Важнейшим шагом на пути от мира РНК к современной клеточной жизни стало появление системы синтеза белков, основанной на генетическом коде. Мир РНК был неизбежно ограничен противоречивыми требованиями к молекулам РНК. В роли рибозимов они должны компактно и прочно сворачиваться, а в роли генетического материала РНК с той же последовательностью должны быть в вытянутом состоянии. Хотя при помощи солей, органических аминов и коротких пептидов это противоречие можно в какой-то мере разрешить, оно все равно мешает создавать большие, сложные и точные рибозимы.

Появление белков снимает это противоречие. Белки не подлежат копированию и поэтому могут сворачиваться настолько плотно, насколько это требуется для их работы в качестве ферментов. Отдельные аминокислоты и короткие пептиды использовались и в мире РНК, но революцией стало появление рибосомы и генетического кода. С этого момента открылась возможность создавать крупные белковые молекулы с нужными свойствами по инструкции, записанной в молекуле РНК.

 

Синтез белка в клетках

Система синтеза белка в современных клетках устроена достаточно сложно. Главная ее часть – рибосома, наномашина, которая соединяет аминокислоты в пептидные цепи по инструкции, закодированной в матричной РНК (рис. 13.1). Рибосома состоит из трех молекул РНК общей длиной до 5000 нуклеотидов и примерно 70 белков. Кроме того, для работы рибосомы нужна система подачи активированных аминокислот, которая включает в себя примерно 40 типов транспортных РНК, 20 типов ферментов – аминоацил-тРНК-синтетаз, каждая из которых присоединяет «свою» аминокислоту к нужной тРНК, и еще десяток вспомогательных белков – факторов инициации, элонгации и терминации.

Неизвестны более простые варианты этой системы, способные проводить синтез белка, хотя бы с меньшей точностью и скоростью. Поэтому сторонники «теории разумного замысла» (современной версии креационизма, утверждающей, что системы «определенной сложности» не могли возникнуть без вмешательства Творца) считают белковый синтез одним из примеров системы, полезной только в полном виде, а ее развитие шаг за шагом – невозможным. Но ученые нашли следы постепенного возникновения компонентов этой сложной системы.

Как мы обсуждали в главе 10, ряд витаминов возник еще в эпоху мира РНК, до появления белков. Аминокислоты химически более разнообразны, чем нуклеотиды, и до появления белков они могли участвовать в функционировании РНК-мира в том же статусе, что и витамины: как вспомогательные группы, пришитые к молекулам РНК. Таким образом, рибозимы с функцией аминоацил-тРНК-синтетаз, т. е. способные прикреплять аминокислоты к тем или иным РНК, могли быть востребованы задолго до появления белкового синтеза. Такие рибозимы получены в ходе экспериментов по искусственному отбору каталитических РНК, и по скорости и точности работы они практически не уступают белковым аминоацил-тРНК-синтетазам.

Механизмы синтеза белка и генетический код

Последовательность всех белков закодирована в последовательности ДНК. В состав белков входит 20 разных аминокислот, а в ДНК – только 4 нуклеотида. Надо как-то сопоставить эти два алфавита друг с другом.

Из 4 типов нуклеотидов можно составить 16 разных двоек или 64 тройки. Поэтому, чтобы закодировать все разнообразие аминокислот, приходится использовать по три нуклеотида на одну аминокислоту. Тройка (триплет) нуклеотидов, кодирующая одну аминокислоту, называется «кодон». В клетках обычно с последовательности ДНК, кодирующей белок, делаются временные копии – матричные РНК (мРНК). Этот процесс называется «транскрипцией». Затем рибосома связывается с матричной РНК, движется по ней и собирает белок в соответствии с последовательностью матричной РНК. Работа рибосомы с мРНК называется «трансляцией».

Как рибосома переводит кодоны матричной РНК в аминокислоты? В этом ей помогают специальные адаптеры, или переходники – транспортные РНК (тРНК). Один конец тРНК связывается с аминокислотой (акцепторный стебель, рис. 13.2), а другой – с кодоном (антикодон – три нуклеотида на конце антикодоновой петли).

Соответствие транспортных РНК и аминокислот обеспечивается работой специальных ферментов – аминоацил-тРНК-синтетаз. В клетках, как правило, есть 20 типов аминоацил-тРНК-синтетаз, каждая из которых узнает одну аминокислоту и соответствующие ей транспортные РНК и соединяет их.

В рибосому аминокислоты поступают только в связанном с тРНК виде (аминоацил-тРНК). Рибосома не может проверить соответствие аминокислоты и тРНК и полностью полагается в этом вопросе на аминоацил-тРНК-синтетазы. Рибосома проверяет только соответствие тРНК и кодонов матричной РНК.

В структуре рибосомы есть два «кармана» для связывания транспортных РНК. Они называются «А-сайт» и «Р-сайт». Новая тРНК, несущая аминокислоту, входит сначала в А-сайт. В Р-сайте в это время находится предыдущая тРНК, к которой прикреплена недостроенная белковая цепь. В глубине обоих «карманов» проходит матричная РНК. Для прочного связывания транспортных РНК в А-сайте и Р-сайте надо, чтобы антикодон тРНК составил три комплементарные пары с кодоном мРНК. Если в А-сайт вошла правильная тРНК (ее антикодон соответствует кодону мРНК), то дальше аминокислота на ее конце реагирует с белковой цепью на тРНК в Р-сайте. Происходит транспептидазная реакция: белковая цепь переносится с тРНК в Р-сайте на аминокислоту на тРНК в А-сайте (рис. 13.1). После этого «пустая» тРНК выходит из Р-сайта, а рибосома делает шаг по матричной РНК. При этом мРНК продвигается на один кодон, а тРНК с белковой цепочкой из А-сайта перемещается в Р-сайт. Дальше рибосома опять может принять аминоацил-тРНК в А-сайт и повторить свой рабочий цикл.

Правило соответствия 64 кодонов и 20 аминокислот называют «генетическим кодом» и обычно записывают в виде таблицы (табл. 13.1). Подобные таблицы соответствия между двумя алфавитами давно применялись в практике шифрования. Те читатели, чья работа связана с компьютерами, вспомнят таблицы компьютерных кодировок – ASCII, Win1251, UTF-8 и другие. Таблица ASCII, например, связывает 128 букв латиницы, цифр и других символов со 128 группами по 7 бит (нулей или единиц).

Если в компьютерных кодировках каждому символу соответствует только одна комбинация бит, и наоборот, то в генетическом коде многим аминокислотам соответствуют несколько кодонов. Например, для глицина есть четыре кодона: GGU, GGC, GGA, GGG. Это свойство генетического кода называется «вырожденность».

Кроме 20 аминокислот генетический код содержит знаки начала и конца белковой последовательности. Знаки конца белка называются «стоп-кодонами», их три: UAG, UAA и UGA. Знак начала одновременно служит кодоном метионина – AUG.

Для чтения 61 кодона аминокислот, казалось бы, нужен 61 тип тРНК. Реально во многих случаях одна тРНК может распознавать сразу два похожих кодона одной аминокислоты. Поэтому в клетках содержится менее 61 типа транспортных РНК, например, 49 – у человека и 41 – у кишечной палочки.

 

Происхождение транспортных РНК

Транспортные РНК (тРНК) – скорее всего, самая древняя деталь системы синтеза белка. Все эти небольшие (обычно 76 нуклеотидов длиной) молекулы имеют одинаковую пространственную укладку с четырьмя двухспиральными участками, которая на плоскости изображается в виде клеверного листа (рис. 13.3). На «черешке» у всех тРНК есть свободный одноцепочечный фрагмент ССА (цитозин-цитозин-аденин), к которому прикрепляется аминокислотный остаток.

Но эти «клеверные листы» используются не только в производстве белков. Как выяснилось, тРНК-подобные структуры участвуют в копировании геномов РНК-вирусов. Такая структура есть, например, на конце одноцепочечного РНК-генома бактериофага Qβ, причем для его узнавания вирусная РНК-полимераза нуждается в помощи бактериальных белков, в норме связывающих транспортные РНК (Weiner and Maizels, 1987). В РНК-вирусах растений встречаются еще более точные аналоги – например, тРНК-подобную структуру из вируса желтой мозаики турнепса узнают бактериальные ферменты, работающие с собственными бактериальными тРНК (Joshi et al., 1984)! Другие вирусы, например, вирус мозаики цветной капусты, используют клеточные тРНК как затравки для синтеза первой цепи ДНК на матрице РНК (Hohn et al., 1985).

У этих и других вирусов создание новой цепи РНК всегда начинается с двух гуаниновых нуклеотидов, комплементарных двум цитозинам в одноцепочечном ЦЦА-участке тРНК-подобной структуры (рис. 13.2). Гуанин в данном случае выбран, скорее всего, потому, что он образует больше всего водородных связей как с другой цепью РНК, так и с молекулой фермента. Таким образом, аденин на самом конце РНК-матрицы не будет скопирован и должен быть достроен отдельно.

И в самом деле, различные вирусные РНК-полимеразы (например, бактериофага Qβ) и даже клеточные ДНК-полимеразы, доходя до конца матричной цепи, добавляют на конце растущей цепи один лишний аденин. Это особенно странно для бактериальных ДНК-полимераз, которые копируют кольцевые ДНК и в норме никогда не сталкиваются с концом матричной цепи. Еще одна странность проявляется в процессе созревания тРНК: сначала специальный фермент РНКаза Р обрезает концы незрелых транспортных РНК, удаляя в том числе нуклеотиды ССА, а потом ССА достраиваются обратно другим ферментом – нуклеотидилтрансферазой.

Из всех этих фактов участия тРНК-подобных структур в репликации была построена гипотеза «геномной метки» (genomic tag hypothesis). Подробное изложение см. в сборнике «RNA World» (Cold Springs Harbor press, 1999).

Эта гипотеза утверждает, что в РНК-мире тРНК-подобные «клеверные листы» появились на концах геномных молекул. Они служили местом начала копирования и защитными концевыми структурами генома. Из-за этого появились и ферменты для достройки ССА-участков, и функция добавления неспаренного концевого аденина различными полимеразами. У тех молекул, которые должны были работать рибозимами и не участвовать дальше в копировании, фермент – предшественник РНКазы Р отрезал «клеверный лист». Этот фермент и по сей день имеет в своем составе маленькую РНК-молекулу, что говорит о том, что он очень древний. Отрезанные «клеверные листы» накапливались, и в какой-то момент для них нашлась новая функция: они стали служить адаптерами для прикрепления аминокислот к рибозимам, причем аминокислоты пришивались к ССА-хвосту, а для связывания с рибозимами служили другие участки молекулы, в том числе будущая антикодоновая петля (Szathmáry, 1993).

Итак, вспомогательные молекулы белкового синтеза изначально имели другие функции и могли возникнуть раньше, чем рибосомы. Но как могла появиться сложно устроенная рибосома из десятков взаимосвязанных, подогнанных друг к другу молекул? Допустим, что первая рибосома обходилась без белков (на эту возможность намекает тот факт, что присоединение новой аминокислоты к цепочке до сих пор катализируется РНК). Но рибосомные РНК сами по себе очень сложны.

 

История рибосомных РНК

Изучение структуры рибосомной РНК (рРНК) показало, что она могла быть построена постепенно, путем добавления новых блоков к уже существующим. Рибосомная РНК большой субъединицы состоит из шести относительно самостоятельных структурных блоков, или доменов (отмечены римскими цифрами на рис. 13.4). Структура каждого домена определяется прежде всего связями внутри него.

В рибосоме домены образуют что-то вроде трехмерного пазла. Причем собрать этот пазл, не ломая детали, можно только в одном порядке, начиная с пятого домена. Это наводит на мысль, что пятый домен древнее всех остальных.

Подозрения подтверждаются, если изучить распределение одного из типов связей между участками РНК, так называемых А-минорных контактов. Это музыкальное название обозначает водородные связи между несколькими последовательными аденинами в одноцепочечном участке и гидроксильными группами рибозы в двухцепочечном участке. Такая связь важна для устойчивости одноцепочечного участка, но не влияет на двухцепочечный, поэтому она могла возникнуть, только если одноцепочечная сторона А-минорного контакта возникла позднее, чем двухцепочечная.

На рисунке 13.4 мы видим распределение таких контактов в большой рибосомной РНК кишечной палочки. Видно, что большинство контактов направлены к пятому домену. Это означает, что пятый домен был древнейшим, а остальные части рибосомной РНК надстроились позже (К. Боков, С. Штейнберг, 2009). Некоторые ученые пришли к аналогичным выводам, используя другие признаки: с удалением от пятого домена, в котором находится пептидил-трансферазный центр (именно там и производится присоединение одной аминокислоты к другой в цепочку), уменьшается содержание ионов магния, увеличивается доля белков и повышается упорядоченность их укладки, а в самом пептидил-трансферазном центре белков нет вовсе (Hsiao еt al., 2009). Недавно эти эволюционные реконструкции получили экспериментальное подтверждение: была синтезирована рибосомная РНК длиной 615 нуклеотидов (в 5 раз меньше, чем в обычных бактериальных рибосомах), состоящая из целого пятого домена и древних фрагментов второго и четвертого доменов. Она оказалась способна к взаимодействию с транспортными РНК и к проведению пептидил-трансферазной реакции (Hsiao et al., 2013).

Современные рибосомы состоят из двух субъединиц. Если большая непосредственно сшивает аминокислоты, то малая субъединица организует взаимодействие транспортной РНК с матричной, контролирует соответствие кодона антикодону, первой садится на матричную РНК и ищет место начала синтеза белка, а также двигает матричную РНК через рибосому. Молекулы транспортных РНК одним концом (акцепторный стебель) связываются с большой субъединицей, а другим (антикодоновая петля) – с малой.

Когда методы определения возраста доменов рибосомной РНК были применены к малой субъединице, результат оказался похож на тот, что мы видели для большой: древнейшей частью молекулы оказался декодирующий центр, в котором происходит связывание антикодоновой петли тРНК с матричной РНК и считывание последовательности матричной РНК. В обоих рибосомных РНК участки, отвечающие за связь субъединиц между собой, моложе, чем пептидил-трансферазный и декодирующий центры (Harish & Caetano-Anolles, 2012).

Получается, что две субъединицы рибосомы сначала существовали по отдельности и только потом объединились. Как могла работать древняя большая субъединица рибосомы без белков и без части доменов рРНК? На пятом домене находится пептидил-транферазный центр рибосомы – он присоединяет новые аминокислоты к растущему полипептиду. Однако этот домен не умеет связываться с матричной РНК и потому никак не может выстроить последовательность аминокислот в цепочке белка. Получается, что древняя большая субъединица рибосомы собирала пептиды из аминокислот без участия матричной РНК и использовала какие-то другие механизмы для контроля их последовательности. Дальше в этой главе мы рассмотрим, какие это могли быть пептиды и какими способами рибосома могла контролировать их последовательность до появления матричных РНК.

РНК малой субъединицы тоже вела какую-то свою, самостоятельную жизнь до того, как войти в состав рибосомы. Исследователи склоняются к тому, что раньше она работала в качестве РНК-полимеразы или РНК-лигазы, то есть строила новые молекулы РНК из отдельных нуклеотидов или из коротких фрагментов по несколько нуклеотидов. Ее современные функции – движение по матричной РНК и контроль комплементарности кодона с антикодоном – близки к функциям полимераз. Полимеразы тоже движутся по копируемой нити РНК и контролируют комплементарность присоединяемого нуклеотида (Noller, 2010). Так что, похоже, малая субъединица вошла в состав рибосомы, когда происходил переход к белкам, кодируемым при помощи матричных РНК.

 

История генетического кода

О дальнейших этапах развития синтеза белков нам может рассказать таблица генетического кода (табл. 13.1).

Существуют четыре основные идеи происхождения связи между аминокислотами и нуклеотидными триплетами. Это теория «застывшей случайности», теория оптимизации на минимум ошибок белкового синтеза, теория структурного соответствия аминокислот кодонам («ключ-замок») и теория коэволюции кодонов и путей биосинтеза аминокислот (Koonin, Novozhilov, 2009).

Первая теория («застывшей случайности») заявляет, что соответствие аминокислот и кодонов когда-то установилось случайно, а потом таким и осталось, потому что любое изменение нарушит структуру сразу многих белков и приведет к гибели клетки. Очевидно, это почти ничего не объясняет.

Вторая, теория оптимизации, утверждает, что генетический код устроен так, чтобы при самых частых ошибках рибосомы аминокислоты заменялись на максимально похожие. Рибосома иногда допускает неточное соответствие кодона мРНК антикодону тРНК, что приводит к включению в белок неправильной аминокислоты. Эти ошибки следуют своим закономерностям: ошибка в третьем нуклеотиде вероятнее, чем в первых двух; перепутать два нуклеотида одного размера (A с G или U с C) проще, чем большой с маленьким (например, А с С).

Как видно из таблицы генетического кода, многие аминокислоты кодируются четырьмя кодонами – последний нуклеотид часто не важен вовсе. Но там, где последний нуклеотид играет роль в выборе аминокислоты, ошибка в нем обычно не так опасна, как могла бы быть в других вариантах генетического кода. Из 20 аминокислот стандартного набора (рис. 13.5) очень мало по-настоящему уникальных. Большинство аминокислот образуют группы из нескольких сходных по размеру и химическим свойствам. Например, валин, лейцин и изолейцин похожи друг на друга, и замена одной из этих трех аминокислот на другую, скорее всего, не испортит белок. Аналогично похожи и во многих случаях взаимозаменяемы аспрагиновая и глутаминовая кислоты, и их кодоны отличаются только в последнем нуклеотиде.

Подсчитано, что стандартный генетический код по устойчивости к ошибкам входит в 0,1 % лучших из возможных, но он не самый лучший. Например, кодон триптофана, UGA, проще всего перепутать с UGG (A либо G в третьем нуклеотиде). UGG является стоп-кодоном, т. е. служит «знаком препинания» для обозначения конца белка в матричной РНК. Если перепутать его с UGA, то вместо завершения белковой цепи к ней присоединится лишний триптофан, а за ним еще какое-то количество лишних аминокислот, пока рибосома не встретит следующий стоп-кодон. Если же произойдет путаница в другую сторону, то вместо вставления триптофана произойдет завершение синтеза белка и получится ошибочный укороченный белок. Поэтому, если стоп-кодон UGA станет кодировать триптофан, помехоустойчивость кода возрастет.

Именно такие изменения кода происходят в малых геномах, например геномах митохондрий (подробнее в главе 18). Так что на формирование стандартного генетического кода влияли и другие факторы, кроме отбора на минимум ошибок. Теория структурного соответствия («ключ-замок») утверждает, что молекулы аминокислот соответствуют по форме кодонам (или антикодонам) РНК, подобно тому как ключ подходит к замку. Благодаря такому соответствию формы кодоны (или антикодоны) способны специфически связывать «свои» аминокислоты, и это взаимодействие дало начало генетическому коду. Действительно, в экспериментах по отбору РНК, хорошо связывающих определенную аминокислоту, в ряде случаев полученные молекулы были обогащены как кодонами, так и антикодонами этой аминокислоты. Самое сильное связывание между аминокислотами и их кодонами наблюдалось для аргинина, изолейцина, гистидина, триптофана и фенилаланина. Все эти аминокислоты относятся к крупным и сложным и, вероятно, появились в составе белков позже, чем самые простые аминокислоты, такие как глицин, аланин, серин и аспарагиновая кислота. К сожалению, так и не удалось создать РНК, связывающие эти простые и древние аминокислоты.

В интересном варианте этой теории рассматривается не просто взаимодействие РНК с аминокислотой, но учитывается еще минеральная подложка, к которой прилипает РНК (Mellersh, 1993). На поверхности смектита и некоторых других глинистых минералов РНК принимает форму зигзага, при этом образуются «карманы», подходящие по размеру для молекул аминокислот и ограниченные с разных сторон тремя нуклеотидами (рис. 13.6). При высыхании зигзаг РНК меняет форму так, что аминокислоты в соседних «карманах» сближаются и могут соединиться пептидной связью.

Форма «карманов» зависит от составляющих их нуклеотидов, особенно от первых двух. Молекулярное моделирование показывает, что большинство троек нуклеотидов составляют «карман», наиболее подходящий для той аминокислоты, которая кодируется этой тройкой в стандартном генетическом коде. Триплеты УАА, УАГ, УГА образуют слишком тесные «карманы» для любой аминокислоты, поэтому стали стоп-кодонами.

Хотя Меллерш, автор этого варианта теории, считал, что аминокислоты связывались напрямую с древней матричной РНК, точно такие же «карманы» могли быть на конце древних транспортных РНК, коль скоро древняя жизнь была связана с минеральными поверхностями.

Наконец, четвертая теория (коэволюции) утверждает, что предковые кодоны принимали участие в биосинтезе аминокислот (Di Giulio, 2008). В таблице генетического кода действительно прослеживается соответствие между первым нуклеотидом кодонов и путями биосинтеза аминокислот. Например, три аминокислоты – аланин, аспарагиновая и глутаминовая – образуются в одну стадию из пировиноградной, щавелевоуксусной и кетоглутаровой кислот. Все они имеют кодоны, начинающиеся с G. В одной из лучше разработанных версий теории (Copley at al., 2005) это объясняется так: синтез аминокислот происходил после присоединения предшественника к гидроксильной группе рибозы РНК (конкретнее, к 2' – концу), и ее, РНК, первые три нуклеотида стали кодоном. В этом случае аминогруппа гуанина оказывается на подходящем расстоянии, чтобы облегчать восстановительное аминирование альфа-кетокислот, таких как пировиноградная и кетоглутаровая (рис. 13.7).

Синтез других аминокислот проходит в несколько стадий и начинается с присоединения фосфатной группы на конец будущей боковой цепи. Аминокислоты, происходящие таким способом из щавелевоуксусной кислоты, – аспарагин, треонин, изолейцин – имеют кодоны на А; происходящие из кетоглутаровой кислоты – аргинин, пролин, глутамин – на С (таблица 13.2). Фосфорилирование облегчается аминогруппами (NH2) этих нуклеотидов, причем расстояние от места прикрепления аминокислоты (2' – ОН группы рибозы) до аминогрупп разных нуклеотидов как раз соответствует разным кислотам-предшественницам.

Дальше по этой теории в игру вступает второй нуклеотид.

В работе Copley et al. (2005) приводится множество возможных реакций с участием двух нуклеотидов протокодона, ведущих к образованию 10 из 20 аминокислот. На рис. 13.7 мы привели лишь одну из них. К сожалению, для многих аминокислот, в том числе древних и важных, связи между кодонами и путями биосинтеза не вписываются в эту схему (валин, лейцин) или не прослеживаются вовсе (глицин, серин). Так что и эта теория тоже объясняет лишь часть особенностей стандартного генетического кода.

 

История аминоацил-тРНК-синтетаз

Аминоацил-тРНК-синтетазы – это группа ферментов, которые присоединяют аминокислоты к соответствующим транспортным РНК. Благодаря их способности к узнаванию аминокислот и транспортных РНК и реализуется генетический код. Если в рибосому попадает аминокислота на «чужой» тРНК, то синтезируется ошибочный белок. Никаких средств проверки таких ошибок рибосома не имеет.

Понятно, что современные аминоацил-тРНК-синтетазы – это белки, которые строятся в рибосоме. На ранних этапах развития рибосомы их функции должны были выполнять рибозимы. Такие рибозимы, узнающие аминокислоту и присоединяющие ее к транспортной РНК, были получены путем искусственного отбора и практически не уступают белковым аналогам в скорости работы и точности узнавания аминокислот.

Аминоацил-тРНК-синтетазы делятся на два класса, которые сильно отличаются по трехмерной структуре. Между двумя классами аминоацил-тРНК-синтетаз существует удивительная симметрия: в клетках, как правило, есть 10 синтетаз класса I и 10 – класса II; опознаваемые ими кодоны разделены тоже практически поровну – 29 и 32. Ферменты разных классов узнают транспортные РНК с разных сторон и присоединяют аминокислоту к разным местам молекулы тРНК: класс I – к 2' – гидроксильной группе концевой рибозы, а класс II – к 3'. В принципе, две аминоацил-тРНК-синтетазы разных классов могли бы присоединить две аминокислоты к одной транспортной РНК, не мешая друг другу. Возможно, что в древности это происходило на первом этапе синтеза дипептидов на одной тРНК. В современных белках аминокислоты, кодируемые двумя классами аминоацил-тРНК-синтетаз, распределены не случайно: вероятность того, что две соседние аминокислоты принадлежат разным классам синтетаз, составляет для древних универсальных белков 58,6 %, а не 50 %, как можно было бы ожидать. Видимо, это отголосок древних механизмов синтеза пептидов.

Разные аминокислоты распределены по классам аминоацил-тРНК-синтетаз не случайно: с одной стороны, в арсенале каждого класса есть кислые, щелочные и гидрофобные аминокислоты, с другой – большинство гидрофобных (лейцин, изолейцин, валин) принадлежат к синтетазам класса I, а самые малые аминокислоты (глицин, аланин) – класса II. Удивительно то, что самые важные аминокислоты в активном центре ферментов класса I присоединяются к своим тРНК при помощи ферментов класса II, и наоборот!

Несмотря на то, что два класса аминоацил-тРНК-синтетаз не имеют ничего общего ни в последовательности аминокислот, ни в их трехмерной укладке, Сергей Родин и Сузуму Оно выдвинули в 1995 году смелую гипотезу о том, что древнейшие синтетазы обоих классов кодировались одним геном (Rodin, Ohno, 1995). Ученые обратили внимание на то, что части генов, кодирующие активный центр (100–120 аминокислот из 600–1000, входящих в состав всей белковой молекулы) в классах I и II, обладают некоторым сходством. Сходство выявляется, если ген одного из классов читать по комплементарной цепи – т. е. «задом наперед», заменяя каждый нуклеотид на комплементарный ему. Родин и Оно предположили, что предковый ген кодировал сразу две аминоацил-тРНК-синтетазы, ставшие предками каждая своего класса, которые читались с этого гена в двух разных направлениях. Такое кодирование двух белков одним геном было тогда неизвестно, но со временем подобный пример нашелся: оказалось, что у водяной плесени Achlya klebsiana один ген кодирует в одну сторону глутамин-дегидрогеназу, а в другую – шаперон семейства HSP70 (шапероны помогают белкам правильно свернуться.) Более того, по трехмерной структуре эта глутамин-дегидрогеназа относится к суперсемейству «Россмановской укладки» (Rossman fold), как и класс I аминоацил-тРНК-синтетаз, а HSP70 по трехмерной структуре оказывается дальним родственником аминоацил-тРНК-синтетаз класса II в суперсемействе биотин-синтазной укладки (Carter, Duax, 2002). Потом совместное кодирование глутамин-дегидрогеназы и HSP70 было обнаружено и в нескольких видах бактерий. Наконец, был получен искусственный ген, кодирующий в одну сторону активный центр аминоацил-тРНК-синтетазы класса I, а в другую сторону – класса II. Оба его продукта хорошо выполняли функции аминоацил-тРНК-синтетаз (Carter et al., 2014). Так что совместное происхождение двух классов аминоацил-тРНК-синтетаз с одним предковым геном кажется очень вероятным. Более того, суперсемейство Россмановской складки – вообще крупнейшее среди белковых суперсемейств, в среднем к нему принадлежат десятки видов клеточных белков. Суперсемейство биотин-синтазного фолда скромнее, но тоже одно из крупнейших. И только у аминоацил-тРНК-синтетаз есть важные причины кодировать два разных белка одним геном – для синтеза белков нужен весь комплект этих ферментов, и вероятность потери гена для одного из них надо минимизировать. Так что эволюция двух крупных белковых суперсемейств могла начаться с аминоацил-тРНК-синтетаз.

Аналогичное экономное кодирование могло быть и в рибосомных РНК. В последовательности рибосомных РНК, особенно малой субъединицы, есть участки, похожие на гены транспортных РНК для всех 20 аминокислот. Уровень сходства составляет 60–80 % совпадающих нуклеотидов. Если при помощи РНК-полимеразы сделать комплементарные копии этих участков рибосомной РНК, то они сворачиваются в трилистники так же, как настоящие транспортные РНК. Это сходство слишком велико, чтобы быть случайностью. Помимо транспортных РНК в рибосомной РНК могли быть закодированы также различные белки. Если перекодировать последовательность рибосомной РНК в белковую, как это в норме происходит с матричными РНК, то среди получившихся последовательностей будет много узнаваемых фрагментов рибосомных белков, аминоацил-тРНК-синтетаз, РНК-полимераз и других ферментов (Root-Bernstein & Root-Bernstein, 2015). Возможно, древние рибосомные РНК помимо своей основной структурной функции заодно кодировали набор транспортных РНК и какие-то из ферментов, необходимых для синтеза белков. В дальнейшем, с увеличением емкости генома, эта функция рибосомных РНК стала ненужной, поэтому следы такого кодирования, к сожалению, сильно размыты за миллиарды лет эволюции.

 

Структуры и функции белков

Большинство белков в клетках – водорастворимые, компактно свернутые молекулы. Укладка белковой цепи определяется порядком полярных и неполярных аминокислот в ней. Белки сворачиваются так, чтобы полярные аминокислоты находились на поверхности и контактировали с водой, а неполярные были скрыты внутри и контактировали друг с другом. Кроме того, цепь аминокислот благодаря водородным связям между C=O и N-H группами остова может образовать два типа упорядоченных структур: альфа-спираль и бета-слой (рис. 13.8). В альфа-спирали белковая цепь закручена вправо, на один оборот спирали приходится 3,6 аминокислот, и водородные связи образуются между соседними витками – через три аминокислоты. В бета-слое белковая цепь сложена в несколько параллельных прямых участков, и водородные связи образуются между соседними прямыми фрагментами цепи.

Эксперименты с искусственными белками показали, что пространственная укладка определяется в основном чередованием полярных и неполярных аминокислот в цепи. Так, для бета-слоя на поверхности белка нужно чередование «один через один» – АВАВАВАВ, так, чтобы все полярные группы аминокислот смотрели в одну сторону, а неполярные – в другую. Для альфа-спирали требуется повторение 7-аминокислотных фрагментов ААВВАВВ или АААВААВ, тогда одна сторона спирали будет полярной и обращенной к воде, а другая – неполярной внутренней.

Пять неполярных аминокислот (валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, метионин) в значительной степени взаимозаменяемы между собой. Глицин и пролин стоят особняком, они не вписываются ни в альфа-спираль, ни в бета-слой и находятся в местах крутых поворотов белковой цепи между спиралями или между прямыми участками бета-слоя. 13 остальных аминокислот полярны и если обращены в воду, то тоже практически взаимозаменяемы. Таким образом, для расчетов трехмерной укладки белка можно в первом приближении считать, что аминокислот не 20, а только 3 – «полярная», «неполярная» и «поворотная». Это резко увеличивает вероятность получить белок с нужной укладкой случайным перебором: для белка из 100 аминокислот возможны 20100 вариантов последовательности, что намного больше числа частиц в видимой Вселенной. Но с точки зрения укладки вариантов только 3100 (приблизительно 1045), а осмысленных (с альфа-спиралями и бета-слоями) еще на много порядков меньше из-за необходимых для этого простых чередований аминокислот.

Эксперименты показывают, что коль скоро белок компактно свернут, то наличие у него какой-нибудь ферментативной активности – правило, а не исключение. Более того, активностей может быть несколько даже у короткого белка!

В опытах группы Майкла Хехта из Принстона изучались искусственные белки, складывающиеся в пучок из четырех альфа-спиралей (такую укладку имеют, например, цитохромы b – белки для переноса электронов и ферритины – белки для хранения железа). Ученые создавали на компьютере кодирующие последовательности для белков длиной 74 аминокислоты. 18 аминокислот между спиралями были всегда одинаковы и включали пролин и глицин, а альфа-спирали составлялись из 24 неполярных позиций (в каждой мог быть валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, метионин) и 32 полярных (в каждой могла быть одна аминокислота из шести: глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, лизин, гистидин, аспарагин, глутамин). При таких ограничениях возможно примерно 1041 вариантов последовательностей. Для 48 случайно выбранных виртуальных белков были синтезированы кодирующие их гены, вставлены в клетки кишечной палочки, и синтезированные белки удалось выделить и изучить. 60 % из них были компактно свернуты в пучки из четырех спиралей. Среди компактно свернутых белков половина связывала гем, подобно настоящим цитохромам, а 4 из 29 проявляли пероксидазную активность (т. е. окисляли субстраты с использованием перекиси водорода). Лучшая из четырех пероксидаз из этой случайной библиотеки лишь в 3,5 раза уступает по активности природным пероксидазам, прошедшим отбор!

В ходе дальнейших экспериментов была создана библиотека 400 случайных 4-спиральных белков длиной 102 аминокислоты. Из них более 90 % компактно сворачивались, 60 % связывали гем, 50 % проявляли пероксидазную активность. Кроме того, эти белки были проверены на другие ферментативные активности в отсутствие гема. Оказалось, что 30 % проявляют эстеразную активность, а 20 % – липазную. 3 % белков в этой библиотеке проявляли все три ферментативные активности, на которые их проверяли! (Patel et al., 2009).

В еще более масштабном поиске более миллиона 4-спиральных 102-аминокислотных белков были проверены на способность заменять природные ферменты кишечной палочки. Кодирующие их гены встраивали в штамм, лишенный необходимого фермента, и проверяли, возвращают ли они бактериям способность расти на минимальной питательной среде. Из 27 удаленных природных ферментов в библиотеке нашлись аналоги для четырех: фосфосерин-фосфатазы, цитрат-синтазы, треонин-деаминазы и энтерин-эстеразы (Fisher et al., 2011).

Эти данные показывают, что коль скоро белок свернут, то какая-нибудь ферментативная активность у него с высокой вероятностью будет. Более того, похоже, что эволюция современных белков ограничена в первую очередь опасностью появления новых нештатных функций, а не опасностью утраты основной функции. Поэтому, например, белки, работающие в митохондриях, эволюционируют в несколько раз быстрее, чем в среднем по клетке, даже если они кодируются ядерным геномом (подробнее о митохондриях – в главе 18). Ведь в митохондриях низкое разнообразие белков и мало потенциальных партнеров для нештатного связывания.

 

Древняя история белков записана в рибосоме

Выше мы рассказывали о разном возрасте деталей рибосомы по мере удаления от пептидил-трансферазного центра. Структуры рибосомных белков тоже меняются в зависимости от расстояния до центра. У кишечной палочки малая субъединица содержит 22 белка, обозначаемые S1-S22, а большая – 36 белков, от L1 до L36. Самые ближайшие к пептидил-транферазному центру и, по-видимому, древнейшие белки рибосомы – это протяженные выступы белков L2, L3, L4 и L22, заходящие глубже всего в рибосомную РНК. Укладка аминокислот в этих выступах либо не упорядочена, либо образует узкие бета-слои из двух параллельных белковых цепей (бета-шпильки). При этом отсутствуют обычные альфа-спирали, составленные закрученными вправо связями между амино– и карбонильными группами. Аминокислотный состав этих древнейших белков своеобразен: они на 70 % состоят всего из пяти аминокислот – глицина, аланина, пролина, аргинина и лизина (Hartman and Smith, 2014). В более молодых частях рибосомы белки образуют более широкие и упорядоченные бета-слои, и лишь в самых молодых белках на внешней поверхности есть альфа-спиральные участки. В аминокислотном составе второго поколения рибосомных белков (с широкими бета-слоями, но без альфа-спиралей) появляются в большом количестве валин и серин, а также ароматические аминокислоты. Внешние рибосомные белки, содержащие альфа-спиральные участки, по аминокислотному составу приближаются к усредненному составу всех клеточных белков, если не считать некоторого избытка лизина и аргинина.

Как мы помним, большая субъединица рибосомы поначалу работала в одиночку, без малой субъединицы и, следовательно, без матричной РНК. Она могла сшивать аминокислоты друг с другом, но не могла собирать из них длинные цепочки с определенной сложной последовательностью. Какие же пептидные цепи могла создавать проторибосома без матричной РНК?

Напрашивается три возможности. Во-первых, проще всего строить пептидные цепи из молекул одной аминокислоты, получая гомополимерный пептид. Во-вторых, можно использовать несколько (от двух до четырех) аминокислот, соединяя их в случайном порядке. Так образуются статистические пептиды. Третий и самый сложный вариант – когда проторибосома чередует две или больше аминокислот в постоянном порядке, производя периодический пептид.

Для гомополимерных пептидов сложно придумать какую-то функцию, которая будет востребована в мире РНК. А для периодических пептидов такие функции есть. Одну из них нам подсказывает структура рибосомных белков L2, L3, L4, L22. Эти белки состоят в основном из бета-шпилек, разделенных неструктурированными участками. Они несут положительный электрический заряд и стабилизируют укладку рибосомной РНК, компенсируя ее отрицательный заряд. Эту функцию почти так же хорошо могут выполнять периодические пептиды, полученные чередованием двухаминокислотных мотивов: (Ala-Arg) 2–4 – (Gly-Pro). Участки чередования аланина с аргинином образуют прямые части бета-шпилек, а пара глицин – пролин образует крутой поворот цепи, чтобы она могла сложиться в шпильку. Такие пептиды, которые могут встраиваться в крупные рибозимы и повышать стабильность их укладки, могли быть первым полезным продуктом пептидил-трансферазного центра. Еще более простой пример вспомогательного пептида с положительным зарядом упоминался в 10-й главе, это Tat-пептид вируса СПИДа. Этот пептид и его синтетические аналоги из повторов Arg-Gly и Arg-Gln-Gly тоже встраиваются в разные рибозимы, повышая стабильность их укладки и эффективность работы. Скорее всего, статистические пептиды такого состава тоже могут помогать работе рибозимов.

Другой вариант полезного периодического пептида можно подсмотреть в структуре активных центров различных ДНК– и РНК-полимераз. Все эти ферменты имеют в активном центре ион магния, связанный между тремя остатками аспарагиновой кислоты. Часто эти три остатка находятся на одном участке белковой цепи в составе последовательности Asp-Val-Asp-Gly-Asp. Следовательно, простое чередование аспарагиновой кислоты с валином и глицином позволяет получить вспомогательный пептид, повышающий эффективность рибозимов-РНК-полимераз.

 

Обойденные и вымершие аминокислоты

В предыдущей главе мы обсуждали возможные альтернативные варианты биохимии – на других химических элементах, в других растворителях, с другими генетическими молекулами вместо ДНК и РНК. Настало время обсудить происхождение набора из 20 аминокислот, составляющего белки, и оценить возможные альтернативы.

Во многих случаях природа выбрала наиболее простые аминокислоты из возможных. Аланин, например, – это самая обыкновенная аминокислота без особых примет. Глицин – единственная возможная аминокислота без боковой группы, благодаря чему по глицину белковая цепь может свободно изгибаться и вращаться. Также в стандартном наборе используются самые простые и доступные кислые аминокислоты (аспарагиновая, глутаминовая) и их амиды (аспарагин, глутамин), аминокислоты со спиртовой группой (серин, треонин), серосодержащие (цистеин), ароматические (фенилаланин, тирозин) с важной для многих ферментов имидазольной группой (гистидин) и жесткие, не допускающие вращения цепи (пролин) (Weber and Miller, 1989). Сложнее ситуация в группах положительно заряженных и неполярных аминокислот.

В стандартном наборе имеется две положительно заряженные аминокислоты – аргинин и лизин. Обе они имеют длинную боковую цепь и сложный путь биосинтеза. В аппарате Миллера и в метеоритах лизин и аргинин не встречаются, зато есть более простые аминокислоты со второй аминогруппой: диаминопропионовая, диаминобутановая и диаминопентановая (орнитин, рис. 13.9). Эти же три аминокислоты есть и в клетках. Диаминопропионовая и диаминобутановая кислоты встречаются у бактерий в составе пептидов специального назначения: антибиотиков и переносчиков железа. Орнитин является промежуточным продуктом в синтезе аргинина и есть у всех организмов – от бактерий до человека. Значит, возможно, что эти аминокислоты были доступны для включения в белки с самого начала, но по каким-то причинам вместо них были выбраны более сложные аргинин и лизин.

Мы можем быть уверены, что аминокислоты со второй аминогруппой входили в состав самых древних белков. Эти белки, чтобы эффективно работать в мире РНК, должны были прочно связываться с молекулами РНК, как, например, рибосомные белки. Такое связывание требует, чтобы белок нес положительный электрический заряд, т. е. имел свободные аминогруппы, которые в водной среде оказываются положительно заряжены. Рибосомные белки своим положительным зарядом компенсируют отрицательный заряд сахарофосфатного остова РНК, и только благодаря им рибосомная РНК длиной более 3000 звеньев может свернуться компактно (Hartman and Smith, 2014).

И аргинин, и лизин имеют длинные и сложные пути биосинтеза, состоящие из восьми-девяти стадий, и маловероятно, что их синтез мог проходить без участия полноценных белковых ферментов. Орнитин и диаминобутановая кислота образуются в три стадии из глутаминовой и аспарагиновой кислот, а диаминопропионовая и вовсе в один шаг из серина, т. е. они явно доступнее. Более того, для лизина у разных групп микробов существуют две разные аминоацил-тРНК-синтетазы, относящиеся к двум разным семействам. Такое разнообразие аминоацил-тРНК-синтетаз может означать, что они появились независимо, а значит, лизин вошел в генетический код уже после расхождения крупных групп микробов. Итак, у нас есть три факта:

1) положительно заряженные аминокислоты должны были быть в белках с самого начала;

2) современные аминокислоты этой группы – лизин и аргинин – имеют очень длинный и сложный биосинтез и могли возникнуть в эволюции позже других аминокислот. Для лизина это подтверждается и разнообразием аминоацил-тРНК-синтетаз;

3) существуют более простые и доступные аминокислоты с положительным зарядом, такие как орнитин, они есть в клетках, но не входят в состав белков.

Возникают подозрения, что простые положительно заряженные аминокислоты когда-то входили в состав белков, но были затем вытеснены лизином и аргинином.

Какие причины могли привести к замене простых положительно заряженных аминокислот на более сложные? В экспериментах с искусственными пептидами из аланина и разных положительно заряженных аминокислот было показано (Padmanabhan et al., 1996), что положительный заряд близко к остову пептидной цепи нарушает стабильность альфа-спирали, и лишь лизин и аргинин несут положительный заряд на безопасном расстоянии. Так что, видимо, причиной перехода на лизин и аргинин было усложнение белков и увеличение доли альфа-спиралей в них. Как видно по структуре рибосомных белков, альфа-спиральные укладки возникли в эволюции позже, чем бета-слои, которые устойчивы и с малыми положительно заряженными аминокислотами.

Где же эти аминокислоты могли быть в таблице генетического кода? В случае орнитина ответить на этот вопрос проще всего. Так как он является промежуточным продуктом на пути к аргинину, то, скорее всего, ему раньше принадлежали основные кодоны аргинина – CGN. Также вымершим аминокислотам могла принадлежать группа кодонов AGN. В современном генетическом коде кодоны AGA и AGG принадлежат аргинину, а AGC и AGU – серину. Обе эти аминокислоты имеют еще по четыре кодона в других местах (CGN аргинина и UCN серина) и, похоже, захватили и поделили кодоны вымершей аминокислоты. Кодоны AGN могли принадлежать, например, диаминопропионовой кислоте. Диаминопропионовая кислота образуется из серина и соответствует ему по размеру, а по электрическому заряду соответствует аргинину, поэтому ее кодоны были поделены между серином и аргинином.

В группе неполярных аминокислот в состав белков входят аминокислоты с разветвленной боковой цепью – валин, лейцин, изолейцин, но не используются их аналоги с прямой боковой цепью, такие как альфа-аминобутановая кислота, норвалин и норлейцин. В опыте Миллера и в метеоритной органике неразветвленные аминокислоты образуются в больших количествах, чем разветвленные. Все три аминокислоты с прямой боковой цепью известны в составе природных пептидов-антибиотиков, а аминобутановая кислота образуется и у животных при распаде белков пищи.

Проблемы со стабильностью альфа-спирали вызывает валин, а прямые неполярные аминокислоты, наоборот, вписываются в нее идеально. Так что здесь мы не видим никакой причины для замены прямых аминокислот на разветвленные в ходе эволюции. Видимо, жизнь с самого начала имела возможность выбора между прямыми и разветвленными неполярными аминокислотами, и вторые были выбраны по какой-то причине, которая больше не важна. Например, такая причина есть в теории стереохимического соответствия кодонов и аминокислот: РНК на глине содержит «карманы», соответствующие по форме валину, лейцину и изолейцину, тогда как для неполярных аминокислот с прямой боковой цепью ни один из триплетов не образует подходящих «карманов». Другое объяснение возможно исходя из теории цианосульфидного протометаболизма (глава 7): в этой сети реакций разветвленные аминокислоты (валин и лейцин) образуются в реакциях ацетона с синильной кислотой, а эффективных путей получения их прямых аналогов нет.

 

«Рабочий код» и происхождение генетического кода

Узнавание транспортных РНК аминоацил-тРНК-синтазами определяется в первую очередь не антикодоном, а нуклеотидами акцепторного стебля – рядом с местом присоединения аминокислоты (рис. 13.2). Часть аминоацил-тРНК-синтетаз, работающая с простыми аминокислотами (такими как аланин, глицин, глутаминовая кислота), вообще не проверяют антикодон тРНК, им достаточно акцепторного стебля. Соответствие между нуклеотидами акцепторного стебля и аминокислотами получило название «рабочего кода» (operational code). Рабочий код проще, чем стандартный генетический код: в него входят три первые нуклеотидные пары акцепторного стебля, причем в этих позициях бывают обычно только гуанин и цитозин, очень редко урацил. Таким образом, рабочий код не вырожден: с его помощью можно закодировать только восемь аминокислот, не используя урацил, и до шестнадцати, используя урацил только в одной позиции из трех.

Одна из самых строгих закономерностей генетического кода – распределение кодонов по типам узнавания транспортных РНК аминоацил-тРНК-синтетазой (табл. 13.3). Аминоацил-тРНК-синтетазы могут контактировать с акцепторным стеблем транспортной РНК с двух разных сторон. У двойных спиралей ДНК и РНК есть два желобка: большой, который образуется боковыми сторонами азотистых оснований, и малый, который образован 2' – гидроксильными (-ОН) группами рибозы обоих цепей. Узнавание может происходить со стороны большого желобка акцепторного стебля (I класс и фенилаланин-тРНК-синтетаза II класса) либо малого желобка (II класс и тирозин-тРНК-синтетаза I класса). Все транспортные РНК со второй буквой кодона U узнаются с малого желобка, с C – с большого. Для кодонов с G в середине способ узнавания определяется первой буквой, с А – последней.

«Рабочий код» не столь однозначен, как классический генетический код. Он сильнее отличается у разных организмов. Однако есть закономерность, связывающая его с классическим: для двух простейших аминокислот – глицина и аланина, а также часто для валина, пролина и аспарагиновой кислоты первые три нуклеотида акцепторного стебля совпадают с одним из кодонов той же аминокислоты (Moller, Janssen, 1992).

Возможное родство «рабочего кода» и классического кода помогает разорвать порочный круг, возникающий во многих моделях происхождения генетического кода. В самом деле, для появления генетического кода должно возникнуть соответствие между аминокислотами и антикодонами тРНК. Аминокислоты и антикодоны, во-первых, химически различаются, во-вторых, находятся на разных концах молекул транспортных РНК и разделены значительным расстоянием. Теория «ключ-замок» и теория коэволюции кода дают приемлемый ответ на вопрос, как возникло соответствие между аминокислотами и какими-то триплетами в каких-то РНК. Но они требуют прямого взаимодействия аминокислоты с фрагментом РНК – будущим кодоном или антикодоном. Как возникло соответствие между аминокислотой и антикодоновой петлей тРНК, которые разделены заметным расстоянием?

Если же у нас для присоединения аминокислот к транспортным РНК сначала использовался «рабочий код» (а для половины аминоацил-тРНК-синтетаз его достаточно и сейчас), то решение есть. Сначала на стереохимической или коэволюционной основе появился «рабочий код», при этом один и тот же участок рибозима-предка аминоацил-тРНК-синтетазы мог узнавать и аминокислоту, и акцепторный стебель. Потом должно возникнуть соответствие между разными акцепторными стеблями и антикодонами. В последовательностях транспортных РНК есть нестрогая, но заметная периодичность – повторы длинной 9–10 нуклеотидов. С учетом образования двуспиральных участков транспортную РНК можно собрать путем последовательных удвоений предковой шпильки из 19 нуклеотидов. Первое удвоение дает структуру из 38 нуклеотидов с двумя шпильками. Такие «половинки транспортной РНК» встречаются на концах геномов РНК-вирусов гораздо чаще, чем «клеверные листы», похожие на полную транспортную РНК. Те аминоацил-тРНК-синтетазы, которые не проверяют антикодон, прекрасно «пришивают» аминокислоты к таким молекулам. Второе удвоение порождает «клеверный лист», причем место стыковки двух сегментов находится на границе антикодона, а сам антикодон возникает как копия участка акцепторного стебля, образующего «рабочий код» (рис. 13.10) (Di Giulio, 2009). Мы видели, что для некоторых аминокислот (таких как глицин, аланин, пролин, аспарагиновая кислота, валин) «рабочий код» совпадает с обычным генетическим кодом. Следовательно, эти аминокислоты участвовали в сборке пептидов на проторибосоме еще до того, как произошла дупликация, породившая современные тРНК. Эта дупликация привела транспортные РНК к современному размеру и современной форме и создала антикодоновую петлю. Только после этой дупликации могли возникнуть взаимодействие антикодоновой петли с матричной РНК и кодируемый белковый синтез. Следовательно, эти пять аминокислот относятся к древнейшим.

 

Порядок развития белкового синтеза и генетическом кода

Мы рассмотрели ключевые факты, проливающие свет на историю рибосом и генетического кода. Попробуем теперь собрать из фрагментов последовательную историю.

1. Основа большой субъединицы рибосомы, пептидил-трансферазный центр, вначале строил пептиды из небольшого набора аминокислот без участия матричной РНК. Возможны три варианта последовательности таких пептидов: чистые полимеры одной аминокислоты, случайное чередование нескольких аминокислот и закономерное чередование, в простейшем случае повтор двух аминокислот. Наличие двух классов аминоацил-тРНК-синтетаз, узнавание ими тРНК с разных сторон и неслучайная принадлежность аминокислот двум классам синтетаз в древних белках могут быть следами двухаминокислотных повторов на этом этапе развития рибосомы. Аминокислоты доставлялись к проторибосоме на молекулах транспортных РНК. Но эти тРНК были меньше и проще современных и имели один длинный двуспиральный участок (современные – четыре коротких). «Рабочий код» (последовательность трех первых нуклеотидов акцепторного стебля) мог использоваться дважды. Сначала вне рибосомы он опознавался рибозимными аминоацил-тРНК-синтетазами для прикрепления каждой аминокислоты к своей тРНК. Затем уже в проторибосоме он мог использоваться для правильного чередования аминокислот в периодических пептидах.

2. В какой-то момент происходит внутренняя дупликация в молекулах транспортных РНК, и они превращаются из древних одиночных шпилек в современные «трилистники». Образуется антикодоновая петля как копия участка акцепторного стебля с «рабочим кодом», и взаимодействие этой петли с другими молекулами РНК позволяет упорядочить последовательность пептидов, производимых на древней рибосоме. Вероятно, сначала антикодоновые петли взаимодействовали со специальным участком рибосомной РНК, а потом ему на смену пришли сменные матричные РНК, позволив одной рибосоме производить множество разных белков. К большой субъединице рибосомы присоединилась малая и стала контролировать взаимодействие транспортной и матричной РНК.

3. Мы можем восстановить набор аминокислот, используемых проторибосомой на этих двух этапах, по двум источникам: совпадение «рабочего кода» в акцепторном стебле транспортной РНК со стандартным кодом в антикодоновой петле той же тРНК и присутствие аминокислоты в составе древнейших белков (внутренние домены рибосомных белков L2, L3, L4, L22). «Рабочий код» дает нам пять аминокислот (глицин, аланин, пролин, аспарагиновая кислота, валин), рибосомные белки – тоже пять, но других (глицин, аланин, пролин и вместо аспарагиновой кислоты и валина – аргинин и лизин). Выше мы упоминали, что в древнейшем генетическом коде вместо аргинина и лизина, скорее всего, были их более простые аналоги, такие как орнитин, диаминопропионовая и диаминобутановая кислоты. Далее для краткости мы будем называть только орнитин, но на самом деле это могла быть любая из этих трех аминокислот или даже могли быть задействованы все три одновременно. Совпадение «рабочего кода» с обычным антикодоном для них могло быть стерто позже, когда эти аминокислоты были заменены на лизин и аргинин. Иными словами, в минимальный набор аминокислот, с которого начался кодируемый синтез белка, входят шесть: глицин, аланин, пролин, аспарагиновая кислота, валин, орнитин. Скорее всего, эти же шесть аминокислот использовались и на первом этапе развития рибосомы, до внутренней дупликации тРНК и появления кода. На этом первом этапе из шести древнейших аминокислот могли строиться вспомогательные пептиды для разных рибозимов. Это могли быть пептиды с положительным зарядом, стабилизирующие укладку рибозимов, на основе чередования орнитина с аланином, глицином или пролином. Кроме того, могли производиться и пептиды с отрицательным зарядом для работы в составе рибозимов-полимераз на основе чередования аспарагиновой кислоты, валина и глицина.

4. Переход к кодированию последовательностей пептидов при помощи матричной РНК дал возможность строить более длинные и воспроизводимые вспомогательные пептиды для разных рибозимов, а затем и полноценные белки, способные компактно свернуться без участия РНК. На этом этапе возникают первые рибосомные белки и первые ферменты, состоящие из бета-слоев, в том числе аминоацил-тРНК-синтетазы.

5. Добавление к аминокислотному набору цистеина, серина и гистидина резко расширяет каталитические возможности белков. Появляются многие основные классы ферментов. Разнообразие белков растет, и все сильнее проявляется врожденный недостаток белков с бета-слоевой укладкой: они склонны соединяться в кристаллоподобные структуры. Известный пример такой кристаллизации бета-слоевого белка – образование амилоидных фибрилл в нервных клетках при болезни Альцгеймера. Толчком к появлению таких кристаллов может стать как неожиданное изменение температуры и солевого состава среды, так и мутация в гене, кодирующем этот белок. По этой причине естественный отбор поддерживает появление белковых структур, состоящих из альфа-спиралей.

6. Для появления белков со стабильной альфа-спиральной укладкой необходимо найти замену орнитину, валину и аспарагиновой кислоте, так как они нарушают устойчивость альфа-спиралей. Добавление в код лейцина, изолейцина, лизина либо аргинина, а также глутаминовой кислоты решает эту проблему. На этом этапе могла возникнуть большая часть универсальных белковых укладок.

7. Завершение стандартного генетического кода. Добавляются ароматические аминокислоты, аспарагин, глутамин. Ароматические аминокислоты могут вступать во взаимодействие с азотистыми основаниями в РНК и коферментах и дают новый способ связывания белков с РНК – это так называемое стэкинг-взаимодействие, основанное на параллельном расположении ароматических колец пуриновых и пиримидиновых оснований. Фенилаланин, кроме того, является самой крупной из гидрофобных аминокислот и повышает стабильность укладки больших белков. Позднее добавление аспарагина и глутамина связано с их плохой устойчивостью к высоким температурам. В белках гипертермофильных микробов, живущих при температуре 90–110 °C, содержание аспарагина и глутамина очень мало. Видимо, они вошли в генетический код после выхода протоклеток из горячих геотермальных водоемов в моря.

Как мы видим, сложнейшая система производства белков вполне могла развиваться постепенно. Многие ее компоненты, такие как транспортные РНК и рибосомная РНК малой субъединицы, исходно имели другие функции, не связанные с белками. Проторибосома, собирающая короткие пептиды без кода, тоже могла быть полезна для организмов РНК-мира. Появление генетического кода и матричных РНК повысило точность и воспроизводимость этих коротких пептидов. После этого дальнейшее совершенствование рибосомы и расширение набора аминокислот поддерживались естественным отбором в первую очередь потому, что позволяли получать новые, более эффективные белковые ферменты.

 

Вся клеточная жизнь на Земле имеет общее происхождение. На это указывают сходство рибосом и, как правило, одинаковая таблица генетического кода во всех клетках. Следовательно, когда-то жил общий для них предок, который дал начало двум весьма разным группам клеток – бактериям и археям. Археи похожи на бактерии по размерам и форме клеток, но отличаются многими биохимическими особенностями. Многие археи населяют горячие источники, толщу земной коры, кислые рудничные воды и другие экстремальные местообитания. Третья клеточная линия, эукариоты (клетки с ядром) возникли позже, и мы рассмотрим их происхождение в главе 18.

Последний общий предок бактерий и архей, сокращенно называемый LUCA (Last Universal Common Ancestor), доступен для изучения методами сравнительной геномики. Поэтому о нем мы знаем намного больше, чем обо всех предыдущих стадиях развития жизни. Сравнивая последовательности генов разных современных организмов, мы можем построить родословные деревья этих генов. Чем меньше различий в последовательностях двух генов, тем позже разделились их предки. Именно таким способом, сравнивая последовательности генов рибосомных РНК, Карл Везе в 1977 году открыл архей. Точнее, ряд видов архей, конечно, был известен микробиологам задолго до 1977 года, но их биохимические особенности считались просто приспособлениями к жизни в горячих источниках. Только сравнение последовательностей рибосомных РНК показало, что отличия архей от бактерий очень глубоки и отражают древность их расхождения.

К сожалению, родословные деревья, построенные по разным генам, часто не совпадают между собой. Причин этому много, и одна из них – горизонтальный перенос генов, т. е. перемещение гена из одного организма в другой, неродственный. Часто это происходит при участии вирусов, а некоторые микробы при наступлении неблагоприятных условий сами начинают поглощать любую ДНК из окружающей среды «в надежде», что в ней окажутся гены, полезные для новых условий. Гены рибосомных РНК, судя по всему, наименее подвержены горизонтальному переносу, поэтому дерево, построенное по ним, хорошо отражает реальную историю видов.

Сравнение деревьев, построенных по разным генам, позволяет нам найти события горизонтального переноса в эволюции этих генов. Если изучаемый ген имелся еще у LUCA и с тех пор передавался только по наследству от родителей к потомкам, то его родословное дерево будет похоже на дерево клеток, от его корня будут расходиться две большие ветви бактерий и архей. Если же дерево генов имеет другой вид, то эволюционная история этого генного семейства была сложнее. Например, если его архейные гены вклиниваются на дереве между бактериальными и присутствуют у меньшинства архей – здесь можно предположить появление гена в линии бактерий и последующий его горизонтальный перенос в некоторые группы архей.

 

Набор генов LUCA

Сравнение прочитанных на сегодня геномов бактерий и архей показывает, что общий предок имел довольно внушительный набор разнообразных генов – более 1000 семейств. Это число соответствует уровню достаточно сложных бактерий. Удивительно, что в этот предковый набор входят гены множества разных метаболических путей, которые ныне не встречаются вместе у одного одноклеточного организма.

Что же нам говорит сравнительная геномика об истории различных клеточных систем? Большинство компонентов системы синтеза белков были уже у LUCA. Это все рибосомные РНК, 33 из 60–65 рибосомных белков и как минимум 17 из 20 аминоацил-тРНК-синтетаз. Рибосомы бактерий и архей отличаются между собой только вспомогательными рибосомными белками.

Несколько отличается история аминоацил-тРНК-синтаз – они претерпели множество горизонтальных переносов, особенно между разными группами бактерий. Аминоацил-тРНК-синтазы, по-видимому, достаточно автономны и взаимодействуют только с тРНК и неизменными аминокислотами. Но главное, что все они восходят к двум общим предкам I и II семейств, возникших еще до LUCA.

Система транскрипции (создания РНК на матрице ДНК) тоже существовала у общего предка бактерий и архей, однако ее устройство отличалось от существующей в современных клетках аналогичной системы. Центральным белком системы транскрипции является ДНК-зависимая РНК-полимераза, которая строит РНК на матрице ДНК. В современных клетках бактерий и архей гены организованы в опероны – блоки из нескольких генов, с которых читается единая матричная РНК. Транскрипция начинается на специальном участке (промоторе) в начале оперона и заканчивается на участке терминации в конце оперона. Для жизнедеятельности клеток активность разных генов должна регулироваться. Многие гены нужны только в определенных ситуациях. Например, кишечная палочка имеет гены, кодирующие ферменты усвоения молочного сахара (лактозы). Эти гены включаются (с них идет транскрипция) только тогда, когда в среде есть лактоза и нет более доступных сахаров, таких как глюкоза и фруктоза.

Регуляция активности генов происходит прежде всего на этапе начала транскрипции. Связывание РНК-полимеразы с промотором сложно регулируется с участием множества белков – транскрипционных факторов. Например, лактозный репрессор – это транскрипционный фактор, т. е. белок, который может связываться с промоторной областью лактозного оперона. Он мешает связыванию РНК-полимеразы с ДНК и не позволяет ей начать транскрипцию. Однако если в клетке есть лактоза, то лактозный репрессор связывается с ней, а не с ДНК, и РНК-полимераза может начать работу на лактозном опероне. Регуляция транскрипции на последующих этапах путем досрочного отделения РНК-полимеразы от ДНК, когда готова только часть мРНК, тоже используется, но ее роль гораздо менее значима.

Только два белка системы транскрипции унаследованы бактериями и археями от LUCA. Это ДНК-зависимая РНК-полимераза и транскрипционный фактор NusG. Он регулирует как раз досрочное отделение РНК-полимеразы. Сложные системы начала транскрипции у бактерий и архей не имеют между собой ничего общего. Следовательно, транскрипция была у LUCA, но регулировалась совсем не так, как в современных клетках.

Система репликации (так в молекулярной биологии называют копирование) ДНК у бактерий и архей устроена в общих чертах похоже, но одинаковые роли в ней играют разные, часто совершенно неродственные белки. То же относится и к системе синтеза дезоксинуклеотидов для ДНК. Мы в деталях рассмотрим сходства и различия этих систем у бактерий и архей ниже в данной главе. Это касается, прежде всего, главного участника процесса – ДНК-зависимой ДНК-полимеразы. Данный фермент у архей и бактерий отличается разительно.

Ферменты, которые делают дезоксинуклеотиды для построения ДНК, тоже, скорее всего, возникали не один раз. Существует два неродственных семейства тимидилат-синтаз, ThyA и ThyX, которые много раз подвергались горизонтальным переносам. Оба семейства есть среди бактерий, архей и вирусов, так что мы не знаем, у кого они впервые возникли.

Рибонуклеотид-редуктазы делятся на три семейства, отличающихся коферментами, механизмами реакции и чувствительностью к кислороду. Все три семейства известны у бактерий, архей, эукариот и вирусов, и часто у одного организма есть рибонуклеотид-редуктазы разных семейств. У бактерий Lactobacillus casei и Pseudomonas aeruginosa есть все три семейства, которые используются в зависимости от наличия кислорода. При этом на уровне трехмерной структуры все три семейства сходны между собой и с еще одним ферментом – пируват-формат-лиазой, разделяющей молекулу пировиноградной кислоты на ацетил-КоА и муравьиную кислоту. Так что мы не знаем, имеют ли рибонуклеотид-редуктазы единое происхождение или они несколько раз возникали из других ферментов, проводящих реакции с радикалами, например пируват-формат-лиазы.

Мы видим, что различные клеточные системы пришли к современному виду не одновременно. Устройство рибосом стабилизировалось еще до LUCA, а вот системы транскрипции и особенно репликации (копирования) ДНК пришли к современному виду уже после разделения бактерий и архей.

 

Геномный материал LUCA и предшествующих стадий эволюции

На основании того, что ключевые ферменты копирования ДНК у бактерий и архей не просто разные, а явно неродственные, было выдвинуто предположение, что LUCA еще обладал РНК-геномом, а переход к ДНК произошел независимо в линиях бактерий и архей (Forterre, 2006). Но эту идею трудно примирить с другими данными.

Сравнительная геномика показывает, что у LUCA было более 1000 генов. Такое количество генов общего предка бактерий и архей означает, что его геном имел достаточно большой размер, порядка 2 млн пар нуклеотидов (для сравнения: геном кишечной палочки имеет длину около 4 млн пар нуклеотидов, самый маленький геном свободноживущей бактерии Pelagibacter ubique – около 1,3 млн пар нуклеотидов). РНК-геномы современных вирусов не превышают 30 000 пар нуклеотидов, тогда как у ДНК-вирусов они достигают 2 млн пар. Размер РНК-геномов ограничен по многим причинам. Во-первых, цепь РНК подвержена самопроизвольным разрывам и еще легче разрывается ионами железа, щелочами и просто высокой температурой. Во-вторых, одно из азотистых оснований – цитозин – в воде постепенно теряет аминогруппу (дезаминируется), превращаясь в другое основание – урацил. В-третьих, при образовании шпилек в РНК нередко образуются каталитические активные участки-рибозимы, которые разрезают себя сами.

Все эти недостатки РНК устранены в ДНК. ДНК содержит дезоксирибозу, не имеющую 2' – гидроксильных групп, с которых начинается большинство реакций гидролиза (рис. 14.1). Эти же гидроксильные группы важны для каталитической активности РНК, поэтому ДНК в отличие от РНК не образует саморазрезающихся рибозимов. Наконец, вместо урацила в ДНК содержится его аналог с дополнительной метильной (СН3) группой – тимин, поэтому урацил, получившийся при дезаминировании цитозина, легко можно обнаружить и починить.

Как показано в работах Манфреда Эйгена, для поддержания структуры живой системы из поколения в поколение необходимо, чтобы среднее количество новых значимых (т. е. сильно влияющих на приспособленность) мутаций в каждом поколении не превышало одной. Все современные организмы, имеющие геномы в диапазоне от 5000 до 5 000 000 нуклеотидов (а это вирусы и бактерии), имеют частоту мутаций в пределах 0,5–1 за поколение, что ниже порога Эйгена. Животные и растения с большими геномами обошли это ограничение за счет избыточности многих генов и полового размножения (так, у человека в среднем происходит 30 новых мутаций за поколение), но вряд ли эти механизмы работали в РНК-мире. Частота мутаций складывается из двух факторов: частоты ошибок при копировании генома и частоты повреждений генома между копированиями. Точность работы РНК-зависимой РНК-полимеразы в принципе может быть достаточно высокой: в экспериментах по искусственному отбору точность РНК-полимеразы вируса желтой лихорадки была доведена до 1 ошибки на 5 000 000 нуклеотидов, что близко к точности бактериальных ДНК-полимераз (Pugachev et al., 2004). Однако уязвимость РНК к гидролизу и дезаминированию цитозина неизбежно вызывает частое появление мутаций между копированиями и ограничивает размер РНК-генома на уровне менее 100 000 пар нуклеотидов.

Реакция превращения рибозы в дезоксирибозу очень сложна и связана с образованием опасных радикалов. Рибозимы не могут ее проводить, так как будет повреждаться рибоза в их структуре. Все известные ферменты, проводящие эту реакцию (рибонуклеотид-редуктазы), – большие белки размером около 1000 аминокислот, т. е. для их кодирования нужно как минимум 3000 нуклеотидов. Поэтому между РНК и ДНК-геномами, возможно, были промежуточные стадии, более простые в получении, чем ДНК, но более стабильные, чем РНК. Одной из таких промежуточных стадий мог быть метил-РНК-геном (Poole et al., 2000). В современных рибосомных и некоторых других клеточных РНК к отдельным 2' – гидроксильным (-ОН) группам рибозы присоединены метильные (-СН3) группы (рис. 14.1, справа). Это блокирует «паразитные» каталитические процессы и защищает цепь РНК от гидролиза в метилированном месте. Метилирование РНК у архей и эукариот делается одним ферментом при помощи «направляющих» малых ядрышковых РНК (мяРНК, snoRNA). Метилированию подвергается до 1–2 % нуклеотидов рибосомной РНК в клетках, а в пробирке в отсутствие мяРНК тот же фермент может прометилировать до 8 % нуклеотидов. Стабильность метил-РНК генома могла отодвинуть предел Эйгена в несколько раз по сравнению с РНК-геномом, возможно, до 300 000–500 000 пар нуклеотидов.

 

LUCA – организм или сообщество?

Предельный размер метил-РНК-генома недостаточен для кодирования всех белков, которые были у LUCA. Что еще важнее, в наборе генов LUCA закодированы дублирующие пути обмена веществ, которые разными способами дают один и тот же продукт. В современных клетках это бывает редко, и обычно два альтернативных пути работают в разных условиях, например при наличии и отсутствии кислорода. Так, в работе Браакмана и Смита (2013) изучалась эволюция путей фиксации углекислого газа, начиная от LUCA. Авторы пришли к выводу, что у LUCA было дублирование путей фиксации CO2, причем оба пути – восстановительный цикл Кребса и ацетил-КоА-путь – работали одновременно. Они предположили, что такое дублирование обеспечивало надежность обмена веществ в условиях несовершенной регуляции генов и слабой изоляции внутренней среды организма от внешней. Но вряд ли этим можно объяснить все случаи дублирования биохимических функций LUCA.

По набору путей обмена веществ получается, что общий предок мог «в одиночку» составлять целую экосистему с замкнутыми геохимическими циклами, что практически не встречается в современной биосфере. Лишь недавно в золотой шахте на глубине свыше 2 км была найдена бактерия Desulforudis audaxviator, полностью обеспечивающая себя всем необходимым без помощи других видов (см. ), но это удивительное исключение. Иными словами, по разнообразию путей обмена веществ последний общий предок больше похож на современное микробное сообщество из многих видов, чем на любой отдельный вид бактерий или архей.

На основе этих данных выдвигались радикальные идеи относительно неклеточной природы общего предка. Например, в статье Мартина и Рассела (2007) рассматривается LUCA в виде сообщества генетических элементов, населяющих микронного размера поры в сульфидных отложениях горячих источников. Стенки в минеральных осадках разделяют протоклетки друг от друга, выполняя функцию мембран. Хотя подобная стадия наверняка была в начале эволюции РНК-мира, присутствие ряда мембранных белков в реконструированном наборе генов LUCA, например, роторной АТФазы, говорит о наличии у него мембран. В последнее время исследователи (например, Koonin, 2009) склоняются к представлению о LUCA как о сообществе молекул РНК и ДНК, обитавшем на поверхности минералов, но имевшем липидные мембраны (вопросу эволюции мембран посвящена следующая глава). Мембраны могли покрывать плоские скопления белков и нуклеиновых кислот на поверхности минерала, чтобы уменьшить их размытие в воду, а также формировать свободно плавающие мембранные пузырьки – расселительные стадии плоских «организмов-сообществ», первые объекты, похожие на клетки.

Одни генетические элементы, составлявшие эти сообщества, демонстрировали более кооперативное поведение, кодировали компоненты рибосомы и ферменты обмена веществ и в дальнейшем вошли в состав клеток. Другие паразитировали на сообществе и стали предками вирусов. Обмен генов объединял это сообщество в достаточной степени, чтобы его члены не могли эволюционировать как раздельные биологические единицы. Каждый отдельный генетический элемент такого сообщества по размеру и содержанию входящих в него генов соответствует вирусу, плазмиде или оперону в клеточном геноме (оперон – группа генов, которые выполняют общую функцию, транскрибируются в общую матричную РНК и регулируются согласованно). Сообщество этих генетических элементов соответствует по количеству и разнообразию генов современному микробному сообществу. Но элементы, похожие на современные клетки (окруженные мембраной и с геномом в виде большой молекулы ДНК, объединяющей сотни оперонов), в такой системе выделить невозможно. Клетки выделились из этой системы позднее путем объединения нескольких главных оперонов, кодирующих рибосому и систему репликации, с большим количеством подчиненных оперонов, кодирующих ферменты обмена веществ.

Такой формат генома объясняет и ситуацию с системой транскрипции LUCA, о которой мы говорили выше. В малых генетических элементах, таких как плазмиды, вирусы и митохондриальные геномы животных, часто есть один район, в котором начинается как копирование, так и транскрипция генов, и запускаются они с участием одних и тех же вспомогательных белков. Поэтому активность генов такого элемента регулируется только вместе с активностью копирования всего генетического элемента. Если нужно регулировать активность генов, не влияя на копирование, то это можно делать путем прерывания транскрипции на определенном гене, в чем и участвует имевшийся у LUCA транскрипционный фактор NusG. Кроме того, в такой системе можно регулировать активность генов при помощи РНК-переключателей в матричной РНК. РНК-переключатели – это структуры из нескольких шпилек, которые могут сворачиваться по-разному в зависимости от того, связана ли с ними какая-нибудь малая молекула. Подобный РНК-переключатель, например, регулирует гены синтеза витамина В1 у бактерий. Когда этого витамина в клетке достаточно, РНК-переключатель связывает его молекулу и меняет форму на такую, которая мешает посадке рибосомы на эту матричную РНК. РНК-переключатели встречаются и сейчас в клетках и регулируют активность многих генов вообще без участия белков.

Геном из многих отдельных молекул ДНК (хромосом) сейчас существует у эукариот – организмов с клеточным ядром. Для точного распределения копий многих молекул по дочерним клеткам при делении нужны специальные механизмы. Геном эукариот состоит из нескольких (до сотен) хромосом, и при делении клетки копии хромосом разделяются по дочерним клеткам при помощи клеточного скелета, формирующего веретено деления, и транспортных белков. Этот процесс похож на эпизод классического балета и точно так же скоординирован. Вряд ли LUCA имел что-то сопоставимое, а без специальных механизмов копии будут разделяться по потомкам случайно. Если геном состоит из десяти фрагментов и надо разделить две копии каждого по потомкам, то вероятность попадания копий каждого фрагмента в обоих потомков – меньше 1 %. Большинство потомков в этом случае получит неполный набор геномных фрагментов.

Есть более простой способ передачи копий геномных фрагментов каждому потомку. У бактерий многие мелкие плазмиды (мелкие молекулы ДНК, существующие в клетке наряду с основной геномной молекулой) образуют по 10–20 копий на клетку. При делении клетки безо всяких специальных механизмов обе дочерние клетки с высокой вероятностью (99,9 % при 10 копиях) получат хотя бы под одной копии плазмиды каждая. Но если таким способом делить много разнотипных плазмид, то вероятность успешного разделения всех плазмид оказывается ниже – около 99 % для 10 видов плазмид, 90 % – для 100 видов и 60 % – для 500 видов. Количество оперонов LUCA оценивается примерно в 500, и если каждый из них в то время был отдельной плазмидой, то разделить их правильно между дочерними клетками получается далеко не всегда.

Возможно, что самостоятельные генетические элементы могли распространяться, подобно вирусам. Вирусы, выходя из зараженной клетки, упаковывают генетический материал в стойкие белковые оболочки, уплывают от места размножения и заражают новые клетки. На доклеточной стадии эволюции граница между вирусами и остальными организмами была не такой четкой, как сейчас. И будущие вирусы, и будущие элементы клеточных геномов имели сравнимые размер и сложность генома. Они отличались только стратегией поведения. Одни генетические элементы кодировали систему синтеза белков или разные ферменты обмена веществ и образовывали кооперативные сообщества, где разные гены помогали размножению друг друга. Они позже вошли в состав клеточных геномов. Другие же паразитировали на кооперативных сообществах и кодировали белки, необходимые для заражения и распространения. Благодаря интенсивному обмену генов все вирусные новшества были доступны и кооперативным генетическим элементам.

Кстати, и сейчас есть генетические элементы, которые сочетают полезные для клетки гены и почти вирусные приемы распространения. Многие бактериальные плазмиды несут полезные для клетки гены, например гены устойчивости к антибиотикам. Наряду с полезными генами у них бывает система токсин-антитоксин: два гена, кодирующие два белка. Один белок ядовит для клетки и устойчив, другой работает противоядием, но быстро разлагается. В случае потери плазмиды клетка лишится противоядия, а запас устойчивого яда ее убьет. В результате плазмида устойчиво сохраняется в клетках даже в тех условиях, когда ее гены бесполезны для клетки.

Если каждая из частей генома сама может позаботиться о своем будущем и в виде вирусоподобной частицы перепрыгнуть в те «организмы-сообщества», которые ее не унаследовали, то возможно устойчивое воспроизведение генома из десятков и сотен отдельных молекул. В этом случае даже на основе чистой РНК можно вместить в одном организме более 1000 генов. Кстати, разные части генома при этом не обязаны иметь одинаковый химический состав и механизмы копирования. С тем же успехом сегментарный геном LUCA может сочетать ДНК и РНК.

 

Мир вирусов и переход от РНК к ДНК

Мы видим, что история предков клеток предположительно тесно переплетена с историей вирусов. Многие биологи отказывали вирусам в праве называться «живыми» потому, что в вирусной частице нет обмена веществ. Однако споры бактерий и грибов тоже до попадания в благоприятные условия останавливают обмен веществ. Даже лягушку можно заморозить в жидком азоте с полной остановкой всех биохимических реакций, но после размораживания она оживет. Вирусная частица (вирион) – это просто покоящаяся стадия жизненного цикла вируса. Крупнейший вирусолог Патрик Фортер предлагает считать основной стадией жизни вируса его активный этап жизни, проходящий в зараженной клетке. Многие вирусы при этом образуют «вирусные фабрики» – особые структуры, сочетающие в себе клеточные и вирусные белки и собирающие новые вирусные частицы. «Вирусные фабрики» и в целом зараженные клетки («вироклетки», как предлагает их называть Фортер), естественно, имеют обмен веществ и, без сомнения, могут называться живыми. При этом они находятся под контролем вирусного генома и производят новые вирусные частицы, а не новые копии клетки, т. е. это, безусловно, живая стадия вируса.

Эволюционная биология долго пренебрегала вирусами, и лишь в последние годы они получили признание как важнейшие агенты горизонтального переноса генов, создатели принципиально новых генов и партнеры по «гонке вооружений» со всеми клеточными организмами. Эта революция подробнее описана, например, у Евгения Кунина в книге «Логика случая. О природе и происхождении биологической эволюции» (М., 2014).

Вирусы, по-видимому, существуют со времен РНК-мира. Существует огромное их разнообразие – одно– и двухцепочечные ДНК-вирусы, ретровирусы, одно– и двухцепочечные РНК-вирусы. Механизмы их репликации очень разные, и не всегда понятно, как одни могли произойти из других. Однако есть несколько характерных генов, которые встречаются во всех классах вирусов и совершенно отсутствуют в клеточных организмах. Это JRC (так называемый рулет с вареньем, jelly-roll capsid protein) – один из типов белков вирусных оболочек, хеликаза S3H, запускающая копирование разных типов вирусных геномов, и упаковочная АТФаза, переносящая ДНК и РНК в собранные белковые оболочки с затратой АТФ. Широкое распространение этих генов означает, что вирусы с древнейших времен составляли единый «вирусный мир» и обменивались между собой генами, если одновременно заражали одного хозяина.

Благодаря вирусам можно обойти еще одно сложное место на пути от РНК-геномов к ДНК-геномам. Как мы говорили выше, частота мутаций складывается из двух факторов: ошибки при копировании генома и повреждения геномных молекул между копированиями. Переход от РНК к ДНК снижает уровень повреждений между копированиями, но частота ошибок копирования в момент перехода должна возрасти! При смене типа геномного материала нужны перестройки фермента-полимеразы, который отвечает за копирование. Старая, хорошо отработанная и достаточно точная полимераза при этом неизбежно сменяется на «сырую» и недоработанную. Позже естественный отбор доведет точность новой полимеразы до совершенства, но непосредственно в момент смены РНК на ДНК отбор будет поддерживать старый геном с точной полимеразой. Закрепление замены урацила на тимин еще проблематичнее. Сам по себе тимин ничуть не лучше урацила. Он позволяет находить и исправлять дезаминирование цитозина в геноме, но для этого нужно еще несколько ферментов. Тимин в ДНК выгоднее, чем урацил, когда уже есть система обнаружения урацила в ДНК и замены его на цитозин. Но по отдельности тимидилат-синтаза бесполезна, а система замены урацила вредна, и непонятно, какой из этих ферментов мог возникнуть первым.

Патрик Фортер (Forterre, 2005; Forterre, Prangishvili, 2009) разрешает эту проблему. По его гипотезе эксперименты с новыми полимеразами велись вирусами, а первой выгодой от смены типа генома было ускользание от защитных систем хозяина. Большинство клеток и в наше время используют разные ферментативные системы, опознающие и уничтожающие вирусные ДНК и РНК. «Гонка вооружений» между вирусами и их доклеточными хозяевами могла вызвать очень быструю эволюцию геномных материалов и полимераз для их копирования. И сегодня у вирусов встречаются разнообразные геномные нуклеиновые кислоты, например ДНК с урацилом у бактериофагов PBS1 и PBS2 (Forterre, 2002). Среди вирусов известны ДНК с дополнительными модификациями нуклеотидов: гидроксиметилцитозин у бактериофага T4, гидроксиметилурацил у бактериофага SP01 и 2-аминоаденин у цианофага S-2L (Poole, Logan, 2005). Все эти странные нуклеотиды помогают вирусной ДНК избежать расщепления ферментами хозяина.

Если замена рибозы на дезоксирибозу когда-то позволила вирусу в 10 раз эффективнее заражать жертв ценой 5-кратного роста числа мутаций, то это было выгодное решение. Кроме того, малый размер вирусных геномов смягчает требования к точности копирования. А необходимость долгого автономного существования вирусной частицы без возможности исправить повреждения и без УФ-защиты минералов ужесточает отбор на устойчивость вирусного генома по сравнению с геномом протоклеток. Лишь после отработки в вирусах новые полимеразы были подхвачены их хозяевами (рис. 14.2).

 

Происхождение систем репликации ДНК

Клеточная ДНК существует в двухцепочечной форме, причем цепи направлены навстречу друг другу. Молекула ДНК-полимеразы, строящая новую цепочку по шаблону старой, всегда двигается в одном направлении – от 3` к 5` концу. Поэтому нельзя просто взять две молекулы ДНК-полимеразы и начать ими синтез двух новых цепей из одной точки двух старых цепей – молекулы ДНК-полимеразы будут двигаться в разные стороны, и большая часть генома в процессе копирования окажется в уязвимой одноцепочечной форме. Чтобы обойти эту сложность, копирование ДНК в клетках идет при помощи специальной молекулярной машины, которая называется «репликативная вилка» и состоит из более чем 20 видов белков. В этом комплексе работа нескольких молекул ДНК-полимеразы согласована так, чтобы не было длинных одноцепочечных участков ДНК.

Как работает репликативная вилка? Прежде всего, двухцепочечную ДНК надо расплести на две отдельные цепи. Это делает фермент хеликаза, молекула которого имеет форму кольца, надетого на двойную спираль ДНК. Хеликаза раскручивает двойную спираль с затратой энергии АТФ. Далее, чтобы одиночные цепи ДНК за хеликазой не соединились обратно в двойную спираль, к ним прикрепляются специальные белки, называемые SSB (single-strand binding – белки, связывающие однонитевую ДНК). После этого на матрице старых цепей ДНК полимеразы могут строить новые цепи. Поскольку цепи направлены навстречу друг другу, а репликативная вилка движется в одну сторону, то копирование двух цепей идет по-разному. Одна старая цепь, по которой репликативная вилка движется от 3` конца к 5`, называется лидирующей. Молекула ДНК-полимеразы просто строит на ней вторую цепь без каких-либо сложностей. По второй старой цепи ДНК (ее называют отстающей) репликативная вилка движется от 5` к 3` концу – в обратную сторону по сравнению с тем, как должна двигаться полимераза. Это противоречие решается через движение полимеразы скачками. Сначала ДНК-полимераза отстающей цепи движется по ней от 3` к 5` концу, строя на ней фрагмент новой цепи (эти куски получили название «фрагменты Оказаки»). Когда длина нового фрагмента достигнет 1000–2000 нуклеотидов, она прекращает синтез и совершает скачок обратно, к 3` концу, на расстояние в две длины фрагментов Оказаки, и оттуда начинает синтез следующего. Точнее, полимераза не совершает скачков, она жестко скреплена с полимеразой лидирующей цепи и другими белками репликативной вилки. Вместо этого отстающая цепь движется через репликативную вилку то в одну, то в другую сторону. Во время синтеза фрагмента Оказаки из вилки выступает все более длинная петля отстающей цепи, а потом она быстро продергивается обратно (рис. 14.3).

Такое поведение полимеразы напоминает историю попугая-контрамота из «Понедельник начинается в субботу». Попугай, который после уникального эксперимента стал жить из будущего в прошлое, сначала попался на глаза героям книги в виде трупа, на второе утро был болен и потом умер, а на третий день оказался живым и здоровым. Однако в пределах одного дня жизнь попугая шла в привычном порядке – он сначала заболел, потом умер; и летал он не задом наперед, а обычным образом.

Такой способ синтеза отстающей цепи – из фрагментов Оказаки – создает свои сложности (рис. 14.4). Все ДНК-полимеразы нуждаются в затравке, или праймере – коротком фрагменте РНК, который комплементарно связан со старой цепью ДНК, и новая цепь ДНК образуется путем удлинения праймера. На отстающей цепи на каждый фрагмент Оказаки нужен свой праймер. Поэтому после работы ДНК-полимеразы новую отстающую цепь обрабатывают еще несколько ферментов. РНКаза Н удаляет РНК-затравки, а вспомогательная ДНК-полимераза вставляет ДНК на их место. Между концом одного фрагмента Оказаки и началом следующего после этого остаются «надрезы» – два соседних нуклеотида новой цепи, между которыми нет связи. Эти надрезы заделывает еще один вспомогательный фермент – ДНК-лигаза. Кроме перечисленных ферментов в репликации участвует еще несколько:

• праймазы делают РНК-затравки, с которых начинается синтез ДНК (один раз – на лидирующей цепи и на каждый фрагмент Оказаки для отстающей цепи);

• 3`–5` экзонуклеазы проверяют точность копирования за ДНК-полимеразами и удаляют неправильно вставленные нуклеотиды;

• топоизомеразы не дают ДНК запутаться в беспорядочный клубок. Эти белки совершают небольшое чудо, которое вызовет зависть у любителей шитья и вязания: пропускают одну нить ДНК через другую, так что обе нити в итоге остаются целыми;

• белок-застежка (он еще называется «скользящий зажим», или сlamp) удерживает всю конструкцию репликативной вилки на ДНК;

• репликационный фактор С (он же белок-погрузчик скользящего зажима, или Сlamp loader) с затратой энергии АТФ защелкивает его в начале репликации;

• в составе репликативной вилки могут быть структурные белки, образующие «скелет» ее конструкции, но не имеющие ферментативной активности. Например, у дрожжей и животных это комплекс GINS из четырех белков.

У вирусов можно встретить большое разнообразие систем репликации. Вирусы с большим геномом, например бактериофаг Т4 (170 000 нуклеотидов), имеют репликативные вилки, похожие на клеточные, но устроенные несколько проще. Одноцепочечные участки ДНК и РНК длиной до 10 000 нуклеотидов достаточно устойчивы, поэтому для вирусов с малыми геномами репликативная вилка не нужна. Они могут использовать самые разные варианты системы репликации. Например, механизм репликации «катящегося кольца» при помощи одной молекулы полимеразы производит длинную одноцепочечную молекулу ДНК, содержащую много линейных копий кольцевой матрицы. Потом эти копии разделяются и замыкаются в кольца при помощи ферментов рекомбинации. У ряда вирусов в качестве затравки (праймера) для начала новой цепи может использоваться не РНК, а специальный белок. Наконец, бывают ретровирусы, у которых ДНК строится на матрице РНК, а РНК – на матрице ДНК, т. е. два типа геномного материала чередуются в жизненном цикле. Более того, многие вирусы используют для своей репликации ферменты хозяина, заставляя их работать в нештатном режиме. Например, у бактериофага лямбда репликация по механизму «катящегося кольца» идет при помощи ДНК-полимеразы клетки-хозяина, в норме работающей в составе репликативной вилки. Так что контекст, в котором работают ДНК-полимеразы, может легко и быстро меняться в ходе эволюции.

Система репликации ДНК в клетках причудливо сочетает компоненты, унаследованные от LUCA, с независимо возникшими (табл. 14.1). Удивительно, что меньше всего сходства между бактериями и археями есть в самых главных компонентах репликативной вилки – ДНК-зависимой ДНК-полимеразе и праймазе. ДНК-полимеразы архей и бактерий не имеют в своей структуре ничего общего. Бактериальные праймазы родственны двум семействам хеликаз, а архейные праймазы не обнаруживают сходства ни с какими другими белками.

Другие компоненты репликативной вилки, хотя имеют сходство у бактерий и архей, но скорее всего, независимо приняли одинаковые функции. Например, работающие в репликации хеликазы всех организмов относятся к одному суперсемейству Р-петли (P-loop ATPase). Но в этом суперсемействе архейные хеликазы ближе к I семейству РНК-хеликаз, а бактериальные хеликазы – к белкам запуска репликации RecA. Проверочные 3' – 5' ДНК-экзонуклеазы относятся к одному большому суперсемейству, но архейные и бактериальные ферменты в нем ближе к разным семействам РНК-экзонуклеаз, чем друг к другу. SSB-белки бактерий и архей тоже принадлежат к одному семейству OB-укладки, куда входят различные ДНК– и РНК-связывающие белки. Однако архейные SSB-белки в пределах этого семейства ближе к аминоацил-тРНК-синтетазам, чем к своим бактериальным аналогам.

Многие вспомогательные компоненты репликативной вилки имеют общее происхождение у бактерий и архей: ДНК-лигазы, скользящий зажим, загрузчик скользящего зажима. РНКазы Н бактерий и архей тоже сходны и имеют общее происхождение, но не обязательно от LUCA. Этот же фермент есть и у ретровирусов. Он мог независимо попасть от них в клетки бактерий и архей.

Общее происхождение скользящего зажима и его погрузчика означает, что структура репликативной вилки, копирующей одновременно две цепи, могла существовать у LUCA – для более простых механизмов, например «катящегося кольца», скользящий зажим и ферменты его погрузки не требуются. Существование репликативной вилки указывает на большие геномные молекулы длиной более 100 000 пар нуклеотидов. Наличие у LUCA ДНК-лигазы и ДНК-зависимой РНК-полимеразы означает, что ДНК в какой-то форме у него уже была. Но принципиально разные ДНК-полимеразы и праймазы бактерий и архей объяснить труднее.

Возможны три основных объяснения:

1) LUCA имел обе версии системы репликации ДНК одновременно, бактерии унаследовали одну, археи – другую;

2) LUCA имел одну из современных систем репликации, в одной из двух линий потомков она была заменена на новую;

3) система репликации LUCA принципиально отличалась и от бактериальной, и от архейной, обе линии потомков ее заменили на современные варианты.

Leipe, Aravind, Koonin (1999) тогда сделали выбор в пользу третьего варианта. По их предположению, LUCA имел гетеродуплексный ДНК-РНК геном, в двухцепочечной форме которого была одна цепь РНК и вторая – ДНК. Такие двойные спирали из разных цепей называются гетеродуплексами. ДНК-РНК-гетеродуплексы прочнее, чем РНК и метил-РНК. Предполагаемый механизм репликации показан на рисунке 14.5 Б. Clamp и Clamp Loader – скользящий зажим и его погрузчик исходно могли помогать обратной транскриптазе не отделяться от копируемой цепи до окончания копирования. Нельзя, впрочем, исключить и другой вариант: у LUCA была репликативная вилка, и в ней работали вместе обратная транскриптаза и ДНК-зависимая РНК-полимераза.

Предположение о гетеродуплексном геноме LUCA легко объясняет, почему бактерии и археи имеют неродственные ДНК-полимеразы. Копировать двухцепочечную ДНК напрямую надежнее, чем через промежуточную стадию РНК, поэтому замена обратной транскриптазы на ДНК-зависимые ДНК-полимеразы была поддержана отбором в линиях бактерий и архей. Это предположение хорошо согласуется и с данными по РНК-полимеразе и ее вспомогательным белкам. Если РНК-полимераза делала молекулы РНК размером в целый геномный фрагмент, то начало и окончание ее работы должны были регулироваться не так, как в современных клетках. Казалось бы, все понятно, но последующие открытия только запутали картину.

 

Разнообразие и происхождение ДНК-полимераз

В работе Лейпе с соавторами не был учтен тот факт, что все клетки имеют как минимум две ДНК-полимеразы – главную и вспомогательную. Главная полимераза делает основную работу по копированию генома, а вспомогательная заполняет ДНК пустые места на месте удаленных РНК-затравок и поврежденных участков генома. У архей главная и вспомогательная ДНК-полимеразы обычно родственны друг другу и имеют похожие трехмерные структуры, а вот у бактерий две ДНК-полимеразы не похожи ни на архейных «коллег», ни друг на друга. Большинство клеточных полимераз относятся к трем семействам: PolA, PolB и PolC.

К семейству PolB относятся главные и вспомогательные ДНК-полимеразы архей и эукариот, а также подавляющее большинство вирусных ДНК-полимераз. Это семейство имеет трехмерную укладку (фолд) «ладонь и пальцы» (palm-and-fingers), которая характерна и для вирусных обратных транскриптаз, и РНК-зависимых РНК-полимераз. По всей видимости, семейство PolB имеет долгую и богатую историю репликации самых разнообразных геномов (Koonin et al., 2006).

В противоположность им семейство PolC составляют исключительно главные ДНК-полимеразы бактерий. Лишь немногие бактериофаги имеют ДНК-полимеразы семейства PolC, которые они, по всей видимости, недавно позаимствовали у своих хозяев. Трехмерная структура полимераз семейства PolC указывает на их дальнее родство с нуклеотидилтрансферазами – ферментами, достраивающими нуклеотидные цепи без помощи матрицы (Bailey et al., 2006). К ним относятся, например, ССА-трансферазы, участвующие в созревании тРНК, и полиА-трансферазы, достраивающие концы из повторяющихся адениновых нуклеотидов у матричных РНК эукариот.

Наконец, ДНК-полимеразы семейства PolA играют вспомогательную роль у бактерий и копируют геномы некоторых бактериофагов (например, Т7) и митохондрий. Их трехмерная структура отдаленно похожа на укладку «ладонь и пальцы», т. е. они произошли от той же предковой молекулы, что и PolB, но этот предок явно еще не был ДНК-полимеразой.

Кроме этих обычных семейств были обнаружены еще несколько менее распространенных. Семейство PolD найдено у многих архей, но считалось вспомогательным. Однако оказалось, что у Thermococcus геном копирует полимераза PolD, а PolB нужна лишь для ремонта разрывов ДНК (Cubonova et al., 2013). У ряда других архей PolD копирует отстающую цепь, а PolB – лидирующую. Вспомогательные полимеразы семейств PolX и PolY встречаются у отдельных представителей бактерий, архей, эукариот и вирусов. Иначе говоря, ДНК-полимеразы явно возникали в эволюции много раз из ферментов с другими функциями.

Хуже того, оказалось, что функция полимеразы может меняться очень легко. Например, вирус гепатита D копирует свой РНК-геном при помощи ДНК-зависимой РНК-полимеразы хозяина, заставляя ее «читать» РНК вместо ДНК (Macnaughton et al., 2002). У ретровирусов обратная транскриптаза (РНК-зависимая ДНК-полимераза) строит первую цепь двухцепочечного ДНК-генома на матрице РНК, а вторую – на матрице первой цепи ДНК, т. е. тоже читает и РНК, и ДНК. Тип молекулы, который полимераза может «писать», изменить чуть сложнее, но тоже легко. Замена всего двух нуклеотидов превратила ДНК-зависимую ДНК-полимеразу в РНК-полимеразу (Cozens et al., 2012).

В результате к 2015 году картина эволюции систем копирования ДНК окончательно запуталась. В 1999 году Лейпе с коллегами уверенно отвергали возможность замены одной ДНК-полимеразы в клетке на другую, потому что для этого нет очевидных причин. Данные по архейным полимеразам PolD показали, что у архей такие замены точно были, но мы не знаем их причины. Идея Фортера о вирусном происхождении клеточных ДНК-полимераз выглядит красиво и убедительно, но среди известных вирусов есть источники только PolA и PolB. Происхождение PolC от ферментов, строящих цепи РНК без матрицы, объяснить трудно. Происхождение PolD вообще неизвестно. Пока мы не узнали, какой из вариантов сотрудничества PolB и PolD у архей был исходно, трудно сказать что-то определенное про систему репликации LUCA. В рамках гипотезы о LUCA-сообществе возможно, что у него было несколько систем репликации и даже несколько типов генома (РНК, РНК-ДНК гибрид, ДНК) одновременно.

 

Заключение

Теперь мы можем подвести итоги. С появлением белкового синтеза первые живые системы сильно расширили свои возможности обмена веществ. Первая белковая РНК-зависимая РНК-полимераза сняла с рибозимов необходимость заниматься собственной репликацией и позволила сильно увеличить количество хранимой генетической информации. Белки также стали промежуточным звеном, создавшим возможность строить липидные мембраны. Так жизнь перешла из плоской формы прилипших к минеральной поверхности РНК к трехмерной форме – скоплениям РНК и белков во впадинах и полостях минеральных отложений, закрытых примитивными мембранами. Полная независимость от глины, сульфида цинка и других минералов тогда была еще невозможна, но появились первые структуры, похожие на клетки, – закрытые мембраной со всех сторон пузырьки, плавающие в воде. Они поначалу были расселительными стадиями плоских, сидящих на минералах протоорганизмов, геном которых состоял, по всей видимости, из множества разных молекул РНК, одно– или двухцепочечных, линейных и кольцевых. Механизмы их репликации, скорее всего, напоминали таковые у РНК-вирусов, их размер соответствовал размеру геномов РНК-вирусов, в пределах 30 000 нуклеотидов. Геномная молекула такого размера может кодировать простую систему трансляции с ее рРНК, тРНК, рибосомными белками и другими факторами.

Возможно, в протоорганизмах существовала «доминирующая» молекула РНК, кодирующая РНК-полимеразу и главные компоненты рибосомы, и многочисленные РНК-плазмиды, кодирующие ферменты обмена веществ, средства защиты и взаимодействия с внешним миром. При делении протоорганизмов эти геномные молекулы расходились не поровну и не попадали в некоторых потомков, что компенсировалось их способностью выходить наружу в виде вирусоподобных частиц и проникать в другие генетические комплексы. Наряду с «полезными» плазмидами уже тогда должен был быть весь спектр эгоистичных генетических элементов: от маленьких, ничего не кодирующих вироидов и специализированных вирусов с белковыми оболочками до внутригеномных паразитов, таких как интроны I типа и частично эгоистичных плазмид.

Вирусы в ходе «гонки вооружений» со своими хозяевами – плоскими протоорганизмами создали новые типы нуклеиновых кислот, такие как метил-РНК, урацил-ДНК и современную ДНК с тимином. Эти новые нуклеиновые кислоты были затем подхвачены протоорганизмами и позволили увеличить размер и стабильность генома. Изобретение ДНК и совершенствование механизмов ее копирования происходило параллельно в разных линиях вирусов, что привело к большому разнообразию ферментов, работающих с ДНК. Наконец, появление надежной репликации ДНК на матрице ДНК подготовило почву для объединения разнообразных генетических элементов в единые большие ДНК-геномы и последующего исхода бактериальных и архейных клеток из геотермальной колыбели в большой мир.

 

Какие мембраны были у LUCA?

В прошлой главе мы проследили происхождение геномной ДНК и механизмов ее репликации – от РНК-белкового мира до больших кольцевых молекул ДНК, составляющих геномы бактерий и архей. Попробуем теперь путем сравнения бактерий и архей узнать структуру мембран их общего предка.

Полярные и неполярные молекулы. Мембраны

Все клетки окружены мембраной – тонкой подвижной пленкой из двух слоев особых молекул, которые называются липидами. Почему липиды образуют именно пленку, а не капли? Схожие механизмы формируют стенки мыльных пузырей и масляные пленки на поверхности воды.

Чтобы разобраться в этом, надо обратиться к деталям строения молекул разных веществ. Например, в молекуле воды электроны, образующие связи кислорода с водородом, смещены к атому кислорода. Поэтому молекула воды электрически полярна – одна ее сторона несет положительный электрический заряд, а другая – отрицательный. Благодаря полярности молекулы воды притягиваются друг к другу. Другие вещества с полярными молекулами, такие как аммиак и этиловый спирт, прекрасно смешиваются с водой.

Если молекула состоит из атомов с примерно одинаковой электроотрицательностью, то в ней не будет местных электрических зарядов. Такими свойствами обладают, например, углеводороды (метан СН 4 , октан С 8 Н 18 , бензол С 6 Н 6 и др.). Неполярные молекулы не притягиваются к полярным. Поэтому при смешивании полярной жидкости с неполярной, например масла с водой, получается не раствор, а эмульсия – взвесь капель одной жидкости в другой. Если в воде или в масле перед смешиванием были растворены какие-либо вещества, они могут переходить из одной жидкости в другую, более подходящую ей по полярности молекул. Это хорошо видно в тарелке борща: красный краситель свеклы (беталаин) имеет полярные молекулы и растворяется в воде, а желтый краситель моркови (каротин) неполярен и переходит в капли жира на поверхности (рис. 15.1). Полярные молекулы еще называются гидрофильными («любящими воду»), а неполярные – гидрофобными («боящимися воды»).

Для получения мембран и мыльных пузырей нужны молекулы с более сложными свойствами. Они должны быть вытянутой формы, с одним полярным концом и другим неполярным. Простейшие молекулы с такими свойствами – жирные кислоты. Их натриевые соли широко используются под названием «мыло». При растворении мыла в воде его молекулы образуют мельчайшие, нанометрового размера шарики и палочки – мицеллы (рис. 15.2). Каждая молекула в мицелле полярным концом контактирует с водой, а неполярный конец спрятан внутри. На поверхности воды мыло образует слой толщиной в одну молекулу. Полярные концы молекул мыла обращены в воду, а неполярные – к воздуху. Стенка мыльного пузыря состоит из двух слоев молекул, они собраны полярными концами внутрь, а неполярными – к воздуху по обе стороны от стенки. Наконец, клеточная мембрана похожа на стенку мыльного пузыря, только вывернутую наизнанку. В мембране полярные концы липидных молекул обращены к воде по обе стороны, а неполярные скрыты внутри.

Мембраны современных бактерий состоят из фосфолипидов – сложных эфиров глицерола, двух остатков жирной кислоты и одного фосфатного остатка (рис. 15.3). К фосфатному остатку может быть присоединена дополнительная полярная группа: это может быть этаноламин, холин, аминокислота серин или многоатомный спирт инозитол. Гидрофобные хвосты жирных кислот образуют средний слой мембраны, а полярные остатки глицерола, фосфата и вспомогательных полярных групп – наружный и внутренний слои. Мембраны архей устроены в принципе похоже, но на другой химической основе. Их липиды имеют в качестве гидрофобной части терпеновые спирты, например геранилгераниол. Углеводородные цепочки терпенов несут метильные (СН3) группы через каждые четыре атома. Эти спирты простыми эфирными связями присоединяются к глицерол-фосфату, к его фосфатному остатку тоже могут присоединяться дополнительные полярные головки, такие же, как у бактерий. Глицерол-фосфат архей тоже отличается от бактериального – у архей используется другой его оптический изомер, глицерол-1-фосфат вместо глицерол-3-фосфата.

Таким образом, сравнение современных мембран ничего нам не дает для понимания их общего предкового состояния – все основные компоненты отличаются вплоть до полной несовместимости. Одна из крайних точек зрения, высказанная Мартином и Расселом (Martin, Russell, 2007), заключается в том, что последний общий предок не имел мембран вовсе и современные мембраны были изобретены независимо предками бактерий и архей при выходе из минеральных каверн.

Другая крайняя точка зрения основана на обнаружении жирных кислот в метеоритах и в условиях опыта Миллера. Согласно ей примитивные мембраны, состоящие из абиогенно синтезированных жирных кислот, существовали еще на заре мира РНК, до появления белков. Обе эти крайности, скорее всего, неверны. В реконструированном арсенале белков LUCA есть несколько мембранных белков, таких как роторная мембранная АТФаза и система секреции белков III типа. Они не могли бы сформироваться без существования хоть каких-нибудь мембран. Абиогенные жирные кислоты же обладают большим разбросом в длине углеводородной цепи, и поэтому из их смеси получаются крайне непрочные мембраны. Вахтерхойзер предполагал, что LUCA имел смесь липидов с обоими изомерами глицерола, а бактерии и археи унаследовали по одному типу из этих двух (Wächtershäuser, 2006). Однако, когда такие мембраны были получены искусственно, оказалось, что липиды с разными изомерами глицерола быстро разделяются на «острова», содержащие преимущественно один изомер из двух, а мембрана легко рвется по границам этих «островов».

Вопрос происхождения мембран также требует решения очередного парадокса «курицы и яйца»: современные мембраны непроницаемы для ионов металлов и заряженных органических молекул, таких как аминокислоты, и слабо пропускают сахара. Чтобы клетки могли поглощать органические вещества из внешней среды, мембрана содержит десятки видов транспортных белков. Клетка с мембраной без транспортных белков обречена на голод, а транспортные белки не могут возникнуть в отсутствие мембран. Хуже того, синтез мембранных белков в современных клетках требует участия мембранного белкового комплекса SRP, который связывается с рибосомой и помогает встроить в мембрану выходящую из нее белковую цепь. Без SRP участок пептида, который должен быть в мембране и состоит из неполярных аминокислот, просто застревает на выходе из рибосомы (Mulkidjanian, Galperin, Koonin, 2009)!

 

Информация о мембранах LUCA сохранилась в ферментах синтеза липидов

Если сами липиды бактерий и архей сильно различаются, вплоть до полной неузнаваемости, то некоторые ферменты, участвующие в их синтезе, довольно похожи. Синтез липидов состоит из многих этапов (рис. 15.4). Сначала образуются гидрофобные хвосты. Жирные кислоты собираются из ацетил-КоА, на каждом шаге синтеза молекула жирной кислоты присоединяет один ацетильный (СН3-СО) фрагмент и вырастает на два атома углерода. Терпены тоже образуются из ацетил-КоА. На первой стадии из трех молекул ацетил-КоА образуется мевалоновая кислота, которая превращается в изопентил-пирофосфат с пятью атомами углерода. Потом из молекул изопентил-пирофосфата собираются более длинные терпены: геранил-пирофосфат, фарнезил-пирофосфат и геранилгеранил-пирофосфат, содержащие 10, 15 и 20 атомов углерода.

Глицерол-фосфат получается из диоксиацетон-фосфата, и затем к нему присоединяются гидрофобные хвосты. Затем к фосфатной группе прикрепляется нуклеотид цитидин-дифосфат, а на последней стадии он заменяется на полярную головную группу – холин, этаноламин, серин или инозитол.

Новая информация о мембранах LUCA появилась в 2012 году, когда несколькими группами ученых был проведен подробный анализ истории генов всех ферментов биосинтеза всех компонентов липидов бактерий, архей и эукариот (Dibrova et al., 2012; Lombard, Lopez-Garcia, Moreira, 2012).

Краткие результаты исследования приведены в таблице 15.1.

Из таблицы видно, что LUCA мог, во-первых, синтезировать терпеноспирты и, во-вторых, пришивать полярные головы к спиртам. Как синтез глицеролфосфата, так и синтез жирных кислот возникли лишь после разделения линий бактерий и архей. Следовательно, проще всего предположить, что липиды LUCA состояли из одного остатка терпенового спирта, остатка фосфата и полярной группы (серин, этаноламин или инозитол) (рис. 15.5). Подобные липиды были синтезированы искусственно. Образующиеся из них мембраны по сравнению с современными обладают высокой подвижностью, текучестью, хорошо пропускают ионы металлов и малые органические молекулы. Это позволяло древним протоклеткам поглощать готовую органику из внешней среды даже без специальных транспортных белков.

Дополнительным аргументом в пользу большей древности терпенов по сравнению с жирными кислотами в мембранах являются особенности путей синтеза тех и других. Длинные цепи жирных кислот синтезируются одним ферментным комплексом путем последовательного добавления двухуглеродных «кирпичиков» ацетил-КоА по одному. Для получения жирных кислот одинаковой длины (а следовательно, и прочной мембраны) нужны достаточно точные и совершенные ферменты. Терпены же синтезируются из более крупных пятиуглеродных строительных блоков изопентилпирофосфата, которые сначала собираются в десятиуглеродные молекулы геранилпирофосфата, а затем при помощи других ферментов – в более длинные спирты (фарнезол, геранилгераниол, кальдархеол, фитол и др.). Требования к точности и специфичности ферментов при такой крупноблочной сборке гораздо ниже.

 

Происхождение первых мембранных белков

Не все белки попадают в мембраны при помощи комплекса SRP. Бывают белки, которые синтезируются в одной клетке, а встроиться в мембрану должны в другой, как некоторые бактериальные токсины. Такие белки, чтобы встроиться в мембрану, используют механизм «выворачивания». Для этого белок не должен иметь участков, состоящих только из гидрофобных аминокислот. Неполярные аминокислоты, которые окажутся внутри мембраны, должны чередоваться с полярными примерно 2 аминокислоты через 2. Такой белок может выходить из рибосомы без помощи SRP и достаточно растворим в воде. Чередование «2 через 2» создает альфа-спиральные участки, у которых один бок полярный, а другой неполярный (обсуждалось в главе 13). В водорастворимой форме такой белок сворачивается неполярными участками внутрь, а попадая на мембрану, разворачивается по ней плоско. Затем его альфа-спирали могут опять собраться компактно, но уже гидрофобными участками наружу. Гидрофильные стороны спиралей образуют при этом пору в мембране, через которую могут проходить вода, ионы, полярные молекулы и даже белки и ДНК.

 

Мембранная электрохимия

Важнейшей функцией мембран является поддержание мембранного электрического потенциала, который используется клеткой для запасания и передачи энергии. Клеточная мембрана работает как конденсатор: ее наружная сторона несет положительный заряд, а внутренняя – отрицательный. Разность потенциалов между сторонами мембраны в активном состоянии клетки может достигать 150–200 милливольт. Напряжение, казалось бы, небольшое, но оно приложено к слою изолятора толщиной всего 10 нанометров, т. е. клеточная мембрана – хороший изолятор. Заряда этого конденсатора хватает на несколько секунд активной жизнедеятельности клетки.

Мембранные электрохимические процессы используются для синтеза основной части клеточного АТФ у большинства современных организмов. В большинстве случаев, в том числе в клетках человека, энергия для получения АТФ в конечном итоге получается в реакциях окисления сахаров и жиров кислородом, т. е. в клеточном дыхании. На первых этапах дыхания (в случае сахаров это гликолиз и цикл Кребса, мы обсуждали их в 11–1 главе) сахара расщепляются, все атомы углерода из их молекул переходят в углекислый газ, а все атомы водорода – на носители, главным образом НАД:

С 6 Н12О 6 (глюкоза) + 6 Н 2 О + 10 НАД + + 2 ФАД → 6 СО 2  + 10 НАДН + 10 Н + + 2 ФАДН 2 .

Эта часть дыхания происходит без участия мембран и кислорода. Мембраны вступают в игру на последующих этапах, а кислород – только в самом конце. Основная часть АТФ образуется благодаря работе белков так называемой «дыхательной цепи», которые находятся в мембране (рис. 15.6). Дыхательная цепь состоит из больших белковых комплексов (они называются неоригинально: комплекс I, комплекс II, III и IV) и маленьких подвижных переносчиков электронов (кофермент Q и цитохром с ). Эти молекулы по цепочке передают электроны от НАДН и ФАДН2 на кислород. Основной поток электронов идет следующим путем: НАДН → комплекс I → кофермент Q → комплекс III → цитохром с → комплекс IV → кислород. Комплекс II играет вспомогательную роль, через него электроны с ФАДН2 входят в дыхательную цепь на кофермент Q.

При прохождении электронов через комплексы дыхательной цепи выделяется энергия, которая используется на откачку из клетки наружу ионов водорода – протонов (Н+). Далее протоны входят обратно в клетку через другой белок – мембранную АТФазу, которая за счет энергии протонов делает АТФ из АДФ и фосфорной кислоты.

Дыхательная цепь называется еще «электрон-транспортной цепью», потому что в ней происходит передача электронов от одних молекул к другим по цепочке.

Напряжение на мембране используется не только для синтеза АТФ, но и для транспорта нужных веществ в клетку. Поскольку на наружной стороне мембраны образуется положительный заряд, то для транспорта незаряженных молекул, таких как сахара, нужно организовать их движение в клетку совместно с протонами. Транспортный белок должен связать на наружной стороне мембраны молекулу сахара и протон, затем изогнуться или вывернуться так, чтобы сахар и протон оказались на внутренней стороне мембраны, и выпустить их внутрь клетки. Для транспорта молекул с отрицательным зарядом, таких как фосфат и нуклеотиды, вместе с каждой нужной молекулой нужно впускать в клетку несколько протонов, чтобы скомпенсировать отрицательный заряд «полезного груза».

 

Происхождение мембранных АТФаз

Комплексы дыхательных цепей очень разнообразны, подстраиваются к условиям обитания клетки, и их гены подвержены горизонтальному переносу. Мы обсудим их происхождение в главе 17. Мембранные АТФазы же во всех клетках устроены довольно похоже. Молекулы мембранной АТФазы состоят из вращающейся части («ротор») и неподвижной («статор») (рис. 15.7). «Ротор» состоит из кольца из 8–15 мелких субъединиц С в мембране, центрального стержня из субъединиц D, d/C и F в цитоплазме. В состав статора входят боковой стержень, выступающий в цитоплазму (субъединицы E и G), и кольцо из трех А– и трех В-субъединиц. Центральный стержень ротора входит в кольцо из А и В-субъединиц, и при вращении его конец изгибает и сдвигает субъединицы А и В друг относительно друга.

Подробное видео работы АТФазы можно посмотреть по адресу: .

Протоны связываются двумя карманами «статора» – по одному с каждой стороны мембраны, и чтобы пройти мембрану, они должны, связавшись с С-субъединицей, ждать поворота C-кольца на одну субъединицу. Это единственный путь от внутреннего «кармана» статора к наружному. Молекулы ATФ и АДФ связываются между A и В субъединицами цитоплазматического «статора», активный АТФазный центр образуется в контакте со статором. Чтобы из АДФ и фосфата получилась молекула АТФ, нужно движение А-субъединицы относительно соседней В-субъединицы. Это движение обеспечивает ротор за счет энергии проходящих через АТФазу протонов. На один оборот ротора каждый из трех АТФазных центров АВ-кольца создает одну молекулу АТФ. Таким образом, на один оборот молекулы через мембрану переносится от 8 до 15 протонов (по одному на каждую C-субъединицу) и синтезируется три молекулы АТФ.

Важнейшее преимущество такого преобразования энергии состоит в том, что роторная АТФаза позволяет клетке использовать для синтеза АТФ химические реакции, выделяющие мало энергии. Она синтезирует за один оборот три молекулы АТФ, а количество прошедших ионов равно числу С-субъединиц – от 8 до 15. Иначе говоря, на синтез одной молекулы АТФ приходится от трех до пяти прошедших ионов. Роторная АТФаза работает как своего рода повышающий трансформатор: достаточно, чтобы выделяющейся в химической реакции энергии хватило на перенос через мембрану одного протона, дальше из множества этих маленьких порций энергии будет собрано несколько более крупных.

Основные субъединицы АТФазы и их взаимное расположение похожи на систему секреции белков III типа (рис. 15.8). Эта общая для бактерий и архей система активно выделяет белки из клетки, развернув их в цепочку, с затратой АТФ и вращением выделяемого белка. А– и В-субъединицы статора также обладают более далеким, но достоверным сходством с хеликазами семейства Rho и белком RecA. Эти белки образуют кольца из шести одинаковых субъединиц, которые вращаются вокруг ДНК, расплетая ее с затратой АТФ (обсуждалось в главе 14). Таким образом, мембранная АТФаза происходит от древнего семейства вращающихся АТФаз с разнообразными функциями. Вероятно, сначала предковая РНК-хеликаза вступила в контакт с мембранной порой и стала работать системой экспорта РНК из протоклетки. АВ-кольцо, происходящее от хеликазы, не только проталкивало экспортируемую РНК наружу, но и крутило ее. Потом этот белковый комплекс переключился с РНК на белки и дал начало системе секреции белков III типа. Потом секретируемый белок застрял в поре этой системы секреции и стал передавать вращение, создаваемое АВ-кольцом, на С-кольцо. Для возникновения роторной АТФ-синтазы осталось только совместить вращение белка и транспорт ионов через него. В составе С-кольца системы секреции белков III типа уже есть участки связывания ионов натрия, которые помогают скреплению С-субъединиц друг с другом. Мутации бокового стержня статора могли создать проходы для этих ионов к обеим сторонам мембраны и превратить заклинившую систему секреции в роторную АТФазу.

Роторные мембранные АТФазы делятся на два семейства: F и A/V. F-семейство характерно для бактерий, A/V – для архей. У организмов с клеточными ядрами, таких как животные и растения, роторные АТФазы обоих семейств встречаются в разных частях одной клетки. F-АТФазы у них обычно находятся в митохондриях, а A/V – в лизосомах и других однослойных мембранных пузырьках. Два семейства АТФаз похожи по набору субъединиц. Большинство субъединиц АТФазы одного семейства похожи и родственны аналогичным субъединицам другого семейства. Исключением является стержень ротора. Между стержнями F и A/V семейств АТФаз нет ничего общего. Поскольку стержень необходим для передачи вращения между С-кольцом и АВ-кольцом, т. е. для сопряжения ионного транспорта с синтезом АТФ, это означает, что общий предок F и A/V АТФаз мог и не быть ион-движущей АТФазой. Не исключено, что два семейства АТФаз возникли независимо из системы секреции белков, когда выделяемый белок застревал в ней и начинал передавать вращение.

 

Натриевая и протонная энергетика

У ряда бактерий и архей мембранные АТФазы впускают в клетку не протоны, а ионы натрия. Соответственно, у них комплексы дыхательной цепи откачивают наружу натрий вместо протонов, мембранные транспортеры и жгутики тоже работают на натрии. Первые открытые обладатели натриевой энергетики обитают в экстремальных условиях: при высокой температуре или в сильнощелочной среде, и замена протонов на натрий выглядит хорошей адаптацией к этим условиям. Однако позже были открыты бактерии с натриевой энергетикой в самых разных экологических нишах, включая морскую воду и кишечник животных. Некоторые бактерии имеют и натриевую, и протонную АТФазу, два типа комплексов электрон-транспортной цепи и в разных условиях могут переключаться между натриевой и протонной энергетикой.

На филогенетическом дереве АТФаз оказывается, что натрий-специфические ферменты занимают самые нижние ветви в обоих семействах, что указывает на их древность.

Второй аргумент в пользу древности натриевой энергетики – устройство ион-связывающих сайтов С-субъединиц. Каждый натриевый сайт образован пятью аминокислотами, атомы кислорода которых точно окружают ион натрия, заменяя молекулы воды в его гидратной оболочке. Протонные сайты же устроены очень по-разному и похожи на поврежденные мутациями варианты натриевого сайта. Причем варианты протонных сайтов хорошо согласуются с отдельными ветвями протонных АТФаз на дереве (Mulkidjanian et al., 2008).

Третий аргумент вытекает из гипотезы происхождения АТФазы на базе системы секреции. Мембранные С-субъединицы системы секреции тоже связаны друг с другом ионами натрия.

Четвертый аргумент связан с мембранными липидами. Дело в том, что мембраны из описанных в начале главы липидов, как у бактерий, так и у архей, не способны удерживать протонный градиент; протоны просачиваются через них, рассеивая энергию в тепло. Зато такие мембраны вполне герметичны для ионов натрия. Чтобы сделать мембраны герметичными для протонов, бактерии и археи добавляют в них разные специальные липиды (рис. 15.9) (Haines, 2001).

Наиболее распространены у бактерий дополнительные липиды с разветвленными концами жирных кислот. У некоторых бактерий, живущих при особо высокой температуре, таких как Bacillus acidocaldarius, на концах жирных кислот находятся еще более объемные циклогексановые кольца.

Многие группы алкалифильных (живущих в щелочных условиях) бактерий содержат в мембранах терпеновый углеводород сквален. Ацидофильные бактерии, живущие в сильнокислой среде (pH ниже 1), используют плоские циклические терпены – гопаноиды, отдаленно напоминающие стеролы эукариот. Наконец, у архей для создания протононепроницаемых мембран в дело идут дифтаниловые липиды – продукты восстановления двойных связей в обычных терпеновых липидах; кроме того, концы гидрофобных хвостов липидов двух сторон мембраны могут химически сшиваться. Проще предположить, что сначала у прокариот существовали более простые по составу мембраны, а протононепроницаемость возникла позже. Протонный энергетический цикл имеет важное преимущество по сравнению с натриевым: перенос протонов через мембрану легко сопрягается почти с любой окислительно-восстановительной реакцией. Протон-движущие комплексы электрон-транспортной цепи гораздо разнообразнее, чем натриевые. Натриевые электрон-транспортные цепи не работают, например, с молекулярным кислородом. Зато существуют не окислительно-восстановительные натриевые насосы, например пирофосфатазные и декарбоксилазные, что означает возможность мембранной энергетики без электрон-траспортных цепей.

 

Устройство электрон-транспортных цепей

Процесс, который биохимики называют «электронный транспорт», представляет собой упорядоченное движение электронов от молекул-восстановителей к молекулам-окислителям. Физик назвал бы это проще: «электрический ток». Мембранные электрохимические процессы в клетках отличаются от электрических явлений неживой природы тем, что в клетках переплетаются два разных электрических тока: ионный и электронный. Для ионов вода – проводник, а мембрана – изолятор, ионные токи направлены поперек мембраны через белковые молекулы. Путь электронов сложнее.

Привычный нам электрический ток – это движение электронов в металлических проводниках и полупроводниковых кристаллах. В клетках нет металлических проводов, но есть молекулы, выполняющие их функцию внутри больших белковых комплексов. Один из двух типов биологических «проводов» строится из гемов – плоских квадратных молекул с богатой системой двойных связей с атомом железа в центре (рис. 15.10). Гем известен в первую очередь как связывающая кислород «деталь» белка гемоглобина, придающая красный цвет нашей крови. Но в клетках есть множество видов других гем-содержащих белков, цитохромов, которые участвуют в переносе электронов. Цитохромы в составе комплексов электрон-транспортных цепей содержат по несколько гемов, прилегающих друг к другу краями. Цепочка гемов проводит электрический ток за счет подвижных электронов в двойных связях молекул. Ближайшим искусственным аналогом такого проводника является графен (слой графита толщиной в один атом). Второй тип внутрибелковых проводов строится из железосерных кластеров, обычно 4Fe-4S, которые подобны наночастицам полупроводящего минерала пирита (FeS2).

Для переноса электронов через воду нет другого пути, кроме как вместе с ионами. Например, хорошие переносчики получаются на основе металлов переменной валентности – железа и меди. В дыхательной цепи участвует цитохром c  – маленький белок с одним гемом, который переносит электрон благодаря окислению и восстановлению атома железа в геме. В электрон-транспортной цепи фотосинтеза есть другой маленький подвижный белок, пластоцианин, который содержит медь.

Кроме металлов электроны могут переноситься через воду в комплекте с протонами, образуя атомы водорода. Мы уже много раз упоминали молекулы-переносчики водорода – НАД и ФАД. В мембранах есть аналогичные жирорастворимые переносчики – хиноны. Электроны попадают в дыхательную цепь клеток человека и животных в основном на НАД. Первый комплекс дыхательной цепи, НАДН-дегидрогеназа, принимает атомы водорода от восстановленного НАДН, после чего эти атомы водорода разделяются на части: электроны по железосерным проводам уходят на другую сторону белкового комплекса, а протоны просто выбрасываются в воду.

Если для ионного тока в клетке легко указать направление – поперек мембраны, то путь электронного тока описывается сложнее. Можно указать химический состав «плюса» и «минуса» его батарейки (в клетках человека это в основном кислород и НАДН), но оба полюса распределены в объеме клетки. В клеточной электрической цепи на пути от «плюса» к «минусу» чередуются большие неподвижные комплексы дыхательной цепи и маленькие подвижные переносчики. Мы можем указать только порядок молекул, между которыми по цепочке перемещаются электроны. Первый комплекс (НАДН-дегидрогеназа) имеет «разъемы» (сайты связывания) для НАДН и для хинона. Третий комплекс (цитохром bc1) имеет сайты связывания для хинона и подвижного цитохрома с . Наконец, четвертый комплекс (цитохром-с-оксидаза) имеет сайты связывания для цитохрома с и кислорода. Второй номер в этой нумерации достался вспомогательному комплексу, окисляющему янтарную кислоту и отдающему электроны на хинон. В электрической цепи он подключен параллельно первому комплексу.

Встречи больших неподвижных комплексов и маленьких подвижных переносчиков происходят благодаря тепловому движению молекул. Каждую секунду каждый комплекс дыхательной цепи сотни раз контактирует с молекулами-переносчиками электронов всех типов, какие только есть в клетке. Представьте себе электрическую цепь, в которой все соединительные провода много раз в секунду выдергиваются из своих разъемов и тыкаются обратно во все разъемы подряд. Примерно так работают электрические цепи в клетках.

Чтобы не произошло «короткого замыкания» (переноса электронов с НАДН на кислород напрямую, мимо всех или части комплексов дыхательной цепи), разные комплексы дыхательной цепи должны иметь разные, несовместимые «разъемы» под разные переносчики. Кроме того, эти «разъемы» по-разному расположены относительно мембраны: сайты связывания НАДН находятся на внутренней стороне белковых комплексов, сайты для хинона – в толще мембраны, а для цитохрома с  – на внешней стороне комплексов дыхательной цепи. Цитохромные и железосерные провода обычно имеют длину порядка толщины мембраны – 10 нм. Однако бактерии семейства Desulfobulbaceae из тех же деталей строят провода вполне солидных размеров – до 1,5 см в длину. Эти нитчатые бактерии населяют морское дно и получают энергию, окисляя сероводород кислородом. Цепочки цитохромов на поверхности соседних клеток, соединенных в длинную нить, точно состыкованы друг с другом и проводят электроны по всей длине нити, позволяя бактериям использовать кислород из воды, а сероводород – из глубины осадка (Pfeffer, 2012).

 

Q-цикл

Решающее преимущество, благодаря которому протонная энергетика сильно потеснила натриевую в живом мире, – ее универсальность. Она обеспечивается тем, что для протонов (но не для ионов натрия) есть механизм переноса через мембрану, который стыкуется практически с любой окислительно-восстановительной реакцией. Он называется Q-цикл, по главной действующей молекуле – коферменту Q, или убихинону (да, это то самое вещество Q10, которое добавляют в косметику). Молекулы убихинона гидрофобны и находятся в мембранах. Кроме того, хинонное кольцо убихинона может легко присоединять и отдавать два электрона или атома водорода (рис. 15.10).

В простейшем варианте Q-цикла перенос протонов происходит за счет того, что один комплекс дыхательной цепи, отдающий электроны на хинон, имеет сайт связывания хинона на внутренней стороне мембраны, а другой, принимающий электроны, – на наружной стороне (рис. 15.11). Хинон может пройти через мембрану, только когда его электрический заряд равен нулю. Иначе говоря, в комплекте с электронами должны быть связаны протоны. Поэтому хинон присоединяет два протона из воды внутри клетки и отдает их в воду снаружи. Ни сам хинон, ни хинон-связывающие сайты ферментов не связаны непосредственно с окислителем и восстановителем, электроны проходят от восстановителя к хинону и от хинона к окислителю по внутрибелковым «проводам» из гемов или железосерных кластеров, никаких движений белковых молекул не требуется. В этой независимости и кроется секрет универсальности убихинонного цикла. Натриевые же насосы вынуждены использовать движения частей белковой молекулы для переноса ионов через мембрану и поэтому труднее перестраиваются на другие реакции.

Подводим итоги: общий предок бактерий и архей имел примитивные мембраны, вероятнее всего, с однохвостыми липидами из терпенового спирта и полярной головки, без глицерола. Эти мембраны пропускали протоны и ионы металлов, но задерживали белки и РНК, поэтому для управляемого выделения белков во внешнюю среду возникли системы секреции. После разделения линий бактерий и архей у них независимо возникли мембраны из липидов с двумя гидрофобными хвостами, непроницаемые для ионов металлов. Выход из исходных геотермальных водоемов в моря с их высокой концентрацией натрия потребовал создания систем откачки натрия из клеток. Так появились натриевые насосы, использующие энергию разных химических реакций. Один из насосов получился из системы секреции белка, в которой застрял секретируемый продукт, превратив ее в роторную Na-движущую АТФазу, и она стала откачивать натрий за счет гидролиза АТФ. Это событие могло произойти два раза независимо в линиях бактерий и архей и дать F– и A/V семейства роторных АТФаз.

Далее горизонтальный перенос генов совместил в одной клетке разные натриевые насосы, в том числе такие, которые создавали больший потенциал, чем роторная АТФаза (рис. 15.12). В этих условиях пригодилось то, что роторная АТФаза обратима: она стала впускать натрий внутрь клетки с синтезом АТФ, и создаваемый химическими насосами натриевый потенциал начал частично расходоваться на синтез АТФ (если взять два разных электрических генератора и соединить их проводами, то тот из них, который давал меньшее напряжение, станет работать электродвигателем).

Затем, по мере освоения кислых местообитаний, появились протононепроницаемые мембраны, а мутация Na-АТФазы превратила ее в протонную. Это позволило использовать ее для откачки лишних протонов из клетки за счет энергии АТФ. Другие прокариоты для той же цели откачки лишних протонов приспособили комплексы дыхательной цепи. После этого горизонтальный перенос генов свел в одной клетке протон-движущие комплексы дыхательной цепи и протон-движущую АТФазу. Протонная энергетика благодаря универсальности Q-цикла, позволяющего легко использовать самые разные окислительно-восстановительные реакции, в значительной степени вытеснила натриевую.

 

Расхождение бактерий и архей

Последний всеобщий предок (LUCA) дал начало двум весьма разным группам микробов – бактериям и археям. Скорее всего, их различия связаны с тем, что они исходно приспосабливались к разным условиям обитания. Например, среди бактерий есть пять групп, способных к фотосинтезу, а среди архей таких нет. По-видимому, основной формой жизни бактерий в архейском и протерозойском периоде были цианобактериальные маты. Это слоистые колонии из многих видов микробов, общей толщиной до 1 см. Верхний слой мата состоит из цианобактерий, осуществляющих кислородный фотосинтез. Под ними находятся другие бактерии, которые ведут фотосинтез без выделения кислорода (например, серный) и используют свет с большей длиной волны, чем цианобактерии верхнего слоя. Также под цианобактериями находятся гетеротрофные бактерии, которые питаются отмершими клетками фотосинтезирующих соседей и выделяемой ими слизью. Они могут использовать кислород для дыхания. В самой глубине мата находятся микробы-бродильщики, которые разрушают органические вещества без участия кислорода. Хотя мат называется «цианобактериальным», он состоит из сотен видов разнообразных бактерий, цианобактерии доминируют в нем только по общей продуктивности.

Такой бактериальный мат на морском мелководье накапливает и упорядочивает осаждающиеся из воды минералы. В разных условиях это могут быть карбонаты, фосфаты или кремнезем. При этом образуются строматолиты («каменные ковры») – характерные слоистые минеральные отложения. В наше время строматолиты очень редки, и для ученых было большой удачей обнаружить их на мелководье залива Шарк (Австралия). Но в отложениях архейского и протерозойского периодов содержится множество строматолитов, и похоже, что в те эпохи цианобактериальные маты занимали большую часть морских мелководий и наземных водоемов.

Археи же предпочитают питаться неорганическими веществами, выходящими из глубин Земли, такими как водород и соединения серы. Они не используют энергию света и, за исключением одной группы метаногенов, не входят в состав цианобактериальных матов.

Различие в составе мембран бактерий и архей отражает разные исходные условия их жизни. Бактерии сменили терпеноспирты на жирные кислоты, так как двойные связи в молекулах терпенов уязвимы к ультрафиолетовому излучению Солнца. Липиды с двойными связями, в свою очередь, сохраняют прочность и текучесть мембраны в широком диапазоне температур, что важно для обитателей горячих источников. Выходы горячей воды в них могут неожиданно исчезать и появляться, поэтому их обитатели должны быть готовы в любой момент попасть из кипятка в холодную воду и обратно. Простая эфирная связь в архейных липидах более устойчива при высоких температурах, чем сложноэфирная. У бактерий, приспособившихся к высоким температурам, сложноэфирные связи в липидах заменяются на простые эфирные, т. е. вместо жирных кислот используются жирные спирты.

Скорее всего, предки бактерий и архей с самого начала разделились по направлениям приспособления. Одна группа, давшая начало бактериям, расселялась по поверхности суши и моря и совершенствовала механизмы использования энергии света. Другая группа «выбрала темную сторону», т. е. стала осваивать подземные местообитания. Ей пришлось научиться обходиться без света, и она дала начало археями.

 

Способы получения энергии у бактерий и архей

Из школьного учебника биологии можно узнать, что есть три основных способа получения энергии живыми организмами. Первый, основной для человека и животных, – аэробное дыхание, в котором сахара, жиры и другие вещества из пищи окисляются кислородом до воды и углекислого газа. Второй способ – брожение, которое превращает сахара в этиловый спирт (у дрожжей) или молочную кислоту (у животных). Брожение обходится без кислорода, но дает почти в 20 раз меньше энергии на 1 г сахара, чем аэробное дыхание. Кроме того, от молочной кислоты болят мышцы после нагрузки. Третий способ, фотосинтез, используют растения, и в конечном счете от созданных в нем сахаров зависят все, кто дышит кислородом или довольствуется брожением.

В мире прокариот (бактерий и архей) способы добычи энергии из внешней среды гораздо разнообразнее. Для начала: дыхание может быть не только кислородным. Например, на дне морей в слое ила живут бактерии, которые окисляют органические вещества сульфатом из морской воды. Этот процесс называется «сульфатное дыхание», или «сульфатредукция», и в нем сульфаты превращаются в сероводород. В почве множество бактерий используют в качестве окислителя соединения азота: нитраты и нитриты. Есть две разновидности нитратного дыхания: денитрификация и аммонификация. При денитрификации образуется свободный азот или оксид азота N2O («веселящий газ»), а при аммонификации бактерии превращают нитрат и нитрит в аммиак. Если аэробное дыхание позволяет из одной молекулы глюкозы получить 38 молекул АТФ, а брожение – только 2, то сульфатное дыхание дает 10–12 молекул АТФ на одну глюкозу, а нитратное – до 20, что гораздо лучше брожения.

В дыхании прокариот окисляться могут не только органические вещества, созданные другими организмами, но и неорганические. Такой способ питания называется хемосинтезом. Бывает множество разновидностей хемосинтеза в зависимости от используемых окислителей и восстановителей (рис. 16.1). Например, водород, выходящий из глубин Земли и выделяемый бродильщиками, можно окислять сульфатом, при этом образуются вода и сероводород. Такой способ питания называется «гидрогенотрофная сульфатредукция», и распространен он у архей. Если нет сульфата, можно взять слабый, но вездесущий окислитель – углекислый газ. Соответствующие процессы называются «метаногенез» и «ацетогенез» по конечным продуктам: метан либо уксусная кислота. Элементарная сера в хемосинтезе уникальна тем, что может одновременно служить окислителем и восстановителем: этот процесс называется «диспропорционирование серы», его продуктами являются сероводород и сульфат. Наконец, при наличии сильных восстановителей можно использовать непривычный окислитель, который существует везде, где есть вода, – протоны (ионы водорода), восстанавливая их до газообразного водорода. Достаточно сильными восстановителями для этого процесса являются угарный газ и муравьиная кислота, а соответствующие способы питания – карбоксидотрофия и форматотрофия.

 

Глубинная биосфера

Одним из замечательных достижений микробиологии на рубеже веков стало открытие масштабной подземной биосферы. О том, что бактерии встречаются в земной коре на километровых глубинах, особенно в водах нефтяных месторождений, было известно и раньше, но только современные методы стерильного бурения, введение изотопных меток и анализа ДНК показали, что земная кора практически во всех районах заселена до глубины 3–5 км, а биомасса подземных микробов сравнима со всей биомассой суши, включая деревья.

Некоторые из подземных микроорганизмов, например обитатели нефтяных пластов, завершают разложение органики, созданной в процессе фотосинтеза и захороненной в толще земной коры. Другие могут строить все необходимые органические вещества из углекислого газа и получают энергию путем хемосинтеза: это сульфатредукторы, метаногены и карбоксидотрофы. Если они используют и восстановитель, и окислитель из недр Земли, то эти организмы могут быть полностью независимы от всей остальной биосферы. Одно такое сообщество, обнаруженное на глубине 3 км в Южной Африке, судя по составу воды, уже несколько миллионов лет существует в полной изоляции от жизни на поверхности планеты ().

Глубинная биосфера, в отличие от жизни на поверхности планеты, почти неуязвима для различных катастроф. Падение астероида, глобальное оледенение, вспышка сверхновой в соседней звездной системе – обитатели глубин едва заметят эти катаклизмы. Даже если планета будет выброшена из своей системы в межзвездное пространство и ее поверхность остынет до температуры жидкого гелия, глубинная биосфера просто сдвинется глубже, ближе к теплому ядру планеты. Если на Марсе когда-то была жизнь, достигшая бактериального уровня сложности, то под поверхностью планеты она, скорее всего, сохранилась и может быть найдена при глубоком бурении. Есть лишь два способа уничтожить глубинную биосферу. Первый нам подсказывает Венера: неограниченный парниковый эффект прогреет поверхность и кору планеты до температур выше 200 °C и надежно стерилизует ее. Второй способ – падение на планету крупного тела, сопоставимого с Луной. Выделение энергии при таком столкновении тоже прогреет верхние 10 км планетарной коры до нескольких сотен градусов, чего не переживут даже самые гипертермофильные микробы.

 

Поздняя метеоритная бомбардировка

3,9 млрд лет назад на планеты Солнечной системы обрушилось большое количество астероидов. В это время образовалось большинство кратеров Луны, Марса и Меркурия. Размеры этих кратеров указывают, что среди попавших на планеты небесных тел многие достигали размера 50 км, а самые крупные могли иметь размер до 200 км. Считалось, что удары крупнейших астероидов должны были приводить к испарению океанов и стерилизации поверхности Земли; соответственно, для зарождения жизни оставался короткий промежуток времени между окончанием бомбардировки и появлением известных следов жизни в гренландской формации Исуа возрастом 3,8 млрд лет. Но постепенно накапливались данные в пользу того, что жизнь возникла до метеоритной бомбардировки и как-то пережила ее. Были обнаружены включения углерода со смещенным изотопным соотношением в кристаллах циркона возрастом 4,25 млрд лет, а уточненные оценки с помощью молекулярных часов указывали на расхождение линий бактерий и архей, которое составляет более 4 млрд лет. Наконец, аккуратное моделирование метеоритной бомбардировки Земли и ее влияния на климат (Abramov, 2009) показало, что удары астероидов диаметром до 300 км стерилизуют только одно полушарие планеты, в то время как в другом полушарии температура не поднимается выше 70–80 °C, и термофильные организмы выживают. Глубинная биосфера страдает еще меньше.

Хотя полной стерилизации поверхности Земли при поздней метеоритной бомбардировке не произошло, организмы, предпочитающие умеренные температуры до 50 °C (они называются мезофилы, в отличие от термофилов, живущих при 50–80 °C, и гипертермофилов, способных жить в кипятке), вряд ли выжили. После окончания бомбардировки холодные места обитания были вновь заселены потомками термофилов.

В нескольких очень интересных исследованиях (например, Akanuma et al., 2013) были сделаны попытки реконструировать последовательности отдельных ферментов LUCA. В этих работах последовательность предковых белков была вычислена из последовательностей множества их современных потомков как у бактерий, так и у архей; затем были синтезированы гены, кодирующие предковый фермент, встроены в клетки кишечной палочки и использованы для наработки и измерения свойств ферментов LUCA. Всякий раз оказывалось, что оптимальная температура для работы предковых ферментов – примерно 65–80 °C. На родословных деревьях как бактерий, так и архей самые первые ветви состоят из термофилов. Это может быть как отражением термофильности LUCA, так и избирательным выживанием термофилов в эпоху поздней метеоритной бомбардировки. Если она привела к вымиранию всех микробов, кроме термофилов, то в этом случае методы реконструкции предковых последовательностей могут ошибочно приписать термофильность и LUCA.

Удары астероидов выбивают из планет осколки, способные преодолеть притяжение и выйти на околосолнечные орбиты. Более сотни марсианских метеоритов такого происхождения попали в руки ученых. Моделирование судьбы обломков, выбитых из Земли во время поздней метеоритной бомбардировки, показало, что они могут быть дополнительным убежищем для спор микробов. До 30 % выбитых обломков возвращается на Землю в течение 5000 лет после столкновения, и содержащиеся в них споры могут вновь заселить остывшую после удара поверхность планеты (Wells, 2003). Более того, эти обломки имеют шанс перенести жизнь на другие тела Солнечной системы: 0,2 % обломков попадают с Земли на Марс в течение 5 млн лет после столкновения, а самые первые достигают Марса уже через 100 000–150 000 лет. Обратный перенос с Марса на Землю требует больше времени – первые обломки совершают этот путь примерно за 300 000 лет, но зато их количество оказывается в 10 раз больше, чем перенесенных с Земли на Марс. Некоторые из обломков имеют шанс попасть даже на спутники Юпитера после 4 млн лет космического путешествия. Так что вполне возможно, что в ходе глубокого бурения на Марсе мы обнаружим жизнь общего происхождения с нашими земными организмами.

 

Устройство фотосинтеза современных растений и цианобактерий

Разнообразные реакции хемосинтеза, упомянутые выше, составляют лишь малую долю в энергетическом балансе биосферы. Подавляющее большинство живых организмов на планете зависит от энергии Солнца напрямую, как растения, или косвенно, как животные, получающие от растений пищу и кислород. Большинство бактерий тоже прямо или косвенно зависит от органики растительного происхождения либо от кислорода. Биосфера подключена к природному термоядерному реактору, Солнцу, благодаря фотосинтезу.

Процесс фотосинтеза, как он описан в школьных учебниках, состоит из световых и темновых реакций. Световые реакции сводятся к синтезу АТФ и восстановителей, таких как НАДФН, при помощи света и какого-либо донора электронов. Темновые реакции – это восстановление СО2 при помощи НАДФН и АТФ в цикле Кальвина или, реже, в других реакциях, и они уже обсуждались в главе о происхождении обмена веществ. Темновые реакции не уникальны для фотосинтеза. Тот же цикл Кальвина работает и при хемосинтезе, и свет не принимает участия в его реакциях.

Напомним структуру фотосинтетического аппарата зеленых растений. Его функциональное ядро составляют реакционные центры – встроенные в мембрану белки, с которыми связаны молекулы хлорофилла – по две в каждом реакционном центре и несколько вспомогательных, передающих энергию света в центр. Возбужденные молекулы хлорофилла передают электроны на молекулы-переносчики, и затем они попадают в электрон-транспортную цепь. В отличие от дыхательной цепи, в которой электрический ток создается «химической батареей», полюса которой – НАДН и кислород, здесь электрический ток создают реакционные центры фотосистем, работающие подобно солнечным батареям. Они питают две нагрузки: во-первых, за счет энергии света происходит электролиз воды с выделением кислорода. Во-вторых, как и в дыхательной цепи, ток электронов через механизм Q-цикла преобразуется в ток протонов через мембрану и синтез АТФ на роторной АТФазе. Напряжения, создаваемого одной фотосистемой, недостаточно для электролиза воды, поэтому две фотосистемы соединяются последовательно. Как мы помним, модули электрон-транспортных цепей соединяются подвижными переносчиками электронов, поэтому для последовательного соединения нужны разные типы переносчиков и несовместимые «разъемы» для них.

Реакционные центры делятся на два типа по используемым переносчикам электронов: фотосистемы I типа (ФСI) передают электроны на ферредоксин – маленький водорастворимый белок с железосерным кластером, а фотосистемы II типа (ФСII) – на хиноны, плавающие в мембране. Цианобактерии и хлоропласты растений обладают обоими типами фотосистем, а различные фотосинтезирующие бактерии – только одним типом из двух. Электроны ФСI через ферредоксин переносятся на НАДФ и затем используются в реакциях восстановления разных органических веществ. Электроны ФСII проходят через хиноны на цитохромный комплекс b6f , отдавая часть энергии на протонный ток и синтез АТФ, и далее на ФСI. В цианобактериях и хлоропластах растений окисленная ФСII с помощью водоокисляющего комплекса восполняет недостающие электроны из молекул воды, выделяя кислород. Кроме того, если клетке требуется больше АТФ, возможен циклический транспорт электронов по маршруту ФСII – хинон – цитохром b6f  – ФСII (рис. 16.2). Реакционные центры окружены большим количеством вспомогательных антенных белков, также связывающих хлорофилл, которые поглощают световые кванты и передают возбуждение на реакционные центры.

 

Разнообразие систем, запасающих энергию света

Очевидно, что столь сложная система из хлорофиллов и других пигментов и электрон-транспортных цепей не могла возникнуть сразу. У нее должны были быть более простые предшественники, а возможно, и альтернативные системы фотосинтеза, не использующие хлорофилл. Как мы помним из предыдущих глав, в состав живых систем с самого начала входили молекулы с особыми отношениями со светом. Например, все азотистые основания эффективно рассеивают энергию ультрафиолетового света в тепло, защищая соседние молекулы. Адениновые нуклеотиды в растворе также способны за счет энергии света присоединять фосфатные группы, синтезируя АТФ. Древние окислительно-восстановительные коферменты, такие как НАД и ФАД, тоже могли пройти отбор на особые фотохимические свойства. Как мы помним из главы про мир РНК-коэнзимов, ФАД (флавинадениндинуклеотид) и в современном мире проводит одну реакцию при помощи энергии света. Это реакция восстановления тиминовых димеров – одного из продуктов повреждения ДНК ультрафиолетом. В ходе экспериментов было обнаружено, что силикатно-протеиноидные микросферы, содержащие флавин, могут за счет энергии света синтезировать АТФ из АДФ и фосфата (рис. 16.3).

У животных и растений на основе бактериальной фотолиазы возникли криптохромы – ФАД-содержащие светочувствительные белки, регулирующие суточные и сезонные ритмы. Как ни удивительно, у животных криптохромы также участвуют в восприятии магнитного поля при помощи магниточувствительной реакции с анион-радикалом кислорода (Solovyov, Schulten, 2009).

Другая группа светопоглощающих пигментов живых клеток – каротиноиды – тоже имеет разнообразные интересные функции. Один из каротиноидов, ретиналь, поглощает синий и голубой свет и превращает их энергию в механические изгибы молекулы, меняющей форму с прямой на изогнутую и обратно (рис. 16.4). В комплексе с мембранными белками бактериородопсинами ретиналь может переносить протоны, ионы натрия и даже ионы хлора через мембрану. Пропуская эти ионы обратно через вращающуюся мембранную АТФазу, клетка может получать АТФ за счет энергии света при помощи лишь одного дополнительного белка. Такая система гораздо надежнее и устойчивее к экстремальным условиям, чем сложные хлорофиллсодержащие фотосистемы. Бактериородопсины были впервые найдены у Halobacterium halobium, населяющей пересоленные лагуны, но в последнее время обнаружено, что они широко распространены у самых разных морских и пресноводных бактерий и позволяют им подолгу активно плавать без пищи. Родственные ретинальсодержащие белки – родопсины – работают в органах зрения всех животных, и благодаря им вы можете читать этот текст. Однако у одной глубоководной рыбы в глазах обнаружен и хлорофилл, позволяющий ей видеть в ближнем инфракрасном диапазоне! (Douglas et al., 1998).

Каротиноиды относятся к терпеновым веществам, гидрофобны и часто находятся в мембранах среди липидов. Самые распространенные каротиноиды, такие как бета-каротин, лежат в мембране параллельно хвостам липидов, проходя от одной стороны мембраны до другой. Скорее всего, исходно они защищали двойные связи древних липидов от повреждения ультрафиолетом, снимая с них возбуждение и рассеивая его в тепло, на самых ранних этапах эволюции мембран.

Третья группа веществ, поглощающих свет и, похоже, превращающих световую энергию в биохимическую, – это меланины, черные и желтые красители, определяющие цвет кожи и волос человека. Меланины состоят из нескольких тысяч одинаковых звеньев и в клетках обычно находятся в виде зерен. Кроме человека и животных меланины широко распространены у грибов и в разных группах бактерий. История открытия меланинового фотосинтеза начинается как фантастический роман: при очередном обследовании состояния саркофага Чернобыльской АЭС внутри него, на бетонных стенах, были найдены пятна совершенно черной плесени, растущей при очень высоком уровне радиации. Плесень была доставлена в лабораторию, где оказалось, что она относится к хорошо известному роду Cryptococcus, но, в отличие от известных родственников, накапливает в клеточных стенках огромное количество меланина. Дальнейшие эксперименты в медицинском колледже Альберта Эйнштейна в Нью-Йорке показали, что повышенный уровень радиации (в 500 раз выше естественного фона) ускоряет рост этой плесени в полтора раза на богатой среде и в три раза – при недостатке питательных веществ (Dadachova et al., 2007). Под действием ультрафиолета, рентгеновских лучей и гамма-лучей меланиновые гранулы восстанавливают НАД, что, видимо, используется в клетках плесени для запасания энергии в виде АТФ (Turick et al., 2011). Подобные черные штаммы были найдены и для других видов плесневых грибков. Они встречаются в высокогорье, где много ультрафиолета, и в зараженных радиацией почвах и способны расти по направлению к источнику радиации. Остается только пожалеть, что в организме человека меланин не обладает такими же замечательными свойствами.

 

Разнообразие и происхождение хлорофиллов и хлорофилл-связывающих белков

Большая часть фотосинтеза на Земле происходит благодаря хлорофиллу. По своему устройству его молекулы очень похожи на гем, о котором шла речь в предыдущей главе, но вместо железа в центре молекулы содержится магний.

В реакционных центрах встречаются три типа пигментов: хлорофилл a (цианобактерии, водоросли и наземные растения), бактериохлорофилл a (фотосинтезирующие бактерии, кроме цианобактерий), бактериохлорофилл g (только у гелиобактерий), а также феофитин – безмагниевый вариант хлорофилла а (только в паре с обычным хлорофиллом а ). Кроме того, в разных растениях, водорослях и бактериях встречаются хлорофиллы b и с и бактериохлорофиллы b , c , d и e . Все эти вещества участвуют либо в передаче энергии света на реакционный центр, либо в движении электронов с реакционного центра на переносчики.

Зеленый цвет хлорофилла обусловлен тем, что он поглощает свет в двух диапазонах – красном и сине-фиолетовом. Свободный хлорофилл в растворе обладает красной флюоресценцией. Можно проделать простой опыт: нарезанную свежую зелень залить небольшим количеством спирта и оставить на ночь в закрытой посуде. Получится ярко-зеленый спиртовой раствор хлорофилла, который будет светиться красным при освещении ультрафиолетовым фонариком. У промежуточных продуктов синтеза хлорофилла – хлорофиллидов, протохлорофиллидов, протопорфирина IX – эта флюоресценция выражена сильнее, а полоса поглощения сдвинута в ближнюю ультрафиолетовую область. Хлорофилл в составе белков реакционных центров никакой флюоресценцией не обладает: вместо этого энергия поглощенного света превращается в электрическую.

Механизмы превращения энергии света в электрическую энергию в принципе одинаковы как в фотосистемах живых клеток, так и в солнечных батареях, созданных человеком. Солнечные батареи состоят из двух тонких слоев полупроводника (например, кремния) с разными добавками, из-за которых электрические свойства слоев отличаются (p-тип и n-тип проводимости). Поглощенный квант света вызывает возбуждение электрона в одном слое, после чего он быстро попадает в другой слой и не может вернуться обратно, кроме как через внешнюю электрическую цепь. Этот процесс называется «разделение зарядов». В реакционных центрах зеленых клеток содержатся молекулы хлорофилла. Они, как и гем, обладают обширной плоской системой двойных связей, электроны которых легко могут перемещаться по всей молекуле. По электрической проводимости хлорофиллы и гемы подобны графену, также обладающему обширной плоской системой двойных связей. Два полупроводника с разными свойствами, между которыми происходит разделение зарядов в фотосистеме II, – это обычный хлорофилл а и феофитин (хлорофилл без атома магния в центре). В фотосистеме I разделение зарядов происходит между «специальной парой» двух тесно сближенных молекул хлорофилла а и третьей молекулой того же хлорофилла а , проводящие свойства которого изменены соседними аминокислотами.

Хлорофилл-связывающие белки обоих типов реакционных центров, так же как главные антенные белки CP43 и CP47 цианобактерий и хлоропластов и светособирающие комплексы зеленых несерных бактерий (LH), состоят из повторяющихся похожих трансмембранных доменов, к части из которых прикрепляются молекулы хлорофилла. К молекулам хлорофилла близко прилежат остатки ароматических аминокислот – тирозина, триптофана, гистидина, которые могут передавать возбуждение на хлорофилл. Сравнение последовательностей этих белков друг с другом показывает, что все они могли произойти от одного предкового мембранного белка, имевшего 11 одинаковых доменов, с молекулами хлорофилла либо его предшественников на каждом домене (Mix et al., 2005; Mulkidjanian, Junge, 1997). В свою очередь, этот белок мог получиться путем последовательных удвоений доменов малого хлорофилл-связывающего белка с одним трансмембранным доменом, подобно современным светозащитным белкам HLIP цианобактерий.

Исходной функцией хлорофилл-связывающего белка, как и у каротиноидов, возможно, была защита от ультрафиолета: такой белок мог эффективно снимать возбуждение с соседних молекул и рассеивать его частью в тепло, частью – в красную флюоресценцию. Такая защита могла быть востребована еще на стадии РНК-белкового мира: протоорганизмы того времени уже имели мембраны, удаленные от минеральной подложки и не защищенные от ультрафиолета сульфидом цинка. Плавающие расселительные стадии протоорганизмов, не связанные с минеральной подложкой, выигрывали от наличия такого белка еще больше. Удвоения доменов и увеличение количества молекул хлорофилла повышали эффективность рассеивания энергии. В современных реакционных центрах сайты связывания переносчиков электронов (хинонов и ферредоксина) появились с утратой некоторыми доменами способности к связыванию хлорофилла.

 

Варианты хлорофилльного фотосинтеза

Способностью к фотосинтезу с помощью хлорофиллов или родственных им бактериохлорофиллов обладают пять неродственных групп бактерий: цианобактерии, пурпурные серные бактерии, зеленые серные бактерии (Chlorobi), зеленые несерные бактерии (Chloroflexi) и гелиобактерии (Heliobacteria). Только цианобактерии окисляют воду, выделяют кислород и обладают двумя типами фотосистем в одной клетке. Остальные фотосинтезирующие бактерии не выделяют кислород, более того, их системы фотосинтеза не могут работать в присутствии кислорода, за исключением Chloroflexi.

Серные бактерии, как пурпурные, так и зеленые, для восстановления углекислого газа окисляют сероводород и серу, выделяя сульфаты. Также они могут использовать для фотосинтеза молекулярный водород (выделяя воду) и соли двухвалентного железа (осаждая магнетит, Fe2O3). Пурпурные серные бактерии имеют фотосистему второго типа, отдающую электроны на хинон, и фиксируют CO2 в цикле Кальвина. Они особенно многочисленны в сернистых источниках и в озерах, где вода разделена на верхний пресный и нижний соленый слои. В таких озерах отсутствует перемешивание, и нижний соленый слой насыщен сероводородом.

Chloroflexi тоже имеют фотосистему второго типа, подобно пурпурным бактериям, но используют 3-гидроксипропионатный цикл фиксации CO2 (Zarzycky et al., 2009). Их историческое название «зеленые несерные бактерии» неверно, так как они могут использовать для восстановления СО2 сероводород, серу и водород (Tang et al., 2011). Впрочем, самый изученный вид этой группы, Chloroflexus auranticus, в природных условиях обычно не фиксирует СО2, а потребляет органические кислоты, выделяемые соседями по сообществу, и получает за счет света только АТФ.

Зеленые серные бактерии (Chlorobi) имеют фотосистему первого типа, отдающую электроны на ферредоксин, и используют восстановительный цикл Кребса для фиксации СО2 (Buchanan, Arnon, 1990).

Heliobacteria используют фотосистему первого типа с бактериохлорофиллом g в реакционном центре. Они населяют заболоченные почвы и особенно многочисленны на заливных рисовых полях. Гелиобактерии не способны к автотрофному росту (на СО2 в качестве единственного источника углерода) и нуждаются в готовой органике в виде сахаров или органических кислот, хотя в их геноме закодированы все, кроме одного, ферменты восстановительного цикла Кребса (Tang, Blankenship, 2010). Энергию света они используют для получения АТФ и фиксации азота.

Разные группы фотосинтезирующих бактерий отличаются по предпочитаемой интенсивности света. Фотосистема, настроенная на улавливание слабого света, под ярким полуденным солнцем становится опасной для клетки, вызывая фотохимические повреждения белков и мембран. Многие цианобактерии способны управляться с ярким светом и имеют для этого специальные приспособления: протеинкиназы для быстрой регулировки фотосистем (в течение секунд-минут) путем фосфорилирования белков и маленькие светозащитные белки HLIP (high light induced protein), синтез которых запускается ярким светом. Часть пурпурных бактерий тоже имеют подобные приспособления и переносят яркий свет. Другие фотосинтезирующие бактерии предпочитают укрываться от яркого света под слоем воды или под клетками цианобактерий в бактериальном мате. У Chlorobi и Chloroflexi есть приспособления к очень слабому свету: хлоросомы, зерна из очень плотно упакованных молекул хлорофилла. Благодаря им Chlorobi живут, например, в сероводородном слое Черного моря на глубинах до 100 м.

 

Эволюция хлорофилльного фотосинтеза

Хлорофилльный фотосинтез используют пять групп бактерий, не родственных между собой. Очевидно, что в распространении генов фотосинтеза большую роль сыграл горизонтальный перенос генов. Это подтверждается и данными по вирусам, заражающим цианобактерий: в их геномах часто встречаются гены компонентов фотосистем. Вирусы могут использовать эти гены для перестройки фотосинтеза зараженной клетки, чтобы быстро получить много энергии для размножения вируса ценой гибели клетки чуть позже. Гены, кодирующие систему фотосинтеза, часто образуют в геноме бактерий компактную группу (супероперон), что должно повышать вероятность переноса всего комплекта.

Система фотосинтеза цианобактерий устроена гораздо сложнее, чем у других групп бактерий: только в ней есть два типа фотосистем, дополнительные вспомогательные пигменты (фикобилины) и белки, связывающие их в компактные гранулы (фикобилисомы), а также защитные белки HLIP и протеинкиназы для регуляции фотосистем (рис. 16.5). Если сравнить набор генов, кодирующих детали системы фотосинтеза, у разных групп фотосинтетических бактерий, то получается, что и пурпурные серобактерии, и Chlorobi, и Chloroflexi, и гелиобактерии имеют больше общих генов с цианобактериями, чем друг с другом. Иными словами, горизонтальный перенос генов фотосинтеза происходил в основном либо от цианобактерий, либо к цианобактериям, но не между четырьмя остальными группами (Mulkidjanian et al., 2006). Лишь хлоросомы, служащие для приспособления к очень слабому свету, являются общим признаком Chlorobi и Chloroflexi и, видимо, были перенесены от одной из этих групп бактерий к другой.

Наиболее вероятно, что предки цианобактерий первыми освоили хлорофилльный фотосинтез, и у них же позднее появились две фотосистемы. Другие группы фотосинтезирующих бактерий приобрели способность к фотосинтезу благодаря событиям горизонтального переноса ряда генов от цианобактерий. Скорее всего, эти переносы произошли до того, как цианобактерии освоили кислородный фотосинтез. Фотосистемы Chlorobi и особенно гелиобактерий сохраняют некоторые очень примитивные черты (подробнее об этом – в главе 17).

 

Геологические следы фотосинтеза и продуктивность древних экосистем

Первые следы фотосинтеза являются одновременно с первыми осадочными породами на Земле, в гренландской формации Исуа возрастом 3,8 млрд лет. Это джеспилиты, или полосатые железные руды (banded iron formations, BIF), а также включения графита со смещенным соотношением изотопов. Полосатые железные руды состоят из тонких (в доли миллиметра) темных слоев магнетита и более светлых слоев кремнезема или карбонатов. Считается, что они отлагались в морях в результате деятельности бактерий, осуществлявших фотосинтез с окислением железа. Магнетит откладывался днем, а карбонатные или кремнеземные слои – ночью. Первые ископаемые, очень похожие на современные нитчатые цианобактерии, появились в осадках Бак Риф (Южная Африка) 3,4 млрд лет назад. Все данные геохимии, однако, свидетельствуют о том, что появление кислорода в атмосфере произошло на 1 млрд лет позже. Изотопное соотношение углерода в осадках Бак Риф указывает на его биологическое происхождение, причем именно через цикл Кальвина. Другие пути фиксации СО2, такие как ацетил-КоА-путь, более чувствительны к различию в массе изотопов и поэтому сильнее обедняют биологический углерод тяжелым изотопом 13С. Отсутствие серы, сульфатов и магнетита говорит о том, что ни железо, ни сера и сероводород не использовались этими ископаемыми бактериями. Иначе говоря, методом исключения выявлено, что эти древние «процианобактерии» использовали в фотосинтезе водород. Их родство с современными цианобактериями подтверждается и положением в сообществе: они жили в самом верхнем слое бактериального мата на мелководье, а следовательно, были приспособлены к яркому свету.

Геохимики подсчитали количество водорода, железа и соединений серы, выделяемых из глубин Земли в архейском периоде (3,9–2,5 млрд лет назад). Исходя из этих оценок удалось сравнить продуктивность разных видов бескислородного фотосинтеза. По оценкам Canfield (2006), получается, что в глобальном масштабе вклад железоокисляющего фотосинтеза достигал 90 %. Железоокисляющие фотосинтезирующие бактерии населяли поверхность открытых океанов. Их общая продуктивность могла быть примерно в 10 раз ниже продуктивности современных морских экосистем. Вклад водородного фотосинтеза оценивается примерно в 10 %, а серного – не более 1 %. Однако выход сероводорода из вулканических источников происходит локально, и фотосинтезирующие серобактерии могли образовывать высокопродуктивные «оазисы» в окрестностях вулканов.

 

Происхождение кислородного фотосинтеза

В течение архейского периода химический состав земной коры и верхней мантии постепенно изменялся: железо погружалось к ядру планеты, вулканическая активность слабела, и продуктивность всех типов фотосинтеза, зависящая от поступления водорода, серы и железа из недр Земли, снижалась. В этих условиях естественный отбор поддержал появление кислородного фотосинтеза, который использует бесконечный источник электронов – воду.

Системы защиты от токсического действия кислорода, необходимые для кислородного фотосинтеза, могли возникнуть даже раньше, чем кислородный фотосинтез. Показано, что на поверхности пирита (FeS2) при освещении в воде образуется перекись водорода – Н2О2. Ионы Fe3+ – продукт железо-зависимого фотосинтеза – тоже окисляют воду до перекиси водорода при освещении раствора, так что каталаза и другие защитные системы могли возникнуть вскоре после выхода бактерий из обогащенных цинком геотермальных водоемов в моря. Более того, показано, что водоокисляющий комплекс современных цианобактерий может использовать H2O2 в качестве источника электронов, причем для этого требуется меньше энергии света, чем для окисления воды. Возможно, обезвреживание перекиси водорода было первой функцией примитивного водоокисляющего комплекса. Существуют противоречивые данные о роли H2O2 в современном кислородном фотосинтезе – в зависимости от изучаемого вида и условий перекись может как подавлять его, так и стимулировать. Некоторым видам цианобактерий для выделения кислорода необходимо, чтобы заметное его количество уже содержалось в среде. Как это объяснить, пока непонятно (Olson, Blankenship, 2004).

Окисление воды – крайне сложная задача. Окислительно-восстановительный потенциал (его сокращенно называют редокс-потенциалом) бактериохлорофилла а (0,55 V) достаточен для окисления водорода, двухвалентного железа, H2S и серы. Редокс-потенциал хлорофилла а из цианобактерий выше, около 0,82 V. Однако если окислять воду, отбирая электроны по одному, то первая реакция, превращающая воду в гидроксильный радикал и протон, требует огромного редокс-потенциала в 2,75 V, недоступного ни для каких фотосинтетических пигментов. Поэтому необходим промежуточный переносчик электронов, способный окислить сразу две молекулы воды – редокс-потенциал хлорофилла будет достаточен, только если его равномерно делить на четыре электрона.

Водоокисляющий комплекс – это связанный с фотосистемой II марганец-кислородный кластер. Он содержит четыре иона марганца, меняющих степень окисления от +3 до +4, кроме того, с ним связано по одному иону кальция и хлора (рис. 16.6). Структура этого кластера напоминает элементарную ячейку таких природных минералов, как рансьеит (CaMn4O9 × 3H2O) и других слоистых оксидов марганца, подобно тому как FeS-кластеры окислительно-восстановительных ферментов похожи на ячейку пирита. Существовала гипотеза о происхождении водоокисляющего комплекса от защитного фермента супероксид-дисмутазы, одна из разновидностей которого содержит два иона марганца. Такой примитивный фермент, как предполагалось, мог быть способен к двухэлектронным реакциям – окислению H2O2 до кислорода. Окисление воды до H2O2 в такой системе было невозможно из-за недостаточного редокс-потенциала хлорофилла. К сожалению, никакого сходства между последовательностями супероксид-дисмутаз и белков фотосистемы II обнаружить не удалось.

Однако было давно замечено, что выделение кислорода в фотосинтезе сильно стимулируется добавлением бикарбонатов (солей HCO3-). Добавление изотопно меченого тяжелым кислородом 18O бикарбоната показало, что при освещении в первые секунды выделяется кислород, содержащий только тяжелый изотоп 18О. Это значит, что водоокисляющий центр переключается на окисление бикарбоната, при этом выделяются кислород и углекислый газ. Кроме того, было обнаружено, что бикарбонат участвует в сборке марганцевого кластера. Водорастворимая форма марганца – ионы Mn2+. В физиологических условиях они находятся в клетке в основном в виде марганец-бикарбонатных комплексов, таких как Mn2(HCO3)22+. В процессе сборки марганцевого кластера эти комплексы присоединяются к фотосистеме II. А затем под действием света Mn2+ в составе комплексов окисляются ею до Mn3+, а бикарбонат – до кислорода и CO2.

Марганец-бикарбонатные кластеры по своему редокс-потенциалу могут служить донорами электронов для бактериальных фотосистем, при этом происходит окисление Mn2+ до Mn3+. Это было обнаружено в экспериментах с фотосистемой II пурпурных бактерий, в норме окисляющих железо (Khorobrykh et al, 2007). Из этого можно построить следующую схему происхождения кислородного фотосинтеза (рис. 16.7): сначала, по мере исчерпания железа в океане, предки цианобактерий стали переходить на марганец-бикарбонатные комплексы в качестве источника электронов для фотосинтеза. Затем мутации ФСII привели к тому, что ионы Mn3+ (продукт марганец-окисляющего фотосинтеза) стали задерживаться на белке и принимать участие в его работе. Из них собрался примитивный марганец-кислородный кластер, способный проводить фотоокисление HCO3– до кислорода и CO2. Эта реакция требует в полтора раза меньше энергии, чем окисление воды, и возможностей бактериальной ФСII для этого практически достаточно. Так у фотосинтезирующих бактерий появился доступ к новому источнику электронов – бикарбонату. По мере того как запасы марганца в океане были израсходованы и осаждены в виде MnO2, процианобактерии стали переходить на окисление того, что осталось, т. е. бикарбоната. Марганец, который до того был расходным материалом для фотосинтеза, стал катализатором для использования бикарбонатов, и потребность в нем уменьшилась в тысячи раз.

Далее бактериохлорофилл a в составе ФСII был заменен более редокс-активными пигментами, такими как бактериохлорофилл g , а затем и хлорофилл а , для повышения скорости бикарбонатного фотосинтеза. Одновременно совершенствовались системы защиты клеток от выделяемого кислорода. Наконец, по мере истощения запасов СО2 в атмосфере и бикарбонатов в море, к марганцевому кластеру присоединился ион кальция, повысивший его редокс-потенциал и сделавший возможным окисление воды. Так цианобактерии освоили неограниченный источник электронов для фотосинтеза и увеличили продуктивность всей биосферы в несколько раз (Dismukes et al., 2001).

Этот сценарий подтверждается новыми геологическими находками (Johnson et al., 2013). В Южной Африке были найдены морские осадки возраста 2,415 млрд лет, которые сильно обогащены оксидами марганца. Этот возраст примерно совпадает с началом оксигенизации атмосферы и гидросферы планеты. Там же присутствуют зерна легко окисляемого минерала пирита. Следовательно, в этих слоях осаждение марганца происходило не за счет реакций с кислородом. По-видимому, это следы деятельности марганец-окисляющих фотосинтезирующих организмов.

Итак, мы видим, что в течение 1,5 млрд лет после возникновения жизнь постепенно осваивала использование энергии Солнца и новые, все более распространенные восстановители для питания углекислым газом. С появлением кислородного фотосинтеза 2,4 млрд лет назад недостаток восстановителей (железа, водорода, соединений серы) более не ограничивал продуктивность экосистем. Появление в атмосфере кислорода, ядовитого для многих древних групп микробов, вызвало масштабное вымирание и перестройку экосистем. По-видимому, именно кислородная среда стала толчком к появлению новых организмов с более сложными клетками – эукариот, т. е. клеток с ядром. Только на основе эукариотной клетки стало возможно появление крупных многоклеточных растений и животных. В последней, 18-й главе мы рассмотрим движущие силы и механизмы появления эукариот.

 

Огромное разнообразие электрон-транспортных цепей разных организмов, работающих в хемосинтезе, фотосинтезе и дыхании, строится из ограниченного количества блоков. Ферментные комплексы состоят из многих отдельных белковых молекул, причем часто мы можем найти родственные компоненты в комплексах с разными функциями. По последовательностям аминокислот в белках и по составу белковых субъединиц в разных комплексах мы можем проследить их эволюцию. Небелковая часть электрон-транспортных цепей, гемы и хиноны, имеет свою эволюционную историю, которую можно проследить по взаимодействующим с ними белкам.

 

Разнообразие и происхождение гемов, хлорофиллов и родственных коферментов

Основной пигмент современного фотосинтеза – хлорофилл, как и основной компонент электрон-транспортных цепей, гем, относится к группе веществ, называемых порфиринами. Широкие плоские молекулы порфиринов, содержащие в центре атом какого-либо металла, легко могут окисляться и восстанавливаться, поглощать свет и проводить электроны от одной соседней молекулы к другой. Также они могут быть эффективными катализаторами химических реакций.

К порфиринам, кроме хлорофилла и обычных гемов (a и b ), относятся некоторые другие молекулы, работающие в клетках, например гем d 1 и сирогем. Последние по сравнению с обычным гемом имеют в своей структуре меньше двойных связей и больше боковых карбоксильных (СООН) групп. Сирогем входит в состав двух типов ферментов: сульфит-редуктаз и ассимиляторных нитрит-редуктаз. Оба этих класса ферментов проводят реакции восстановления с переносом в общей сложности до шести электронов, восстанавливая сульфит до сероводорода и нитрит до аммиака. Гем d 1 входит в состав единственного фермента, диссимиляторной нитрит-редуктазы, которая восстанавливает нитрит до оксида азота, NO, с переносом одного электрона.

Более далекие родственники гемов – кофермент F430 и витамин В12. Кофермент F430 содержит никель и участвует в процессах метаногенеза. Ни у каких других организмов, кроме архей-метаногенов, он не встречается. Витамин В12 же есть почти у всех организмов, содержит кобальт и участвует в реакциях переноса метильных групп. Его строение несколько отличается от типичных порфиринов: в нем отсутствует один из метиленовых мостиков, соединяющих малые кольца в большое порфириновое кольцо. Вместо этого два малых кольца из четырех связаны напрямую; такие молекулы называются «коррины» (рис. 17.1).

Синтез всех порфиринов и витамина В12 начинается одинаково (рис. 17.2). Глутаминовая кислота восстанавливается до альдегида, потом аминогруппа переносится на конец молекулы, и получается дельта-аминолевулиновая кислота. Две ее молекулы реагируют друг с другом, образуя порфобилиноген – вещество с пятичленным пиррольным кольцом в молекуле. Затем четыре молекулы порфобилиногена объединяются в цепочку (гидроксиметилбилан), которая замыкается в кольцо (уропорфириноген III). Отсюда пути синтеза разных порфиринов расходятся.

Известно несколько разных путей синтеза гемов и витамина В12 из уропорфириногена III. Их эволюционные отношения долго не удавалось распутать. Лишь недавно, с описанием всех ферментов и реакций пути синтеза витамина В12 у архей (Moore et al., 2013), удалось разобраться в этом разнообразии. Эти цепочки реакций делятся на две группы: аэробные (работающие в присутствии кислорода) и анаэробные. Их главное различие состоит в том, что в аэробных путях синтеза гема и В12 атом металла вставляется в молекулу на последней стадии, а в анаэробных – ближе к началу и участвует в последующих реакциях. Смысл этих различий, видимо, в том, что металлсодержащие промежуточные продукты в кислородной среде могут легко окисляться и быть источниками повреждающих активных форм кислорода.

Превращение уропорфириногена III в гемы и хлорофиллы сводится к восстановлению части двойных связей, вставке железа или магния и «обработке краев напильником» – отщеплению или укорочению боковых цепей. В аэробных путях синтеза порядок реакций с боковыми цепями может различаться в разных организмах (Dailey et al., 2015). У многих архей, а также у части анаэробных бактерий (сульфатвосстанавливающих, например Desulfovibrio, и некоторых денитрифицирующих) обнаружен, по-видимому, древнейший путь синтеза гема (Bali et al., 2011). Гемы b и d 1 у них образуются из сирогема, причем на всех стадиях превращений атом железа остается в центре молекулы. По-видимому, это означает, что и в эволюции сирогем был предшественником этих гемов (рис. 17.3).

 

Разнообразие и эволюция гем-содержащих белков

Цитохромы были открыты и разделены на типы (а, b, c ) еще в конце XIX века по своим спектроскопическим свойствам – грубо говоря, по цвету. Первое время после открытия гемов считалось, что каждому типу цитохромов соответствует свой тип гема, отличающийся боковыми группами порфиринового кольца. Потом оказалось, что реально существуют только гемы a, b и d 1 . Цитохромы с содержат гем b , но отличаются от прочих типов цитохромов способом соединения гема с белком. В цитохромах с гем соединен с белковой молекулой двумя прочными ковалентными связями, а в цитохромах а, b и d  – только слабыми координационными связями. Цитохромы a и b образуются самопроизвольно в пробирке из очищенного белка и гема. Ковалентное соединение гема с белком в цитохромах c образуется при помощи специальных ферментов. Так что в эволюции цитохромы с должны были возникнуть позже, чем другие типы цитохромов. Распространение цитохромов с и филогенетические деревья ферментов, соединяющих гем с белком, показывают, что цитохромы с появились уже после появления основных групп бактерий. Их изобретателями могли быть протеобактерии или цианобактерии, а возможно, и те и другие независимо. Дальнейшее распространение цитохромов с по другим группам бактерий и архей происходило путем горизонтального переноса генов. Благодаря прочным ковалентным связям гема с белковой цепью в цитохромах с они гораздо устойчивее и могут участвовать в большем разнообразии реакций, чем цитохромы a и b .

О сирогем-содержащих белках мы можем с уверенностью сказать, что у LUCA из них была диссимиляторная сульфит-редуктаза (Dsr). Она восстанавливает сульфит (SO32-) до серы в сульфатном дыхании либо, наоборот, окисляет серу до сульфита в серном фотосинтезе. Молекула этого фермента состоит из двух похожих субъединиц, каждая из которых связывает сирогем, но только один из двух сирогемов образует активный центр. Значит, древний вариант сульфит-редуктазы Dsr состоял из двух одинаковых белковых половинок, кодируемых одним геном, и имел два активных центра. Филогенетическое дерево белковых субъединиц этого фермента однозначно показывает, что дупликация гена, давшая начало двум разным субъединицам, произошла до разделения бактерий и архей (Dhillon et al., 2005). Ассимиляторная сульфит-редуктаза (Asr) по структуре похожа на сульфит-редуктазу Dsr, но две субъединицы у нее слились в единую белковую цепь, а неработающий второй сирогем был утрачен. Подобной структурой обладает и нитрит-редуктаза. Усиление различий между субъединицами и их слияние указывают, что нитрит-редуктаза и сульфит-редуктаза Asr произошли от Dsr. Это согласуется и с их функциями: редуктаза Asr образует сероводород из сульфита, нитрит-редуктаза – аммиак из нитрита, а в геотермальных водоемах, где обитал LUCA, сероводород и аммиак были в достатке. Сульфит-редуктаза Dsr же может работать в обратном направлении, окисляя серу; и в этом качестве могла быть востребована у LUCA, например, в процессе фотосинтеза.

Итак, мы можем быть уверены, что из разнообразия порфиринов LUCA могли быть сирогем, участвующий в окислении серы, и витамин В12, работающий, среди прочего, в восстановительном ацетил-КоА-пути фиксации углекислого раза (см. главу 11). О древности других порфиринов мы не можем судить так же достоверно. Гемы a и b участвуют во множестве окислительно-восстановительных реакций, и у нас нет четких аргументов ни за, ни против их присутствия у LUCA. Хлорофиллы или промежуточные продукты их синтеза (протохлорофиллиды) могли быть у LUCA в качестве защитных пигментов. Нельзя исключать, что эту же функцию защиты от ультрафиолета могли выполнять какие-нибудь другие порфирины, которые не сохранились до нашего времени.

 

Разнообразие и эволюция хинонов

В разных группах бактерий и архей для переноса электронов в мембранах используются химически разные хиноны: убихинон, пластохинон, менахинон, кальдареллахинон и другие (рис. 17.4). Кроме того, существуют бактерии и археи, не имеющие хинонов вовсе: это ацетогены из клостридий и большинство групп архей-метаногенов. В электрон-транспортной цепи электроны передаются с более слабого окислителя на более сильный. Единственный окислитель, доступный метаногенам, CO2, слишком слаб, чтобы принимать электроны с хинонов. Лишь у архейного семейства метаногенов Methanosarcinales есть аналоги хинонов – метанофеназины, которые по своему редокс-потенциалу могут отдавать электроны на CO2.

Если посмотреть распределение разных хинонов по филогенетическому дереву бактерий и архей, то легко можно увидеть, что большинство хинонов появились в эволюции после расхождения основных групп бактерий. Убихинон возник у протеобактерий, пластохинон – у цианобактерий, а кальдареллахинон – у архей Sulfolobales. Менахинон же распространен у самых разных групп бактерий и архей. Обладатели уби-, пласто– и кальдареллахинона обычно используют кислород либо устойчивы к нему, а организмы с менахиноном, как правило, строгие анаэробы. Менахинон реагирует с кислородом, образуя ядовитую перекись водорода, поэтому с появлением кислорода в атмосфере разные группы бактерий и архей независимо друг от друга нашли ему безопасную замену. Менахинон в настоящее время найден у самых разных групп анаэробных бактерий и архей, в том числе древних. Вероятно, он был еще у LUCA либо возник вскоре после разделения бактерий и архей.

 

Разнообразие электрон-транспортных цепей

В предыдущих главах мы познакомились с двумя самыми распространенными вариантами электрон-транспортных цепей, работающими в аэробном дыхании и в кислородном фотосинтезе. На самом деле разнообразие гораздо шире, потому что бактерии и археи используют множество разных окислителей и восстановителей (см. главу 16). Кроме упомянутых в прошлой главе окислителей (кислород, сульфат, нитрат, нитрит) разные бактерии могут использовать серу, хлорат, перхлорат, арсенат, селенат, растворенное трехвалентное железо (в кислой среде), твердые оксиды Fe2O3 и MnO2, хлорорганические соединения и другие вещества. В качестве восстановителей может использоваться такая экзотика, как фосфит, арсенит, соединения сурьмы и даже урана. Более того, существуют разные неродственные варианты ферментных комплексов для одной и той же реакции. Например, для окисления железа у разных микробов известно четыре разных ферментных системы. Описание всего этого разнообразия заняло бы целую книгу, поэтому мы ограничимся здесь разбором двух электрон-транспортных цепей: денитрификации и сульфатного дыхания/окисления серы. Первая интересна тем, что некоторые ее ферменты эволюционно родственны ферментам кислородного дыхания, а вторая, по-видимому, одна из древнейших.

В ходе денитрификации нитрат восстанавливается до азота в четыре стадии:

NO 3 - → NO 2 - → NO → N 2 O → N 2 .

Каждая из четырех реакций катализируется своим ферментом. Типичная дыхательная цепь денитрификации похожа на цепь, работающую в аэробном дыхании: в ее составе тоже есть комплекс I (НАДН-дегидрогеназа) и комплекс III (цитохромный комплекс bc 1 , в состав которого входят цитохромы b и с ), между которыми электроны переносятся при помощи хинонов. Однако если аэробная дыхательная цепь линейна, то дыхательная цепь денитрификации разветвляется в двух местах. Хиноны в ней переносят электроны не только к цитохрому bc 1 , но и к нитрат-редуктазе, а после цитохрома bc 1 подвижный малый цитохром с доставляет электроны по трем разным адресам: на нитрит-редуктазу, NO-редуктазу и N2O-редуктазу (рис. 17.5).

Из-за разветвления дыхательная цепь денитрификации нуждается в тонком управлении распределения тока. Например, нитрит-редуктаза производит ядовитый оксид азота NO. В норме его концентрация очень мала, потому что NO-редуктаза быстро превращает NO в безопасный N2O. Но если NO-редуктазе не хватит электронов, клетка отравит сама себя оксидом азота. Поэтому дыхательная цепь денитрификации качает меньше протонов, чем могла бы, – меньшая эффективность оказывается платой за безопасность. Кроме изображенного на рисунке варианта существуют более простые денитрификационные дыхательные цепи, в которых нет комплекса III, а все четыре редуктазы получают электроны прямо с хинона. Они проще в управлении, но переносят меньше протонов через мембрану.

Все известные варианты дыхательных цепей денитрификации, аммонификации и других окислительно-восстановительных превращений соединений азота используют компоненты, возникшие в эволюции после LUCA: цитохромы c и медьсодержащие ферменты. Медь входит в состав активного центра N2O-редуктазы и вспомогательных субъединиц NO-редуктазы. Так что их появление в эволюции, видимо, произошло уже после возникновения основных групп бактерий.

Восстановление сульфата, как и нитрата, происходит в несколько этапов. Поскольку сульфат – очень слабый окислитель, то он нуждается в активации с помощью АТФ. Сульфат превращается в аденозил-фосфосульфат, который далее восстанавливается до сульфита, серы и сероводорода:

SO 4 2- → аденозил-фосфо-SO 4 - → SO 3 2- → S → H 2 S.

Аденозил-фосфосульфат-редуктаза (Apr) получает электроны не от обычных переносчиков, а от белкового комплекса-партнера, который называется Qmo (рис. 17.6). Даже с учетом активации АТФ сульфат – слишком слабый окислитель, чтобы принимать электроны с хинона. Поэтому комплекс Qmo объединяет в один ток электроны из двух источников с разным напряжением: от хинона (слабый восстановитель) и от ферредоксина (сильный восстановитель). Благодаря этому Apr может восстановить сульфат до сульфита. Работа комплекса Qmo называется «электронная конфуркация».

Дальше работает диссимиляторная сульфит-редуктаза (DsrAB), которая восстанавливает сульфит до серы, перенося четыре электрона. В клетках сера из активного центра сульфит-редуктазы выходит при помощи вспомогательного белка DsrC, молекула которого имеет длинную «ручку» с двумя остатками цистеина. Сера реагирует с этими цистеинами, превращаясь в H2S, а цистеины окисляются в дисульфидный мостик. Другой ферментный комплекс, гетеродисульфид-редуктаза (DsrMKJOP), восстанавливает этот дисульфидный мостик обратно, получая электроны с хинона. У многих бактерий эта система работает в обратном направлении, окисляя сероводород и серу до сульфита, например, в процессах фотосинтеза и диспропорционирования серы.

Комплексы сульфатного дыхания устроены достаточно однотипны у разных организмов, кроме того, сульфатное дыхание – признак нескольких древних, рано ответвляющихся групп архей и бактерий. Оно обходится без меди и обычно без цитохромов c . Субъединицы одного из его ферментов, сульфит-редуктазы DsrAB, судя по филогенетическому дереву, появились при дупликации генов еще до LUCA. Все это говорит о большой древности этого пути метаболизма.

 

Модульная структура окислительно-восстановительных ферментов

Изучение большого разнообразия дыхательных цепей показывает, что множество ферментных комплексов, работающих с разными веществами, строятся из небольшого набора субъединиц, как в конструкторе LEGO (Baymann et al., 2003). В простейшем случае дыхательная цепь состоит из двух комплексов, перенос электронов между которыми осуществляется хиноном. Каждый из двух комплексов включает как минимум три блока:

• каталитическая субъединица получает электроны от восстановителя;

• мембранная субъединица отдает электроны на хинон;

• соединительная субъединица работает «проводом» между двумя другими.

Среди каталитических субъединиц выделяются своей универсальностью молибденовые оксидоредуктазы (их еще называют CISM – Complex Iron-Sulfur Molibden). Это семейство ферментов восстанавливает гидрокарбонат (до муравьиной кислоты), нитрат (до нитрита), хлорат, перхлорат, арсенат, селенат, полисульфиды, диметилсульфоксид, триметиламиноксид и даже хлорорганические вещества. В состав этой субъединицы входит молибден, связанный с двумя молекулами витамина В9 (этот комплекс называется «молибденовый кофактор», MoCo), и один 4Fe-4S кластер (рис. 17.7).

Гетеродисульфид-редуктазная субъединица содержит три железосерных кластера 4Fe-4S (один из них связан с белком через пять атомов серы, а не через четыре, как обычно). Она входит в состав нескольких ферментов метаногенеза и сульфатного дыхания, у метаногенов восстанавливает дисульфидный мостик между двумя коферментами (CoB-S-S-CoM), у сульфатредукторов – мостик между двумя цистеинами в переносящем серу белке DsrC.

NiFe-гидрогеназная субъединица работает с молекулярным водородом (Н2). Она входит в состав разных гидрогеназ, мембранных и растворимых, поглощающих и выделяющих водород, а также формат-гидрогенлиазы и даже комплекса I (НАДН-хинон-оксидоредуктазы), и сочетается с разными «проводами» и хинонными портами.

Трансмембранные цитохромы b сочетают функции «проводов» и «хинонных разъемов» и используются, когда каталитическая субъединица должна быть по одну сторону мембраны, а хинон – по другую. Они содержат два гема b и входят в состав формат-дегидрогеназы, нитрат-редуктазы, гидрогеназ, комплекса b 6 f в фотосинтезе и многих других ферментов.

Другой белковый модуль с хинонным сайтом носит обозначение PsrC/NrfD. Эта субъединица связывает каталитический центр с хинонами на той же стороне мембраны, в отличие от цитохромов b . Она входит в состав полисульфид-редуктаз Psr, арсенат-редуктазы, аммонифицицирующей нитрит-редуктазы Nrf и некоторых гидрогеназ. В составе некоторых комплексов эта субъединица дополнительно переносит протоны через мембрану за счет изменения формы белка.

Кроме трансмембранных «проводов» в комплексах электрон-транспортной цепи часто бывают гидрофильные провода, соединяющие разные субъединицы. Основные типы гидрофильных проводов – это тетракубановый белок (4 кластера 4Fe-4S), бактериальный ферредоксин (2 кластера 4Fe-4S, более известен как подвижный переносчик) и двухгемовый цитохром с .

Например, формат-дегидрогеназа Fdn состоит из трех субъединиц: молибденовой каталитической, тетракубанового «провода» и хинон-связывающего цитохрома b . Нитрат-редуктаза Nar собрана из таких же модулей, но в другой ориентации – ее каталитический домен обращен внутрь клетки, а не наружу.

Ферменты сульфатного дыхания дают примеры более сложных структур. Например, комплекс Qmo, проводящий электроны к аденозил-фосфосульфат-редуктазе (Apr), занимается сведением в один ток электронов от хинона и ферредоксина. В его составе есть цитохром b , дикубановая субъединица и две флавин-содержащие субъединицы. Комплекс DsrMKJOP, восстанавливающий переносчик серы DsrC, состоит обычно из пяти субъединиц: каталитической гетеродисульфид-редуктазной, двух мембранных хинонных портов (цитохром b и PsrC/NrfD типа) и двух вспомогательных на наружной стороне мембраны (трехгемовый цитохром с и тетракубановая). Зачем такая сложность – непонятно, потому что в некоторых клетках с той же работой справляется комплекс DsrMK из двух субъединиц – одной каталитической и одного цитохрома b . В группе дельта-протеобактерий ферменты сульфатного дыхания и другие комплексы еще более усложнены и содержат по несколько субъединиц цитохромов с , которые могут иметь до четырех-шести гемов. Видимо, это позволяет им быстро переключаться между разными окислителями и восстановителями.

 

Происхождение комплекса I (НАДН-хинон-оксидоредуктаза)

Один из сложнейших комплексов дыхательной цепи митохондрий и многих бактерий, комплекс I, переносит электроны с НАДН на хиноны. Энергия этих электронов используется для откачки из клетки протонов, которые затем входят обратно через роторную АТФазу и производят АТФ. У архей Methanosarcinales есть родственные комплексы, переносящие электроны с водорастворимого кофермента F420 на мембранный аналог хинона, метанофеназин. Минимальный вариант комплекса I включает в себя 14 разных субъединиц. В митохондриях животных комплекс I еще более сложен, и количество его субъединиц может превышать 40. Комплекс I по форме похож на букву Г, одно плечо которой лежит в мембране, а другое выступает в цитоплазму. Сайт связывания НАДН находится на конце цитоплазматического плеча. Четыре из мембранных субъединиц (J, L, M, N) непосредственно переносят протоны через мембрану за счет изменения формы белка (рис. 17.8).

Сравнение аминокислотных последовательностей субъединиц комплекса I показало, что у многих из них есть родственники в других типах белков, прежде всего среди гидрогеназ и натрий-протонных антипортеров. Гидрогеназы – это разнообразная группа ферментов, работающих с молекулярным водородом. Они могут как вырабатывать водород, окисляя НАДН, ферредоксин и другие переносчики электронов, так и поглощать водород с восстановлением переносчиков. Эти функции востребованы, например, у организмов, использующих молекулярный водород для получения энергии и восстановления СО2 (ацетогены, метаногены и многие другие). По используемым металлам в активном центре гидрогеназы делятся на NiFe и FeFe семейства, которые дальше подразделяются на группы по составу субъединиц. Родством с комплексом I обладает четвертая группа NiFe гидрогеназ.

В четвертой группе гидрогеназ наиболее просто устроены гидрогеназы Ech. Это мембранные ферменты, получающие электроны от цитоплазматических доноров и выделяющие водород. Они состоят из шести субъединиц, все они имеют гомологи в комплексе I. Четыре цитоплазматических субъединицы гидрогеназы Ech родственны субъединицам B, C, D, I комплекса I, а две мембранных – субъединицам H и L соответственно (рис. 17.8). Каталитический центр гидрогеназы Ech, содержащий по одному атому железа и никеля, расположен на гомологе D-субъединицы комплекса I.

Более сложные гидрогеназы этой группы имеют дополнительные субъединицы. Например, Hyc – формат-гидроген-лиаза кишечной палочки – осуществляет разложение муравьиной кислоты с выделением СО2 и водорода. Она состоит из восьми субъединиц, шесть из которых похожи на субъединицы Ech, а две другие – молибден-содержащая формат-дегидрогеназа и субъединица, участвующая в передаче электронов от молибденового центра к никель-железному. Эти две субъединицы гомологичны, соответственно, С– и N-концам субъединицы G комплекса I. Гидрогеназа Hyf, тоже обнаруженная у кишечной палочки, имеет также гомологи мембранных субъединиц K, M, N комплекса I, которые ответственны за перенос протонов через мембрану. К сожалению, источник электронов для Hyf пока не найден. У других бактерий и архей обнаружены гидрогеназы четвертой группы, содержащие до 13 субъединиц и способные переносить ионы через мембраны. Для некоторых из них известны доноры электронов. Например, гидрогеназа Coo бактерий Rhodospirillum и Carboxydothermus окисляет угарный газ с выделением водорода и запасанием энергии.

Известны также близкородственные гидрогеназам белки, не имеющие собственно гидрогеназного центра. Наиболее просто устроены комплексы Ehr, состоящие из двух цитоплазматических субъединиц (гомологи B и D комплекса I) и четырех находящихся в мембране, которые соответствуют субъединицам H, L, M и С-концу K в составе комплекса I. Их функции неизвестны. Более сложный гидрогеназоподобный комплекс Mbx архей Pyrococcus и Thermococcus содержит также гомологи субъединиц C и I и дополнительные мембранные субъединицы. Он переносит электроны с ферредоксина на НАДФ и сопрягает эту реакцию с переносом протонов через мембрану.

Субъединицы L, M и N комплекса I ответственны за транспорт ионов. Помимо гидрогеназ четвертой группы родственные им белки входят в состав натрий-протонных антипортеров. Эти мембранные транспортные белки обменивают один ион натрия на один протон, перенося их через мембрану навстречу друг другу, и могут работать в обоих направлениях. Перенос ионов происходит благодаря движениям всей белковой молекулы. Эти антипортеры используются для соединения натриевой и протонной энергетики в одной клетке и могли быть одной из первых систем откачки протонов из клетки на заре протонной энергетики. Детальное изучение трехмерной структуры комплекса I показало, что субъединица H обладает сходной пространственной укладкой с L, M и N, но у нее отсутствуют аминокислоты, необходимые для связывания ионов. Видимо, она, подобно L, M и N, тоже происходит от натрий-протонных антипортеров, но в составе комплекса I изменила функцию и участвует в передаче движения от цитоплазматического плеча «рычага» к ионным насосам L – M-N.

Мы видим, что шире всего распространены четыре субъединицы: мембранные H и L и цитоплазматические B и D. Они присутствуют в комплексе I, во всех мембранных гидрогеназах и гидрогеназоподобных комплексах, например Ehr. Поскольку они всегда оказываются в середине ферментных комплексов, их еще называют «универсальным адаптером». Субъединицы B и D также родственны двум субъединицам растворимых NiFe-гидрогеназ. Видимо, движение электронов в этих гидрогеназах сопровождалось изменением формы белка, и соединение B-D субъединиц с мембранными H-L, происходящими от натрий-протонного антипортера, позволило гидрогеназе запасать энергию, перенося ионы через мембрану.

На следующем шаге по пути к комплексу I гидрогеназа, видимо, стала формат-гидрогенлиазой, подобно Hyc кишечной палочки. Для этого к комплексу присоединились две субъединицы, которые в современном комплексе I слились в единую субъединицу G. Потом к комплексу присоединились субъединицы E и F, родственные растворимым НАДН-дегидрогеназам, и донором электронов стала НАДН вместо муравьиной кислоты. Однако субъединица G, утратившая аминокислоты, нужные для связывания молибдена, до сих пор сохраняет сходство с формат-дегидрогеназами. Приблизительно тогда же субъединица D утратила сайт связывания никель-железного кластера и способность выделять водород, и акцептором электронов стал хинон. Разница редокс-потенциала между НАДН и хиноном больше, чем между муравьиной кислотой и водородом. Поэтому перенос электронов с НАДН на хинон позволяет получить больше энергии. Чтобы полнее использовать эту энергию, в результате дупликации субъединицы L возникли дополнительные ионные насосы M и N. Малая субъединица K похожа на вспомогательные субъединицы натрий-протонных антипортеров и, видимо, была позаимствована из них для помощи в работе L – M-N.

Эволюция комплекса I дает нам яркий пример смены функций на молекулярном уровне. Миллиарды лет назад субъединицы комплекса I потеряли железно-никелевый гидрогеназный центр и молибденовый формат-дегидрогеназный центр. Однако субъединицы D и G не были утрачены из состава комплекса и до сих пор сохраняют сходство с соответствующими активными ферментами. Видимо, они встроены в передачу механического движения внутри комплекса, и их утрата приведет к неработоспособности всей большой молекулярной машины.

 

Происхождение цитохромных комплексов

bc

1

(комплекс III) и

b

6

f

Цитохромные комплексы bc 1 и b 6 f входят в состав электрон-транспортных цепей митохондрий, хлоропластов, цианобактерий и многих аэробных бактерий. Как можно догадаться из их названия, они состоят из нескольких цитохромов разных типов. Цитохромные комплексы переносят электроны с хинонов на водорастворимые высокопотенциальные переносчики, обычно малые цитохромы с или пластоцианины. Важной функцией этих комплексов является бифуркация, или разветвление пути электронов (процесс, обратный конфуркации электронов в комплексе Qmo сульфатного дыхания). Приняв два электрона с хинона на наружной стороне мембраны и выбросив наружу два протона, цитохромный комплекс пускает их по разным путям. Один электрон проходит к сайту растворимого переносчика (например, цитохрома с ) и следует дальше по электрон-транспортной цепи, а другой электрон попадает на внутреннюю сторону мембраны, где находится второй хинонный сайт комплекса bc 1 . Когда хинон во втором сайте примет два электрона, он проходит через мембрану к первому хинонному сайту комплекса и отдает там электроны на цитохром и протоны в воду. За счет такого сложного пути электронов удается полнее использовать разницу потенциалов между хиноном и цитохромом с : на каждый прошедший через комплекс электрон через мембрану переносятся два протона, а не один, как в простейшем Q-цикле.

Цитохромные комплексы bc 1 содержат от 3 субъединиц у ряда бактерий до 11 субъединиц в митохондриях. Три основные субъединицы, которые есть в любых вариантах комплекса bc 1 , – это трансмембранный цитохром b (8 трансмембранных спиралей, два гема b ), цитохром с и железосерный белок Риске. Последний содержит необычный железосерный кластер 2Fe-2S, связанный с двумя цистеинами и двумя гистидинами. Из-за такого аминокислотного окружения его редокс-потенциал гораздо выше, чем у ферредоксинов, в которых железосерные кластеры связаны с белком через четыре цистеина. Комплексы b 6 f устроены сходно с bc 1 , но вместо одного цитохрома b в них есть два разных белка: цитохром b 6 с четырьмя трансмембранными спиралями и белок PetD с тремя спиралями. Они по последовательности аминокислот сходны с N– и C-концевыми половинами цитохрома b комплекса bc 1 , но связывают больше кофакторов: два гема b на цитохроме b 6 и по одной молекуле гема с , хлорофилла а и каротина на белке PetD. Цитохром f функционально аналогичен цитохрому c 1 комплекса bc 1 и тоже содержит гем c , но совсем не похож на цитохром c 1 по последовательности и имеет другое происхождение. Белки Риске комплексов bc 1 и b 6 f устроены практически одинаково.

История цитохромных комплексов запутана из-за горизонтальных переносов генов. Комплексы bc 1 -типа (с длинным цитохромом b ) встречаются как у бактерий, так и у архей, а комплексы типа b 6 f  – только у бактерий. У некоторых бактерий в геноме закодировано до четырех разных комплексов, причем на филогенетическом дереве они находятся на различных ветвях. В одном геноме могут сочетаться гены комплексов bc 1 и b 6 f . Лишь недавно, с накоплением данных по большому количеству геномов, удалось установить, что на филогенетическом дереве есть несколько ветвей bc 1 комплексов и несколько ветвей b 6 f комплексов (Dibrova et al., 2013). Иными словами, переход от одного типа к другому – будь то слияние двух генов в один длинный цитохром b или разделение гена на два – происходил несколько раз. Это позволяет предположить вероятное направление эволюции: несколько независимых событий разделения гена в одной и той же точке, да еще с последующим появлением сайта связывания гема c в одном месте в разных ветвях комплексов b 6 f очень маловероятны. А эволюция в обратном направлении – слияние двух соседних генов одного оперона и утрата сайта связывания гема с  – вполне могла происходить много раз независимо.

Длинная 8-спиральная форма цитохрома b уникальна для комплекса bc 1 . Короткие 4-спиральные цитохромы b встречаются, помимо комплекса b 6 f , еще в ряде мембранных окислительно-восстановительных ферментов, например в формат-дегидрогеназе, и участвуют в проведении электронов через мембрану. Такие белки могли быть востребованы еще во времена LUCA, чтобы снимать электроны с внеклеточных доноров (например, кристаллов сульфида цинка) и использовать их для восстановления веществ внутри клетки. Функция современных комплексов bc 1 и b 6 f  – разветвление электронов – могла возникнуть только с появлением достаточно сильных окислителей. Появление кислородного фотосинтеза сделало такой сильный окислитель (кислород) доступным для биосферы, но до того единственным сильным окислителем были хлорофиллсодержащие фотосистемы. Большинство комплексов b 6 f типа встречаются у фотосинтетиков (цианобактерий, Chlorobi и гелиобактерий) и участвуют в фотосинтезе. Хлорофилл и каротин в составе комплексов b 6 f участвуют в регуляции транспорта электронов между фотосистемами в зависимости от освещенности.

Так что, скорее всего, первые комплексы b 6 f появились у процианобактерий путем объединения цитохрома b , белка Риске (он присутствует и в других редокс-ферментах, в том числе древних) и других субъединиц. Дальше они распространялись путем горизонтального переноса, в том числе вместе с генами фотосинтеза: у гелиобактерий все субъединицы b 6 f комплекса входят в супероперон фотосинтетических генов. У нефотосинтезирующих клеток светозависимая регуляция комплекса b 6 f не требовалась, хлорофилл и каротин терялись, и слияние субъединицы PetD с 4-спиральным цитохромом b 6 помогало стабилизировать структуру комплексов после потери этих кофакторов. Дальнейшая эволюция цитохромных комплексов шла под давлением кислорода: они были оптимизированы для уменьшения образования повреждающих активных форм кислорода и приспособлены к работе в дыхательной цепи аэробного дыхания.

 

Происхождение цитохром-с-оксидазы

Ключевой фермент аэробного дыхания, комплекс IV, или цитохром-с-оксидаза, завершает дыхательную цепь и переносит электроны с цитохрома с на кислород. Она относится к семейству гем-медных оксидаз (НСО, haem-copper oxydase). Разные ферменты этого семейства восстанавливают кислород до воды либо оксид азота NO до закиси азота N2O. Все основные функции этих ферментов выполняются одной большой субъединицей, содержащей 12 трансмембранных спиралей, два гема и атом меди между тремя гистидинами (рис. 17.10). У работающих с NO ферментов этого семейства вместо атома меди присутствует железо. По сходству последовательностей главной субъединицы и набору вспомогательных субъединиц семейство делят на четыре подсемейства: НСО-А, НСО-В и НСО-С, которые восстанавливают кислород и переносят протоны через мембрану, и NOR, который восстанавливает NO и не переносит протоны. Подсемейство НСО-А, к которому относится и комплекс IV митохондрий (см. главу 15), оптимизировано для высоких концентраций кислорода и переносит больше протонов, чем НСО-В и НСО-С.

Среди ученых существуют очень разные точки зрения о происхождении и эволюции этого семейства ферментов. Например, в работах группы Анны-Лизы Дуклузье и Вольфганга Ницшке в Марселе (Ducluzeau et al., 2009) отстаивается сценарий, в котором ферменты подсемейства NOR (переносящие электроны с хинона на NO) были еще у LUCA и участвовали в нитритном дыхании или защите от оксида азота, а кислородные подсемейства произошли от него после появления кислородного фотосинтеза минимум два раза независимо. В пользу этого сценария ученые приводят филогенетические деревья, на которых подсемейство NOR, в отличие от других, четко делится на архейную и бактериальные ветви с корнем между ними. Именно такое дерево мы можем ожидать для белка, который был унаследован первыми бактериями и археями прямо от LUCA, а не распространялся путем горизонтального переноса.

Кроме того, до появления кислорода на Земле вся медь была связана в нерастворимых минералах в одновалентном состоянии, например в Cu2S, и не использовалась клетками. Только с появлением кислорода эти минералы стали окисляться в относительно растворимые соединения двухвалентной меди, такие как CuSO4. Все медьсодержащие ферменты эволюционно относительно молоды, и железо в активном центре NOR, казалось бы, свидетельствует о древности этого подсемейства по сравнению с медь-содержащими HCO-A, B и C. Остаток тирозина, абсолютно необходимый для восстановления кислорода, находится в HCO-C совсем не там, где в HCO-A и НСО-В. Следовательно, переход этих ферментов на работу с кислородом был вызван разными, независимыми мутациями, добавившими тирозин к активному центру.

Другие ученые, например Грибальдо (Gribaldo et al., 2009), используя несколько другие методы построения деревьев, обращают внимание на то, что НСО-А распространены в очень многих группах бактерий и архей, тогда как другие подсемейства ограничены в распространении. На основании их деревьев получается, что подсемейство НСО-В появилось у архей Sulfolobales и попало к бактериям путем горизонтального переноса, а НСО-С и NOR – изобретение протеобактерий. Дерево подсемейства НСО-А в их работе очень похоже на дерево 16S рибосомных РНК, не подверженных горизонтальному переносу, и предполагается, что НСО-А еще во времена LUCA участвовало в защите от кислорода – правда, непонятно, откуда кислород мог тогда взяться.

Некоторые факты не укладываются ни в один из этих двух сценариев: например, в составе вспомогательных субъединиц NOR есть медь, значит, и это подсемейство должно быть не старше, чем кислородный фотосинтез. Другой факт связан с липидами. Известно, что для работы НСО во впадинах главной субъединицы должны быть связаны молекулы липидов бактериального типа – с жирными кислотами. Чтобы HCO работал в мембране археи, состоящей из терпеноидных липидов (см. главу 15), в ней должна быть небольшая примесь липидов бактериального типа. Археи, использующие НСО, всегда имеют также ферменты для синтеза бактериальных липидов, явно полученные горизонтальным переносом от бактерий (Dibrova et al., 2014). Иными словами, все НСО архей должны быть получены от бактерий, а не унаследованы от LUCA. При таком переносе мембранный белок оказывается в новом липидном окружении, к которому он не был приспособлен. Оптимизация перенесенного белка для работы в окружении архейных липидов приводит к ускоренной эволюции его последовательности и ошибкам при построении филогенетических деревьев.

Прорыв в понимании происхождения этого семейства наметился в 2014 году. Биоинформатики из Техасского университета, используя чувствительные методы поиска сходства белков, нашли дальних родственников семейства НСО (Pei et al., 2014). Молекула НСО обладает несовершенной трехлучевой симметрией: 12 трансмембранных спиралей образуют 3 похожие группы по 4 спирали, расположенные вокруг общего центра. Два гема и один атом меди нарушают симметрию. Среди обнаруженных родственников НСО часть белков имеет 4 трансмембранные спирали, похожие больше всего на 9–12-ю спирали НСО (их назвали НСОН-s, НСО homolog single domain). Такие белки не могут устойчиво свернуться поодиночке, а должны объединяться по три, чтобы получилась трехмерная укладка, похожая на HCO. Если в геноме есть несколько генов HCOH-s, кодируемые ими белки могут объединяться в комплексы смешанного состава из двух субъединиц одного типа и одной – другого.

Судя по наличию связывающих гем остатков гистидина, комплексы из одинаковых субъединиц могут содержать три молекулы гема, а комплексы состава «2+1» – одну. Другие родственники НСО, НСОН-t (НСО homolog triple domain) состоят из 12 спиралей, уложенных так же, как в НСО. Большинство из них связывают один гем, некоторые – два (рис. 17.10).

Почти все эти белки известны только из последовательностей полных геномов различных бактерий и никогда не изучались экспериментаторами. Только одна из семи групп HCOH-t попадала в руки экспериментаторов раньше. Это белок NnrS, выделенный из холерных вибрионов. У холерного вибриона он обеспечивает устойчивость к оксиду азота, вырабатываемому иммунной системой хозяина. У почвенных бактерий, где белок NnrS тоже был опознан, он организует движение клеток в сторону большей концентрации нитратов и нитритов. Точный механизм его работы неизвестен, в пробирке NnrS холерного вибриона не окисляет и не восстанавливает NO. Гены nnrS и большинства других родственников НСО в геномах соседствуют с генами ферментов нитратного и нитритного дыхания и генами защиты от отравления NO (не только иммунная система животных, но и сами бактерии травят им друг друга). Так что их функции должны быть как-то связаны с оксидами азота. 4-спиральные НСОН-s явно имеют отношение к предкам НСО, у которых еще не произошло слияния трех белковых субъединиц в одну. Остается ждать, пока биологи-экспериментаторы исследуют разведанные биоинформатиками цели, и тогда мы сможем судить о функциях предков гем-медных оксидаз.

 

Эволюция фотосистем

Происхождение фотосистем от простых хлорофилл-связывающих белков с функцией защиты от ультрафиолета не вызывает больших сомнений. Гораздо менее понятно, как появилось два типа фотосистем. Существует две точки зрения. По одной гипотезе (слияния), ФСI и ФСII независимо возникли из светозащитных белков в разных линиях бактерий. В этом случае цианобактерии, имеющие оба типа фотосистем в одной клетке, появились благодаря событию горизонтального переноса генов одной из фотосистем. Другая гипотеза предполагает, что две фотосистемы возникли путем дупликации генов в одной клетке и появления какого-то «разделения труда» между копиями предкового гена. От этой клетки произошли цианобактерии, а потом вторая фотосистема распространилась к другим группам бактерий путем горизонтального переноса генов.

Некоторые указания на порядок появления разных систем фотосинтеза можно найти в устройстве фотосистем. Так, реакционные центры фотосистем обычно состоят из двух белковых субъединиц. Это разные, хотя и родственные белки, возникшие в результате дупликации общего предкового гена. Однако у Chlorobi и гелиобактерий РЦ1 состоит из двух одинаковых субъединиц, т. е. их фотосистемы сохранили предковое состояние, существовавшее до дупликации. РЦ2 пурпурных бактерий и Chloroflexi состоят из двух разных субъединиц, как и ФСII цианобактерий. На филогенетическом дереве видно, что разные субъединицы РЦ2 пурпурных бактерий ближе друг к другу, чем к субъединицам ФСII цианобактерий. Следовательно, две субъединицы РЦ2 пурпурных и две субъединицы ФСII цианобактерий – это результат двух независимых дупликаций генов (рис. 17.11).

Трехмерная структура фотосистем цианобактерий показывает, что они очень близки по пространственной укладке белка и расположению кофакторов – хлорофиллов, феофитинов, хинонов (Baymann, 2001). Однако есть важное различие: в ФСI реакционный центр (в котором происходит разделение зарядов) и антенная часть являются двумя доменами одной белковой цепи, проходящей через мембрану 11 раз, а в ФСII они разделены на отдельные белковые молекулы, кодируемые разными генами. Антенная часть ФСII образуется белками CP43 и CP47, имеющими шесть трансмембранных спиралей, а реакционный центр – белками D1 и D2 c пятью трансмембранными спиралями (рис. 17.12). По трехмерной структуре CP43/CP47 и D1/D2 соответствуют двум доменам единого белка ФСI.

РЦ1 Chlorobi и гелиобактерий состоит из двух одинаковых белковых молекул с 11 трансмембранными спиралями каждая, образующими антенный домен и центр разделения зарядов, так же как ФСI цианобактерий. Однако РЦ2 пурпурных бактерий и Chloroflexi не имеют ничего похожего на CP43/CP47 и содержат только пять трансмембранных участков. Функции CP43/CP47 выполняют другие антенные белки, не имеющие никаких аналогов у цианобактерий. По аминокислотной последовательности CP43/CP47 цианобактерий больше похожи на антенный домен РЦ1 гелиобактерий, чем на антенну ФСI той же цианобактериальной клетки.

Как нам разобраться, какой вариант фотосистемы древнее – с отдельным антенным белком вроде CP43/CP47 или слитный? Хотя в процессе эволюции происходят как слияния, так и разделения белков, в данном случае гораздо более вероятно разделение предкового двухдоменного белка. Все примитивные варианты фотосистем, состоящие из одинаковых половинок (РЦ1 гелиобактерий и Chloroflexi), состоят из двухдоменных 11-спиральных белков. Появление ФСII в таком случае должно было произойти у предков цианобактерий, а РЦ2 пурпурных бактерий и Chlorobi, видимо, произошли от ФСII древних цианобактерий путем утраты CP43/CP47 и приобрели новые антенные белки (рис. 17.12).

Есть и другой способ узнать, каким способом появилось два типа фотосистем. Если две фотосистемы развивались независимо в разных группах бактерий, то на филогенетических деревьях разных генов фотосинтеза должен быть виден глубокий раздел на ветви обладателей РЦ1 и РЦ2. Среди генов, относящихся к фотосинтезу, наиболее широко распространены ферменты синтеза хлорофилла. Филогенетические деревья этих ферментов (Sousa et al., 2013, Gupta, 2012) показывают, что такого раздела нет (рис. 17.13). Наоборот, Chlorobi с РЦ1 и Chloroflexi с РЦ2 на этих деревьях очень близки друг к другу, а пурпурные бактерии и вовсе попадают внутрь группы цианобактерий. Ферменты пурпурных бактерий специфически сходны с ферментами так называемой ветви С цианобактерий. Члены этой ветви – мелкие одноклеточные цианобактерии океанского пикопланктона (клетки размером менее 2 мкм), такие как Prochlorococcus и Synechococcus. Иначе говоря, история ферментов синтеза хлорофилла, так же как история белков фотосистем, лучше согласуется с появлением обеих фотосистем у предка цианобактерий и горизонтальным переносом их в четыре другие группы фотосинтетических бактерий.

Описанный в главе 16 сценарий появления кислородного фотосинтеза был основан в основном на биофизических экспериментальных данных о современных цианобактериях. Никто тогда не ожидал, что предсказанные переходные формы ФСII, окисляющие марганец и бикарбонат, удастся найти и изучить в пробирке. Однако недавнее исследование геномов цианобактерий показало, что древние варианты ФСII до сих пор существуют и используются клетками в некоторых особых условиях (Cardona, 2015).

Водоокисляющий комплекс находится на субъединице D1 – одной из двух неравных половинок реакционного центра ФСII. В геномах многих цианобактерий закодировано несколько (иногда больше десятка) вариантов D1. Было известно, что смена вариантов D1 используется цианобактериями, например, для защиты от слишком яркого света. В работе Танаи Кордона с коллегами было обнаружено, что некоторые варианты субъединицы D1 сильно отличаются от основных, повседневно используемых вариантов. На филогенетическом дереве такие нетипичные белки образуют три отдельные ветви близко к его корню (на рис. 17.14 обозначены G1, G2, G3. Обычные субъединицы D1 образуют ветвь G4). Поскольку у всех известных цианобактерий есть белки из ветви G4 (а они отвечают за окисление воды и выделение кислорода в процессе фотосинтеза), выходит, что белки ветвей G1-G3 появились в результате удвоения генов еще до появления общего предка современных цианобактерий. Ни один из этих белков раньше не попадал в руки экспериментаторов, поэтому об особенностях работы этих белков мы пока можем судить лишь на основе биоинформационного анализа, опираясь на последовательность аминокислот в белках и, соответственно, их структурных свойств и на данные об активности генов в разных условиях.

Последовательности этих необычных вариантов генов D1 показывают, что фотосистемы групп G1 и G2 не имеют аминокислот, необходимых для связывания марганцевого кластера. А значит, они не могут окислять воду. Группа G3 в этом отношении похожа на обычные фотосистемы и, видимо, может окислять воду и выделять кислород. Гены группы G1 включаются при приспособлении цианобактерий к дальнему красному свету (длина волны 720 нм и более, не поглощается обычными фотосистемами), G2 – по ночам, а G3 – при недостатке кислорода. В ближайшие несколько лет биологи-экспериментаторы должны изучить эти цели, разведанные биоинформатиками, и разобраться в деталях работы древних вариантов фотосистемы II. Их результаты должны серьезно уточнить и дополнить описанный путь эволюции кислородного фотосинтеза.

 

Доступность окислителей и восстановителей на древней Земле

В дыхании микробов используется четыре основных типа окислителей: кислород, соединения азота (нитрат и нитрит), соединения серы (сульфат и сульфит) и углекислый газ. Мы можем быть уверены, что в архейскую эру не было в доступе самого сильного окислителя – кислорода. Весь свободный кислород на Земле образуется благодаря растениям и цианобактериям, которые освоили кислородный фотосинтез лишь в конце архея. В осадочных породах архейского возраста встречаются легко окисляемые кислородом минералы (пирит, уранинит), в том числе в виде гальки, обкатанной в текучей воде. Они могли сохраниться в неокисленном виде, только если кислорода в атмосфере и, соответственно, в воде тогда не было. Также достоверно известно, что слабый окислитель – углекислый газ – был в изобилии. Ситуация с сульфатами и нитратами сложнее.

Вулканические газы содержат заметное количество сернистого газа (SO2) и сероводорода. В атмосфере под действием солнечного ультрафиолетового излучения они разлагаются. Сероводород превращается в пылинки кристаллической серы и водород, улетающий в космос, а сернистый газ дает серную кислоту и те же пылинки серы. Если вместе с сернистым газом облучению подвергается сероводород или метан, как, видимо, и было на древней Земле, то выход серной кислоты уменьшается, а серы – увеличивается. У геохимиков есть данные, позволяющие оценить роль разных процессов окисления и восстановления серы начиная с раннего архея, 3,5 млрд лет назад. Прежде всего, это слои барита (BaSO4), осаждавшиеся на дне морей 3,5–3,4 млрд лет назад. Барий отличается от большинства металлов тем, что его сульфат практически не растворим в воде, а другие соли с двухосновными кислотами (карбонат, сульфид, сульфит) хорошо растворимы. В современной морской воде много сульфатов и нет бария. Видимо, 3,5 млрд лет назад существовала обратная ситуация: в море был барий и не было сульфатов. Те сульфаты, которые попадали в море или образовывались в нем, оседали в виде барита, а 3,5 млрд лет назад барий в море кончился, и пошло накопление сульфатов в воде.

Об истории серы и сульфатов можно много узнать по особенностям их изотопного состава в древних породах. Природная сера состоит из основного изотопа 32S и двух тяжелых, 33S и 34S. Как и в случае углерода, биологические процессы обычно приводят к сортировке изотопов серы: сера, прошедшая через клетки, обедняется тяжелыми изотопами и обогащается легкими. Сортировка эта масс-зависима: недостача 34S вдвое больше, чем 33S. В диспропорционировании серы, когда образуется сразу два продукта (сульфат и H2S), сероводород обедняется тяжелыми изотопами, а сульфат, наоборот, обогащается. В фотолизе сернистого газа сортировка изотопов происходит по-другому: они разделяются не столько по массе, сколько по ядерному спину, и изменяется содержание нечетного 33S относительно четных 32S и 34S. Сера, образуемая при фотолизе SO2, обогащена 33S, а серная кислота им обеднена (рис. 17.15). В противовес масс-зависимому фракционированию серы этот называется масс-независимым фракционированием, потому что не зависит от массы изотопов.

Исследования архейских баритов (Philippot et al., 2007) показали, что сульфат в них обеднен 33S и не имеет отклонений в содержании 34S, т. е. появился в процессе фотолиза сернистого газа. В этих же баритах содержатся включения пирита и других сульфидных минералов, и сера в них сильно обогащена 33S и немного обеднена 34S. Это означает, что сульфидные включения образовались каким-то способом из серы, которая происходит из сернистого газа путем фотолиза. Сниженное содержание 34S в сульфидах сначала было принято за следы микробного диспропорционирования серы. Однако в следующей работе тех же авторов (Philippot et al, 2012) с более точным моделированием фотолиза SO2 в атмосфере делается вывод, что убедительных следов жизнедеятельности микробов в изотопном составе соединений серы архейского периода нет.

Иначе говоря, для эпохи 3,4–3,5 млрд лет назад у нас есть свидетельства абиогенного образования серы и сульфатов из SO2, но нет четких следов микробного метаболизма серы. Эти геологические следы, однако, на 500–600 млн лет моложе, чем живший еще до поздней бомбардировки общий предок бактерий и архей. В его время доля SO2 в вулканических газах могла быть меньше, а H2S – больше. Как шла изотопная сортировка серы в таких условиях, мы не знаем, а значит, неясно, какие изотопные следы надо искать.

Для соединений азота ситуация немного понятнее, чем для серы. Нитриты были на Земле с древнейших времен, но в очень малых количествах. В наше время большая часть нитратов и нитритов образуется бактериями в процессе нитрификации – окисления аммиака кислородом для получения энергии. Кроме того, во время разрядов молний при огромных температурах азот реагирует с кислородом, образуя оксид азота, NO. Затем NO уже при обычных температурах окисляется кислородом до NO2 и реагирует с водой, образуя азотную кислоту, которая содержится в малых количествах в дождевых каплях во время грозы. До появления кислородного фотосинтеза эти реакции происходить не могли, но, как оказалось, кислород не обязателен для образования NO в молниях. В экспериментах с электрическими разрядами в смеси углекислого газа и азота, имитировавшей архейскую атмосферу, оказалось, что в ней оксид азота образуется с той же эффективностью, если доля углекислого газа в смеси выше 80 % (Navarro-González et al., 2001). Это подтверждается и анализами атмосферы Венеры, где тоже много углекислого газа, есть азот и гремят грозы, – в ней обнаружено около 0,0001 % NO.

В отсутствие кислорода NO растворялся в воде, давая азотистую кислоту (HNO2). Количество оксида азота, образующегося при разряде молний, и тогда, и сейчас не очень велико – около 1 млн т ежегодно на всю Землю. Если этот оксид азота равномерно распределялся по планете, то соответствующая концентрация азотистой кислоты в водоемах получается слишком малой, чтобы ее можно было использовать для дыхания. Однако она может быть значима как азотное удобрение, а возможно, и как яд: ферменты метаногенов к ней очень чувствительны, она губительна для них.

Если разнообразие и доступность окислителей на древней Земле были ниже, чем сейчас, то с восстановителями дело обстояло гораздо лучше. Как мы помним из главы 6, взаимодействие воды с горячими базальтами (серпентинизация) приводит к выделению водорода, метана и муравьиной кислоты, которые по трещинам выходят из горных пород на поверхность. В испарениях геотермальных полей даже в нашу кислородную эпоху присутствуют угарный газ и восстановленные формы фосфора – фосфиты и гипофосфиты. В древности их должно было быть значительно больше. Эти же испарения и геотермальные воды несли сероводород, а в морской воде было растворено много двухвалентного железа. Все эти восстановители можно было использовать – имелся бы только подходящий окислитель. В условиях дефицита окислителей особую ценность приобретают сильные восстановители, позволяющие получать энергию за счет выделения водорода: муравьиная кислота, угарный газ и фосфит.

 

Энергетика LUCA, первых бактерий и архей

Вооружившись информацией о доступности разных окислителей и восстановителей на древней Земле и об эволюции компонентов биоэнергетических систем, мы можем попробовать оценить, какие источники энергии могли использоваться LUCA и его ближайшими потомками – первыми бактериями и археями.

Как мы помним, в геотермальных водоемах, где шла эволюция от первых биологических молекулярных систем до LUCA, были уникальные источники химической энергии, ныне в основном исчезнувшие. Например, с конденсацией геотермального пара туда поступали оксиды фосфора, которые, растворяясь в воде, давали пирофосфат – источник энергии, аналогичный АТФ. Отложения сульфида цинка в этих водоемах на свету производили органические кислоты из CO2 и фосфорилировали разные органические вещества за счет окисления фосфита. Флавиновые коферменты могли обеспечивать примитивный фотосинтез, производя АТФ за счет энергии света, еще до появления мембран. Все это было доступно и общему предку бактерий и архей, уже имевшему мембраны и более 1000 генов.

Разделение линий бактерий и архей произошло при освоении новых местообитаний. Судя по образу жизни современных бактерий и архей, предки бактерий расселялись по поверхности суши и океана, используя фотосинтез, а предки архей ушли в трещины и пустоты земной коры, используя химические источники энергии. Скорее всего, мембрана LUCA еще не могла держать электрический потенциал, характерный для современных мембран, и мембранной энергетики в современном смысле у него не было. Однако у LUCA существовали предшественники многих ее компонентов: система секреции белков (предок роторной АТФазы), гемы (как минимум сирогем) и, вероятно, менахинон и трансмембранный цитохром b для проведения электронов через мембрану. Также у него было некоторое разнообразие окислительно-восстановительных ферментов, включая молибденовую формат-дегидрогеназу и никелевую CO-дегидрогеназу, сирогем-содержащие ферменты окисления серы и несколько гидрогеназ, в том числе мембранная гидрогеназа четвертого типа.

На основе этого набора деталей для предка архей, уходящего в подземные местообитания, можно предположить обмен веществ, основанный на окислении муравьиной кислоты, угарного газа и, возможно, фосфитов:

HCOOH → CO 2 + H 2 CO + H 2 O → CO 2 + H 2

В качестве продуктов обмена выделялись углекислый газ и водород, мембранный потенциал создавали гидрогеназы четвертого типа, родственные комплексу I. Высокая концентрация водорода в среде угнетает такой метаболизм, и, чтобы решить эту проблему, предки архей могли начать утилизировать выделяющийся водород, превращая его в метан:

4HCOOH → 3CO 2 + CH 4 + 2H 2 O

4CO + 2H 2 O → 3CO 2 + CH 4

Такой примитивный метаногенез (форматотрофный и карбоксидотрофный) позволил им получать энергию и при избытке водорода вокруг. В условиях перебоев в поступлении угарного газа и муравьиной кислоты отбор поддерживал изменения обмена веществ, позволяющие использовать более доступный водород. В классическом (гидрогенотрофном) метаногенезе:

CO 2 + 4H 2 → CH 4 + 2H 2 O

труднее всего происходит первая стадия: восстановление CO2 до HCOOH. Для этой реакции клетка вынуждена тратить энергию, чтобы потом получить обратно на следующих стадиях. Поэтому на переходном этапе эволюции метаногенеза археи могли одновременно использовать муравьиную кислоту и водород:

HCOOH + 3H 2 → CH 4 + 2 H 2 O,

чтобы получать в два-три раза больше энергии из имеющегося количества HCOOH. Отбор поддерживал все более полное использование химической энергии, и в результате метаногенные археи научились обходиться вообще только водородом и CO2. Для этого им пришлось создать массу уникальных приспособлений: коферменты В и M, метанофуран, метаноптерин (замена фолиевой кислоты в пути восстановления С1-групп) и новые переносчики электронов – деазафлавин F420 и никель-порфирин F430.

У бактерий возможностей было больше. Их предки оставались на поверхности и могли использовать солнечный свет. С появлением мембранного потенциала и роторной АТФазы к древнему флавиновому фотосинтезу добавились новые механизмы с использованием родопсина, а потом и хлорофилла. Хотя современный хлорофилльный фотосинтез работает только с протонным градиентом, теоретически возможно включить хлорофилл и в натриевый биоэнергетический цикл. Для этого фотосистему I надо скомбинировать с вариантом комплекса I, окисляющим ферредоксин (среди бактерий такие варианты известны). В качестве доноров электронов использовались водород, сероводород и сера.

Кроме фотосинтеза бактерии освоили получение химической энергии путем диспропорционирования серы, серного дыхания и сульфатного дыхания. До того возможности получения энергии из готовой органики были ограничены брожением, а с появлением серного и сульфатного дыхания замкнулся биологический круговорот углерода, состоящий из фотосинтеза и дыхания. В современную эпоху органическое вещество создается в основном в процессах кислородного фотосинтеза растений:

6CO 2 + 6H 2 O → C 6 H 12 O 6 (глюкоза) + 6O 2

и разрушается в кислородном дыхании животных, бактерий и грибов:

C 6 H 12 O 6 + 6O 2 → 6CO 2 + 6H 2 O.

Подобный цикл можно замкнуть и с другими окислителями, например, соединениями серы:

6CO 2 + 3H 2 S + 6H 2 O → C 6 H 12 O 6 + 3H 2 SO 4 (серный фотосинтез)

C 6 H 12 O 6 + 3H 2 SO 4 → 6CO 2 + 3H 2 S + 6H 2 O (сульфатное дыхание)

Затем фотосинтезирующие бактерии освоили окисление железа и смогли заселить открытый океан, где железо было основным донором электронов. Так уже в раннем архее (около 3,5 млрд лет назад) сложилась всепланетная прокариотная биосфера, которая просуществовала без больших изменений больше 1 млрд лет, до появления кислородного фотосинтеза.

 

Клетки с ядром – новый уровень сложности жизни

Бактерии и археи населяют всю поверхность планеты, толщу и дно океанов и несколько километров земной коры. Однако рекорды размеров и сложности принадлежат другому домену живых организмов – эукариотам. К ним относятся животные и растения, водоросли, грибы и разнообразные одноклеточные организмы – инфузории, амебы, жгутиконосцы и другие. Клетки эукариот отличаются от клеток бактерий и архей во многих отношениях. Если разнообразие бактерий и архей – это прежде всего разнообразие биохимии, то разнообразие эукариот – это во многом разнообразие форм клеток. Все эукариоты имеют практически одинаковый базовый обмен веществ, а если им надо выйти за его пределы, то они обычно «берут на работу» симбионтов-бактерий, вместо того чтобы самим осваивать новые биохимические реакции. Если клетки бактерий и архей, как правило, простые шарики, палочки, нити или спиральки, то многие эукариоты имеют клетки очень сложной формы (рис. 18.1).

Клетки эукариот крупнее примерно в десять раз и содержат ядро, отделяющее геном от остальной клетки. В клетках эукариот находятся сложные системы мембранных цистерн и пузырьков – эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, лизосомы и другие пузырьки (они называются вакуоли) (рис. 18.2). Пузырьки управляемо отшнуровываются от мембран в одних местах и сливаются с ними в других.

Форму эукариотической клетки поддерживает клеточный скелет (цитоскелет). Он состоит из тонких нитей белка актина (микрофиламенты) и более толстых трубочек из белка тубулина (микротрубочки). Микротрубочки в основном расходятся из центра клетки ко всей периферии. Микрофиламенты проходят параллельно клеточной мембране, образуя под ней трехмерную сеть. С цитоскелетом связаны моторные белки – миозин, динеин и кинезин. Они перемещают органеллы внутри клетки и обеспечивают движение и изменения формы всей клетки. Если повредить мембрану бактериальной клетки, то все ее содержимое начнет вытекать наружу. В случае повреждения эукариотической клетки вытекают только вода и малые молекулы, а крупные белки и РНК остаются внутри, потому что они прикреплены к цитоскелету. Благодаря ему клетки эукариот могут принимать разнообразные сложные формы.

Отшнуровка и слияние мембран регулируется множеством специальных белков. Благодаря такому управлению мембранами клетки большинства эукариот способны к фагоцитозу – поглощению твердых частиц из внешней среды внутрь клетки. При этом поглощенная частица оказывается окружена мембраной, и с ней можно дальше что-нибудь сделать, например, добавить пищеварительные ферменты и съесть. Многие одноклеточные эукариоты используют фагоцитоз для питания бактериями и друг другом. В организме животных и человека тот же механизм применяется клетками иммунной системы для уничтожения бактерий. Фагоцитоз – отличительная черта эукариот. Бактерии и археи к нему не способны и поглощают из внешней среды только растворенные вещества.

Рибосомы эукариотической клетки крупнее, чем бактериальные, содержат больше белков и используют другой механизм для узнавания матричных РНК. Рибосомы бактерий и архей могут присоединиться к мРНК в любом месте, продвинуться по ней в сторону 3' конца до ближайшего старт-кодона AUG и начать с него синтез белка. Рибосомы эукариот узнают специальную метку на 5' конце мРНК, она называется «кэп», т. е. шапочка, и представляет собой гуаниновый нуклеотид, пришитый особым образом – через 5' – 5' трифосфатный мостик. Матричная РНК без кэпа, как правило, не узнается эукариотическими рибосомами.

На 3' конце матричные РНК эукариот имеют другую модификацию – хвост из 200–500 адениновых нуклеотидов. Каждая мРНК эукариот кодирует только один белок, тогда как у бактерий обычно несколько белков, гены которых составляют один оперон.

Дыхательные цепи и мембранные АТФазы бактерий и архей находятся на внешней мембране клетки, а у эукариот убраны в специальные органеллы – митохондрии и пластиды. Геном бактерий и архей, как правило, имеет вид одной кольцевой молекулы ДНК, а геном эукариот состоит из нескольких линейных молекул ДНК – хромосом. Геномные молекулы ДНК эукариот намотаны для компактности на специальные белковые «катушки» – гистоны. Размер генома может достигать десятков миллиардов пар нуклеотидов, что на четыре порядка больше, чем у бактерий. Геном эукариот часто переполнен некодирующими последовательностями разных типов. При делении эукариотической клетки цитоскелет разделяет скопированные хромосомы по дочерним клеткам в сложном движении, напоминающем эпизод классического балета. Наконец, в жизненном цикле многих эукариот есть половой процесс, при котором в одной клетке собираются гены двух родителей, и мейоз – специальное деление, в котором хромосомы, происходящие от разных родителей, обмениваются отдельными участками, после чего диплоидная клетка делится на четыре гаплоидных (с одиночным хромосомным набором). Таким образом, эукариотическая клетка гораздо сложнее организована, чем бактериальная, и ее появление было таким же крупным эволюционным событием, как переход от РНК-мира к первым клеткам.

Геном эукариотической клетки разделен на несколько физических «томов» – хромосом. Когда клетка делится, каждой из двух дочерних клеток должно достаться по своей копии каждой хромосомы. Механизм, который это обеспечивает, называется «митоз».

В процессе подготовки к делению клетка должна вырасти до достаточного размера и скопировать все хромосомы. Когда это выполнено, начинается деление. На первой стадии митоза (профаза) в ядре прекращается синтез мРНК. Хромосомы, которые до этого находились в относительно рыхлом состоянии, становятся компактными и плотно упакованными. Только в таком состоянии их видно в световой микроскоп. Ядерная оболочка разрушается, и хромосомы оказываются в цитоплазме клетки. Микротрубочки цитоскелета клетки перестраиваются. Если между делениями они расходились звездой от центриоли – специальной структуры, организующей систему микротрубочек по всей клетке, то в профазе центриоль удваивается, две дочерние центриоли расходятся по разным сторонам клетки, и микротрубочки образуют вокруг них две звезды.

На следующей стадии, метафазе, микротрубочки двух звезд встречаются посередине. Свежескопированные хромосомы парами прикрепляются к микротрубочкам: одна хромосома каждой пары к микротрубочкам одной звезды, вторая – к другой. Эта структура из миктротрубочек и хромосом называется «митотическое веретено». В его полюсах находятся центриоли, а по экватору расположены пары хромосом.

Когда все пары хромосом правильно прикрепились к веретену, митоз переходит в следующую стадию, анафазу. До этого во время метафазы микротрубочки при помощи моторных белков тянули хромосомы к противоположным полюсам, но попарное соединение копий хромосом не позволяло им разойтись. В анафазе белки, образующие попарное соединение хромосом, разрезаются специальным ферментом. Натяжение микротрубочек растаскивает хромосомы к двум полюсам веретена.

После анафазы наступает телофаза. Веретено становится больше не нужно и разбирается, а вокруг каждой из двух групп хромосом появляется новая ядерная оболочка – образуется два ядра, пока еще в одной клетке. Наконец, после деления ядер наступает время деления всей клетки – цитокинез. В нем главную роль играет вторая половина цитоскелета – микрофиламенты. Они формируют кольцо под наружной мембраной по экватору клетки. Микрофиламенты кольца образуют много связей с мембраной, поэтому, когда кольцо сокращается, оно перетягивает всю клетку пополам и в конечном итоге разделяет ее на две.

Митоз – это самое обычное стандартное клеточное деление эукариот. В ходе митоза хромосомный набор сначала удваивается, а потом делится ровно пополам. Кроме него бывает еще специальное деление – мейоз. В мейозе происходит одно удвоение хромосом и два деления хромосомного набора и клетки. Поэтому в итоге мейоза получаются клетки с уменьшенным вдвое количеством хромосом. Мейоз есть у организмов с половым размножением. При половом размножении происходит слияние половых клеток, и образуется клетка с двойным набором хромосом – зигота. Чтобы число хромосом не удваивалось в каждом поколении, нужен мейоз, который будет уменьшать число хромосом. У животных и человека мейоз происходит при созревании половых клеток. Все клетки человека, кроме сперматозоидов и яйцеклеток, имеют двойной (2n) набор хромосом (иногда больше), только половые клетки (сперматозоиды и яйцеклетки) – одинарный (n). Другое отличие мейоза от митоза состоит в том, что первая профаза мейоза протекает очень долго. В первой профазе родственные хромосомы, унаследованные от разных родителей, обмениваются участками друг с другом. Этот процесс называется «кроссинговер» и служит для повышения генетического разнообразия потомства.

 

Химерное происхождение эукариот

Первым шагом в понимании происхождения эукариотической клетки стало обнаружение сходства между митохондриями и свободноживущими аэробными бактериями, а также между пластидами и цианобактериями. Первые работы в этом направлении появились еще в конце XIX века, а в современном виде теорию симбиогенеза сформулировала Линн Маргулис в 1970-х годах. К тому времени уже было обнаружено, что пластиды и митохондрии имеют собственную миниатюрную генетическую систему, включающую кольцевую молекулу ДНК, особые рибосомы – мельче, чем в цитоплазме эукариот, и похожие на бактериальные, – и никогда не образуются с нуля, а только в процессе роста и деления существующих. Все это указывает на происхождение пластид и митохондрий от бактериальных симбионтов, когда-то поселившихся в цитоплазме эукариотической клетки. Подобный симбиоз часто происходит и в наше время, например, у глубоководных червей-погонофор внутри клеток преобразованного кишечника живут хемосинтезирующие бактерии. Благодаря этим бактериям погонофоры могут питаться сероводородом. Для приобретения таких симбионтов они должны быть проглочены клеткой хозяина путем фагоцитоза, следовательно, фагоцитоз – это древняя особенность эукариот, возникшая до приобретения митохондрий.

Тогда же, в 1970-е, были попытки расширить теорию симбиогенеза и на другие системы эукариотической клетки. Несколько раз сообщалось об обнаружении собственной ДНК в центриолях – центрах организации тубулинового цитоскелета, в гидрогеносомах и пероксисомах – специальных вакуолях, осуществляющих реакции с выделением водорода и утилизацию перекиси водорода. С применением более совершенных методов эти открытия пришлось «закрыть», но оказалось, что пероксисомы и гидрогеносомы почему-то получают новые липиды для мембран по одной молекуле через специальную систему транспортных белков, ту же, что доставляет липиды в митохондрии, тогда как обычные вакуоли получают новые липиды в виде целых мембранных пузырьков. Эта особенность пероксисом может означать, что они произошли от митохондрий путем крайнего упрощения и полной потери генома.

Гораздо сложнее было установить природу ядерно-цитоплазматического компонента (ЯЦК) эукариотической клетки. Сегодня, когда прочитаны последовательности геномов более чем тысячи видов бактерий и архей, появилась возможность методами сравнительной геномики искать прокариотных родственников каждого из тысяч эукариотических белков (см., напр.: Марков А., Куликов А. Происхождение эвкариот: выводы из анализа белковых гомологий в трех надцарствах живой природы: ).

Краткие результаты такого поиска представлены на рис. 18.4.

Хорошо видно, что базовые генетические процессы эукариотических клеток – репликация (копирование ДНК), транскрипция (создание РНК на матрице ДНК), трансляция (синтез белков), репарация (ремонт повреждений ДНК) – обслуживаются белками практически только архейного происхождения. Гены этих групп реже всего подвергаются горизонтальному переносу и, скорее всего, были унаследованы эукариотами напрямую. ДНК– и РНК-полимеразы бактериального происхождения в клетках эукариот работают в митохондриях и пластидах и явно перенесены из их геномов. Это значит, что предок ядра и цитоплазмы, скорее всего, был близок к археям.

Происхождение митохондрий благодаря сравнению геномов удалось значительно уточнить. Их бактериальные предки относились к группе альфа-протеобактерий, причем в современном мире к ним ближе всего находятся пурпурные бактерии Rhodospirillum. Эти бактерии способны как к фотосинтезу, основанному на окислении соединений серы для восстановления CO2, так и к аэробному дыханию на готовой органике, переключаясь между этими режимами обмена веществ в зависимости от наличия кислорода и света. Большая часть их дыхательной цепи работает как при фотосинтезе, так и при аэробном дыхании.

Ранее считалось, что некоторые безмитохондриальные эукариоты (лямблии, микроспоридии) отделились от остальных в глубокой древности и никогда не имели митохондрий. Сегодня выясняется, что в их ядерном геноме есть гены альфа-протеобактериального происхождения, похожие на аналоги у других эукариот. Гены альфа-протеобактерий попали в геном эукариот в большом количестве при обзаведении митохондриями. Это значит, что у всех безмитохондриальных эукариот, для которых прочитаны последовательности генома, митохондрии когда-то были, а затем утратились, что свидетельствует о потере когда-то имевшихся митохондрий.

Кроме кислородного дыхания у митохондрий есть другие функции. Одна из них – сборка железосерных кластеров ферментов, в том числе работающих в цитоплазме (Tielens, Rotte, Hellemond, Martin, 2002). Для этого требуется транспорт свернутых белковых молекул, содержащих железосерные кластеры, через митохондриальную мембрану. Это достаточно сложное и затратное приспособление, которое могло возникнуть, только если хозяин митохондрий сам не умел строить железосерные кластеры.

 

Другие возможные источники генов эукариот

Мы определили два основных источника генов эукариот: это альфа-протеобактерия, давшая начало митохондриям, и архея, ставшая ее хозяином в симбиозе. Однако этих источников недостаточно: в геномах эукариот есть много генов, которые похожи на гены разных бактерий, но отсутствуют у альфа-протеобактерий.

Кроме митохондрий у эукариот есть другая органелла, происходящая от симбионта, – хлоропласт водорослей и растений. Хлоропласты происходят от цианобактерий и, по некоторым гипотезам, могли быть у общего предка всех эукариот и утратились во всех ветвях, кроме водорослей и происходящих от них растений. Может быть, они внесли свой вклад в геном всех эукариот?

Сравнение геномов показывает, что это не так. У эукариот насчитывается более 200 генных семейств бактериального происхождения, которых нет ни у альфа-протеобактерий, ни у цианобактерий, и, следовательно, приобретенных другими путями. Функции этих генных семейств чаще всего связаны с регуляцией и передачей сигналов, тогда как гены альфа-протеобактериального происхождения связаны прежде всего с обменом веществ (рис. 18.5). Вклад цианобактерий заметен только в ядерных геномах водорослей и растений. Некоторые из белков эукариот, хотя имеют альфа-протеобактериальных родственников, но ближе к белкам других групп бактерий. Например, все ферменты гликолиза эукариот наиболее сходны с белками бактерий-бродильщиков рода Clostridium.

Несколько белковых семейств эукариот, связанных со слиянием и отшнуровкой мембранных пузырьков, имеют архейное происхождение – например, Adaptin N, Syntaxin, AdAR repeat. К сожалению, их функции в клетках архей неизвестны.

Помимо самих митохондрий, организующих кислородное дыхание, для приспособления к кислородной среде нужны белки, защищающие цитоплазму от повреждений, такие как оксигеназы, пероксидазы, каталаза. Эти белки эукариот получены от бактерий, причем не родственных митохондриям. Чего и следовало ожидать – ведь, чтобы получать выгоду от аэробного дыхания, надо сначала научиться защищаться от токсического действия кислорода, которое проявляется уже при очень малых его концентрациях.

Мембраны эукариот, подобно бактериальным, состоят из сложных эфиров жирных кислот. Ферменты биосинтеза липидов, соответственно, могли быть получены только от бактерий. По своим аминокислотным последовательностям они ближе всего к ферментам альфа-протеобактерий, а значит, получены от предков митохондрий. Другая важная группа липидов, инозитол-фосфаты, унаследована эукариотами от архей. Инозитол-фосфатные липиды составляют небольшую долю мембран эукариот, но важны как метки мембран разного назначения, регуляторы состояния мембранных белков, слияния и разделения мембранных пузырьков и даже регуляторы работы генов (на стадии созревания матричных РНК и экспорта их из ядра). Важно, что древние и универсальные мембранные белки, такие как роторная АТФаза или сигнал-распознающая частица, встраивающая новые белки в мембрану, у эукариот похожи на архейные, но работают в мембране, состоящей в основном из липидов бактериального типа. Значит, в эволюции эукариот был этап замены мембранных липидов с архейных на бактериальные. Японские биохимики воспроизвели промежуточную стадию этого процесса, создав трансгенную кишечную палочку с генами синтеза архейных липидов (Shimada, Yamagishi, 2011). Оказалось, что смесь липидов разного происхождения практически не влияет на жизнеспособность клеток при любых соотношениях бактериальных и архейных липидов.

Отличительной чертой мембран эукариотических клеток являются вспомогательные липиды – стеролы, такие как холестерол. Стеролы повышают текучесть мембран и поэтому важны для фагоцитоза и транспорта мембранных пузырьков. Выходит, что стеролы, вероятно, появились раньше, чем митохондрии. Предшественником всех стеролов является терпеновый углеводород сквален, который мы уже упоминали в главе 15 как добавку к липидам у бактерий, живущих в щелочных средах. В качестве промежуточного продукта обмена веществ сквален распространен гораздо шире, он синтезируется у многих бактерий и архей. Однако дальнейшие стадии синтеза стеролов характерны только для эукариот.

На первом шаге сквален-монооксигеназа катализирует присоединение кислорода к концевой двойной связи сквалена, образуя сквален-2,3-эпоксид. Для этой реакции требуется молекулярный кислород, хотя и в очень малой концентрации. Затем ланостерол-синтаза катализирует восстановление эпоксида, при этом неустойчивый продукт восстановления – радикал сквалена – перестраивает двойные связи в замкнутые кольца, образуя ланостерол (рис. 18.6). Ланостерол дает начало всем другим стероидам путем модификации боковых групп.

Из-за крайней важности стеролов для эукариотической клетки происхождение ферментов их биосинтеза внимательно исследовалось. Сходные ферменты, синтезирующие те же стеролы, были обнаружены у некоторых гамма-протеобактерий, например Methylococcus capsulatus (Lamb et al., 2007), у Gemmata obscuriglobus из планктомицетов (Pearson et al., 2003) и у ряда микобактерий, например Plesiocystis pacifica и Stigmatella aurantiaca. Однако подробное исследование показало, что все эти ферменты бактерий получены горизонтальным переносом от эукариот уже после расхождения линий растений и животных (Desmond, Gribaldo, 2009). Первый шаг биосинтеза стеролов – присоединение кислорода к сквалену – мог быть поначалу одним из способов защиты от молекулярного кислорода, и лишь потом нашлось применение полученному сквален-2,3-эпоксиду.

Большая часть эукариотических генов бактериального происхождения, не принадлежавших предкам митохондрий и пластид, кодирует защитные, рецепторные, транспортные, сигнальные и регуляторные белки. Сюда относятся, например, белки теплового шока Hsp90, белки устойчивости к тяжелым металлам TerC и Ttg2 и др. Что интересно, белки, которые у эукариот обеспечивают взаимодействие между компонентами клетки, у бактерий нужны для связей между разными клеткам в сообществе. Например, Tim44 эукариот необходим для транспорта белков через внутреннюю мембрану митохондрий из цитоплазмы, а его бактериальные родственники экспортируют белки из клеток во внешнюю среду. Это свидетельствует о том, что при возникновении эукариотической клетки под одной мембраной оказались уже отработанные системы связи клеток в сообществе.

В целом можно сказать, что те белки эукариот, которые получены от других бактерий (не предков митохондрий и пластид), не имеют какого-то одного источника. Скорее, они были получены от множества разных бактерий путем горизонтального переноса генов. Гипотезы, в которых до симбиоза с протеобактериями было слияние клеток какой-то другой бактерии с археей, не поддерживаются этими геномными данными.

 

Архейный предок эукариот

Хотя участие какой-то археи в происхождении эукариот давно стало очевидно, выделить конкретную группу архей, к которой мог относиться предок эукариот, оказалось не так просто. Многие компоненты эукариотной клетки были найдены у отдельных видов архей, но это были разные виды, относящиеся к разным крупным группам архей. Так обстоит дело, например, с цитоскелетными белками тубулинами. Давно известны белки FtsZ, отдаленно похожие по последовательности на тубулин и широко распространенные у бактерий и архей. Они собираются в пластины и трубки и необходимы для деления прокариотических клеток. В 2012 году были найдены артубулины – близкие родственники тубулина – у двух видов архей рода Nitrosoarchaeum, принадлежащих к группе Thaumarchaeota. Их функция пока неизвестна (Yutin, Koonin, 2012).

Аналогично у бактерий и архей широко распространены белки, отдаленно сходные с актином; их называют MreB. Они собираются в тонкие нити и участвуют в перетяжке делящейся бактериальной клетки. Другие дальние белковые родственники актина кодируются плазмидами (маленькими независимыми молекулами ДНК у бактерий) и служат для их расхождения при делении клетки. В 2009 году у нескольких видов группы Crenarchaeota были обнаружены кренактины, весьма похожие на актин эукариот (Ettema et al., 2011). Кренактины образуют нити, которые придают клеткам палочковидную форму, часто с разветвлениями. По своей последовательности кренактины близки не только к актинам, но и к белкам Arp2/Arp3 (Actin-related proteins), которые у эукариот образуют разветвления актиновых нитей. В некоторых случаях совместная полимеризация актина и Arp2/Arp3 на внутренней стороне клеточной мембраны достаточна для отшнуровки фагоцитозного пузырька (Yutin et al., 2009).

Наряду с артубулинами у Thaumarchaeota обнаружились гены еще одной эукариотической системы – ESCRT-III (endosomal sorting complex required for transport). Эта группа белков связана с мембранами комплекса Гольджи, эндоплазматического ретикулума и вакуолей; она участвует в сортировке содержимого мембранных пузырьков. В клетках Thaumarchaeota белки этого комплекса необходимы для деления клеток, работая вместо отсутствующего у них FtsZ (Makarova et al., 2010).

В геноме Caldiarchaeum subterranum, прочитанном в 2010 году, были обнаружены гены важной для эукариот системы убиквитиновой модификации белков. Эта система пришивает убиквитин – маленький белок – к различным клеточным белкам. Убиквитин служит обычно меткой для уничтожения белков. Кроме собственно убиквитина (Ub) в нее в минимальном варианте входит три фермента – Е1, Е2 и Е3, катализирующие разные стадии присоединения Ub. У бактерий известны отдаленные родственники Е1 и Е2, но их функции не связаны с убиквитином, они катализируют включение серы при синтезе витамина В1 и молибденовых кластеров ферментов.

Меченые убиквитином белки обычно разрушаются в протеасомах – специальных белковых комплексах для выборочного уничтожения дефектных и ненужных белков. Функциональное ядро протеасомы состоит из 28 белковых молекул, собранных в четыре кольца из семи субъединиц; кроме того, в ее работе принимают участие дополнительные регуляторные субъединицы. Протеасомы были известны ранее у некоторых бактерий (Mycobacterium tuberculosum) и архей (Haloferax volcanii), но убиквитиновой системы у этих видов нет. Протеасомы есть и у Caldiarchaeum subterranum, они похожи на эукариотические также по наличию белка RPN11, который опознает убиквитиновые метки на белках (Nunoura et al., 2011).

Почти все, что мы знаем об устройстве и образе жизни бактерий и архей, ученые узнали, выращивая и изучая микробов в лаборатории. Те микробы, для которых не удалось подобрать условия выращивания, долго оставались неизвестными. В XXI веке появились методы метагеномики – анализа всей ДНК, содержащейся в природной пробе (вода, почва, ил). Метагеномика позволяет оценить разнообразие микробов в пробе без культивирования. Используя метагеномный способ, ученые быстро выяснили, что микробное разнообразие в природе огромно. Более 99 % видов микробов, которые есть в природе, никогда не вырастали в лаборатории, и до появления метагеномики об их существовании можно было только догадываться. Хуже того, половина крупных групп бактерий и архей не имеет ни одного культивируемого представителя и известна только по метагеномным данным. Ученые подозревали, что среди них скрываются и близкие родственники эукариот.

И вот в 2015 году такие археи, близкие к эукариотам, были найдены (Spang et al., 2015). Норвежская экспедиция, изучавшая геотермальное поле Замок Локи (Loki's castle) в Северной Атлантике, собрала пробы донных осадков, обильно заселенных бактериями и археями. Анализ ДНК в этих пробах показал, что в сообществе преобладает один вид архей, относящийся к некультивируемой группе архей DSAG (deep-sea Archaea group). На его долю приходилось более 10 % клеток, а значит, появилась возможность прочитать не только гены рибосомных РНК, по которым устанавливают родственные связи микробов, но и собрать весь его геном. Этот вид, который получил временное название Lokiarchaeum, оказался ближе к эукариотам, чем все известные ранее археи. Его геном имеет размер более 5 млн пар нуклеотидов и кодирует 5381 белок, поэтому является одним из самых сложных геномов архей. Среди этих белков есть пять актиноподобных белков, более похожих на актины и ARP эукариот, чем кренактины (рис. 18.7). Также Lokiarchaeum обладает большим набором сигнальных белков суперсемейства Ras – 92 разновидностями! Эти белки в клетках эукариот регулируют перестройки цитоскелета, транспорт пузырьков, передачу сигналов между мембраной, цитоплазмой и ядром, деление клеток и многие другие функции. Белки Ras человека очень хорошо изучены, потому что мутации в них часто приводят к неограниченному делению клеток и раку. Хотя отдельные Ras-подобные белки встречаются в разных группах бактерий и архей, только Lokiarchaeum имеет их большой набор. При этом часть его Ras-белков попадает в отдельные эукариотные подсемейства этого суперсемейства. Еще у Lokiarchaeum есть большой набор генов системы ESCRT-III; в отличие от Thaumarchaeota у него уже произошло выделение нескольких эукариотных подсемейств этих генов. Также у него появляются гены комплексов ESCRT-I и ESCRT-II, которые у эукариот взаимодействуют с ESCRT-III, собирая вместе и загружая в мембранные пузырьки меченные убиквитином белки, подлежащие разборке на аминокислоты.

По набору генов, связанных с цитоскелетом и управлением мембранами, похоже, что Lokiarchaeum и его общий с эукариотами предок могут иметь способность к фагоцитозу. К сожалению, Lokiarchaeum не растет в лаборатории, поэтому пока нет возможности проверить, есть ли у него фагоцитоз на самом деле. Зато в тех же пробах из Замка Локи есть в меньшем количестве ДНК других локиархеот, и одна из них, Loki3, еще ближе к эукариотам. Через пару лет и ее геном, скорее всего, будет прочитан.

 

Причины и механизмы появления эукариот

Мы видим, что эукариотическая клетка сочетает в себе черты архей и различных неродственных групп бактерий. От архей унаследованы центральные информационные системы клетки (синтез белков, копирование и ремонт ДНК), зачатки цитоскелета, зачатки систем управления мембранами и убиквитиновая система мечения белков. От бактерий произошли ферменты обмена сахаров, липидов и отчасти – стеролов, системы защиты от кислорода и всевозможные сигнальные и регуляторные белки. Очевидно, что приобретение митохондрий было далеко не первым шагом на пути происхождения эукариот: чтобы такой симбиоз стал технически возможен, скорее всего, был необходим уже работающий фагоцитоз. А чтобы он был полезен, надо сначала иметь ферменты гликолиза, защиту от кислорода, системы транспорта веществ и передачи сигналов между симбионтом и хозяином.

Как мог происходить процесс появления эукариот? Во-первых, симбиоз, многочисленные переносы генов от разных бактерий и большая роль сигнально-регуляторных генов означают, что процесс происходил в сложном микробном сообществе. Во-вторых, митохондрии и стерол, исходно присущие всем эукариотам, свидетельствуют о том, что эукариоты эволюционировали в кислородной среде. Кислород указывает нам, что сообщество, в котором появились эукариоты, скорее всего, было цианобактериальным матом, о котором уже рассказывалось в главе 16. В-третьих, архейное происхождение базовых генетических систем (синтез белков, копирование и ремонт ДНК) эукариот свидетельствует о том, что у истоков процесса стояли археи.

Проще всего предположить, что процесс возникновения эукариотной клетки стал ответом на появление кислородного фотосинтеза и отравление среды кислородом. В обмене веществ многих архей, метаногенов и метилотрофов важную роль играют ферменты, содержащие никель. Они очень уязвимы для кислорода, а значит, архейный предок в условиях кислородного кризиса не мог больше жить по-старому и был вынужден радикально изменить обмен веществ.

В современных бактериальных сообществах есть примеры тесного взаимодействия и соседства архей с бактериями. Например, метаногенные археи, поглощающие водород, живут в симбиозе с уксуснокислыми бродильщиками, выделяющими водород. В районах просачивания метана из морского дна живут в тесном симбиозе окисляющие метан археи и восстанавливающие сульфат бактерии, и между ними происходит обмен электронами при помощи соединений железа (Sivan et al., 2014). Так что архейный предок эукариот тоже мог жить в тесном симбиозе с какими-то бактериями. По самой популярной версии, он был метаногеном и получал водород от симбионтов – уксуснокислых бродильщиков.

Появление кислородного фотосинтеза вызвало крупный экологический кризис. Многие обитатели цианобактериального мата вымерли, другим же удалось создать свои или приобрести горизонтальным переносом чужие системы защиты от кислорода. Этот процесс произошел не мгновенно, а распространялся с поверхности в глубокие слои мата. К моменту появления серьезных проблем у метаногенов их соседи сверху уже имели системы адаптации к кислороду. Многие микробы в состоянии стресса начинают активно поглощать ДНК из внешней среды – таким способом наша архея приобрела гены, необходимые для защиты от кислорода, и новый обмен веществ, скорее всего, молочнокислое брожение. Сквален-монооксигеназа, необходимая для синтеза стеролов, могла исходно служить для защиты от кислорода. Механизм проводимой ею реакции очень похож на поставленное под контроль перекисное окисление липидов, одну из форм кислородного повреждения клеток. Отсутствие клеточной стенки, актиновый цитоскелет для поддержания вытянутой и ветвистой формы клетки и стеролы позволили ей перейти к фагоцитозу и успешно конкурировать с соседями-бактериями. Мембрана высокой текучести, подходящая для фагоцитоза, плохо держит мембранный электрический потенциал. Но предок эукариот в это время получал энергию путем брожения и мало зависел от мембранных энергетических процессов.

Тем временем в верхних слоях мата пурпурные фотосинтезирующие бактерии отработали аэробное дыхание, после чего органические кислоты, выделяемые бродильщиками нижних слоев, превратились для них в ценный ресурс. Эти аэробы стали оптимальными партнерами для симбиоза с фагоцитирующими бродильщиками. Фагоцитирующий предок эукариот сначала поглощал их как добычу, затем стал откладывать их переваривание и сначала подращивать на своих продуктах брожения, а потом симбионты стали отдавать хозяину АТФ и были оставлены в живых окончательно. Эти события в чем-то похожи на переход древних людей от охоты к скотоводству.

Одним из следствий приобретения митохондрий стало размножение интронов. Эти некодирующие вставки в различных генах очень обильны у эукариот, а у бактерий и архей бывают только в генах рибосомных и транспортных РНК. Чтобы не нарушать функцию РНК или белка, интрон должен быть вырезан из РНК. У бактерий и архей синтез белков, закодированных в матричной РНК, начинается еще до того, как эта мРНК будет полностью построена на матрице ДНК. При попадании интронов в белок-кодирующие гены бактерий вырезание интрона из мРНК будет осложнено – «голова» интрона окажется в рибосоме еще до того, как «хвост» будет достроен, интрон не сможет вырезаться из мРНК, и синтезированный с нее белок станет дефектным.

Интроны и сплайсинг

В генах бактерий и архей последовательность, кодирующая белок, расположена в ДНК так же, как и в матричной РНК, – одним непрерывным куском. У эукариот белок-кодирующие последовательности прерываются некодирующими вставками – интронами. Фрагменты кодирующей последовательности, разделенные интронами, называются «экзоны». Из-за наличия интронов мРНК эукариот подвергаются сложному процессу созревания. Незрелая матричная РНК содержит копии всех экзонов и интронов гена. Для получения зрелой мРНК интроны должны быть удалены, а оставшиеся экзоны соединены. Этот процесс называется «сплайсинг» – от старого морского термина, означавшего скрепление концов двух канатов без узла.

Не очень понятно, зачем эукариотам эти сложности. Сплайсинг дает некоторые преимущества, например, позволяет эукариотам получать с одного гена много разных белков. Для этого часть экзонов вырезается из мРНК вместе с интронами. В зависимости от того, какие экзоны войдут в зрелую матричную РНК, получатся разные варианты белка. Рекорд разнообразия альтернативного сплайсинга принадлежит белку иммунной системы насекомых DSCAM. Ген DSCAM мухи содержит 117 экзонов, комбинации которых дают 38 000 вариантов белка.

Эукариоты платят за эту возможность дополнительными затратами энергии и времени на синтез интронов мРНК. Хуже того, из-за сплайсинга включение и выключение генов занимает гораздо больше времени. У бактерий синтез белков на новой мРНК начинается еще до того, как она будет достроена до конца, благодаря этому через несколько минут после включения гена с него получатся первые готовые белки. У эукариот же сначала мРНК должна быть достроена до конца, а из-за интронов она длиннее, чем у бактерий, и синтезируется дольше. Потом должен пройти сплайсинг, тоже занимающий время, затем прикрепление кэпа, полиаденинового хвоста и экспорт мРНК из ядра в цитоплазму. Только после этого рибосомы смогут приступить к работе. Поэтому у эукариот от включения гена до появления первого готового белка проходит в лучшем случае от 30 до 60 минут, а часто несколько часов.

В ходе сплайсинга нередко происходят ошибки, приводящие к появлению дефектных мРНК. Для уничтожения таких матричных РНК эукариоты имеют специальную систему NMD (nonsence-mediated decay). Немногочисленные интроны в геномах бактерий вырезают себя из РНК сами, т. е. они являются рибозимами. В геномах эукариот счет интронов идет на десятки тысяч, и способностью к вырезанию самих себя они не обладают. Сплайсинг эукариот происходит при помощи специального РНК-белкового комплекса – сплайсосомы. Основную роль в ней играют шесть видов малых ядерных РНК, которые являются рибозимами. В структуре этих РНК есть сходство с самовырезающимися интронами бактерий.

Появление ядра, разделившее синтез матричных РНК и синтез белков, сняло эти ограничения, и началось бурное размножение интронов в белок-кодирующих генах предка эукариот. Мутации интронов часто нарушали их способность к самовырезанию и приводили к возникновению большого количества дефектных белков. Это вызвало давление отбора на появление системы NMD для контроля качества мРНК. Часть интронов специализировалась на вырезании других, поврежденных интронов. От них произошли малые ядерные РНК, составляющие основу сплайсосомы.

 

Гипотезы о происхождении ядра

Если происхождение митохондрий в целом понятно, то о пути появления ядра общепринятой теории нет. Образование ядра должно было в первую очередь обозначиться появлением оболочки вокруг генетического материала. Существует четыре гипотезы, объясняющие появление ядерной оболочки:

• гипотеза впячивания клеточной мембраны;

• эндоспоровая гипотеза;

• симбиотическая гипотеза;

• гипотеза слияния клеточных выростов.

Согласно гипотезе впячивания клеточной мембраны, оболочка ядра возникла из клеточной мембраны, часть которой ввернулась внутрь клетки. Так получилась система мембран эндоплазматического ретикулума, которая является продолжением двойной ядерной мембраны. Окружение ДНК мембраной было выгодно при питании путем фагоцитоза, так как при этом в цитоплазму неизбежно попадала чужеродная ДНК. Хуже того, в ней содержались вирусы и мобильные элементы. Поэтому появление ядерной оболочки для защиты генетического материала было поддержано отбором.

Подобное вворачивание мембраны и окружение ею ДНК известно у бактерии Gemmata obscuriglobis из группы Planctomycetes (Fuerst, Sagulenko, 2012) (рис. 18.9). Планктомицеты имеют наряду с наружной клеточной мембраной еще внутреннюю, которая делит цитоплазму клетки на две части. Внутренняя цитоплазма (пиреллюлосома) содержит рибосомы, и в ней происходит синтез белка, а внешняя цитоплазма (парифоплазма) не имеет рибосом. У Gemmata obscuriglobis внутренняя мембрана образует складку, которая окружает ДНК аналогично ядерной мембране эукариот. Однако у Gemmata эта оболочка не отделяет геномную ДНК от рибосом. Как и у всех бактерий, рибосомы Gemmata связываются с еще не завершенными матричными РНК и сразу начинают синтез белка. Ядерная мембрана эукариот же разделяет процессы транскрипции (создания матричных РНК) и трансляции (синтез белка по инструкциям в матричных РНК).

Эндоспоровая гипотеза выводит ядро и цитоплазму от двух клеток одного вида микробов. У микробов рода Bacillus при образовании спор происходит особое клеточное деление, при котором одна дочерняя клетка, дающая начало споре, оказывается внутри другой. К сожалению, такое деление известно только у Bacillus, его нет у всех остальных бактерий и ни у одной из архей.

По симбиотической гипотезе ядро и цитоплазма эукариотической клетки происходят от двух организмов, вступивших в симбиоз друг с другом. А после их слияния генетический материал предка цитоплазмы был частично перенесен в ядро, а частично утерян. Предлагались разные пары симбионтов, например спирохета внутри археи (Margulis et al., 2006) или архея внутри бактерии-планктомицета (Forterre, 2011). Иначе говоря, клетка эукариот по этим гипотезам получается химерой из трех микробов: цитоплазма – от археи (а может, от планктомицета), ядерная оболочка – от спирохеты (а может, от археи), а митохондрии – от альфа-протеобактерий. К сожалению, геномные данные не подтверждают симбиоз трех клеток. Большинство белков эукариот имеет либо архейное, либо альфа-протеобактериальное происхождение. Доля тех белков, которые происходят от других групп бактерий, меньше, а главное, не обнаруживается единого для них источника. Скорее, они получены от многих разных бактерий путем переноса отдельных групп генов, а не симбиоза и слияния целых клеток. На сегодня рассматривается только вариант симбиотической гипотезы, в котором третьим партнером был крупный вирус. О нем будет подробно рассказано дальше.

Наконец, четвертая гипотеза, предложенная только в 2014 году, выводит ядро от клетки предковой археи, покрытой клеточной стенкой, а цитоплазму – от слившихся выростов клетки, выходивших за пределы клеточной стенки (Baum and Baum, 2014). У разных архей известны такие выросты, которые увеличивают поверхность для поглощения веществ из внешней среды или для лучшего контакта с соседями по сообществу. По гипотезе Баумов, предок эукариот использовал такие выросты для улучшения контакта с будущими митохондриями. Потом выросты увеличились в объеме и частично слились между собой. Щели между ними стали эндоплазматическим ретикулумом, а слившиеся концевые части выростов создали новую клеточную мембрану (рис. 18.10).

Эта гипотеза объясняет некоторые странные особенности эукариот. Например, клеточная стенка архей состоит из белковых цепей, соединенных полисахаридными перемычками через боковые аминогруппы (N-гликозилирование). Где можно было бы увидеть следы этой клеточной стенки у эукариот?

Если мембрана ядра произошла путем вворачивания наружной мембраны клетки, то мы бы ожидали увидеть химические следы предковой клеточной стенки на внешней мембране. Если ядро произошло от симбионта, поселившегося внутри археи, то следы клеточной стенки хозяина тоже должны остаться на внешней мембране. Однако следы архейной клеточной стенки обнаруживаются ближе к ядру.

Архейные ферменты N-гликозилирования были унаследованы эукариотами и работают внутри эндоплазматического ретикулума, рядом с ядром, модифицируя различные белки. Инозитол-фосфатные липиды, биохимическое наследство архей, в эукариотических клетках производятся почему-то в ядре, хотя остальные функции ядра связаны с ДНК и генетикой. Митохондрии в клетках эукариот связаны с эндоплазматическим ретикулумом (ЭР), деление митохондрий происходит при помощи ЭР. Такая связь предсказывается только гипотезой слияния клеточных выростов, по которой митохондрии когда-то жили в просветах будущего ЭР, а потом прорвали его стенку и оказались в цитоплазме хозяина.

Гипотеза расширения мембраны дает ряд предсказаний, которые можно проверять. Например, она проясняет происхождение ресничек и жгутиков – тонких двигательных выростов эукариотной клетки. По этой гипотезе, жгутики произошли от тех выростов клетки, которые специализировались на движении. Как и другие выросты клетки, в месте прикрепления к телу клетки они укреплялись белковыми кольцами, которые в эукариотических клетках стали ядерными порами. Значит, в основании жгутиков могут оказаться те же белки, что и в ядерных порах. Также гипотеза расширения мембраны дает подробные предсказания о механизме сборки этих пор. Поскольку гипотеза расширения мембраны была опубликована только в 2014 году, проверка этих следствий только началась, и скоро происхождение ядра и ядерных оболочек может проясниться.

 

Роль вирусов в происхождении эукариот

Мы рассмотрели происхождение эукариот путем симбиоза между археей и бактерией в условиях перехода микробного сообщества к кислородной среде. Однако этот сценарий не объясняет многие особенности эукариотических клеток. Непонятно, как переход археи к фагоцитозу и обзаведение симбионтами могли способствовать появлению, например, полового размножения и мейоза. А если обратить внимание на более частные вопросы, то совершенно несуразной выглядит такая деталь эукариотической системы трансляции (считывания), как кэпы матричных РНК. Кэп – это остаток 7-метилгуанозина, пришитый к 5'-концу мРНК специальным 5' – 5'-трифосфатным мостиком (рис. 18.11). Он требуется для начала трансляции на эукариотической рибосоме – без него рибосома не может связаться с мРНК.

Для узнавания кэпа рибосомой есть специальный белок – фактор инициации eIF4E, не имеющий аналогов у прокариот. Важно, что из-за наличия кэпа и eIF4E эукариоты не могут иметь оперонов – групп генов, которые транскрибируются в одну длинную мРНК, кодирующую несколько белков последовательно, один за другим. Опероны позволяют бактериям и археям экономить на регуляции активности генов: достаточно одного регуляторного участка в начале оперона, чтобы одновременно управлять активностью всех его генов. (Обычно белки, которые кодируются генами одного оперона, функционально связаны, а значит, требуются в равных количествах.) Переход к кэпированным мРНК на заре эволюции эукариот потребовал бы массированной перестройки генома, распада всех оперонов и появления тысяч новых регуляторных участков для отдельных генов. Сложно представить себе причину, по которой это было бы выгодно для клетки, и еще сложнее найти причину, по которой система пришивания и узнавания кэпа вообще возникла.

Эти особенности эукариот находят объяснение, если допустить, что в их появлении участвовали помимо архейного и бактериального партнеров еще и вирусы. Вирусное происхождение отдельных компонентов эукариотической клетки не вызывает сомнения. Так, фермент теломераза, достраивающий защитные концевые структуры хромосомной ДНК (теломеры), происходит от обратной транскриптазы ретровирусов. Часть генетического аппарата митохондрий – ДНК-полимераза, РНК-полимераза и праймаза – унаследована от хвостатого бактериофага, похожего на современный фаг Т4 и встроенного в геном бактериального предка митохондрий. Однако есть и более радикальное мнение о роли вирусов в появлении эукариотической клетки – вирусная теория происхождения ядра.

Эту теорию в современном виде выдвинули вирусологи Филипп Джон Белл и Масахара Такемура (Bell, 2001; Takemura, 2001; Bell, 2009). Они утверждают, что ядро эукариотической клетки происходит от крупного ДНК-вируса, заразившего древнюю архею. Этот вирус мог перейти к умеренной эксплуатации хозяина: он не убивал его сразу (это явление называется лизисом), а сосуществовал, медленно размножая свою ДНК в его клетках (лизогения). Постепенно такой вирус мог взять клетку хозяина под полный контроль. Поначалу другие ученые практически не рассматривали эту теорию всерьез, но в последнее время она стала набирать популярность – так, к ее обсуждению подключился крупнейший французский вирусолог Патрик Фортерр.

Ключевую стадию пришивания кэпа проводит фермент гуанилил-трансфераза. Поскольку эукариотические рибосомы не связываются с мРНК без кэпа, вирусы эукариот для синтеза своих белков должны как-то решать эту проблему. Мелкие ДНК-вирусы, умеющие проникать в ядро сквозь ядерные поры, обычно используют гуанилил-трансферазу хозяина. РНК-вирусы создают на 5' концах своих мРНК сложные конструкции из шпилек (они называются IRES), которые имитируют форму белка eIF4E и позволяют РНК связаться с рибосомой без участия кэпа и eIF4E. Крупные ДНК-вирусы обычно имеют свою собственную гуанилилтрансферазу и производят матричные РНК с кэпами. В ходе эволюции эти ферменты могли передаваться между хозяевами и вирусами в обоих направлениях, но где они появились исходно?

Белл провел филогенетический анализ ферментов пришивания кэпа, который показывает, что ферменты эукариот образуют на дереве единую самостоятельную ветвь (рис. 18.12). Случай переноса фермента из клетки вирусу отразился бы на этом дереве вирусной веткой среди эукариот, но ничего такого мы не видим. А значит, следов переноса гуанилилтрансферазы от клеток вирусам нет.

Чтобы понять, какой из узлов дерева гуанилилтрансфераз самый древний и соответствует предковому ферменту, к ним добавлены родственные ферменты – АТФ-зависимые ДНК-лигазы. Это более древние белки, предковые по отношению к гуанилилтрансферазам. Соответственно, та часть дерева гуанилилтрансфераз, которая выходит из лигазной части дерева, укажет нам древнейшую гуанилилтрансферазу. Оказывается, она принадлежала вирусам: первая ветвь ее потомков содержит ферменты поксвирусов (вирус оспы и его родственники), вторая – ферменты вируса ASF (африканской чумы свиней – African swine fever) и третья – вируса хлореллы. Гуанилилтрансферазы эукариот происходят от фермента вирусной линии, давшей начало вирусам ASF и хлореллы. Это доказывает, что кэпирование мРНК, как и другие инновации в генетических системах, появилось сначала среди вирусов и лишь затем было заимствовано эукариотами.

Для вирусов, в отличие от клеток, есть очевидная выгода в создании такой системы. Это средство перехвата управления клеткой хозяина. Вирус вносит в клетку фермент, который разрушает клеточные матричные РНК без кэпа и не трогает вирусные мРНК с кэпом. Белок eIF4E тоже мог сначала появиться у вирусов как средство захвата рибосом хозяина. Он присоединяется к рибосомам, после чего они узнают только вирусные мРНК с кэпом, останавливая синтез белков клетки. Современные клеточные eIF4E обычно связаны с рибосомами. У мимивируса обнаружен собственный белок-аналог eIF4E, роль его пока непонятна.

Такемура обратил внимание на систему репликации ДНК эукариот. По сравнению с машинами репликации бактерий и архей эукариотическая версия сложна и медлительна. Если у бактерий и архей скорость репликации составляет около 1000 нуклеотидов в секунду, то у эукариот обычно около 50. Там, где многие бактерии и археи обходятся одной ДНК-полимеразой (см. главу 14), эукариоты используют три родственные. Дельта-полимераза копирует отстающую цепь, эпсилон-полимераза – лидирующую, а альфа-полимераза имеет неожиданную функцию. Она удлиняет РНК-затравки на 15–20 нуклеотидов уже из ДНК, после чего уступает место полимеразам дельта и эпсилон. Альфа-полимераза часто делает ошибки, поэтому созданные ею фрагменты ДНК потом удаляются одновременно с РНК-затравками, и дельта-полимераза строит на их месте точные копии ДНК-матрицы. Кроме этих трех ДНК-полимераз у большинства эукариот есть четвертая – дзета-полимераза. Она заменяет другие полимеразы, когда нужно срочно скопировать поврежденную ДНК и нет времени на ее починку.

Все четыре эукариотические полимеразы принадлежат к семейству PolB (глава 14), но достаточно сильно различаются между собой. На родословном дереве ДНК-полимераз эукариот, архей и вирусов (рис. 18.13) хорошо видно, что полимераза эпсилон унаследована эукариотами от архей, полимераза дельта – от вирусов, а полимеразы альфа и дзета образуют отдельные ветви, начинающиеся ближе к корню дерева, чем δ. Об их происхождении нельзя судить точно, но они тоже могли попасть в клетки эукариот от каких-то вымерших или еще не открытых вирусов.

Наконец, Патрик Фортерр связал с вирусами происхождение огромного количества эукариотических белков, которые не похожи ни на какие белки бактерий и архей (Forterre, 2011). По последним оценкам, общий предок современных линий эукариот уже имел более 1400 таких белков. Среди них преобладают вспомогательные белки цитоскелета и ДНК-связывающие белки, в структуре которых присутствуют многочисленные короткие повторы. Вирусы, особенно крупные, содержат много генов, не похожих ни на какие гены клеточных организмов, а часто и на гены других вирусов. Кодируемые ими белки тоже часто имеют множественные короткие повторы. Низкая точность вирусных полимераз, интенсивная рекомбинация и «гонка вооружений» с хозяевами приводят к очень быстрой эволюции вирусных белков по сравнению с клеточными, поэтому вирусы – обильный источник принципиально новых белков.

 

Вирусная теория происхождения ядра и полового размножения

К крупным ДНК-вирусам (LNCDV, Large Nucleo-Cytoplasmic DNA Viruses) относятся, например, поксвирусы (из них широко известен возбудитель оспы), мимивирусы (недавно открытая группа гигантских вирусов-паразитов амеб) и фикоднавирусы, поражающие водоросли. Они имеют крупную и сложную вирусную частицу, покрытую несколькими мембранами. Самая внешняя мембрана сливается с наружной мембраной клетки при заражении, и в цитоплазму попадает вирус, окруженный двумя внутренними мембранами. Эти мембраны местами сливаются между собой, образуя некое подобие ядерных пор. Они выстланы изнутри белками капсида (вирусной оболочки), аналогичными белкам ядерной оболочки. В такой форме вирус долго существует в цитоплазме, в нем происходят транскрипция, кэпирование и полиаденилирование РНК, экспорт зрелых РНК в цитоплазму через поры вирусной частицы. Вирусы оспы раньше называли «мини-ядрами», а вирион мимивируса по размеру почти не уступает ядру клетки-хозяина.

Сходство крупных ДНК-вирусов с ядром эукариот наблюдается по многим признакам:

• генетический материал ограничен двумя липидными мембранами с белковым каркасом между ними;

• транскрипция и трансляция разделены в пространстве (транскрипция идет внутри вируса, трансляция – в цитоплазме клетки-хозяина);

• мРНК активно экспортируется через поры в мембранной оболочке;

• геном состоит из линейных молекул ДНК с тандемными повторами на концах;

• расхождение дочерних молекул ДНК при делении может сопровождаться исчезновением оболочки.

Геном таких вирусов представлен линейной двухцепочечной ДНК длиной до 200 000 пар нуклеотидов у поксвирусов и более 1 млн – у мимивирусов, что сравнимо с размером самых малых бактериальных геномов. Открытые в 2013 году пандоравирусы имеют геном размером до 2,5 млн пар нуклеотидов, что соответствует среднему геному свободноживущей бактерии. Для репликации ДНК эти вирусы разбирают вирусную частицу (она называется «вирион»). По мере накопления вирусной ДНК в цитоплазме клетки собираются новые вирионы, которые окружаются впячиваниями эндоплазматического ретикулума и плазматической мембраны. Кэпирование, полиаденилирование, а часто и подготовка дезоксирибонуклеотидов при размножении этих вирусов осуществляют их собственные ферменты, без участия клеточных белков.

По предложенному Беллом сценарию вирус, ставший предком ядра, паразитировал на метаногенной архее с клетками разветвленной формы, не имевшей клеточной стенки (Bell, 2006). Такие археи есть и сейчас, например, Methanoplasma elizabethii; разветвленная форма позволяет им плотнее контактировать с выделяющими водород бактериями-ацетогенами. Как и у многих современных крупных ДНК-вирусов, зрелые частицы этого вируса были покрыты тремя мембранами. Внешняя из трех мембран сливалась с наружной мембраной заражаемой клетки, а две внутренние имели поры, пропускавшие РНК и другие молекулы из вируса в цитоплазму клетки и обратно. Такие оболочки современных вирусов строятся из мембран эндоплазматического ретикулума клетки-хозяина, а у археи, не имевшей внутренних мембран, для их построения использовалась внешняя мембрана клетки. От мембраны клетки-хозяина «отшнуровывались» круглые пузырьки, которые затем складывались в двухслойное полушарие, окружали новые копии вирусной ДНК и выходили из клетки, покрываясь при этом третьей мембраной (рис. 18.14). Подобным образом одеваются мембранами частицы бактериофага PRD1, и в его случае все манипуляции с мембранами производят только вирусные белки.

Ключевым моментом превращения вируса в ядро должен был стать, как мы уже упоминали, переход такого вируса в лизогенное состояние. Многие вирусы способны переключаться между литическим жизненным циклом (быстрое размножение с гибелью клеток хозяина) и лизогенным существованием – скрытой инфекцией, практически не влияющей на жизнеспособность хозяина. Лизогенное состояние достигается двумя способами: можно вставить свой геном в геном хозяина и пользоваться хозяйскими системами репликации или же, переключив активность вирусных генов, постоянно существовать в цитоплазме. В этом случае вирус временно превращается в плазмиду – автономную молекулу ДНК. Он тоже может пользоваться хозяйской системой репликации, но ему нужны собственные механизмы контроля количества копий. Если он будет отставать в репликации от генома хозяина, то деления хозяина будут часто порождать незараженные клетки, а если репликация вируса будет слишком активной, то он будет снижать жизнеспособность хозяина.

Большинство лизогенных бактериофагов и крупные плазмиды поддерживают минимальное число своих копий и используют специальную систему разделения копий по дочерним клеткам, похожую на ту, которая разделяет хромосомы в клетках современных эукариот. Эта система обычно включает в себя белок, способный собираться в нити, специальные участки ДНК (центромеры) и второй белок, связывающий центромеры с нитями первого белка. Центромеры – это части молекулы ДНК (хромосомы или плазмиды), которые не содержат генов и состоят из многочисленных коротких повторов. К ним прикрепляются нити веретена деления и через них же соединяются сестринские хромосомы до того, как разойтись по разным клеткам. В расхождении хромосом при делении клеток животных, которое описано во вставке в начале этой главы, веретено деления имеет два центра организации на полюсах, и хромосомы растаскиваются к этим полюсам. Гораздо более простые системы разделения копий плазмид имеют один центр организации веретена – соединенные центромеры двух копий плазмиды. Короткие нити веретена прикрепляются одним концом к одной копии плазмиды, другим – к другой. Удлинение нитей толкает две копии плазмиды в разные стороны. У ряда одноклеточных эукариот (эвглены, динофлагелляты и др.) при митозе ядерная оболочка сохраняется, веретено деления образуется внутри ядра, а механизм движения хромосом похож на таковой у плазмид.

У некоторых плазмид, например R1, белок нитей похож на актин, у других встречаются родственники тубулина. Плазмиды, не способные образовывать вирусные частицы, имеют другой путь заражения новых клеток – конъюгацию, т. е. образование специальных контактов между бактериальными клетками, по которым передается плазмидная ДНК.

И плазмиды, использующие конъюгацию, и лизогенные вирусы обычно способны отличить уже зараженные их собратьями клетки от «чистых», чтобы предотвратить бесполезное повторное заражение. Такое распознавание работает только в пределах близких видов вирусов, поэтому клетка может быть заражена одновременно несколькими разными лизогенными вирусами. Однако стабильная лизогенная инфекция несколькими вирусами требует, чтобы они использовали разные, несовместимые системы разделения копий по дочерним клеткам, иначе первое же деление клетки разносит разные лизогены по разным линиям потомков.

Лизогенные вирусы, такие как N15, и плазмиды, как R1, уже имеют цикл размножения, напоминающий митоз эукариот: они реплицируются один раз, после чего две копии остаются связанными в центромерном регионе. Дальнейшая репликация блокируется до тех пор, пока полимеризация нитей не растащит две копии далеко друг от друга. Гигантский вирус – предок ядра, в отличие от N15 и R1, имел оболочку вириона. Поэтому ему приходилось разбирать оболочку на время репликации и деления и восстанавливать ее для транскрипции генов, что еще ближе к митозу.

Следующим шагом от вируса к ядру стала потеря литического пути размножения, т. е. выхода новых вирусных частиц с гибелью хозяина. Вирус оказался «в одной лодке» с хозяином, и теперь требовалось, во-первых, по возможности снизить вред, наносимый хозяину, а во-вторых, создать механизм конъюгации для заражения новых хозяев. Второе было очень просто, так как вирус уже обладал белками, вызывающими слияние мембран. Достаточно было перенести их с оболочки вириона на клеточную мембрану, чтобы получить возможность слияния клеток зараженного хозяина с незараженным. Этот же белок на внешней мембране улучшил способности хозяина к фагоцитозу за счет слияния двух его собственных ложноножек вокруг добычи. На этой стадии использование кэпов и eIF4E для подавления трансляции генов хозяина стало опасным, и многие жизненно важные гены хозяина были перенесены в геном вируса под его управление. Современные мимивирусы содержат сотни генов, недавно перенесенных из генома хозяина, так что сценарий не выглядит нереальным. Затем кэпы пригодились для того, чтобы ограничить и поставить под контроль транскрипцию огромного количества генов, проникавших в цитоплазму из перевариваемых клеток с переходом к фагоцитозу. Поглощенные чужеродные ДНК могли транскрибироваться в цитоплазме, но получаемые при этом мРНК не имели кэпов и не узнавались рибосомами протоэукариотной клетки, оснащенными белком eIF4E. Необходимые митохондриальные гены переносились в ядро под контроль его систем регуляции. В итоге кольцевой геном архейного предка исчез совсем, а митохондриальные геномы сократились до считаных десятков генов.

Происхождение мейоза и полового размножения требует взаимодействия между разными штаммами такого лизогенного вируса. Два штамма, достаточно разных, чтобы опознавать друг друга как «чужих», но еще с одинаковой системой сегрегации, могли вызывать слияние мембран своих клеток с последующей репликацией обоих вирусных геномов. Однотипные центромеры и центромер-связывающие белки приводили к тому, что все четыре генома оказывались склеенными вместе по центромерам. Рекомбинационные белки, необходимые для достройки концов линейной вирусной ДНК, могли в этот момент вызывать рекомбинации между геномами разных штаммов, аналогичные кроссинговеру. Деление хозяйской клетки приводило к разделению вирусных геномов по два в каждую дочернюю клетку, они оставались связанными по центромере и не реплицировались. Второе деление клетки-хозяина окончательно разделяло вирусные геномы и разрешало их репликацию. Естественный отбор мог закрепить такое поведение, потому что рекомбинация между двумя вирусными геномами в одной клетке позволяет им избавиться от вредных мутаций. Нечто подобное показано для вирусов с ультрафиолетовыми повреждениями после дезинфекции: при заражении одной клетки несколькими поврежденными вирусами одного вида из их геномов собирается один работоспособный, и происходит его успешное размножение (Barry, 1961).

Итак, вирусная теория происхождения ядра лучше других объясняет такие особенности эукариот, как кэпирование мРНК, отсутствие оперонов и митоз. Она объясняет также происхождение систем слияния мембран и отшнуровки мембранных пузырьков. Серьезными доказательствами в ее пользу могут стать:

• обнаружение среди вирусов архей близких родственников крупных ДНК-вирусов эукариот;

• обнаружение у архейных вирусов системы кэпов;

• находка родственных белков мейоза у вирусов.

К сожалению, архейные вирусы пока изучены очень слабо.

Участие вируса в симбиозе, давшем начало эукариотам, снимает многие проблемы взаимодействия архейного и бактериального геномов в одной клетке и защиты от попадания чужеродной ДНК при фагоцитозе. Вирусы, и особенно крупные ДНК-вирусы, обладают изощренными механизмами для манипуляции чужими генетическими системами. Благодаря транскрипции внутри вирусной частицы и наличию кэпов матричных РНК вирус мог поддерживать функционирование зараженной клетки, несмотря на мощный поток чужих генов из фагоцитированных бактерий.

К сожалению, мы не знаем, как примирить вирусную теорию с другими версиями происхождения ядра. В рамках вирусной теории, например, с одной стороны, трудно объяснить, почему синтез инозитол-фосфатов происходит в ядре, или связь митохондрий с ЭР. С другой стороны, кэпы матричных РНК, распад оперонов и происхождение новых ДНК-полимераз трудно объяснить без участия вирусов. Скорее всего, со временем будет создан сценарий появления эукариот, который объединит сильные стороны этих теорий.

 

Дальнейшая эволюция эукариот

После установления симбиоза с митохондриями первые эукариоты стали высокоэффективными хищниками: аэробное дыхание повышает эффективность использования пищи почти в 20 раз по сравнению с гликолизом. Они вышли на поверхность мата и стали поедать цианобактерии. Иногда эукариоты не переваривали съеденные клетки цианобактерий, а оставляли их жить внутри пищеварительной вакуоли и потребляли только выделяемые ими сахара. Такие цианобактерии дали начало второму типу симбиотических органелл – хлоропластам. Эукариоты, приручившие цианобактерий, дали начало трем современным группам водорослей: зеленым, красным и глаукофитовым. Хлоропласты всех этих водорослей покрыты двумя мембранами: внешней – из пищеварительной вакуоли хозяина и внутренней – из клеточной мембраны симбионта. Этот симбиоз называется первичным.

Водоросли больше не нуждались в питании фагоцитозом и ушли из бактериального мата в толщу океана, другие же продолжили питаться бактериями. В дальнейшем среди эукариот появились крупные хищные формы, такие как инфузории, приспособившиеся к питанию другими эукариотами, в первую очередь водорослями. Они вместе со своей добычей составили новую экосистему открытого моря, независимую от занявших мелководья бактериальных матов.

Эукариоты легко заводят внутриклеточные симбиотические бактерии и подчиняют их себе. Так альфа-протеобактерии стали митохондриями, затем цианобактерии – хлоропластами. И в дальнейшем всякий раз, когда эукариотам требовался какой-нибудь новый биохимический путь, они брали на работу бактерий, уже владеющих им. Так, десятки групп глубоководных животных независимо приручили хемосинтетические бактерии, окисляющие сероводород или метан. Фиксация азота, разложение целлюлозы, синтез витаминов и многое другое эукариоты получают благодаря симбиотическим бактериям. Более того, эукариоты способны вступать в эндосимбиоз с другими эукариотами. Многие группы водорослей возникли в результате вторичного симбиоза, когда в роли хозяев выступали хищные амебы и жгутиконосцы, а симбионтами становились зеленые и красные водоросли (рис. 18.15). При таком симбиозе клетки водорослей дегенерируют, и от них могут остаться только хлоропласт и одна-две дополнительные мембраны. Например, хлоропласты амебы Chlorarachnion происходят от зеленых водорослей. Эти хлоропласты покрыты четырьмя мембранами (две мембраны хлоропласта зеленой водоросли, клеточная мембрана зеленой водоросли и пищеварительная вакуоль амебы). Между второй и третьей мембранами находится нуклеоморф – маленький остаток ядра зеленой водоросли с тремя хромосомами, несущими около 280 генов. Эвгленовые хлоропласты тоже происходят от зеленых водорослей, но дегенерация зашла дальше: нуклеоморфа нет, а из четырех мембран осталось три.

Другой хищный жгутиконосец приручил красную водоросль. Его потомки дали начало бурым, золотистым, диатомовым, криптофитовым, гаптофитовым водорослям и динофлагеллятам. Хлоропласты всех этих водорослей имеют три или четыре мембраны. У криптофитовых хлоропласты содержат нуклеоморф, как у Chlorarachnion. Многие группы динофлагеллятов, даже получив фотосинтезирующих симбионтов, возвращались к хищничеству или переходили к паразитизму.

От последних произошли споровики – группа одноклеточных, к которым относится возбудитель малярии. Предки споровиков, как и ряд других водорослей, перенесли в хлоропласт синтез липидов. Поэтому, отказавшись от фотосинтеза, потерять хлоропласт полностью они не смогли. Даже у малярийного плазмодия, предки которого сотни миллионов лет были паразитами, сохраняется апикопласт – маленький, покрытый четырьмя мембранами бесцветный остаток хлоропласта со своей кольцевой ДНК.

Среди вернувшихся к хищному образу жизни динофлагеллят есть множество примеров повторного приобретения водорослей-симбионтов. Так, Lepidodinium завел себе зеленую водоросль, Karenia – гаптофитовую, а Dinophysis – криптофитовую (Keeling, 2004).

Вершиной же симбиотического таланта эукариот можно считать клетку динофлагелляты Kryptoperidinium. Эта одноклеточная водоросль происходит от динофлагеллят, которые имели хлоропласт – потомок красной водоросли. Затем эти динофлагелляты вернулись к хищному образу жизни. Старый хлоропласт остался у них в качестве маленького фоторецептора (глазка). Потом эти хищные жгутиконосцы вступили в симбиоз с диатомовой водорослью, которая сохранила ядро и значительную часть генома. В клетке Kryptoperidinium под управлением ядра находятся в общей сложности пять «чужих» геномов: свой митохондриальный, старого хлоропласта (фоторецептор), ядерный симбионта-диатомеи, митохондриальный геном симбионта-диатомеи и хлоропластный геном симбионта-диатомеи (рис. 18.16, Figueroa et al., 2009). Деление ядер хозяина и симбионта строго синхронизировано. Более того, при половом размножении происходят мейоз и слияние как главных ядер половых клеток, так и ядер симбионтов.

Наличие цитоскелета и сложной системы регуляции генов позволило эукариотным клеткам объединиться в крупные многоклеточные организмы. Сначала это были нитчатые и лентовидные водоросли, которые ускорили накопление кислорода в атмосфере. Новый уровень кислородного насыщения среды открыл возможность появления многоклеточных животных. За этим последовало радикальное усложнение биосферы («Кембрийский взрыв»), когда за короткое время появились десятки типов животных, и некоторые из ранних представителей быстро достигли метровых размеров. После «Кембрийского взрыва» эволюция шла с ускорением, и с тех пор облик Земли определяют многоклеточные растения и животные.