Работа Хенрика с Х-хромосомой показала, что закономерности сходства и различия между мтДНК обезьяны и человека распространяются, по крайней мере, на некоторую часть ядерного генома. А что же касается неандертальца, то невозможно было предугадать, сможем ли мы когда-нибудь добраться до его ядерного генома. В периоды уныния я думал, что мы навечно уткнулись в бледную и упрощенную митохондриальную историю человека.
Понятно, что, не считая результатов всяких затейливых “допотопных” исследований вроде растений из янтаря или динозавров (а я их и не считал настоящими результатами), еще никому не удавалось выделить ядерную ДНК из древних остатков. Но когда уныние уступало здравому смыслу, то казалось, что попробовать все же стоит.
Именно в тот момент в лабораторию прибыл Алекс Гринвуд, ростом маленький, но очень настойчивый. Я посвятил его в наши планы по выделению ядерной ДНК и честно предупредил, что хотя результат чрезвычайно для нас важен, вероятность получить его невелика. Алекс принял вызов.
Я предложил метод “массированной атаки”. Это вот что: тестировать все подряд образцы костной ткани и отобрать те, у которых митохондриальная ДНК сохранилась наилучшим образом, затем экстрагировать всю ДНК из большего количества ткани – вдруг да объявится ядерная. Мы, конечно, не могли себе позволить отрабатывать подобную методику на материале собственно неандертальцев; сохранившихся остатков было слишком мало, и слишком они были ценны, а риск провала слишком велик. Поэтому мы решили попробовать поработать с костями животных, материалом более массовым и потому менее ценным для палеонтологов. Вот тут-то и пригодились кости пещерных медведей, которые я вывез из темных подвалов Института четвертичной палеонтологии в Загребе. Те кости раскопали в известняковой пещере Виндия, как раз вместе с костями неандертальцев, из которых мы выделили ДНК. Так что если бы нам удалось выделить ядерную ДНК из медведей, то почему бы после не попробовать то же и с неандертальцами?
Для начала Алекс экстрагировал всю ДНК из костей хорватских пещерных медведей – а их возраст, напомню, от 30 до 40 тысяч лет. Затем он проверил, содержат ли экстракты мтДНК, схожие с медвежьими. Да, содержат. Он выбрал те вытяжки, в которых нашлось наибольшее количество мтДНК, и попробовал амплифицировать из них короткие фрагменты ядерной ДНК. Не получилось. Алекс приуныл, я тоже расстроился, но не удивился. Он столкнулся с хорошо мне знакомой проблемой: так как каждая клетка имеет сотни митохондриальных геномов и только два ядерных, то количество каждого конкретного фрагмента ядерной ДНК уменьшается сто- или тысячекратно по сравнению с количеством отдельно взятого фрагмента мтДНК. Так что даже если в наших экстрактах и присутствовало некоторое минимальное количество ядерных нуклеотидов, то вероятность того, что амплифицируются именно они, падала в 100–1000 раз.
Проблема решалась очевидным способом: увеличить количество костного материала. Алекс сделал экстракты из большего количества кости и попробовал амплифицировать более короткие участки ядерных ДНК. Он использовал такие праймеры, которые подсоединялись к концам исключительно медвежьих ДНК-фрагментов, но наверняка не человеческих. Это для того, чтобы не тратиться лишний раз на человеческие ДНК-загрязнения. В этот раз Алекс не получил ничего, вообще ничего. Из этого мегаэкстракта не удалось амплифицировать даже митохондриальной ДНК. Ничего.
После нескольких недель бесплодных попыток и опытов с различными костями мы наконец догадались, что из большого количества ткани просто невозможно экстрагировать ДНК. И не потому, что амплифицировать там нечего, а потому, что экстракты содержали какое-то вещество, угнетающее ферменты, участвующие в ПЦР; ПЦР останавливалась, и на выходе оказывалось пусто. Мы промучились некоторое время, пытаясь определить и убрать непонятный ингибитор, но не смогли. Мы стали постепенно, поэтапно разбавлять экстракт, пока амплификация мтДНК снова не активировалась. Определив разбавленный до нужной концентрации раствор, мы пробовали амплифицировать ядерную ДНК. И получали… неудачу за неудачей. Я старался сохранять оптимизм, но шли месяцы, и Алекс все больше падал духом и волновался: будут ли вообще хоть сколько-нибудь годные для публикации результаты?.. Мы обдумывали и такую возможность: после смерти животного ядерные ДНК разрушаются ферментами, проникающими сквозь ядерную мембрану разлагающейся клетки. Митохондриальная же ДНК окружена двойной мембраной, потому лучше защищена от ферментных атак. Следовательно, у нее больше шансов дождаться, пока органическая ткань высохнет, замерзнет или окажется так или иначе недоступна для ферментов, и, таким образом, она может сохраниться. Такой сценарий заставил меня задуматься, а возможно ли в принципе обнаружить древнюю ядерную ДНК, даже если мы сумеем справиться с проблемой ингибитора ПЦР. Мало-помалу я, как и Алекс, впал в уныние. Итак, пещерные медведи нас подвели. Мы предположили, что, быть может, условия, в которых находились кости, просто не благоприятствовали сохранению ядерной ДНК. И мы приняли решение переключиться на другой материал, самой лучшей, как мы ожидали, сохранности: остатки мамонтов из вечной мерзлоты в Сибири и Аляске. Те мамонты замерзли сразу после смерти, а замораживание, как мы знаем, замедляет или совсем прекращает развитие бактерий и множество других химических реакций, включающих и разрушительные для ДНК. Мы уже знали из работ Матиаса Хёсса, что мамонты из Сибири дают большое количество мтДНК. Правда, неандертальцев никогда не находили в вечной мерзлоте, так что работа с мамонтами означала шаг в сторону от моей конечной цели. Но нам нужно было как-то узнать, способна ли в принципе ядерная ДНК пережить 10 или даже 100 тысяч лет. Если мы не найдем ядерные нуклеотиды в замороженных тканях мамонта, то всё, можно прекращать поиски: неандертальцев находят в куда менее благоприятных для сохранения условиях, и ядерная ДНК там уж и подавно не сохранится.
К счастью, я систематически коллекционировал древние кости из разных музеев, так что Алекс смог немедленно опробовать наши идеи на имеющемся материале. Он отобрал зуб мамонта, в котором осталось особенно много мтДНК. Этот зуб выкопали из вечной мерзлоты, когда строили главное шоссе на Аляске, идущее от северо-востока Британской Колумбии до Фэрбенкса. Шоссе строили в страшной спешке во время Второй мировой войны. Зуб нашли, положили в большую коробку и оставили ее в Американском музее естественной истории, там он с тех пор и лежал. Чтобы облегчить работу по выделению ДНК, мы наметили сегмент ядерного генома, содержащего часть гена, известного как 28S рДНК; он кодирует одну из молекул РНК рибосом, органелл, управляющих синтезом белков в клетке. Преимущество этого гена нам виделось в том, что в одной клетке содержалось несколько сотен его реплик. И получалось, что после смерти животного подобных фрагментов оставалось примерно столько же, сколько и мтДНК. К моему великому облегчению и радости, у Алекса получилось амплифицировать этот рибосомальный ген. Он секвенировал размноженные копии из вытяжки мамонта и реконструировал нуклеотидную последовательность этого гена, используя методику перекрывающихся участков. Эту методику мы отработали, еще когда изучали неандертальскую мтДНК. Затем Алекс взялся сравнить полученную последовательность с соответствующими цепочками африканских и индийских слонов, ближайших родственников мамонта. У меня тогда по поводу загрязнений началась прямо-таки паранойя, и я запретил Алексу и вообще кому-то из лаборатории работать с ДНК слонов до тех пор, пока Алекс не получит результат по мамонтам. И вот теперь, выйдя наконец из “чистой комнаты”, Алекс занялся секвенированием гена 28S рДНК слонов, применив тот же праймер, что и для мамонта. И получил ту же последовательность. Соответствующий фрагмент ДНК африканских слонов отличался все же по двум позициям, что говорило о том, что мамонты ближе к индийским, чем к африканским слонам. Мы, конечно, сравнили мамонтов со слонами, но не это являлось целью всей затеи: нам нужно было выделить древнюю ядерную ДНК. Чтобы подтвердить возраст, мы отправили ткань зуба того мамонта на углеродное датирование. И когда в ответном сообщении открылось “14 тысяч лет”, я в первый раз за много месяцев удовлетворенно расслабился. Так мы впервые в истории получили ядерную ДНК позднего плейстоцена.
Вдохновленный результатом, Алекс придумал праймеры для амплификации двух коротких участков фрагмента особого гена, который носит название “ген фактора Виллебранда”; в геноме слона содержится только по одному такому гену. Фактор Виллебранда – его ген записывают как vWF – это белок крови, который помогает тромбоцитам прикрепляться к поврежденным кровеносным сосудам. Мы выбрали именно этот ген, так как его нуклеотидная последовательность как у слонов, так и у многих других млекопитающих уже была известна, и нам оставалось только выделить его из тканей мамонта и сравнить с уже имеющимися, современными. Я глазам не поверил, когда на очередном еженедельном лабораторном обсуждении Алекс показал картинки с полосками в геле, и это было не что иное, как амплифицированные фрагменты гена мамонта. Он повторил эксперимент дважды, каждый раз с заново приготовленными экстрактами из мамонтовой кости. Среди множества клонов, которые он секвенировал, были хорошо видны ошибки в отдельных молекулах ДНК, появляющиеся или из-за химического разрушения древних ДНК, или из-за пристраивания неправильного нуклеотида к цепочке ДНК при ПЦР (рис. 9.1). Но для одной из позиций Алекс заметил интересную закономерность. Он секвенировал в общей сложности тридцать клонов, проведя для каждого три независимые серии ПЦР. В одной из позиций у пятнадцати клонов стояло Ц, у четырнадцати – Т и у одного А. Единственный случай с аденином (А) мы посчитали ошибкой ДНК-полимеризации, но остальная картинка – у меня сердце замерло… Это конкретное место в цепочке являлось тем, что генетики называют гетерозиготной позицией, или, иначе, точечным нуклеотидным полиморфизмом (сокращенно – SNP, СНИП). В этом месте две копии данного гена, полученные от мамы-мамонтихи и папы-мамонта, различались. И нам удалось увидеть самую первую гетерозиготную позицию, СНИП, ледникового периода. То есть мы имели дело с генетикой в чистом виде, с генетикой в действии, если хотите, – вот вам ядерный ген, у которого в популяции встречается два варианта. Дело пошло на лад. Если нам удалось прочитать оба варианта этого гена, тогда, в принципе, остальные части генома тоже могут быть доступны. И таким образом, откроется возможность, по крайней мере теоретически, получать генетическую информацию о видах, вымерших много тысяч лет назад.
Рис. 9.1. Клонированные ДНК последовательности по трем амплификациям фрагмента ядерного гена мамонта возрастом 14 тысяч лет. Стрелка показывает на гетерозиготную позицию, или СНИП, впервые обнаруженную для ДНК из позднего плейстоцена. Из A.D. Greenwood et al. Nuclear DNA sequences from late Pleistocene megafauna. Molecular Biology and Evolution 16, 1466- 1473 (1999)
Чтобы закрепить успех, Алекс отсеквенировал еще два фрагмента генов, имеющих по одной копии в ядре. Один из них кодировал белок, регулирующий выделение нейромедиаторов в мозге, а другой – белок, связывающий витамин А; этот последний вырабатывался палочками и колбочками в глазу. И в обоих случаях у Алекса все превосходно получилось.
Мы так долго бились с ядерной ДНК, что Алексовы результаты с мамонтом были встречены с величайшей радостью, и у меня несколько дней царил прямо праздник на душе. Но… не мамонты интересовали меня, совсем не мамонты. Неандертальцы – вот моя цель, а я точно знал, что в вечной мерзлоте неандертальцев не бывает. Я убедил Алекса вернуться к пещерным медведям и попробовать еще раз материал из Виндии: проверить, не сможем ли мы все же получить ядерную ДНК из остатков, не подвергшихся заморозке.
Он проанализировал мтДНК нескольких пещерных медведей и выбрал кость, в которой, по всей видимости, ДНК содержалось больше всего. Мы сделали ее углеродный анализ – оказалось, 33 тысяч лет, что приблизительно соответствовало возрасту неандертальцев.
Алекс стал работать именно с этой костью. Он попробовал выделить гены рибосомальной РНК – а в геноме множество их копий. И действительно, после амплификации Алексу удалось получить небольшое их количество. Далее он реконструировал последовательность из амплифицированных клонов. И выяснил, что у пещерных медведей она идентична соответствующим нуклеотидным последовательностям современных медведей.
Безусловно, это был успех, но с “ложкой дегтя”. Мы затратили столько усилий на ген с множеством копий в геноме; а что, если речь пойдет о гене, у которого есть только одна копия, например о vWF, с которым Алекс работал на мамонтовом материале? Тогда эксперименты заведомо обречены на провал. Алекс тем не менее попробовал и, как и ожидалось, потерпел неудачу. В глубине души – я никому об этом не рассказывал – я глубоко огорчился результатами экспериментов. Мы показали, что ядерная ДНК способна выдержать более десятка тысяч лет в вечной мерзлоте и что только следы даже самой распространенной ядерной нуклеотидной последовательности обнаруживаются в костях пещерных медведей. Разница между замораживанием и хранением в известняковой пещере была огромной.
В 1999 году мы опубликовали все открытия Алекса в прекрасной, на мой взгляд, работе[42], которую незаслуженно обошли вниманием. Там доказывалось, что ядерная ДНК сохраняется в остатках из вечной мерзлоты и что в ней даже можно выявить гетерозиготную позицию, такую, где две хромосомные копии несут разные варианты нуклеотидных последовательностей. Мы с уверенностью говорили о перспективах генетических исследований остатков из вечной мерзлоты и в конце работы написали: “В отложениях вечной мерзлоты и в других холодных средах находится множество животных остатков. В подобных остатках выявляются не только мтДНК, но и ядерные ДНК-последовательности, причем во многих случаях представленные в геноме единственной копией; это открывает перспективы использования ядерных локусов в филогенетических и популяционных генетических задачах, а также в исследованиях генов, определяющих фенотипические признаки”.
Со временем другие ученые продолжили эти исследования, однако произошло это нескоро, через пять или даже десять лет. Но что еще обиднее, на тот момент казалось, что если только неандертальца не раскопают в вечной мерзлоте, никогда нам не увидеть целого неандертальского генома.