3.1. Миры до РНК и мир РНК
Многие исследователи полагают, что первым клеточным миром был мир РНК (Ferris, 1999; Hoenigsberg, 2003). Однако по причинам, рассмотренным выше, более правдоподобна версия, согласно которой в ранних клетках функционировали информационные автореплицирующиеся молекулы, в которых азотистые основания были подключены к просто организованным линкерам. Эти линкеры могли быть синтезированы путем пребиотических синтезов. Один из возможных предшественников РНК – уже упоминавшаяся выше пептид-нуклеиновая кислота (ПНК) – имеет структуру белка (звенья соединены пептидной связью), в котором боковыми группами являются азотистые основания (см. Раздел 2.5). Комплементарные нити ПНК способны образовать биспираль и, что особенно важно, комплементарные нити ПНК и РНК образуют гибридную биспираль. Экспериментально установлено, что ПНК может быть использована в качестве матрицы при комплементарном синтезе РНК (Bohler et al., 1995). Если ПНК как информационная автореплицирующаяся структура была непосредственным предшественником РНК, то благодаря столь высокой их совместимости переход к миру РНК мог произойти достаточно плавно. Этот переход был подготовлен приобретением клетками способности производить сахар d-рибозу, нуклеозиды, являющиеся продуктами присоединения одного из четырех азотистых оснований (аденина, гуанина, цитозина или урацила) к d-рибозе по углероду С1, и нуклеотиды – фосфорилированные макроэргические производные нуклеозидов (нуклеозидтрифосфаты). Именно нуклеотиды являются звеньями в цепи РНК. Сами нуклеотиды и ряд их низкомолекулярных производных могли быть использованы для запасания и переноса энергии, а также в качестве коферментов участвовать в ферментативном катализе, в том числе в комплементарной авторепликации РНК. На этом поприще РНК вытеснила предшествовавшие ей автореплицирующиеся макромолекулы. Первоначально мир РНК, в принципе, мало отличался от того, на смену которому он пришел. Предположительно, достаточно протяженные молекулы РНК были организованы подобно их предшественникам в форме последовательности петель, которые селективно связывали определенные аминокислоты и фиксировали их в положениях, благоприятствовавших образованию полимерной цепи (Рис. 1А). Таким образом, молекулы РНК одновременно служили матрицами, связывающими аминокислоты, и кодировали аминокислотную последовательность пептида (белка). Правдоподобность этой гипотезы подтверждается данными о реальном существовании структур РНК, специфически связывающих определенные аминокислоты. Такая структура была первоначально выявлена в интроне предшественника рибосомной РНК тетрахимены (Yarus, 1988). Соответствующий участок РНК стабильно изогнут в форме петли, сформированной как полость, которая специфически связывает аргинин. При этом оказалось, что РНК-петля предпочтительно связывает L-форму аргинина, т. е. осуществляет хиральную селекцию. Измерения константы диссоциации такого комплекса показали его высокую стабильность (Geiger et al., 1996). Впоследствии были обнаружены РНК петли, специфически связывающие фенилаланин и триптофан (Zinnen and Yarus, 1995). Эти наблюдения имеют принципиальное значение. В частности, они подтверждают возможность осуществления хиральной селекции аминокислот в петлях примитивных РНК-матриц. В период, когда синтез аминокислот был абиотическим и, следовательно, в клетку поступали оба оптических изомера, способность петель осуществлять первичную селекцию энантиомеров (оптических изомеров) обеспечивала оптическую однородность сформированного белка.
Не исключено, что для образования пептидной связи в клетке, т. е. в достаточно мягких условиях, аминокислоты были предварительно активированы. В модельных экспериментах образование пептидов было осуществлено при поликонденсации эфиров альфа-аминокислот (Fukuda et al., 1981). Современный механизм активирования аминокислот – подключение их к 3-OH концу тРНК с образованием эфирной связи – в несколько иной форме мог быть реализован уже на этапе примитивного кодирования пептидов на оганизованной в форме петель РНК-матрице (Felden and Giege, 1998).
В образовании химических связей между аминокислотами, удерживаемыми в петлях РНК-матрицы, могли участвовать как РНК-ферменты (рибозимы), так и ферменты белковой природы. Этот вопрос остается открытым. Однако в современном аппарате трансляции на рибосомах этап образования пептидной связи осуществляется с участием элемента рибосомной РНК в качестве рибозима (Joyce, 1989; Lhose and Szostak, 1996; Zhang and Cech, 1997).
Химические модификации азотистых оснований, а также ошибки при копировании (подключение к растущей цепи не комплементарного матрице азотистого основания) являлись причиной мутаций в РНК-матрицах, которые приводили к конформационным изменениям петель и обеспечивали их изменчивость как адапторов аминокислот. Соответственно эволюционировали контролируемые РНК-матрицами белки. Другой кардинальный путь модификации РНК-матриц, имеющий следствием появление новых белков, – рекомбинация матриц как путем прямого обмена материалом, так и по механизму перемены матрицы при репликации (Kogoma, 1996).
Необходимым элементом рассматриваемого механизма примитивного кодирования белков является плотная укладка РНК-матрицы, обеспечивающая ее компактность и тесное прилегание соседних петель друг к другу (как монеты в стопке). При должном ориентировании аминокислот, связанных с соседними петлями, их концевые амино и карбоксильная группы оказывались достаточно сближенными для образования химической связи. Можно предположить, что определенная конформация матричной молекулы РНК, обеспечивавшая координированную позицию петель и их тесную упаковку, была стабилизирована взаимодействием боковых участков соседних петель. Интересно отметить, что, хотя в современной системе трансляции основную стабилизирующую функцию выполняет рибосома, взаимодействие петлевых элементов двух молекул тРНК, которые доставили в рибосому очередные аминокислоты, сохраняет значение как дополнительный стабилизирующий фактор (Smith and Yarus, 1989).
3.2. Переход к современному способу кодирования аминокислотных последовательностей в белках
Мир РНК явился переломным в эволюции клетки, т. к. в рамках этого мира произошел переход от образования пептидов на организованных в форме петель матрицах к современному способу кодирования наследственной информации и отделенному от этого процесса синтезу белков в сложно организованных РНК-белковых структурах – рибосомах. В этом синтезе, помимо рибосомных РНК, участвуют информационные (messendger) РНК (мРНК), в нуклеотидных последовательностях которых закодированы аминокислотные последовательности белков, и адапторные или транспортные РНК (тРНК), которые связываются с определенными аминокислотами и доставляют их в рибосомы к экспонированным кодонам мРНК. Одной из интригующих загадок эволюции является вопрос, появились мРНК и тРНК согласованно как “запланированные” элементы системы кодирования белков или возникли независимо, не будучи исходно предназначены для целей кодирования. До настоящего времени общепринятого решения этой проблемы нет. Автору представляется предпочтительной гипотеза “нецелевого” (по Дарвину) образования этих типов РНК, которые впоследствии оказались тесно взаимодействующими элементами новой системы кодирования и синтеза белков.
Имея в виду эту гипотезу, еще раз обратим внимание на то обстоятельство, что петли РНК-матрицы были тесно сближены. Это могло привести в действие процедуру репликации (копирования) со сменой матрицы (copy choice) (Kogoma, 1996): сближенные участки петель, которые мы достаточно условно именуем торцевыми, служили элементами прерывистой матрицы, по которой шел синтез непрерывной комплементарной копии (Рис. 1Б). Нуклеотидную последовательность этой “огибающей” нити можно условно разбить на ряд коротких участков, которые соответствовали определенным петлям (были комплементарны их торцевым участкам) и следовали в том же порядке. Очевидно, что благодаря такой структуре, возникшая первоначально как побочный продукт “огибающая” нить несла информацию о последовательности аминокислот в пептиде. Эта нить, как и другие молекулы РНК, подвергалась авторепликации, благодаря чему зафиксированная в ней информация оказывалась тиражирована в потомстве. Однако в условиях примитивного кодирования белков информационные возможности огибающих РНК оставались невостребованными. Первоначально они могли выполнять роль дополнительного стабилизатора конформации РНК-матрицы с тесно сближенными петлями, осуществляя с их торцами комплементарное взаимодействие. Однако в клетках наряду с полными РНК-матрицами присутствовали их фрагменты, возникавшие как при прерывании синтеза РНК-матриц, так и при деградации полных молекул. С помощью огибающей РНК фрагменты РНК-матрицы могли быть выстроены в “правильной” последовательности, образуя в сумме полную матрицу.
Рис. 1.
Рис. 1. Схемы, иллюстрирующие гипотезу перехода от примитивного синтеза предетерминированных пептидов к современному генетическому коду.
А. Образование белка (пептида), запрограммированного последовательностью петель-полостей единой молекулы РНК, связывающих активированные аминокислоты. Б. То же. Показана также “огибающая” РНК, нуклеотидная последовательность которой соответствует (комплементарна) ряду “торцов” петлевых элементов матрицы. В. Синтез пептидов на последовательности разделенных полостей-петель, набираемых из общего пула. Порядок петлевых элементов в наборе определяется связыванием их торцевых участков с соответствующими участками «огибающей» РНК, выполняющей таким образом роль информационной молекулы (мРНК). Соответственно, петлевые элементы в этой схеме являются предшественниками тРНК. Г. Эпизод современного синтеза белка на рибосоме: присоединение очередного звена к растущей белковой цепи. Вследствие изменения механизма узнавания адапторами соответствующих аминокислот петли тРНК перестали представлять собою «полости», хотя в них присутствуют необходимые для узнавания структурные элементы.
Схемы Рис. 1 предназначены для иллюстрации основных положений гипотезы и не отражают истинной конформации (укладки) матричных молекул РНК. Другие разъяснения приведены в тексте. Рисунок создан при участии В.В. Горбенко.
И это уже можно рассматривать как частичную реализацию информационных возможностей огибающих нитей. До полной реализации этих возможностей оставался один шаг: образование пула автореплицирующихся автономных РНК-адапторов, связывавших отдельные аминокислоты и узнававших соответствующие им участки в информационных нитях. Первоначально адапторные молекулы – предшественницы современных транспортных РНК (тРНК) – возникали как однопетлевые фрагменты РНК-матрицы. Сформировавшийся пул автономных РНК-петель обеспечивал связывание всех аминокислот, входивших тогда в состав пептидов. “Заряженные” аминокислотами автономные петли матричной РНК были также способны своими торцевыми участками подключаться к соответствующим (комплементарным) участкам огибающей РНК. Принципиально важным для дальнейшей эволюции качеством пула автономных адапторов аминокислот стала его универсальность: он мог быть использован при синтезе любого пептида в присутствии соответствующей огибающей РНК.
Переход к современному принципу кодирования аминокислотных последовательностей и к способу прочтения этого кода при синтезе белка в рибосоме иллюстрирует схема Рис. 1Б: связавшие аминокислоты петли-адапторы выстроены в том же порядке, что на Рис. 1A и Б, но не потому, что они в этом порядке связаны друг с другом в единой молекуле, а потому, что получили информацию о своей позиции благодаря взаимодействию с соответствующими участками огибающей РНК, принявшей на себя функции мРНК. Участки, узнаваемые в мРНК адапторными РНК, представляли собою кодоны, а их последовательность кодировала определенный пептид.
Поначалу новый способ кодирования белков развивался как вспомогательный вариант “под прикрытием” продолжавшего функционировать примитивного механизма. Главным эволюционным стимулом к переключению на новый способ кодирования белков явилась высокая рациональность этого способа, освободившего клетку от необходимости содержать и сохранять в поколениях значительное количество (по числу белков) РНК-матриц, размеры которых многократно превышали размеры соответствующих мРНК. После перехода к кодированию с участием мРНК открылась возможность увеличения как числа, так и размеров клеточных белков. Соответственно возросли их разнообразие и конформационная сложность, что позволило клеткам освоить новые пути метаболизма, усовершенствовать энергетику, кардинально повысить скорость и точность синтезов.
Первоначально характер связывания аминокислот соответствующими им адапторами сохранялся таким же, как при примитивном синтезе: полость, образованная петлей РНК, конформационно соответствовала аминокислоте и удерживала ее в связанном положении. Впоследствии механизм связывания был изменен. Оно стало осуществляться при посредничестве белковых ферментов аминоацил-тРНК-синтетаз, подключающих аминокислоты к 3'-концевому аденозину соответствующего адаптора (тРНК). При этом изменилось назначение петлевой области в молекулах тРНК. Ее структура сохранила специфичность, но преобразовалась соответственно новому назначению – служить объектом узнавания для специфической аминоацил-тРНК-синтетазы.
Предлагаемая модель позволяет удовлетворительно объяснить происхождение ряда характерных особенностей современного генетического кода, в частности, появление “бессмысленных кодонов”, обрывающих синтез пептида на рибосоме. При синтезе белка по единой РНК-матрице их роль выполняли петли, которые вообще не связывали аминокислоту (Рис. 1A). Такие петли разделяли два пептида, образованные на единой РНК-матрице. В пуле разделившихся петель-адапторов “пустой” петлевой элемент не закрепился за ненадобностью, но соответствующий ему кодон сохранился в мРНК (Рис. 1Б).
В схемах Рис. 1, иллюстрирующих гипотезу возникновения современного способа кодирования белков, использован нынешний трехнуклеотидный (трехбуквенный) код. Однако на раннем этапе перехода к современному способу кодирования код, вероятно, был иным. Логично предположить, что число букв в нем было не три, а не менее чем семь-девять. Благодаря этому энергия комплементарного кодон-антикодонного взаимодействия могла обеспечить стабильность комплекса на время, необходимое для образования пептидной связи.
Большой размер раннего кодона мог также в отсутствие специального механизма обеспечивать соблюдение рамки считывания. При трехбуквенном коде все возможные 64 триплета задействованы, т. е. за исключением трех стоп-кодонов они могут быть узнаны соответствующими тРНК. Поэтому смещение рамки считывания в мРНК, кодирующей определенный пептид, на одну или две буквы не прерывало бы синтеза, но изменило бы последовательность кодонов, т. е. привело бы к появлению “неправильного” пептида. При современном синтезе белка на рибосомах осуществляется контроль начала считывания со стартового кодона, определяющего N-концевую аминокислоту и одновременно обозначающего начало рамки считывания. Однако трудно рассчитывать на то, что контроль соблюдения рамки считывания уже осуществлялся в ранних версиях современного способа кодирования. Роль контролирующего фактора в соблюдении рамки считывания могли сыграть большие размеры кодона. При семибуквенном коде и четырех узнаваемых элементах (азотистых основаниях) число возможных вариантов кодонов около 16 000. Очевидно, что число функционировавших РНК-адапторов и, соответственно, “осмысленных” (соответствовавших определенным аминокислотам) кодонов было многократно ниже. Абсолютное большинство потенциальных кодонов не имело адапторов. Поэтому вопрос об использовании “неправильной” рамки считывания вообще не стоял: существовала единственная рамка, обеспеченная адапторами на всем протяжении. В ней осуществлялся синтез запрограммированного пептида.
Впоследствии, когда сформировался действующий поныне аппарат синтеза белков (Рис. 1В), включающий рибосому, которая наряду с другими функциями осуществляет узнавание стартового кодона в мРНК, контролирует последовательное подключение “заряженных” аминокислотами тРНК и стабилизирует кодон-антикодонное взаимодействие до момента формирования пептидной связи, размер кодона был редуцирован до необходимого минимума – триплета. Возможный ход эволюции генетического кода рассматривался ранее (Fitch and Upper, 1987).
3.3. Трансформация мира РНК в мир РНК-ДНК
Новый скачок в эволюции клетки связан с появлением ДНК и переходом к ней функций основного носителя генетической информации. Эволюционно этот переход был обусловлен меньшей склонностью ДНК к гидролизу (Бреслер, 1963) и, соответственно, более высокой прочностью полинуклеотидной цепи. Последнее обстоятельство позволяет ДНК формировать значительно более длинные молекулы, чем это возможно у РНК. В современной клетке только ДНК является автореплицирующейся молекулой и присутствует в форме двунитевой молекулы (биспирали). Все клеточные РНК синтезируются в форме однонитевых молекул путем комплементарного копирования “смысловой” нити двунитевой ДНК-матрицы.
Именно двунитевая структура ДНК повлекла формирование целой серии репарационных систем, способных узнавать и устранять дефекты в одной нити, используя информацию, которую несет комплементарная нить. Эти преобразования в структуре и метаболизме клетки, обеспечившие повышенную устойчивость ее генетического аппарата, были реализованы в хромосомах, содержащих двойную нить ДНК протяженностью в несколько миллионов нуклеотидных звеньев. Резко возросло и перестало быть лимитирующим фактором в эволюции общее количество генетического материала, которым способна управлять клетка (т. е. сохранять, реплицировать, эквивалентно распределять в потомстве, контролировать считывание информации). В современном мире на первом месте – скорость и контролируемость метаболического процесса. Поэтому в генах, помимо структурных участков, кодирующих белки или функциональные РНК (транспортные, рибосомные и др.), присутствуют регуляторные области, которые при участии белков активаторов и репрессоров контролируют транскрипцию.
Сложные и почти безошибочные процедуры синтеза белка и репликации ДНК – лучшие подтверждения высокой организованности молекулярно-биологических процессов в современном мире. Они осуществляются при протягивании кодирующих матриц (соответственно, информационной РНК и разделенных родительских нитей ДНК), подобно ленте конвейера через синтезирующий аппарат, смонтированный в специальных органеллах, рибосомах и реплисомах, которые можно считать молекулярными фабриками или, что звучит более современно, нанофабриками. Редкие ошибки, допускаемые при воспроизведении ДНК ферментами ДНК-полимеразами и корректазами, приводят к включению в синтезируемую нить нуклеотидного звена, некомплементарного матричному звену. Они являются теми самыми мутациями, которые лежат в основе Дарвиновской эволюции. Если бы механизм воспроизведения ДНК стал абсолютно точным, то эволюция сошла бы на нет. Жизнь могла бы сохраняться только при неизменных условиях среды, что практически невозможно. В основных чертах, работа внутриклеточных молекулярных фабрик – синтез белка на рибосомах (Watson, 1963; Гаврилова и Спирин, 1967; Кириллов и Семенков, 1984; Spirin, 2004) и полуконсервативная репликация ДНК в реплисомах (Мосевицкий, 1976; Alberts, 1984; Kornberg, 1985) – описана более тридцати лет тому назад, однако некоторые важные детали остаются невыясненными и поныне.
Отпечатки клеток, которые уже были похожи на современных бактерий, обнаружены в осадочных породах, возраст которых достигает 3.5 млрд лет (Schopf, 1993, 2006). Есть основания полагать, что генетический код, оформившийся уже тогда или даже раньше, впоследствии не претерпел существенных изменений. Высокую стабильность генетического кода можно объяснить опасностью любой перекодировки – изменения назначения того или иного триплета. Перекодировка возможна вследствие мутирования гена тРНК в участке, представляющем антикодон. Очевидно, что мутировавшая тРНК будет узнавать в мРНК новый триплет (кодон), соответствующий измененному антикодону. При этом мутантная тРНК сохраняет специфичность по отношению к аминокислоте. Это приведет к тому, что практически все белки окажутся множественно мутантными, что неизбежно расстроит метаболизм клетки и вызовет ее гибель.
После возникновения праклетки (стволовой линии) эволюция проявилась в активном видообразовании, причем были и такие кардинальные решения, как возникновение около 1.7 млрд лет тому назад эукариотических (снабженных ядром) клеток, а затем на их основе – всего разнообразия многоклеточных организмов (см. Hedges et al., 2004). Вместе с тем, не известно ни одного случая отступления от уже присутствовавших в пралинии базовых атрибутов современной генетики и молекулярной биологии. Так, практически в неизменном виде сохранен общий для всего живого мира Земли генетический код. Общими являются также механизмы репликации ДНК, синтеза РНК (транскрипция), образования белков (трансляция) и многие другие биохимические процессы. Определенные различия, возникшие уже в разделившихся ветвях потомства праклетки и потому выявляемые при сравнительном анализе (см. Раздел 7.3), только подчеркивают универсальность главных генетических принципов и биохимических механизмов.
Было бы опрометчиво утверждать, что определенные изменения этих принципов и механизмов невозможны. Современный мир принято считать миром ДНК. Переход от мира РНК к этому миру зафиксирован в ряде сохранившихся поныне процедур, в которых при производстве специфичных для ДНК структур используются их аналоги из мира РНК. Так, предшественники ДНК дезоксирибонуклеотиды синтезируются из рибонуклеотидов, а дезоксирибонуклеотид, несущий характерное для ДНК азотистое основание тимин, образуется из дезоксирибонуклеотида, сохранившего характерное для РНК основание урацил, путем метилирования последнего. Однако переход от мира РНК к миру ДНК остался незавершенным. В современном мире ДНК переняла функцию сохранения наследственной информации, в то время как вся оперативная деятельность осталась за РНК. Поэтому более правильно именовать его РНК-ДНК-миром. Само двойное наименование указывает на промежуточное состояние этого мира. Переход к истинному миру ДНК, в котором РНК утратила бы все свои функции и была бы исключена из клеточного метаболизма, означал бы новый этап рационализации этого процесса, а следовательно, и жизнедеятельности всей клетки, т. е., казалось бы, является перспективным с точки зрения эволюции. Недавнее обнаружение у ДНК способности выполнять ферментативные функции (Garibotti et al., 2006, 2007; Lu and Liu, 2006) косвенно подтверждает потенциальные возможности мира ДНК. С другой стороны, сам факт не только сохранения в течение более 3.5 млрд лет, но и бурного развития “промежуточного” мира РНК-ДНК свидетельствует о его высокой эволюционной стабильности. Однако очевидное преуспевание мира РНК-ДНК отнюдь не означает, что эволюция не предпримет попытки перейти к следующему миру, если сочтет его более рациональным. Появление другого, эволюционно предпочтительного генетического аппарата, в котором не останется места для РНК, означало бы переход к новым формам жизни и в перспективе исчезновение нас, людей. Впрочем, такая эволюция в ее начальной стадии возможна только на уровне бактерий, а затем организмам с новой генетической системой предстояло бы пройти весь путь эволюции заново. Возможно, уже сейчас где-то на дне водоема или на почве образовался мутантный клон бактерий, начавших движение в направлении “чистого” мира ДНК, принципиальная возможность существования которого (правда, как предшественника мира РНК) уже рассматривалась (Dworkin et al., 2003). Первоначально такие бактерии представляли бы опасность только в случае их болезнетворности. Однако развитие мира ДНК (пока, повторяем, только гипотетическое) грозит вытеснением предшествующему миру РНК-ДНК. Именно так происходило ранее – новый мир полностью замещал собою мир-предшественник. Однако ныне ситуация коренным образом изменилась. Принадлежащий миру РНК-ДНК человек вместе с разумом приобрел способность анализировать ситуацию и в случае необходимости принимать меры к ее изменению. Очевидно, что и в этом случае человечество не осталось бы в роли стороннего наблюдателя и взяло бы под контроль параллельно развивающийся “чужой” мир. Однако это уже из области фантастики.