При оплодотворении хромосомы обоих родителей только объединяются в одном ядре. Однако функционировать в качестве источника генетической информации они начинают не всегда сразу. Поэтому начало развития зародыша, если рассматривать его как процесс реализации отцовской и материнской наследственности, может быть, правильнее считать не с момента оплодотворения, а позже.

Молекулярным проявлением функции генов, как мы знаем, является их транскрипция, т. е. синтез РНК. У видов, яйцеклетки которых невелики, синтез РНК можно обнаружить довольно рано — уже после первых делений яйца. Ho у рыб и амфибий, имеющих крупные яйца, транскрипция обнаруживается только тогда, когда число клеток достигает нескольких тысяч. У всех животных РНК начинает синтезироваться не позже бластулы и первый процесс формообразования всегда происходит под контролем собственного генома зародыша.

Следует различать саму работу генов (транскрипцию мРНК на ДНК) и проявление этой работы, т. е. появление тех или иных признаков. В генетике такое проявление называют экспрессией генов. В простом случае экспрессия выражается в синтезе какого-либо белка, а в более сложных — в таких проявлениях развития, как образование органов, т. е. морфогенез. Между собственно работой генов, т. е. транскрипцией, и их экспрессией должно пройти некоторое время. Иногда это минуты, но нередко и часы, и тогда становится небезразличным, что мы примем за точное время начала работы генов — начало транскрипции или начало экспрессии.

Ну и наконец, нам, вероятно, следует договориться, включение каких генов мы условимся считать началом генетического контроля и началом развития. Надо ли считать таким началом синтез рРНК или тРНК? Они ведь определяют не само развитие, а лишь образование аппарата синтеза белка. Можно ли считать таким началом транскрипцию гистоновых мРНК? Ведь гистоны тоже не определяют развитие и нужны лишь для формирования новых хромосом при делении клеток. Или же нам считать за начало развития лишь включение тех генов, которые контролируют само развитие, т, е, морфогенез? На эти вопросы, очевидно, не может быть строгого ответа. Просто, обсуждая результаты опытов, мы будем каждый раз оговаривать, о чем идет речь.

 

1. До начала работы генов

В оплодотворенном яйце, зиготе, синтез РНК редко начинается сразу, а если и начинается, то играет малоспецифическую роль, т. е. определяет не собственно процессы развития, а синтез рРНК, тРНК, образование гистонов и т. д., которые необходимы для построения хромосом и создания белоксинтезирующего аппарата. Начало ядерной функции, определяющей развитие, или морфогенез (отсюда — морфогенетическая функция ядер), очевидно, зависит от многих обстоятельств, и прежде всего связано с размерами яйца: у всех видов, имеющих «маленькие» яйца (30—200 мкм в диаметре), гены начинают работать раньше, а у видов с «большими» яйцами (от 0,3 мм и выше), как у рыб и амфибий, — значительно позже. Птицы в этом отношении изучены хуже.

Причины таких различий легко объяснить. РНК, синтезированная в одном или даже в нескольких десятках ядер, в течение первых часов раннего развития не может оказать существенное влияние и изменить синтез белка в огромных объемах цитоплазмы большого яйца. И только на стадии многих сотен или тысячи клеток, когда каждое ядро будет окружено небольшим участком цитоплазмы, синтез новых РНК сможет заметно повлиять на состав синтезируемых белков в данной клетке.

Определенную роль играет также и то, что на самых ранних стадиях развития (во время быстрых делений яйца) значительную часть клеточного цикла занимают репликация ДНК и митоз. Во время дробления яиц рыб и амфибий синтез ДНК происходит всего за 15 мин, но и весь клеточный цикл не превышает 30 мин. У дрозофилы же первые деления ядер происходят еще быстрее — каждые 9 мин. Это означает, что в каждый момент времени значительные участки ДНК заняты репликацией, что, вероятно, затрудняет транскрипцию.

Есть и другая, более важная причина, по которой синтез мРНК на самых ранних стадиях не может играть специфическую роль в развитии. Во время первых делений дробления малочисленные ядра еще не занимают в яйце окончательную позицию. Только после 10–15 митозов ядра будут распределены по яйцу и каждое из них будет окружено своим, отличающимся от других участком цитоплазмы, вместе с которым оно образует эмбриональную клетку, способную к дальнейшему развитию. Эти участки отличаются не только своим местоположением в яйце, они могут отличаться и по химическому составу, так как цитоплазма яиц у многих животных неоднородна.

Вот, например, как происходит раннее развитие у насекомых, и прежде всего у хорошо изученной дрозофилы. Первые семь-восемь делений ядер происходят в центре яйца без деления цитоплазмы, и в это время только ядра будущих половых клеток обособляются от остальных и перемещаются к заднему полюсу яйца. После того как после восьми делений число ядер достигнет 256, они, продолжая делиться, перемещаются из центра на периферию и распределяются в тонком слое цитоплазмы под яйцевой оболочкой. Там они образуют клетки, составляющие бластодерму. Только после этого темп делений замедляется, начинается синтез РНК и происходит детерминация — предопределение основных частей будущей личинки и мухи. Очевидно, что, пока ядра находились в общей для них цитоплазме в центре яйца, они ничем не отличались друг от друга и, следовательно, не могли синтезировать разные РНК. Только заняв различные места в яйце, попав в окружение своей цитоплазмы, они «узнали», какие именно гены в них должны работать. Иначе говоря, ядра получили от цитоплазмы, как сейчас говорят, «позиционную информацию». После этого они начинают синтезировать те виды мРНК, которые необходимы в их новой позиции.

Вместе с тем синтез белков в яйце достаточно интенсивен с самого начала развития: у одних видов он не прекращается со времени оогенеза, у других (например, у морского ежа) синтез белка сразу после оплодотворения возрастает в десятки раз. Для обеспечения этого процесса и происходит в оогенезе создание мощного белоксинтезирующего аппарата и накопление мРНК, часть из которых используется с самого начала развития, а часть вступает в действие наиболее поздних стадиях. Среди этих материнских мРНК, вероятно, отсутствуют те, которые специфически необходимы для таких процессов развития, как гаструляция или последующие этапы морфогенеза. Ведь в ходе этих событий разные клетки ведут себя по-разному, следовательно, они должны отличаться по некоторым белкам (и соответственно по мРНК). Вот тут уже, даже несколько раньше и необходима специфическая морфогенетическая функция ядер — разная в разных частях зародыша.

 

2. Как можно судить о начале работы генов

Начало работы генов, точнее, их экспрессию можно заметить по проявлению отцовских признаков, если эти признаки отличаются от материнских. Действительно, когда у зародыша появляются черты, присущие отцовскому организму, но отсутствующие у материнского, не остается сомнений, что отцовские гены начали работать (одновременно с ними обычно начинают работать и гены в хромосомах, полученных от матери). Трудность тут состоит в том, что обычно признаки, отличающие двух животных одного вида (например, окраска), проявляются только на поздних стадиях, когда мы и без того знаем, что гены давно уже начали работать.

Эту трудность можно частично преодолеть, если использовать межвидовые, межродовые и даже межсемейственные гибриды, у которых отличия родительских организмов были бы достаточно велики и могли бы проявляться на более ранних стадиях. Получение отдаленных гибридов хорошо удается у морских ежей, у рыб, хуже — у птиц и почему-то совсем плохо у амфибий. Во всех опытах, проведенных на гибридах, было показано, что их развитие начинается неотличимо от развития материнского организма. Этого и следовало ожидать: ведь на самых ранних стадиях гены, в том числе и отцовские, еще не работают. Отцовские признаки проявляются обычно позже — у более дифференцированных зародышей или даже только у ранней личинки.

Этот метод имеет тот очевидный недостаток, что эмбриональное развитие даже довольно далеких видов обычно протекает очень похоже и на ранних стадиях бывает трудно отыскать видовые или родовые различия. Кроме этого, при отдаленной гибридизации нет полной уверенности в том, что гены, находящиеся в различных (отцовских и материнских) хромосомах, будут включаться одновременно. Поэтому более надежные данные о начале функционирования генов были получены при изучении летальных гибридов.

При скрещивании далеких видов, даже если оплодотворение и произошло, дальнейшее развитие часто протекает ненормально и в результате заканчивается ранней или поздней гибелью. Такие гибриды называются летальными. При изучении многих летальных гибридов рыб и особенно амфибий было показано, что их развитие останавливается на одной и той же ранней стадии — поздней бластуле. Через определенное время гибридные зародыши, так и не преодолев эту стадию, погибают, очевидно, из-за каких-то несоответствий в работе отцовских генов в чужой им материнской цитоплазме. Важно, что, исследовав десятки гибридных комбинаций, никому не удалось обнаружить гибриды рыб или амфибий, у которых развитие останавливалось бы ранее поздней бластулы. На этой стадии гены рыб и амфибий определенно начинают работать. Ho выяснить в таких опытах, не произошла ли активация генов раньше, невозможно. Дело в том, что остановка развития — это типичное проявление морфогенетической функции ядер, т. е. экспрессия их генов. Очевидно, что их функционирование начинается несколько раньше остановки развития.

Рассмотрим в этой связи наши опыты с гибридами рыб. Если яйца вьюна оплодотворить спермиями рыб из других родов и семейств, но того же отряда карпообразных, то их развитие вначале идет нормально, но потом все более отклоняется от нормы. Тем не менее из таких гибридных зародышей выклевываются подвижные, хотя и уродливые личинки, которые погибают через несколько дней. Эти опыты ничего не могут сказать о том, когда происходит активация ядер зародыша, так как, раннее развитие таких гибридов внешне идет нормально и влияние отцовских генов обнаружить трудно. Однако эти эксперименты можно модифицировать. Если до оплодотворения яйца вьюна облучить высокой дозой рентгеновской радиации (10–20 тыс. рад), то их ядра будут разрушены, в то время как цитоплазма практически не пострадает. При оплодотворении таких яиц спермиями своего вида образуются андрогенетические (андрос — мужской) гаплоидные зародыши. Они содержат материнскую цитоплазму и отцовское гаплоидное ядро. Такие зародыши будут развиваться нормально, хотя все личинки в конце концов погибнут, так как гаплоиды нежизнеспособны.

Иной результат получается, если облученные, т. е. фактические безъядерные, яйца вьюна оплодотворить спермиями других видов рыб. При этом образуются андрогенетические гаплоидные гибриды, у которых цитоплазма яйца принадлежит вьюну, а гаплоидные ядра — другому, отцовскому виду. Мы использовали спермин золотой рыбки, барбуса, данио рерио и других аквариумных рыб. И во всех этих случаях развитие доходило только до стадии поздней бластулы, останавливалось и через некоторое время зародыши погибали. Это означает, что гены одного вида не способны обеспечить развитие в чужой цитоплазме. Однако время гибели разных гибридов оказалось неодинаковым: одни погибали почти сразу же после остановки развития, другие жили еще несколько часов. Для каждой гибридной комбинации было свое характерное время выживания. Так как цитоплазма у всех этих зародышей была одна и та же, то очевидно, что время их жизни зависело от активности чужеродных ядер.

Опыты показали, что чужеродные гены, оказавшись в цитоплазме вьюна, все же функционируют и начинают свою работу не позже стадии поздней бластулы.

Есть и более простой способ узнать о начале экспрессии генов зародыша. Если облучить яйцо рентгеновыми лучами уже после оплодотворения, то убиты будут оба ядра — и мужское и женское. Можно также оплодотворить облученное яйцо облученными спермиями. Результат был везде совершенно одинаков: развитие таких безъядерных зародышей всегда останавливалось на стадии поздней бластулы, перед самой гаструляцией.

Очевидно, что развитие безъядерного яйца может происходить только до той стадии, до какой оно было обеспечено запасом белков и мРНК, синтезированных в оогенезе. Остановка развития таких зародышей, по-видимому, наступит как раз тогда, когда возникает необходимость в новых белках, синтезированных на новых мРНК, транскрибированных не в оогенезе, а уже в собственных ядрах зародыша. Эти результаты не оставляют сомнений в том, что именно гаструляция является первым проявлением активности генов у рыб и амфибий.

Иные результаты были получены, однако, при инактивации ядер у других типов и классов животных. Кроме действия высоких доз радиации, инактивация генетического аппарата может быть эффективно достигнута действием специфических веществ, подавляющих транскрипцию, — актиномицина D или а-аманитина. Подавление транскрипции в яйцах морского ежа, вызванное этими веществами или радиацией, приводит к остановке развития на более ранних стадиях, чем у рыб и амфибий, — уже во время ранней — средней бластулы. У представителя моллюсков — большого прудовика развитие останавливается на стадии 16 клеток, у круглого червя аскариды — на стадии двух — четырех бластомеров. Опыты, проведенные на зародышах мыши, показали, что ингибиторы синтеза РНК или большие нехватки хромосом приводят

у млекопитающих к очень ранней остановке развития — после двух первых делений.

Перечисленные примеры показывают, что экспрессия генома зародыша в каждой группе животных начинается на своей стадии. В маленьких яйцах (моллюски, круглые черви, млекопитающие) это всегда более ранние стадии, чем в больших (амфибии, рыбы).

Эти опыты, как мы уже говорили, позволяют обнаружить только начало проявления морфогенетической функции ядер. Можно ли выяснить, на какой именно стадии начинается само функционирование генома? Ведь эти два события могут разделять минуты или даже часы. Метод для решения этой задачи был предложен нами уже много лет назад. И хотя с тех пор появились новые, более прямые подходы, этот метод сохранил свое значение и используется в некоторых работах. Опыты были проведены на яйцах вьюна. Здесь хочется сказать несколько слов об этом прекрасном объекте. Роль объекта к биологии может быть очень важна. Вспомним, что законы генетики были открыты на горохе и на дрозофиле, и трудно сказать, па сколько лет задержалось бы развитие этой пауки, если бы выбор объектов оказался менее удачен.

Классическим объектом эмбриологии всегда считалась лягушка. Сейчас особенно широко используют африканскую шпорцевую лягушку — ксенопуса. Развитие экспериментальной эмбриологии рыб явно отстает и, как нам кажется, во многом из-за того, что не было найдено подходящего объекта.

Когда в нашей лаборатории были начаты первые эксперименты на зародышах вьюна, мы убедились в его необыкновенных достоинствах. Возможность получать и хранить этих неприхотливых рыб круглый год и круглый год получать от них икру, прозрачность ее оболочек, разработанный нами метод отделять зародыш от желтка и культивировать в солевой среде, наконец, возможность использовать таких зародышей для изотопных исследований — вот лишь краткий перечень достоинств вьюна как эмбриологического объекта. Поэтому вьюн сейчас широко используется в различных исследованиях в нашей стране и в странах Восточной Европы, т. е. в тех странах, где он обитает.

Если высокой дозой рентгеновской радиации (20 тыс. рад) инактивировать ядра яиц вьюна тотчас после оплодотворения, то развитие, как мы уже знаем, пойдет внешне нормально только до стадии поздней бластулы, на которой оно остановится. У вьюна при температуре 21 °C стадия поздней бластулы наступает через 9 ч после оплодотворения, и эту стадию удобно так и называть — «стадия 9 часов», всегда имея в виду температуру 21 °C. Если инактивацию ядер произвести через 1 или через 2 ч после оплодотворения, все произойдет точно так же: развитие блокируется на стадии 9 часов, т. е. на поздней бластуле. Это наступит соответственно через 8 или через 7 ч после инактивации ядер. Даже если мы облучим зародышей уже на стадии ранней или средней бластулы, т. е. после 4 или 6 ч нормального развития, остановка все равно произойдет на стадии 9 часов, т. е. через 5 или через 3 ч после облучения. Это означает, что запас белков и мРНК, синтезированных в оогенезе вьюна, достаточен на первые 9 ч развития и этот запас не возрастает за первые шесть часов, а как бы постепенно тратится. Имел ли зародыш неповрежденные ядра только 1 или все первые 6 ч развития, никакой роли не играет: результат будет все тот же — остановка на стадии 9 часов.

Результат этих опытов может быть истолкован только одним образом: в первые 6 ч развития ядра зародыша не осуществляют морфогенетической функции. В это время они активно делятся и соответственно в них синтезируется ДНК. В них в принципе могло бы даже синтезироваться немного РНК, но такие ее виды, которые морфогенеза (конкретно гаструляции) не определяют.

Иной результат получается, если зародыш облучить рентгеновской радиацией и инактивировать в нем ядра в конце стадии средней бластулы, через семь часов после начала развития. Такие зародыши явно начинают гаструляцию и останавливаются на стадии ранней гаструлы, приблизительно эквивалентной 12–13 ч развития. Инактивация ядер через 8 ч после оплодотворения блокирует развитие на еще более поздней стадии —16–17 ч, когда гаструляция близка к завершению. Наконец, действие радиации на стадии 9 часов останавливает развитие уже после завершения гаструляции. Следовательно, позволив ядрам работать в течение всего 3 ч (от 6 до 9 ч), мы как бы предопределили последующее развитие на 8–9 ч вперед.

Эти опыты показали, что морфогенетическая функция ядер начинает осуществляться со стадии средней бластулы или, точнее, через 6 ч после оплодотворения. Это на 3 ч раньше, чем ее первое проявление (поздняя бластула — 9 ч). Все другие методы, о которых речь шла выше, действительно не позволяли судить о начале работы генов.

Точнее всего определить момент начала ядерной активности можно по начавшемуся синтезу РНК. Этот метод не только дает возможность установить, на какой стадии включаются гены зародыша, но и позволяет узнать, какие именно РНК образуются — рРНК, тРНК или мРНК. Более того, в некоторых случаях мы можем сказать, входят ли в состав вновь синтезированных мРНК интересующие нас индивидуальные мРНК, например гистоновые, т. е. мы можем узнать, какие гены начали работать. Однако нам неизвестно, какие мРНК кодируют белки, определяющие морфогенез. Поэтому судить о начале работы генов, определяющих морфогенез, мы можем пока только при помощи метода инактивации ядер на последовательных стадиях развития.

 

3. Включение индивидуальных генов

Когда мы до сих пор говорили о начале функционирования ядер, или, конкретно, о начале синтеза РНК, речь, естественно, шла об одновременном включении сотен, если не тысяч генов, — включение одного или десяти генов мы просто бы не заметили. По-видимому, в раннем развитии существует общий механизм, включающий одновременно транскрипцию сразу в очень многих точках хромосом. Однако должна существовать и другая регуляция, определяющая, почему в число этих тысяч генов попал именно данный ген, а не соседний. По другой развиваемой сейчас гипотезе, которую мы подробно обсудим в одной из последующих глав, включаются и работают, может быть, почти все гены, но некоторые из них транскрибируются намного интенсивнее, и, помимо этого, процессинг затрагивает только нужные про-мРНК, а остальные разрушаются и даже не выходят из ядра. Пока же мы будем обсуждать эту проблему в «классических» представлениях о включении и выключении генов.

Включение отдельных (индивидуальных) генов происходит не только в раннем развитии, но и на всем протяжении клеточной дифференцировки. Этот процесс является одной из главных проблем и для молекулярной биологии, и для биологии развития. Хорошей моделью для его исследования может служить включение в эмбриональном развитии отдельных генов, кодирующих тот или иной фермент, о чем мы можем судить по появлению самого фермента.

Если этот фермент впервые появляется в развитии зародыша, то его появление, как правило, происходит лишь немногим позже включения соответствующего гена. Так, например, перед началом движений зародыша в нем начинается синтез холинэстеразы — фермента, важного для передачи на мышцу нервного импульса. До начала движений зародыша этого фермента почти нет. При дифференцировке поджелудочной железы в ней появляются отсутствующие до этого пищеварительные ферменты. У зародышей змей еще в яйце формируются ядовитые железы и в них начинают накапливаться особые ферменты змеиного ядра. В свежеотложенном яйце их, естественно, не было.

Хотя конкретные механизмы включения таких генов неизвестны, сам факт их включения на той, а не на другой стадии кажется достаточно понятным. Дифференцировка, например, поджелудочной железы на генетическом уровне и состоит в последовательном включении генов, сначала определяющих формообразование железы, а затем синтез в ней пищеварительных ферментов. В этом смысле менее понятно, а потому более интересно включение генов для тех ферментов, которые присутствуют во всех клетках и на всех стадиях развития.

Действительно, в каждой клетке имеется относительно немного видов особенных ферментов, характерных только для данного типа клеток. Известный биолог Эфрусси назвал такие белки белками «роскоши», имея в виду, что сама клетка могла бы без этих белков и обойтись. Ho вместе с тем в клетках присутствует большое количество (порядка тысячи) ферментов, необходимых всем видам клеток. Это так называемые «хаус-кипинг»-ферменты, т. е. ферменты «домашнего хозяйства». Они определяют и контролируют такие общеклеточные процессы, как дыхание и вообще энергетический обмен, проницаемость клеточных мембран, синтез белка и нуклеиновых кислот, образование различных биологически важных веществ и т. д. Естественно, что все эти «хаус-кипинг»-ферменты действуют и накапливаются в ооците, имеются в яйце и во всех клетках зародыша, присутствуют в тканях взрослого организма. Их концентрация и количественные соотношения могут меняться в зависимости от стадии развития и вида ткани, хотя в ходе раннего эмбриогенеза многие из них поддерживаются на довольно постоянном уровне.

Время жизни каждого вида фермента различно и варьирует от десятков минут до нескольких дней. Поэтому они должны почти все время синтезироваться для того, чтобы в клетке поддерживалось постоянное количество ферментных молекул. Для этого в клетке должны постоянно присутствовать мРНК для этих ферментов, а так как срок жизни мРНК также ограничен, то должны работать гены, пополняющие их количество.

Эта равновесная ситуация (транскрипция и распад мРНК, трансляция и распад ферментных белков) нарушается в яйце и в самом раннем эмбриональном развитии, когда работа генов прерывается, а зародыш содержит накопленный в оогенезе запас самих ферментных белков, а также мРНК для синтеза этих белков. Очевидно, что и эти ферменты и мРНК такие же, как в материнском организме, — ведь они были созданы благодаря активности генов ооцита. Неизвестно, содержатся ли в яйце мРНК для всех видов белков, присутствующих в яйце. Поэтому то или иное время эмбриональные клетки живут за счет накопленного фермента, причем его убыль может некоторое время пополняться благодаря трансляции на запасенной мРНК. Ho в какой-то момент развития должны включиться собственные гены зародыша (на отцовской и материнской хромосомах) и появиться новосинтезированные мРНК, а на них должен начать транслироваться новый (точно такой же или аналогичный) фермент зародыша, который постепенно вытесняет чисто материнский фермент.

С чем связано включение генов данного «хаус-киппинг»-фермента на определенной стадии развития и какие механизмы это включение определяют? Это пока неясно, хотя для многих ферментов уже известно, когда в зародыше включаются гены, которые их контролируют. Судить о времени включения такого гена просто по проявлению ферментной активности нельзя, так как «хаус-кипинг»-фермент присутствует и активен на всех стадиях развития. О том, когда материнский фермент заменяется ферментом зародыша, можно судить по тому, когда впервые появляется отцовский фермент. Для этого можно использовать гибриды. У близких видов, которые хорошо скрещиваются, и даже у разных особей внутри вида одни и те же по названию и действию ферменты могут немного различаться.

Чаще всего материнский и отцовский ферменты различают по электрофоретической подвижности, т. е. по скорости движения молекул фермента в электрическом поле.

Оказалось, что многие ферменты присутствуют в клетках в нескольких похожих вариантах, их называют изоферментами и различают также по электрофоретической подвижности. Скрещивая два организма, отличающиеся по изоферментам, можно обнаружить, когда в ходе развития впервые появляется отцовский изофермент. Это означает, что включились и проявились отцовские гены данного фермента.

Скрещивание внутри одного вида и использование индивидуальных различий в изоферментах предпочтительны потому, что в этом случае есть уверенность, что оба гена — отцовский и материнский — включаются одновременно. Если же речь идет о межвидовых скрещиваниях или о более отдаленных гибридах, то полной уверенности в этом нет, так как у разных видов стадии, на которых включается тот или иной ген, могут несколько различаться.

Однако некоторые ферменты, принадлежащие к разным видам, электрофоретически не различаются. Многие ферменты трудно или даже невозможно подвергнуть электрофорезу или не удается потом выявить их место в геле с помощью цветной реакции, например такой важный митохондриальный фермент дыхания, как цитохромоксидаза. В составе митохондрий подвергнуть его электрофорезу, естественно, нельзя, а при выделении из них он сразу теряет активность. Для таких случаев в совместной работе нашей лаборатории биохимической эмбриологии (Москва, Институт биологии развития) и лаборатории сравнительной цитологии (Ленинград, Институт цитологии) было предложено использовать различия в теплоустойчивости ферментов.

Действительно, как показали ленинградские ученые В. Я. Александров и Б. П. Ушаков, у хладнокровных животных, обитающих в теплом климате, устойчивость белков к высоким температурам обычно оказывается выше, чем устойчивость аналогичных белков у видов, обитающих в холодном климате. Теплоустойчивость легко измерить, если образцы экстракта белков нагревать при разных температурах в течение определенного времени и потом смотреть процент активности фермента, которая после такого прогрева сохранилась. Температура, при которой сохраняется половина активности фермента, и есть показатель теплоустойчивости.

Первоначально нами совместно с А. А. Кусакиной (Ленинград) было показано, что один из ферментов углеводного обмена — альдолаза у вьюна имеет теплоустойчивость на 5–6° ниже, чем у тропических аквариумных рыб, которых можно скрещивать с вьюном (данио, барбус, разбора и др.). У гибрида вьюна (♀) с данио (♂) (яйца вьюна, сперма данио) на ранних стадиях теплоустойчивость альдолазы была такой же, как у вьюна. Так продолжалось до стадии 23 часа (появление зачатков первых органов), когда теплоустойчивость внезапно стала повышаться. В течение нескольких часов она поднялась на 2,5–3° и далее осталась на том же уровне. Это означало, что именно со стадии 23 часа начинается проявление отцовского гена альдолазы и в результате у гибридов возникает смесь двух ферментов — отцовского и материнского. Когда мы взяли реципрокных гибридных зародышей данио (♀) × вьюн (♂), их теплоустойчивость сначала была высокой, как у данио, а затем на той же стадии 23 часа стала снижаться и также достигла промежуточного значения.

В литературе накопилось довольно много данных о начале экспрессии генов, кодирующих различные ферменты. Такие данные получены в основном методом электрофореза на гибридах лягушек, двух видов форели, курицы и перепела и др. В нашей лаборатории при использовании обоих методов — по электрофоретической подвижности и по теплоустойчивости — на гибридах вьюна и других рыб получены данные о начале экспрессии генов, кодирующих несколько ферментов.

Оказалось, что ни у одного из исследованных нами ферментов гены не начинают проявлять свою активность тогда, когда начинается морфогенетическая функция генов, т. е. на стадии бластулы. Самое раннее проявление отцовских генов было обнаружено для цитохромоксидазы: повышение ее теплоустойчивости у гибридов вьюн × данио было замечено на стадии поздней гаструлы (14 ч развития при 21 °C). Однако некоторые гены, кодирующие такие важные ферменты, как глюкозо-6-фосфатдегидро- геназу или эстеразу, впервые начинают проявляться только в конце эмбрионального развития, а лактатдегидрогеназа еще позже — у ранней личинки.

Во многих случаях, хотя и не во всех, начало экспрессии генов совпадает с началом повышения общей активности фермента. Для эстеразы не только была обнаружена стадия, на которой начинается образование фермента, кодируемого генами зародыша, но и показано, как постепенно после этого исчезает материнский фермент. Однако почему одни ферменты начинают заменяться новыми, кодируемыми генами зародыша относительно рано, а другие — гораздо позже, остается непонятным.

Может быть, это связано со временем жизни самих белков и их мРНК, запасенных в оогенезе. Может быть, на той или иной стадии один изофермент должен заменяться другим. Может быть, быстрый рост отдельных органов зародыша требует соответствующего синтеза ферментов в клетках этого органа. Наконец, рост всего зародыша или личинки предполагает и увеличение количества фермента. Во всех этих случаях может оказаться необходимым появление нового фермента, а для этого необходимо включение собственных генов зародыша.

Подводя итог всей главе, можно сказать, что включение генетического аппарата на определенной стадии развития или включение отдельных генов требует участия специального механизма регуляции. В этом механизме должен быть какой-то датчик стадии развития, запускающий всю цепь событий, в конце которой много генов или один из них начинает транскрибироваться.

В трех последовательных главах мы рассмотрели три «начала» развития — от начала оогенеза, от момента оплодотворения и от начала работы генов зародыша — и убедились, что существенно не то, что называть началом развития, а те последовательно наступающие процессы, которые и составляют раннее развитие. Все они проходят под генетическим контролем. Разница между ними лишь в том, чьи это гены и когда они функционируют. В оогенезе это непосредственный эффект действия материнских генов; при созревании яйца, при оплодотворении и на начальных стадиях развития это отдаленный эффект тех же материнских генов, но опосредованный через запасенные в оогенезе мРНК и белки. Наконец, все последующее развитие происходит снова под непосредственным контролем генов, но уже генов зародыша.