СНАРЕ-белков внедрен в липидный бислой мембраны, а другой свободно свисает в цитоплазму, простираясь на расстояние нескольких десятков нанометров. Когда свободный конец одного Р-СНАРЕ касается свободного конца сплетения из трех Кью-СНАРЕ, то они выстраиваются параллельно дуг другу, так, что свободные концы находятся на одной стороне, а заякоренные в мембрану концы — на другой. Затем они начинают скручиваться друг вокруг друга, образуя плотный перекрученный жгут. Тем самым заякоренные концы сближаются друг с другом. Поскольку выдергивание этих белков из мембраны энергетически невыгодно, то органеллы следуют за заякоренными концами белков и органеллы сближаются. Теперь достаточно небольшого увеличения концентрации ионов кальция для того, чтобы он связал две отрицательно заряженные головки молекул липидов из противостоящих органелл для того, чтобы органеллы слились друг с другом.

После доставки белка в пластинчатый комплекс Гольджи, так он подвергается дальнейшей модификации. Отдельные моносахара отрезаются от разветвленной начальной цепочки, полученной белком в эндоплазматической сети. Затем сахаридная цепь удлиняется за счет работы ферментов гликозидаз и гликотрансфераз, то есть ферментов, присоединяющих моносахара. Эти ферменты расположены в пластинчатом комплексе. Когда на конце сахаридной цепи оказываются сиалиловая кислота или моносахар, имеющий название фукоза, белок выходит из пластинчатого комплекса.

Как это происходит? Первым этапом является восстановление способности мембран Гольджи сливаться друг с другом, в частности способности к слиянию между мембранным доменом, заполненным транспортируемыми белками и цистернами срединного отдела. В условиях, когда транспорт через пластинчатый комплекс блокирован, равновесие между процессом образования КОП1 везикул и их слияния с цистернами пластинчатого комплекса сдвигается со стороны большего образования КОП1 везикул.

Пузырьки, образующиеся в результате активности коатомера-1, концентрируют в своем составе мембрин и ГОС28, два белка из СНАРЕ комплексов (которые оперируют на уровне аппарата Гольджи), принадлежащих к группе Qb. Удаление двух этих белков делает набор СНАРЕ, остающихся на цистернах, неадекватным для формирования СНАРЕ комплекса, а значит для слияния мембран. Напомним (см. выше), что любой СНАРЕ комплекс должен включать с себя 4 спиральные цепи, одну с аргинином в центре, а три других разного веса, но с глютамином в центре. Отсутствие хотя бы одной цепи делает формирование СНАРЕ комплекса невозможным и, следовательно, блокирует слияние мембран.

Через АГ проходит, по крайней мере, три потока синтезированных клеткой белков, предназначенных не для цитоплазмы: поток гидролитических ферментов в отдел лизосом, поток выделяемых белков, которые накапливаются в секреторных вакуолях, и выделяются из клетки только по получении специальных сигналов, поток постоянно выделяемых секреторных белков, потом мембранных белков для эндосом, лизосом и плазматической мембраны. Следовательно, должен быть какой-то специальный механизм пространственного разделения этих разных белков и их путей следования. В цис- и средних зонах стопки мембранных дисков все эти белки идут вместе без их разделения, хотя они и модифицируются раздельно в зависимости от их олигосахаридных маркеров.

После того, как белки и липиды, прибывшие и включенные в состав АГ, обработаны ферментами гликозидазами и их первичная сортировка осуществлена, они должны быть отправлены к 4 различным местам (Собственно разделение белков, их сортировка, происходит в так называемом пост-Гольджиевом сплетении и этот процесс расшифрован не до конца). Во-первых, они отправляются на базолатеральную плазматическую мембрану, которая и является основой плазматической мембраны в неполярных клетках. В полярных клетках наряду с базолатеральной (то есть расположенной в основании и по бокам клетки) существует и так называемая апикальная (или верхушечная) плазматическая мембрана, расположенная на верхушке клетки и смотрящая не в межклеточную среду организма, а вовне. Кроме этих двух станций назначения, часть белков и липидов направляются к эндосомам и лизосомам в составе специальных мембранных переносчиков. Переносчики транспортируют специальные высоко гликозилированные белки, способные в кислой среде противостоять действию агрессивных лизосомальных ферментов-гидролаз. Лизосомные ферменты переносятся от комплекса Гольджи до эндосом и лизосом с участием особого белка, называемого рецептором маннозо-6-фостата. Он концентрируется с помощью клатринового комплекса и адапторного комплекса один на мембранах и цистернах транс-сплетения. Но об этом ниже.

От АГ исходит поток переносчиков, связанный с постоянной, или так называемой конститутивной секрецией. Так фибробласты выделяют большое количество гликопротеидов и муцинов, входящих в основное вещество соединительной ткани. Многие клетки постоянно выделяют белки, способствующие связыванию их с субстратами, постоянно идет поток мембранных пузырьков к поверхности клетки, несущие элементы гликокаликса (полисахаридного покрытия клеток) и мембранных гликопротеидов. Этот поток выделяемых клеткой компонентов не подлежит сортировке в рецепторной транс-системе аппарата Гольджи. Первичные вакуоли этого потока также отщепляются от мембран и относятся по своей структуре к окаймленным вакуолям, содержащим клатрин.

Транспорт к базолатеральной плазматической мембране осуществляется следующим образом. После слияния с эндосомальным отделом транссети мембранный участок, содержащий секретируемый белок, превращается в транспортер, предназначенный для доставки белка к плазмалемме. При этом из после-Гольджиевого сплетения вытягивается трубочка по направлению к плазматической мембране. Образуются тубулярновезикулярные агрегаты, которые участием моторного белка кинезина перемещаются по микротрубочкам к плазмалемме и сливаются с ней с помощью соответствующих СНАРЕ-белков. Движение секретируемого белка вдоль трубочки будет выглядеть как перемещение светящегося шарика вдоль менее ярких светящихся, описанного на живых клетках. Наличие связи создает основу для ситуации, когда одна длинная эндосомальная или вытягиваемая трубочка может временно соединять плазмалемму и эндосому.

 

V.6. ЭНЗИМАТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ БЕЛКОВ И ЛИПИДОВ В АГ

В цис-зону аппарата Гольджи синтезированные в эндоплазматической сети белки попадают после первичного гликозилирования и редукции там же нескольких сахаридных остатков. В конечном итоге все белки там имеют одинаковые олигосахаридные цепи, состоящие из двух молекул N-ацетилглюкозамина, шести молекул маннозы. В цис-цистернах начинается вторичная модификация олигосахаридных цепей и их сортировка на два класса. В результате олигосахариды на гидролитических ферментах, предназначенных для лизосом (богатые маннозой олгосахариды), фосфорилируются, а олигосахариды других белков, направляемых в секреторные гранулы, или к плазматической мембране, подвергаются сложным превращениям, теряя ряд сахаров и присоединяя галактозу, N-ацетилглюкозамин и сиаловые кислоты. При этом возникает специальный комплекс олигосахаридов.

Такие превращения олигосахаридов осуществляются с помощью ферментов — гликозилтрансфераз, входящих в состав мембран цистерн АГ. Так как каждая зона в стопках имеет свой набор ферментов гликозилирования, то гликопротеиды как бы по эстафете переносятся из одного мембранного отсека (“этажа” в стопке цистерн диктиосомы) в другой и в каждом подвергаются специфическому воздействию ферментов. Так в цис-участке происходит фосфорилирование манноз в лизосомных ферментах и образуется особая маннозо-6-группировка, характерная для всех гидролитических ферментов, которые потом попадут в лизосомы.

В средней части диктиосом протекает вторичное гликозилирование секреторных белков: дополнительное удаление маннозы и присоединение N-ацетилглюкозамина. В транс-участке к олигосахаридной цепи присоединяются галактоза и сиаловые кислоты.

В аппарате Гольджи клеток животных происходит синтез длинных неразветвленных полисахаридных цепей глюкозаиногликанов. Один из них, гиалуроновая кислота, входящая в состав внеклеточного матрикса соединительной ткани, содержит несколько тысяч повторяющихся дисахаридных блоков. Многие глюкозаиногликаны ковалентно связаны с белками и образуют протеогликаны (мукопротеины). Такие полисахаридные цепи модифицируются в аппарате Гольджи и связываются с белками, которые в виде протеогликанов секретируются клетками. В аппарате Гольджи происходит также сульфатирование глюкозаиногликанов и некоторых белков.

В аппарате Гольджи растительных клеток происходит синтез полисахаридов матрикса клеточной стенки (гемицеллюлозы, пектины). Кроме того, диктиосомы растительных клеток участвуют в синтезе и выделении слизей и муцинов, в состав которых входят также полисахариды. Синтез же основного каркасного полисахарида растительных клеточных стенок, целлюлозы, происходит на поверхности плазматической мембраны.

Гликолитические ферменты аппарата Гольджи относятся к категории белков мембранных второго типа. Если мембранные белки первого типа отличаются тем, что их С-конец смотрит в цитоплазму, а N-конец в просвет пластинчатого комплекса, то белки второго типа характеризуются тем, что у них положение С- и N-концов противоположное. Их С-конец смотрит в просвет, а N-конец — в цитоплазму. Второй важной особенностью гликозидаз пластинчатого комплекса является тот факт, что их цитоплазматический конец очень короткий. Часто он представлен цепочкой из 5–7 аминокислот. Третьей особенностью вышеуказанных гликозидаз является наличие четких границ той гидрофобной зоны, которая погружена непосредственно в липидный бислой. Кроме того эта гидрофобная цепочка очень часто содержит ароматические аминокислоты, которые делают рельеф их гидрофобной поверхности очень неровным. Поэтому когда эти гидрофобные сегменты оказываются в липидном бислое, в котором много холестерола, делающего бислой упорядоченным, возникает энергетический дисбаланс, свободная энергия системы становится выше обычного и поэтому эти белки из такого липидного бислоя вытесняются.

Если посмотреть на концентрацию гликозидаз пластинчатого комплекса в мембранах Гольджи и сравнить с таковой в мембранах эндоплазматической сети, где они синтезируются, то разница в концентрации получится довольно внушительной — не менее 20 раз, а часто и больше. Это свидетельствует о том, что ферменты Гольджи концентрируются в пластинчатом комплексе с чрезвычайно высокой эффективностью. Хотя проведено значительное количество исследований, посвященных этому вопросу, тем не менее, ясности в этом вопросе нет. Прежде всего, оказалось, что для выхода из эндоплазматической сети гликозидазы требуют наличия фунции коатомера 2 (КОП2). Те 2 или 3 аминокислоты, содержащие щелочные остатки — это обычно аргинин или лизин — и расположенные сразу же за гидрофобным внутри мембранным сегментом, взаимодействуют с компонентами КОП2 и если эти аминокислоты удалить, то гликозидазы не могут покинуть цистерны эндоплазматической сети. Другим интересным свойством гликозидаз, расположенных большей частью в цистернах, которые прилежат к транс стороне стопки, является их зависимость их положения от длины, но не от аминокислотного состава, гидрофобного сегмента (важно, однако, чтобы аминокислоты, которые его образуют, были гидрофобными, а не гидрофильными).

Если с помощью методов молекулярной биологии длина этого гидрофобного сегмента, например у галактозил-трансферазы или сиалил-трансферазы, увеличивалась, то мутантный белок-гликозидаза покидала цистерны аппарата Гольджи и оказывалась на плазматической мембране. Более того, если длина гидрофобного трансмембранного сегмента сиалил-трансферазы чуть-чуть (важно, чтобы она была не меньше длины сегментов, погруженных в бислой липидов, у мембранных белков эндоплазматического ретикулума, который обладает наиболее тонкой мембраной, если это требование не выполняется, то белок просто не включается в мембраны и оказывается растворимым белком) уменьшалась, то новая измененная сиалил-трансфераза перемешалась ближе к цис-стороне аппарата Гольджи.

Последняя цистерна контактирует с эндосомами, имеющими существенно более высокую концентрацию холестерина. Это ведет к диффузии холестерина в транс цистерну, который вытесняет гликоферменты из данной цистерны в более проксимальную с менее толстой мембраной. Диффундируя по мембранам пластинчатого комплекса, холестерол может инициировать дестабилизацию тубулярной связи с эндоплазматической сетью, стимулировать процесс созревания цистерн и вытеснения из транс-цистерн остаточных количества резидентных (то есть располагающихся здесь) белков, что способствует превращению транс-цистерн в мембранные трубочки.

В клетках имеется четкая закономерность в ионных градиентах концентраций по ходу секреторного внутриклеточного пути. В вакуолях эндоплазматической сети имеется высокая концентрация ионов кальция, относительно низкая концентрация ионов водорода (рН = 7,1), низкая концентрация ионов калия и хлора, низкая концентрация ионов натрия. В пластинчатом комплексе Гольджи, особенно на его транс стороне, увеличивается концентрация ионов водорода и снижается концентрация ионов кальция. В эндосомах, через которые проходят переносчики, транспортирующие белки от пластинчатого комплекса по направлению к плазматической мембране, имеется низкая концентрация ионов кальция, высокая концентрация ионов водорода, увеличена концентрация ионов натрия и хлора. Наконец, в окружающей внеклеточной среде, куда доставляются (секретируются) белки из переносчиков, имеется высокая концентрация ионов кальция, низкая концентрация инов водорода (рН = 7,4), высокая концентрация ионов хлора и натрия и низкая концентрация ионов калия. Как клапаны, то открываются, то закрываются.

Работу пластинчатого комплекса можно сравнить с работой грудного лимфатического протока. Как известно, человек — прямоходящее животное. У него имеется особая система циркуляции жидкости, которая накачивает ее в вертикальном положении от уровня пальцев на ногах, до уровня ключиц. При этом лимфатические сосуды по которым движется эта жидкость лимфа, имеют очень слабые тонкие стенки. Эти стенки не выдержали бы давления столба жидкости высотой 1,5 метра. Более того на ногах нет насоса, который бы мог преодолеть такое давление водного столба. Тем не менее, даже когда человек стоит, лимфа спокойно течет из ног по направлению к началу шеи и сосуды не лопаются. Что же обеспечивает поднятие жидкости на высоту 1,5 метра?

Все дело в том, что столб жидкости разбит на несколько последовательно расположенных друг за другом, а точнее один на другом сосудов. Сегменты сосудов отделены друг от друга клапанами, которые не дают лимфе течь вниз. Теперь представим, что все сегменты лимфатического протока заполнены лимфой. Вначале слабые мышечные клетки, расположенные в стенке самого верхнего сегмента, сокращаются. Давление в сегменте повышается, клапан, ведущий в нижний сегмент, закрывается. Верхний же клапан, ведущий в полую вену, открывается и лимфа из самого верхнего сегмента вытекает в вену. Для преодоления такого невысокого столбика жидкости сил у мышечных клеток хватает. В результате самый верхний сегмент лимфатического протока опорожняется. Затем происходит сокращение мышц следующего за самым верхним сегмента, который расположен сразу под самым верхним. Давление в нем повышается и клапан, ведущий вниз, закрывается, а клапан, который был закрыт и ведет в самый верхний сегмент, открывается и жидкость из второго сегмента выдавливается в самый верхний сегмент. Затем сокращаются мышечные клетки третьего с верху сегмента. Клапан, ведущий в нижележащий сегмент, закрывается, а клапан, ведущий во второй с верху сегмент, открывается. Лимфа оказывается во втором сегменте. И так далее. В результате такой конструкции удается без проблем поднимать лимфу на высоту 1,5 метра без особых усилий. Нужна только координация в последовательности сокращений мышц.

Попробуем применить данную конструкцию к пластинчатому комплексу Гольджи. Гидростатическое давление в лимфатическом протоке аналогично концентрационному градиенту. Роль клапанов выполняют тонкие трубочки, соединяющие диски пластинчатого комплекса. Представим себе, что с помощью особого механизма мы блокируем выход экспортируемых белков из эндоплазматической сети. В этот момент, когда пластинчатый комплекс не заполнен транспортируемыми белками, в нем продолжается накачка ионов водорода в просвет последнего диска, располагающегося на транс стороне. Из-за постоянного образования и размыкания соединительных трубочек между дисками в пластинчатом комплексе образуется своеобразное динамическое равновесие и градиент концентрации ионов водорода. Она больше всего в дисках на транс стороне и меньше на цис-стороне.

Вначале эндоплазматическая сеть или промежуточная органелла (так иногда называют переносчики, транспортирующие белки между эндоплазматической сетью и пластинчатым комплексом Гольджи) соединена тонкой трубочкой с первым диском АГ, второй диск соединен с третьим, четвертый — с пятым, пятый — с шестым. Затем последовательность соединений меняется. Первый диск отсоединяется от промежуточной органеллы, и соединяется со вторым, третий — с четвертым, пятый — с шестым, седьмой — с транс сетью. Затем первоначальный порядок восстанавливается. Первый диск снова соединяется со вторым, третий с четвертым, пятый с шестым, седьмой с мешком, расположенным после АГ. Затем все разрезается и цистерны сливаются в другом порядке. Первый диск — с эндоплазматическим ретикулумом. Второй с третьим, четвертый с пятым, шестой с седьмым… И так далее.

После того, как блок удален и когда соединены первый диск и эндоплазматическая сеть, то растворимые молекулы белков, накопленные (в связи с блоком их выхода) в эндоплазматической сети начинают диффундировать по узкой трубочке в первый диск на цис-стороне. Из-за того, что в первом диске более высокая концентрация водородных ионов, то кислые белки, например, альбумин, становятся менее заряженными и имеют тенденцию к агрегации. Образовав димер или тример, они с трудом проходят обратно. Тем самым узкая трубка функционирует как клапан, препятствующий обратной диффузии молекул в эндоплазматическую сеть. Если теперь трубочка разрывается, и устанавливается соединение между первым и вторым диском, то из-за того, что кислотность во втором больше, там агрегация альбумина ещё выше и узкая трубочка опять выступает как клапан, блокирующий обратную диффузию альбумина. Тем самым все новые и новые порции альбумина все в большей и большей степени концентрируются на транс стороне.

Хотя в самый начальный момент диски не содержат транспортируемых белков, но белки, расположенные в самом последнем, на транс-стороне, диске продолжают качать ионы водорода из цитоплазмы внутрь просвета диска. Из-за наличия трубчатых соединений ионы водорода диффундируют по направлению к цис-стороне и возникает градиент кислотности. Она самая высокая на транс стороне и низкая на цис-стороне. Белки, в которых среди аминокислот превалируют содержащие кислотные остатки, обладают кислыми свойствами и при снижении pH до значений, когда и кислотные и щелочные остатки нейтрализуются в равной степени, такие белки имеют тенденцию к агрегации. Видимо, того же эффекта можно достичь, если использовать насосы ионов хлора или калия.

Работа аппарата Гольджи похожа на работу лимфатического протокеа, где волна сокращений идет вниз, а лимфа поднимается вверх. Так и тут, из-за градиента и постоянной откачки белка из более начального диска альбумин все более и более концентрируется на транс-стороне. Такой механизм называется поцеловал-и-убежал (кисс-анд-ран, kiss-and-run).

 

V.7. ТРАНСПОРТ ОТ ПЛАСТИНЧАТОГО АППАРАТА ГОЛЬДЖИ К ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ

В поляризованных клетках существуют механизмы, специфически направляющие как мембранные, так и секретируемые белки к определенному домену плазматической мембраны. Раз состав и функция двух доменов плазматической мембраны различны, то совершенно по другому осуществляется транспорт по направлению к верхушечной плазматической мембране. Во-первых, он медленнее. Во-вторых, в этом транспорте задействованы не микротрубочки, а актиномиозиновый комплекс.

В деталях механизм транспорта между пластинчатым комплексом и апикальной плазматической мембраной точно не известен. Во-первых, позиция пластинчатого комплекса относительно апикальной плазматической мембраны имеет существенные особенности. Как правило, пластинчатый комплекс расположен в непосредственной близости от апикальной плазматической мембраны. Дело в том, что расположение центриолей и центросом в поляризированных клетках, то есть имеющих апикальную и базолатеральную плазматическую мембраны, имеет существенные особенности по сравнению с неполярными клетками. Обычно центросома в таких клетках также расположена непосредственно под апикальной мембраной. Поскольку транспорт от пластинчатого комплекса по направлению к апикальной мембране идет по направлению к минус концу МТ, то кинезин уже особой роли не играет. Здесь чаше задействован актин-миозиновый комплекс. После-Гольджиевые переносчики начинают полимеризовать актин, который в свою очередь взаимодействует с миозином, локализованным под апикальной мембраной. Передвижение переносчиков происходит медленнее. Не понятно также, какие СНАРЕ-белки задействованы с этом процессе.

Удалось установить, что белки, предназначенные для различных доменов, вместе проходят путь от эндоплазматической сети до транс-сети Гольджи, где они сортируются и направляются в составе секреторных или транспортных пузырьков к соответствующим участкам клеточной мембраны. Апикальные, и базолатеральные белки имеют сигналы сортировки, направляющие их к соответствующему домену; с другой стороны, может быть, только один из этих путей требует специального сигнала, а другой реализуется при отсутствии сигнала.

Основные сигналы, обеспечивающие сортировку белков к базолатеральной мембране, находятся в цитоплазматическом домене мембранного белка. Очень часто они взаимодействуют с адапторными белками АП-3 и 4. Напротив, сигналы, ответственные за сортировку в сторону апикальной плазмалеммы, расположены в люминальном домене и трансмембранном домене. Одним из важнейших среди последних является наличие высокой степени гликозилирования и увеличенная длина трансмембранного домена.

 

V.8. РЕГУЛИРУЕМАЯ СЕКРЕЦИЯ

В секреторных вакуолях часто происходит агрегация накопленных белков в виде плотных секреторных гранул. Это приводит к повышению концентрации белка в этих вакуолях примерно в 200 раз, по сравнению с его концентрацией в аппарате Гольджи. Затем эти белки по мере накопления в секреторных вакуолях выбрасываются из клетки путем экзоцитоза, поле получения клеткой соответствующего сигнала.

Хотя постоянная или конститутивная, а точнее сказать нерегулируемая, секреция имеет существенное значение для жизнедеятельности клеток, самую важную роль в большинстве организмов играет регулируемая секреция белков, гликозилированных белков и полисахаридов.

Суть данного процесса можно описать следующим образом. Секретируемые белки являются растворимыми немембранными белками. Долгое время считалось, что правильно свернутые (на научном жаргонизме их еще называют фолдированными белками), взаимодействуют с так называемыми рецепторами секретируемых белков. Согласно данной модели, свернутый белок прикреплялся к своему мембранному рецептору. Последний же взаимодействовал с КОП-2 покрытием и тем самым оказывался внутри КОП-2 везикул, которые затем транспортировались от эндоплазматической сеть к пластинчатому комплексу. Несмотря на насущную необходимость найти эти рецепторы для всего многообразия секретируемых белков, они так и не найдены, за исключением одного случая с дрожжах. И то остается не совсем ясным, насколько эти данные можно обобщать для всех дрожжей.

Новый взгляд на работу АГ позволяет по-другому оценить механизмы выхода секретируемых белков из эндоплазматической сети и их последующей концентрации либо в секреторных гранулах либо в пост-Гольджи структурах. Эти механизмы общие не только для белков регулируемой секреции, но и для белков секретируемых клетками печени для нужд плазмы крови без всякой регуляции.

Одни вещества непрерывно секретируются производящими их клетками, тогда как другие запасаются в секреторных пузырьках и высвобождаются только после получения клеткой соответствующего сигнала извне. Этот сигнал к секреции часто представляет собой химический медиатор, например гормон, связывающийся с рецепторами на поверхности клетки. В результате происходит активация рецепторов, которая вызывает обычно кратковременное повышение концентрации свободного кальция в цитоплазме. Последнее инициирует процесс экзоцитоза, побуждая секреторные пузырьки к слиянию с плазматической мембраной и таким образом высвобождая их содержимое во внеклеточное пространство. Мембраны секреторных пузырьков объединяются с плазматической мембраной и в дальнейшем посредством эндоцитоза возвращаются в первоначальное состояние. Общая площадь мембраны, временно включающейся в состав плазматической мембраны, может быть огромной: в ацинарной клетке поджелудочной железы в состав апикальной плазматической мембраны площадью 30 кв. мкм при стимулировании клетки к секреции включается около 900 кв. мкм мембраны секреторной гранулы.

Слияние внутриклеточных пузырьков с плазматической мембраной называется экзоцитозом. Например, для того чтобы секретировать инсулин, клетки, продуцирующие этот гормон, упаковывают его во внутриклеточные пузырьки, которые сливаются с плазматической мембраной и открываются во внеклеточное пространство, высвобождая при этом инсулин.

 

V.9. ТРАНСПОРТ ОТ АГ К ЭНДОСОМАМ И ЛИЗОСОМАМ

Несколько по-другому организовано концентрирование ферментов, предназначенных для доставки в лизосомы. Эти ферменты имеют особые последовательности аминокислот, к которым в момент, когда белок попадает в пластинчатый комплекс Гольджи, присоединяются небольшие цепи моносахаров, один из которых заканчивается маннозой с форфатной группой. На уровне последнего диска АГ располагаются (они здесь концентрируются с помощью особых механизмов, о которых рассказывать просто нет времени) особые рецепторы. Эти рецепторы имеют свойство приклеиваться к маннозе, связанной с фосфатной группой. Тем самым ферменты лизосом концентрируются на уровне последнего диска АГ и затем отправляются в сторону эндосом, а потом лизосом.

Модификация ферментов, функционирующих в лизосомах и способных разрезать аминокислотные цепи, происходит в АГ. Как уже указывалось выше, лизосомальные ферменты синтезируются в эндоплазматической сети и затем попадают в АГ, здесь имеются специальные ферменты, которые распознают участки лизосомальных ферментов, способные к присоединению фосфатной группировки. Формируется особая химическая группа маннозо-6-фосфат. Она очень характерна и может очень прочно прикрепляться к специальным мембранным белкам рецепторам. Существует два таких рецептора маннозо-6-фосфатных групп.

Рецепторы маннозо-6-фосфата является маркером ТГС и мембран поздних эндосом, но его нет в мембранах лизосом.

Только белки-предшественники лизосомных гидролаз имеют специфическую олигосахаридную, а именно, маннозную группу. В цис-цистернах эти группировки фосфорилируются и дальше вместе с другими белками переносятся от цистерны к цистерне, через среднюю зону в транс-участок. Мембраны ТГС содержат трансмембранный белок — рецептор (манноза-6-фосфатный рецептор или М-6-Ф-рецептор), который узнает фосфорилированные маннозные группировки олигосахаридной цепи лизосомных ферментов и связывается с ними. Это связывание происходит при нейтральных значениях рН внутри цистерн транссети. На мембранах эти М-6-Ф-рецепторные белки образуют кластеры, группы, которые концентрируются в зонах образования мембранных почек, покрытых клатрином.

Следовательно, М-6-Ф-рецепторы, являясь трансмембранными белками, связываясь с лизосомными гидролазами, отделяют их, отсортировывают, от других белков (например, секреторных, нелизосомных) и концентрируют их в окаймленных почках. Процесс очень сложно организован в пространстве и времени. После того, как лизосомальные ферменты получили свой маркер — маннозо-6-фосфатную группировку, от них отрезается небольшой участок молекулы, который предотвращает преждевременную активацию фермента. Большей частью отрезание происходит в ТГС или в эндосомах и осуществляется это особым белком фурином. После захвата готовых лизосомальных ферментов М6Ф-рецепторами, рецепторы приобретают способность взаимодействовать с клатрин-1 покрытием, встречающимся на ТГС и эндосомах. Рецептор захватывается клатрин-1 бляшками и начинается формирование мембранной почки, покрытой плотным клатрин-1 покрытием. В этом же покрытии скорее всего (и это было показано для ряда белков) концентрируются соответствующие СНАРЕ, ответственные за слияние с эндосомами. На определенном этапе, покрытие отщепляется, также скорее всего с участием динамина и актина и мембранная почка сливается с эндосомой. При этом идет разрыв ножки мембранной почки и содержимое почки оказывается уже в составе эндосом. Описаны специализированные переносчики, покрытые клатрин-1 покрытием и двигающиеся от АГ на периферии клетки. Однако это найдено на клетках с увеличенным содержанием одного из компонентов клатрин-1 покрытия. Поэтому не ясно, имеются ли такие переносчики в норме.

Переносчики, содержащие набор лизосомальных ферментов, образуются в ТГС (TGN) и перемещаются к ранним или поздним эндосомам, где встречаются с интернализованными (поглощенными клеткой) лигандами или фагоцитированным материалом. Таким образом, формируются структуры, которые иногда обозначаются как поздние эндосомы.

При слиянии первичной лизосомы с эндоцитозной вакуолью происходит диссоциация комплексов М-6-Ф-рецептор-гидролаза, из-за кислой среды внутри вторичной лизосомы. Затем уже свободный фермент после потери фосфатной группы активируется и вступает в работу. Освободившиеся мембранные рецепторы переходят в мелкие пузырьки, отщепляющиеся от вторичной лизосомы, и уходят снова в транс-участок аппарата Гольджи, т. е. происходит их рециклизация.

Как уже говорилось, внутри эндосом из-за активности протонного переносчика происходит закисление среды. Начиная с рН 6 лизосомные ферменты диссоциируют от М-6-Ф-рецепторов, активируются и начинают работать в полости эндолизосомы. Участки же мембран вместе с М-6-Ф-рецепторами возвращаются путем рециклизации мембранных пузырьков обратно в ТГС.

При ознакомлении с работой лизосом, всегда возникает вопрос, почему же эти мембранные образования не переваривают сами себя? Мембранные компоненты лизосом очень устойчивы к гидролазам, содержащимся внутри лизосомных пузырьков. Мембраны лизосом уникальны. Оптимум рН для функционирования большинства лизосомных гидролаз близок к 5, поэтому клетка встраивает в лизосомные мембраны огромное количество протонных насосов (Н+ обменников), которые закисляют среду в поздних эндосомах и особенно в лизосомах. Мембраны лизосом отличает очень высокий уровень гликозилирования специфических гликопротеинов мембран лизосом. Эти белки типа ЛАМП или ЛГП (lamp и lgps) имеют специальные сигналы, которые позволяют им очень долго находиться в просвете АГ. Такое поведение ведет к тому, что полисахаридные цепочки у них становятся очень длинными и резко разветвленными с обилием молекул сиалиловой кислоты и фукозы на концах полисахаридных цепей.

При высоком содержании протонов в среде такие полисахариды образуют олигомеры, которые надежно предупреждают проникновение лизосомальных гидролаз к стенке лизосом и тем самым предохраняют стенку от повреждения. Мембранные элементы лизосом защищены от действия кислых гидролаз олигосахаридными участками, которые или не узнаются лизосомными ферментами, либо просто мешают гидролазам взаимодействовать с ними. Если бы этого не было, то при повреждении стенки лизосомальные гидролазы выходили бы в цитоплазму и вызывали самопереваривание клетки. Такие ситуации случаются в патологии.

Наконец, созревшие (модифицированные) белки переносятся в различные отделы клетки, такие, как лизосомы, цитоплазматическая мембрана или секреторные пузырьки. Последние высвобождают свое содержимое к межклеточное пространство, сливаясь с плазматической мембраной (экзоцитоз). Эти транспортные процессы могут проходить постоянно, или регуляторными, т. е. управляться химическими сигналами.

Прибытие переносчика к плазматической мембране не всегда сопровождается его полным слиянием с ней и встраиванием мембраны переносчика в плазматическую мембрану. Возможен вариант, когда после слияния переносчик опорожняет свое содержимое во внешнюю среду через образовавшуюся пору, а вот интеграции его мембраны в плазматическую мембрану не происходит. Вместо этого переносчик отщепляется от плазматической мембраны, теряя с ней непрерывность. Такой механизм соответствует модели поцеловал-и-убежал (кисс-анд-ран, kiss-and-run) (177). Также совсем недавно было доказано, что механизм транспорта по типу "поцеловал-убежал" имеется и при транспорте между меланосомами и эндосомами (147).

И последний вопрос — зачем я написал данный раздел? Затем, чтобы показать сложность пути, которые проходят белки уже после их синтеза, чтобы читатель мог убедиться, что образование любого белка до того момента, когда он сможет нормально выполнять свою функцию, требует участия сотен других белков, а значит и генов. Белки долгое время обрабатываются продуктами других генов, другими белками, которые тоже могут иметь мутации, разный уровень экспрессии и т. д. Поэтому менделевская идея о прямой связи между информацией, содержащейся в гене, и фенотипическим признаком в корне неверна. Она может быть достигнута только, если задействованы все механизмы клеток и организмов, исправляющие все ошибки работы белковых и нуклеиновых машин и мутации в геноме. Таких ситуаций оказалось чрезвычайно мало.