И, наконец, давайте посмотрим на реальное сложное наследование одной очень четкой мутации, на примере наследственного заболевания человека муковисцидоза (написано по материалам англоязычной Википедии). Муковисцидоз — это, казалось бы, пример типичного рецессивного заболевания. (Замечу в скобках, что в настоящее время известно более 4500 болезней, которые классифицируются как генетические заболевания. Только небольшая часть из них картирована и для еще меньшей установлен биохимический механизм, с помощью которого ген осуществляет свою функцию. Принято различать хромосомные, моногенные и полигенные (мультифакториальные) наследственные болезни. Сведения о них собраны в Базе данных MIM, которую легко найти в Интернете. Рецессивные генетические болезни, такие как муковисцидоз, проявляются в том случае, если повреждены оба аллеля гена). Почему я выбрал муковисцидоз? Дело в том, что белок, мутация в котором ответственна за заболевание мне хорошо знаком. Я этим вопросом занимался чуть-чуть и знаю механизмы транспорта данного белка.
Итак, муковисцидоз (кистозный фиброз) — системное наследственное заболевание, обусловленное мутацией гена трансмембранного регулятора муковисцидоза и характеризующееся поражением желез внешней секреции, тяжёлыми нарушениями функций органов дыхания и желудочно-кишечного тракта. В основе заболевания лежит мутация в последовательности нуклеотидов белка, который по-английски называется cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Более часто употребляют сокращенное название Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR, СФТР). Точное русское название будет таким — трансмембранный регулятор электрической проводимости фиброза ведущего к образованию пузырей. Мы будем называть данный белок на основе первых букв его английского названия — СФТР.
СФТР — это человеческий ген, который предоставляет инструкции по изготовлению белка СФТР. Этот ген локализуется в середине длинного плеча 7-й хромосомы. Он состоит из 1480 аминокислот и кодируется 230 000 парами нуклеотидов. Следовательно, в его составе имеется довольно много интронов. Трехмерная упаковка белка СФТР довольно характерна. Он имеет 12 гидрофобных, то есть составленных из аминокислот, которые не смачиваются водой. У этих аминокислот нет полярных группировок. После полимеризации в полипептид такие участки напоминают углеводороды нефти. Для того, чтобы уменьшить общую энтропию системы, эти гидрофобные участки оказываются внутри липидного бислоя, будучи защищенными от молекул воды гидрофобной зоной бислоя. В цитоплазму и в просвет органелл, через которые проходит белок, обращены только петли связывающие эти десять гидрофобных участков.
Данный белок функционирует как трансмембранный канал, пропускающий преимущественно в одном направлении ионы хлора из цитоплазмы наружу от клетки или из цитоплазмы в просвет органелл секреторного пути или органелл, связанных с поглощением веществ из внеклеточной среды, эндоцитозом. Такие хлорные каналы найдены в эпителиальных клетках многих органов, продуцирующих слизь, слюну, пот, слезы и пищеварительные ферменты. Функция таких каналов очень важна для выделения из клеток и транспорта белков, которые входят в состав секретируемых жидкостей. Причина состоит в том, что перенос ионов хлора из цитоплазмы в просвет органелл данных двух путей или через плазматическую мембрану, выстилающую апикальную или верхушечную часть клеток, вода устремляется за ионами хлора и тем самым разжижает состав секрета.
Мутации, вызывающие муковисцидоз (чаще всего это удаление аминокислоты фенилаланина на позиции номер 508) сравнительно давно и встречаются у тысяч или миллионов людей. Муковисцидоз наследуется по аутосомно-рецессивному типу и регистрируется в большинстве стран Европы с частотой 1:2000 — 1:2500 новорожденных. Если оба родителя гетерозиготные и носители мутировавшего гена, то риск рождения больного муковисцидозом ребенка составляет 25 %. По данным исследований частота гетерозиготного носительства патологического гена равна 2–5 %.
Белок, который называется трансмембранный регулятор муковисцидоза, представляет собой мембранный белок, полипептидная цепочка которого 12 раз пронизывает двойной слой липидных молекул эндомембран вдоль секреторного пути, а потом и плазматической мембраны. СФТР синтезируется из мРНК на мембране цистерн эндоплазматического мембранной сети. 12 гидрофобных участков его аминокислотной цепи пронизывают во взаимо перпендикулярных направлениях мембрану и образуют как бы канал, образованный этими 12 цепочками аминокислот. При этом аминокислоты, которые имеют полярные группы, оказываются ориентированными внутрь канала и он приобретает гидрофильные свойства, то есть смачивается водой. Через этот канал и проходят в одном направлении — из цитоплазмы в окружающую внеклеточную среду (или в просвет внутриклеточных мембранных органелл, в которых оказывается в данный момент белок СФТР) отрицательно заряженные и окруженные водной оболочкой ионы хлора. Данный белок ориентирован таким образом, что в просвет внутриклеточных вакуолей или во внеклеточную среду, если белок оказывается доставленным на верхушечную (то есть смотрящую в просвет трубчатых структур, образованных эпителиальными клетками) плазматическую мембрану, смотрят только очень короткие петли, связывающие гидрофобные участки цепи, участки, которые находятся внутри гидрофобной зоны мембраны. В тоже время оба конца цепи и три глобулярные участка данного белка смотрят в цитоплазму, независимо от того, где он находится в каждый данный момент его жизни. Если он оказывается на плазматической мембране, то ионы хлора откачиваются в окружающую среду. Если же он функционирует на одной из мембранных вакуолей, то ионы хлора двигаются внутрь просвета ее и не могут пройти обратно. В результате число отрицательно заряженных ионов в цитоплазме уменьшается и ее кислотность снижается. Она приобретает щелочные свойства. Напротив, содержимое вакуолей и внеклеточной среды в результате функции белка СФТР закисляется. Вместе с ионами хлора идет вода и тем самым находящиеся в просвете желез белковые секреты разжижаются.
Во время синтеза СФТР на рибосомах, прикрепленных к мембранам эндоплазматической сети, данный белок встраивается в ту же самую мембрану, к которой была прикреплена рибосома. Для прикрепления в эндоплазматической сети СФТР имеет сигнальную последовательность на азотном конце. При встраивании в мембрану происходит пронизывание аминокислотной цепью двойного слоя липидов. Пронизывание бислоя происходит аж двенадцать раз. Поэтому цепь образует на мембране как бы зиг-заг. Белок располагается относительно мембраны таким образом, что в просвет эндоплазматической сети оказываются обращенными только 6 коротких петель аминокислотной цепи. Оба азотный и углеродный концы полипептидной цепи обращены в цитопламу. В промежутке между первыми 6 гидрофобными участками белка и вторыми 6 гидрофобными участками, которые, как я уже сказал, пронизывают взад и вперед мембрану и располагаются внутри нее, имеется сферический клубок, образованный цепью аминокислот. Похожие, но меньшие по размерам клубки имеются на азотистом и углеродном концах полипептидной цепи, а также рядом в большим срединным клубком.
Две пары по 6 гидрофобных участков образуют как бы кольцевой забор внутри мембране, отгораживая от липидов центральный канал. При этом полярные группы аминокислот этих гидрофобных участков обращены в просвет данного канала, а неполярные абсолютно гидрофобные участки смотрят наружу от трансмембранного канала.
В результате подобной организации указанный канал оказывается доступным для попадания туда ионов хлора, которые, как известно, окружены экраном из поляризованных молекул воды и имеют резко отрицательный заряд.
Сгустки аминокислот выполняют роль клапанов. Они образуют круг вокруг частокола из 12 трансмембранных участков и закрывают гидрофильный канал со стороны цитоплазмы. При подходе иона хлора круг размыкается и в пространство между аминокислотными клубками проникает ион хлора. При этом одна из аминокислотных петель закрывает вход в указанный трансмембранный канал. Затем петля отходит и ион хлора идет в трансмембранный канал, а клубки прикрывают канал со стороны цитоплазмы. Тем самым канал для ионов хлора работает как бы в два такта.
Он может пропускать ионы хлора только в одном направлении — из цитопламы в просвет органеллы, где расположен данный белок или во внеклеточную среду, если белок доставлен на верхушечный (апикальный) участок плазматической мембраны. Данный участок отделен от остальной плазматической мембраны специальными белковыми замками, не пропускающими воду, и смотрит в просвет желез, бронхов или желудочно-кишечного тракта.
На верхушечную плазматическую мембраны СФТР попадает в результате довольно сложного пути. После завершения трехмерной упаковки на мембране эндоплазматической сети, СФТР попадает в мембранные переносчики (как он это делает, пока не ясно). Мембранные переносчики взаимодействуют с белковым мембранным покрытием, имеющим название коатомер.
Затем мембранные перевозчики двигаются в сторону пластинчатого комплекса Гольджи и когда они достигают его, то он с помощью тонкого мембранного цилиндра сливаются с дисками цистерн пластинчатого комплекса. Полного перемешивания мембран дисков и вакуоли не происходит. Они остаются соединенными мембранной трубочкой. По трубочке происходит диффузия ферментов, которые ответственны за синтез полисахаридных цепей и расположены внутри дисков пластинчатого комплекса.
Как я уже говорил, эти ферменты ответственны за синтез длинных полисахаридных цепей. Полисахаридная цепь синтезируется и на белке СФТР. Она начинает расти от короткой аминокислотной петли, обращенной в просвет вакуоли-переносчика. Интересно, что по трубочке в мембранную вакуолю способны переходить не все 180 ферментов, которые располагаются внутри дисков, а только два или три. Поэтому полисахаридная цепь на белке СФТР образуется особая. Она состоит в основном из одного моносахарида, имеющего аминогруппу. Полисахарид образуется очень большой длины. Это указывает, что связь между пластинчатым комплексом и транспортирующей СФТР вакуолью существует долгое время. То есть на уровне пластинчатого комплекса транспортирующая вакуоль задерживается на некоторое время. Видимо, длина полисахарида оказывает влияние на способность белка СФТР предупреждать забрасывание ионов хлора в обратном направлении.
После окончания синтеза длинной полисахаридной цепи, вакуоль с СФТР идет к органелле, располагающейся после аппарата Гольджи. Здесь она находится долгое время, пока клетке не потребуется начать откачивать ионы хлора из цитоплазмы. Обычно такая необходимость появляется тогда, когда из-вне поступает циклический моно-аденофосфат (циклоАМФ). После этого резко увеличивается способность вакуолей, содержащих СФТР сливаться с верхушечной плазматической мембраной. После сливания СФТР оказывается на верхушечной мембране и выполняет свою главную функцию.
Ионы хлора транспортируются через мембрану без использования химической энергии макроэргов, то есть веществ типа АТФ или ГТФ, где химическая энергия запасена специально для использования внутри клетки для выполнения разного рода работ. Откачка ионов хлора из цитоплазмы ведет к тому, что кислотность в ней уменьшается, а в просвете или во внеклеточной среде увеличивается. Ионы хлора по законам осмоса увлекают за собой воду. При этом белковый секрет или слизь в просвете разжижаются.
Если белка нет на апикальной плазматической мембране, то ионы хлора не увлекают воду и секрет не разжижается. Его заселяют микробы и после безуспешной борьбы с ними человек обычно умирает в возрасте до 30 лет.
В настоящее время идентифицировано около 1000 мутаций гена СФТР. Большинство из них не ведет к развитию болезни. Главной мутацией, вызывающей заболевание является исчезновение из аминокислотной цепочки аминокислоты фенилаланина на 508-й позиции. В результате нарушается образование трехмерной структуры белка и он не может покинуть пределы ЭС. Данная мутация вызывает заболевание в 66 % случаев.
Главной мутацией, которая нарушает доставку СФТР на верхушечную плазматическую мембрану является удаление трех нуклеотидов, ответственных за кодирования аминокислоты фенилаланина на позиции 508. Если фенилаланина нет, то нарушается взаимодействие с коатомером 2 и СФТР не покидает эндоплазматическую сеть. После некоторого периода пребывания там он подвергается расщеплению на аминокислоты.
Следствием мутации гена является нарушение структуры и функции белка, получившего название трансмембранный регулятор муковисцидоза. Следствием же повреждения функции белка является сгущение секретов желез внешней секреции, затруднение эвакуации секрета и изменение его физико-химических свойств, что, в свою очередь, и обуславливает клиническую картину заболевания. Изменения в поджелудочной железе, органах дыхания, желудочно-кишечном тракте регистрируются уже во внутриутробном периоде и с возрастом пациента неуклонно нарастают. Выделение вязкого секрета экзокринными железами приводит к затруднению оттока и застою с последующим расширением выводных протоков желез, атрофией железистой ткани и развитием прогрессирующего фиброза. Активность ферментов кишечника и поджелудочной железы значительно снижена. Наряду с формированием склероза в органах имеет место нарушение функций фибробластов. Установлено, что фибробласты больных муковисцидозом продуцируют цилиарный фактор, или М-фактор, который обладает антицилиарной активностью — он нарушает работу ресничек эпителия.
Оказывается, как и в случае в серповидно-клеточной анемией, мутация в СФТР может быть доминантной, если рассматривать в качестве признака заболеваемость холерой, при которой образуется много цикло АМФ и больные погибают от потери жидкости из кишечника. Без функции данного белка холера протекает гораздо легче.
В истории с СФТР много остается неясным. И, тем не менее, никаких данных, доказывающих, что муковисцидоз расщепляется по типу Менделевского распределения 3 к 1 я не нашел. Данный белок специфически взаимодействует с 400 различными белками и значит, теоретически мутации всех из этих белков могут вызвать при определенных условиях способны вызвать заболевание сходное с муковисцидозом или сам муковисцидоз. При муковисцидозе могут поражаться практически все органы, где имеются клетки, секретирующие слизь или другие жидкие секреты. И это при всем то, что поражается один и тот же ген СФТР. Однако без гена СФТР (после его искусственного удаления) нет особых поражений у мышей и крыс. У мышей удаление СФТР не дает никакого эффекта. Поэтому и в этом случае говорить о прямой связи ген-признак не приходится.
Итак, СФТР — рецессивное заболевание, но с неполным доминированием нормального гена. Однако и в этом примере видно, что никакой прямой связи между информацией, записанной в гене, и фенотипом нет — эта связь очень сложная и опосредованная. Казалось бы, при муковисцидозе повреждается один ген, но для реализации эффекта данной мутации, для реализации повреждения на уровне фенотипа задействованы сотни других генов.
Таким образом, ни при наследовании групп крови, ни при муковосцидозе нет прямой связи между информацией, записанной в последовательности нуклеиновых кислот, и фенотипическими признаками организма. Связь эта очень опосредованная и в ее реализации принимают участие сотни, а то и тысячи белков.
Итак, особого наследственного вещества, метаболически изолированного от организма, не было и нет.