Однажды поздним вечером в 1996 году, когда я уже забрался в кровать и задремывал, вдруг раздался телефонный звонок. Звонил Матиас Крингс, мой аспирант с зоологического факультета Мюнхенского университета. И он сказал: “Это не человек”.
“Еду…” – пробормотал я, натягивая штаны по дороге к машине. И поехал через город в лабораторию. В тот день Матиас зарядил наш секвенатор фрагментами ДНК из крохотного кусочка плечевой кости неандертальца. Кость досталась нам из Рейнского краеведческого музея в Бонне, именно из нее удалось извлечь ДНК и потом размножить ее. Годы разочарований научили меня не ожидать больших чудес. Обычно мы получали бактериальную или человеческую ДНК – то, что вобрали кости за 140 лет музейного хранения. Но Матиас был так возбужден… может, все же попались неандертальские гены? Лучше уж не надеяться.
В лаборатории сидели Матиас с Ральфом Шмитцем, молодым археологом, который помог нам раздобыть в Бонне разрешение взять кусочек от музейного экспоната. Они едва сдерживали восторг, показывая выползающую из секвенатора последовательность из А-Ц-Г-Т. Никто из нас в жизни такой не видел!
То, что непосвященному кажется случайной комбинацией из четырех букв, на самом деле сжатая запись химической структуры ДНК, генетического материала, который хранится почти во всех клетках тела. Две нити знаменитой двойной спирали ДНК составлены из блоков, содержащих нуклеотиды – аденин, тимин, гуанин и цитозин. Они записываются аббревиатурами А, Т, Г и Ц. Важен порядок, в котором эти нуклеотиды следуют один за другим, в нем содержится вся генетическая информация, необходимая для формирования организма и его функционирования. Нам нужна была определенная часть ДНК, а точнее, часть митохондриальной ДНК (мтДНК). Это, если кратко, то, что передается через материнскую яйцеклетку всем потомкам. В митохондриях, крошечных клеточных органеллах, хранятся бесчисленные копии этой ДНК. Они служат одной только насущнейшей цели – помочь митохондриям снабжать клетку энергией. Каждый из нас несет только один тип мтДНК, составляющей примерно 0,0005 всего генома. Но так как в каждой клетке содержатся тысячи однотипных копий, то их относительно легко изучать, не в пример ядерному геному – он в каждой клетке представлен лишь двумя копиями, одной от мамы, а другой от папы. К 1996 году уже были изучены мтДНК тысяч людей со всего мира. Обычно эти последовательности сравнивались с эталонной (эталонной, или референсной, считается та, что была определена первой). В результате множественных сравнений составился список отличий – в каких позициях какие нуклеотиды различаются. И вот что нас привело в восторг – отличия из неандертальской кости не были похожи ни на одно из известных для человека. Я с трудом верил в реальность происходящего.
Столкнувшись с чем-то заманчивым и неожиданным, я всегда начинаю сомневаться. Так и тут: я стал искать, где мы могли ошибиться. Может, к примеру, мы взяли клей, изготовленный из коровьих костей, и теперь умиляемся коровьей ДНК. Но нет, мы сразу же проверили – это не она, а совсем другая (последовательность коровьей ДНК уже была известна). Эта новая последовательность ДНК очень походила на человеческую, но все же отличалась от всех известных доныне. И я начал проникаться мыслью, что это и вправду первый кусочек ДНК, извлеченный из останков вымерших людей.
Мы открыли бутылку шампанского, которая хранилась у нас в холодильнике в обеденной комнате. Все понимали, что если это действительно неандертальская ДНК, то перед нами открываются необъятные возможности. Вероятно, в один прекрасный день мы сможем сравнить какой-нибудь целый (!) неандертальский ген с современным человеческим. И я думал и думал об этом, бредя домой по темным улицам Мюнхена (мы выпили слишком много шампанского, и я не мог сесть за руль). И уснуть я не мог, мысли мои раз за разом возвращались к неандертальцам – и к тому единственному, чью ДНК мы, кажется, поймали.
В 1856 году, за три года до публикации дарвиновского “Происхождения видов”, при расчистке небольшой пещеры в каменоломне в долине Неандерталь, примерно в семи милях от Дюссельдорфа, рабочие нашли верхнюю часть черепа и несколько костей. Они думали, что откопали кости медведя. Но через несколько лет эти остатки переопределили; решено было, что это вымершая, возможно предковая, форма человека. Так впервые были описаны остатки древних людей, и эта находка потрясла весь ученый мир. С тех пор исследования неандертальцев не прекращались. Кроме тех первых, нашли еще множество костей, с их помощью решались самые разные вопросы: кто такие неандертальцы, как они жили, почему исчезли около 30 тысяч лет назад, как в течение тысячелетий уживались на одной территории в Европе предшественники современных людей и неандертальцы – дружили или воевали? – и кем они нам, в конце концов, приходились, прямыми предками или просто давно умершими дальними родственниками (см. рис. 1.1). Со всей очевидностью бросаются в глаза свидетельства их вполне человеческого, понятного нам поведения и ритуалов: они и ухаживали за ранеными, и хоронили своих мертвых, и, возможно, даже играли музыку (есть на то кое-какие археологические данные). Во всем этом они больше напоминают нас, чем любую из современных обезьян. Но если больше, то насколько? Была ли у них речь? Или они представляют тупиковую линию в эволюции людей? А может, какие-то из их генов спрятаны в нас сегодняшних? Все эти вопросы вошли естественной частью в науку палеоантропологию, дисциплину, можно сказать стартовавшую от тех костей из долины Неандерталь, из которых мы теперь, кажется, смогли извлечь ДНК.
Каждый из этих вопросов достоин пристальнейшего внимания, но мне казалось, что с этим фрагментом ДНК нас ждет награда куда более ценная. Ведь неандертальцы – наши ближайшие вымершие родственники. И если бы удалось изучить их ДНК, то непременно бы выяснилось, в какой степени схожи наши гены. Несколько лет назад в нашей лаборатории отсеквенировали большое число фрагментов ДНК шимпанзе. И тогда мы показали, что у человека и шимпанзе различаются чуть больше одного процента нуклеотидов. Ясно, что неандертальцы должны отличаться от нас еще меньше. Но – и самое восхитительное “но” – именно среди этих немногих различий обязаны объявиться те, что отделяют нас от наших ранних предшественников. И не только от неандертальца, но и от мальчика из Туркана, жившего около 1,6 млн лет назад, и от Люси, возрастом около 3,2 млн лет, и от синантропа, которому около полумиллиона лет. Благодаря этим немногим различиям человеческая линия свернула на совершенно новый эволюционный курс: ускоренное технологическое развитие, появление искусства, возможно языка и культуры, как мы их теперь понимаем. Десяток-другой различий в ДНК создали для всего этого необходимую биологическую базу. И если мы сможем изучить неандертальскую ДНК, то все это само придет нам в руки. Убаюканный мечтами (или манией величия), я наконец заснул на рассвете.
Рис. 1.1. Реконструкция скелета неандертальца (слева) и современного человека (справа). С разрешения К. Моубрей, Б. Моли, Я. Татерсол, Г. Соер. Американский музей естественной истории
На следующий день и я, и Матиас опоздали в лабораторию. Мы, естественно, перепроверили вчерашнюю последовательность. Нужно было убедиться, что тут нет ошибок. А потом мы сели и стали думать, как нам дальше поступить. Ведь одно дело – выделить из неандертальских останков один небольшой интересный кусочек мтДНК, но совершенно другое – убедить себя (хотя бы себя, об остальном человечестве речь пока не шла), что эта ДНК принадлежит индивидууму, жившему 40 тысяч лет назад. Предыдущие двенадцать лет работы довольно точно определяли наши дальнейшие действия. Сначала нужно повторить эксперимент. И не просто самый последний его этап, но все с самого начала, с высверливания кусочка кости. Ведь есть вероятность, что мы обманулись случайно попорченной и видоизмененной человеческой мтДНК из этой кости. Затем нужно удлинить этот фрагмент последовательности мтДНК с помощью других фрагментов, которые с ним перекрываются. За счет этого у нас появится возможность реконструировать относительно длинные участки последовательности. И уже с них начнется выяснение, насколько неандертальская мтДНК отличается от сегодняшней человеческой. И только потом приступить к третьему, важнейшему этапу. Я сам часто говорил, что результаты, из ряда вон выходящие, требуют столь же тщательных, из ряда вон выходящих проверок – а именно повторения их в других независимых лабораториях. Что совершенно нетипично для нашего насквозь конкурентного научного мира.
А заявление насчет прочтения неандертальской ДНК будет, безусловно, сочтено как раз таким, из ряда вон выходящим. Так что если мы хотим исключить возможные лабораторные ошибки, то придется отдать кусочек драгоценной неандертальской кости в какую-то независимую лабораторию и молиться, чтобы там получили те же результаты. Мы сидели и говорили обо всем этом с Матиасом и Ральфом. Прикинув план работ, мы поклялись держать все в строжайшей тайне. Не стоит привлекать к себе внимание, пока не уверимся, что все в точности так, как мы думаем.
Матиас сразу же ударился в работу. Промаявшись почти три года в тщетных попытках извлечь ДНК из египетских мумий, он воодушевился перспективой успеха. Ральф должен был вернуться в Бонн и ужасно из-за этого переживал; там он ничего не мог делать, только сидеть сложа руки и с горячим нетерпением ждать от нас весточки. Я пытался сосредоточиться на своих собственных проектах, но мне с огромным трудом удавалось отвлечься от Матиасовых занятий.
А Матиасу приходилось нелегко. Ведь мы работали не с теми чистенькими образцовыми препаратами, какие получаются из образцов крови или тканей живых индивидов. Из учебников мы привыкли к виду аккуратной двойной спирали ДНК, в которой чередой идут друг за дружкой нуклеотиды АТГЦ, соединенные попарно – аденин с тимином и гуанин с цитозином – и пристегнутые к остову из сахара и фосфата. Но на самом деле в клеточном ядре или в митохондриях ДНК все время в движении, ее химическая структура не статична. Напротив, ее упорядоченная организация то и дело нарушается, повреждения хитрыми способами отслеживаются и исправляются. Вдобавок молекула ДНК ужасно длинная. Каждая хромосома представляет собой одну громадную молекулу. В комплекте из 23 хромосом человека собраны в сумме около 3,2 миллиарда нуклеотидов. Так как в ядре у нас два таких комплекта – один от отца, другой от матери, и в каждом по 23 хромосомы, – то всего получается 6,4 миллиарда нуклеотидов (или лучше пар нуклеотидов, так как спираль двойная). По сравнению с ядерной митохондриальная ДНК ничтожна, всего 16 500 пар нуклеотидов. Но и это число велико. Кроме того, не будем забывать, что ДНК нам попалась древняя, а не современная, и как с ней работать, неизвестно.
Самый распространенный тип повреждений ДНК как ядерной, так и митохондриальной – это потеря одной из химических составляющих у цитозина. Цитозин, избавившись от аминогруппы, превращается в урацил (У), другой нуклеотид, который никогда не встречается в природных ДНК. В клетках имеются особые ферментные системы, убирающие урацил и возвращающие цитозин на место. Вырезанные урацилы отправляются на клеточную свалку.
Между прочим, по числу дефектных нуклеотидов в анализах мочи подсчитано, что в каждой клетке ежедневно примерно 10 тысяч цитозинов превращаются в урацилы и затем возвращаются в исходную форму. И это лишь одна из десятка обычных химических опасностей, которые подстерегают наш геном. Например, нуклеотид может выпасть, получается пустое место, по которому происходит разрыв нитей двойной молекулы ДНК. С этой напастью сражаются специальные ферменты, которые вставляют нуклеотиды на место; им нужно успеть до того, как нити разойдутся. А если все же это произошло, то в бой вступают другие ферменты – их задача вновь соединить разошедшиеся нити. В действительности хватит и часа, чтобы клеточный геном изменился, не будь эти ремонтные бригады постоянно на страже.
Для бесперебойной работы ремонтных (или репарационных) систем, понятное дело, необходима энергия. Но после смерти, когда останавливается дыхание, в клетках быстро заканчивается кислород и, соответственно, энергетическая подпитка. В результате система репарации прекращает работу, и начинают накапливаться всевозможные повреждения. К повреждениям, происходящим в живой клетке, добавляются еще и спонтанные посмертные изменения молекул, связанные с процессами разложения. В живой клетке все ферменты и другие вещества содержатся отдельно друг от друга, каждое в предназначенном ему клеточном участке, компартменте. Поддержание компартментов в порядке – это одна из ключевых функций клетки. В одних отделах сконцентрированы ферменты, способные разрезать нить ДНК, они вступают в действие на некоторых этапах репарации. Другие отделы содержат ферменты, которые измельчают ДНК микроорганизмов, так или иначе попадающих в клетку. А когда организм умирает и перестает вырабатывать энергию, эти клеточные компартменты смешиваются, мембраны растворяются, ферменты вытекают наружу и разлагают ДНК каждый своим порядком. За какие-нибудь часы или дни нити ДНК разрезаются, дробятся на кусочки, все более и более мелкие по мере течения времени. Тут же начинают безудержно расти бактерии – обитатели наших кишок и легких, ведь тело потеряло способность контролировать их размножение. И в конце концов хранившаяся в молекулах ДНК генетическая информация растворяется, та информация, которая некогда сформировала наше тело, поддерживала его, заставляла действовать. И когда этот процесс завершается, уходят последние следы нашей биологической индивидуальности. В некотором смысле так заканчивается процесс физической смерти.
Но вспомним: практически каждая из триллионов клеток тела содержит полный комплект индивидуальной ДНК. Поэтому даже если в одних клетках ДНК полностью исчезнет, то в других, запрятанных в укромных тайниках тела, могут и сохраниться кое-какие генетические следы. К примеру, любые процессы разложения идут в присутствии воды. А если какой-то участок тела высохнет, не дожидаясь полного разложения ДНК? Тогда разрушение ДНК остановится, и отдельные фрагменты могут законсервироваться. Так происходит, если тело оказывается в сухом месте и мумифицируется. Тело может высохнуть случайно – мало ли, где настигает смерть, – или же труп подвергается намеренному обезвоживанию. Более всего этим знаменит Древний Египет, где примерно от 5000 до 1500 лет назад тела сотен тысяч умерших подвергались ритуальной мумификации, чтобы их души и после смерти имели пристанище.
Пусть даже никакой мумификации не происходит, но некоторые части тела, такие как зубы и кости, продолжают существовать еще долго после захоронения. Живые клетки в этих твердых тканях устроены в крошечных полостях минеральной матрицы; без живых клеток не было бы никакой возможности наращивать новую костную ткань, например при переломах.
Когда костная клетка умирает и ее содержимое растекается, то ДНК может связаться с минеральной основой. Минеральные комплексы обеспечивают химическую защиту молекулам ДНК. И за счет этого некоторой части ДНК может посчастливиться избежать немедленного разрушения.
Предположим, что часть ДНК пережила посмертный телесный хаос. Но есть и другие процессы, которые набрасываются на генетическую молекулу, действуя, правда, гораздо медленнее. Отнесем к ним фоновую космическую радиацию, постоянно создающую активные радикалы, трансформирующие и разрушающие ДНК. И другие химические процессы, идущие в присутствии воды – такие как превращение Ц в У, – как мы уже знаем, не останавливаются при высушивании. В огромной ДНК всегда присутствуют молекулы воды, пристроенные между двумя нитями, потому что составляющие нитей имеют сильное сродство, афинность, с водой.
Эти молекулы воды вступают в самопроизвольные водозависимые реакции. Самая быстрая из таких реакций – деаминация, потеря аминогруппы цитозином. В результате этой реакции – и не только этой, но и многих других, пока еще не расшифрованных, – молекула ДНК дестабилизируется, и нити рвутся. Так что мало опустошения, какое производит смерть в генетическом хозяйстве, ДНК продолжает убывать и дробиться, даже если удалось пережить клеточную смерть. Понятно, что темпы утраты генетической информации зависят от многих факторов: от температуры, кислотности и прочего. Но даже при самом благоприятном стечении обстоятельств генетическая программа, которая строила шаг за шагом свой персонаж, в конце концов разрушается и исчезает. Получается, что нам с коллегами удалось захватить еще не завершенный процесс деградации неандертальской ДНК: за 40 тысяч лет природные силы еще не до конца справились со своей разрушительной задачей.
Матиас прочитал кусочек последовательности мтДНК длиной в 61 нуклеотид. Для этого он должен был произвести манипуляцию, которая называется “полимеразная цепная реакция” (ПЦР). Чтобы подтвердить результат, он начал с нее, повторив в точности все свои действия шаг за шагом. Для начала ему понадобились так называемые праймеры, два искусственных коротких кусочка ДНК. Они были нарочно так сконструированы, чтобы связываться с одним из концов конкретного отрезка мтДНК, того самого, длиной в 61 нуклеотид. Раствор праймеров смешивался с ничтожным количеством ДНК из кости, и в смесь добавлялась ДНК-полимераза.
Этот фермент синтезирует новую нить ДНК, комплементарно пристраивая нуклеотиды к уже имеющимся нитям, ограниченным двумя праймерами, каждый со своей стороны. Смесь сначала подогревается, чтобы сдвоенные нити разъединились. Праймеры находят на одиночных нитях комплементарные себе участки и по мере охлаждения смеси связываются с ними: А с Т, а Г с Ц.
Необходимые ферменты затем находят праймеры и, отталкиваясь от них, достраивают нуклеотид за нуклеотидом две комплементарные цепочки, одну на первой из разъединившихся нитей, вторую – на второй. И тогда получается уже четыре нити. Четыре нити из костей неандертальца. И этот процесс размножения нитей, или амплификации, повторяется – и вот уже имеем 8 нитей, а затем и 16, и 32 и так далее. Всего можно производить тридцать-сорок циклов дупликации нитей.
Эта простая и изящная методика, предложенная в 1983 году независимым исследователем Кэри Муллисом, работает чрезвычайно мощно. Из одного-единственного фрагмента ДНК за сорок циклов дупликации можно в принципе получить около триллиона его копий. И это именно то, с чем мы работаем, так что, на мой взгляд, Муллис определенно заслужил свою Нобелевскую премию по химии, которой его наградили в 1993 году. Однако исключительная чувствительность ПЦР оборачивается против нас. В вытяжках из древней кости, где, как мы надеемся, имеется несколько выживших древних молекул (а может, и не имеется), болтается и немалое число молекул ДНК от современных людей. Это загрязнения, сопровождающие эксперимент, – из реактивов, из лабораторной посуды, из воздушной пыли. Пылинки, летающие по комнате, где живут и работают люди, это большей частью частички человеческой кожи. И они, понятное дело, содержат клетки с полным набором ДНК. Также человеческая ДНК попадает в образец, когда человеческие руки извлекают его из земли или берут для музейного изучения. Поэтому мы и решили поискать в древних костях необычный фрагмент мтДНК, а именно такой, который у людей сильно варьирует. Такой, что если мы получим после ПЦР неоднородный набор фрагментов, то это должно насторожить нас: ага, тут ДНК от нескольких индивидов, а не единственного, ископаемого; значит, что-то мы упустили (или, скорее, набрали лишнего). Но мы-то обнаружили такой фрагмент, которого никогда ни у кого из современных людей не находили! Нам было от чего возликовать. Если бы мы увидели последовательность, зарегистрированную у современных людей, мы бы никогда не смогли сказать, откуда она взялась. Может, от древнего неандертальца, если у него она была похожа на нашу современную, а может, от какого-то прохожего, залетела в наш эксперимент с частичкой пыли.
К тому времени я был отлично знаком с загрязнениями. В течение двенадцати лет я анализировал древнюю ДНК из вымерших млекопитающих – пещерных медведей, мамонтов, гигантских ленивцев. Раз за разом получая унылые результаты (практически во всех костях после ПЦР я обнаруживал человеческую мтДНК), я обдумывал и изобретал способы, как уменьшить загрязнение. Поэтому Матиас выполнял все приготовительные к ПЦР операции (обработка образцов, вытяжки и все такое – вплоть до первого нагревания смеси) в особой комнатке, сверхчистой, отделенной с абсолютной надежностью от остальных лабораторных помещений. А когда древняя ДНК вместе с праймерами и другими необходимыми для ПЦР компонентами наливались в пробирку, пробирка запечатывалась, ее относили в лабораторию и там уже с ней дальше работали. В “чистой комнате” раз в неделю все поверхности мыли хлоркой и каждую ночь включали ультрафиолет, чтобы разрушить всю занесенную с пылью ДНК. Чтобы туда зайти, нужно было в специальном предбаннике облачиться в защитную робу, надеть на лицо маску, на волосы специальную шапочку, на руки перчатки. Это проделывал и Матиас, и любой, кто работал в “чистой комнате”. Все реактивы и инструменты доставлялись прямо в эту комнату, минуя любые другие институтские помещения. Если кто должен был здесь работать, то здесь же и должен был начаться его день. Раз выйдя (за какой угодно надобностью), вернуться уже было нельзя, ведь мы в лаборатории анализировали огромное количество разнообразных ДНК, и их можно ненароком занести в “чистую комнату”. Мягко выражаясь, у меня развилась паранойя на почве загрязнений, и тому, честно, были причины.
И даже со всеми предосторожностями в тех первых экспериментах нашлись следы загрязнений. После ПЦР всю полученную из кости партию ДНК – а это были предположительно однотипные фрагменты из 61 нуклеотида – Матиас клонировал в бактериальных носителях. Это делалось для того, чтобы проверить, действительно ли получился только один тип фрагментов или там их несколько. В бактерию с помощью специального носителя – плазмиды – встраивался один 61– нуклеотидный фрагмент, в другую бактерию следущий, в третью бактерию следующий далее и т. д. Затем бактерии размножались, и вместе с ними клонировались и встроенные фрагменты ДНК. Таким образом, отсеквенировав ДНК бактерий из выросших колоний, можно было увидеть, какие типы ДНК присутствовали в полученной от ПЦР партии фрагментов. В самых первых Матиасовых эспериментах мы получили 17 колоний с идентичными фрагментами, которые при этом отличались от всех двух тысяч с хвостиком доселе известных современных. И вдобавок к ним еще один фрагмент, которому нашлось соответствие среди этих двух тысяч. Так что загрязнение все-таки было, возможно, от музейных работников, а возможно, от других людей, через чьи руки прошел образец за 140 лет изучения.
Поэтому первым делом Матиас повторил ПЦР и клонирование. На этот раз он выявил 10 клонов с одним и тем же фрагментом, тем самым, выстраданным нами, и еще два других, которые, похоже, произошли от современных людей. Потом Матиас взял другой костный кусочек, сделал из него новую вытяжку, снова провел ПЦР и снова клонировал всю партию в бактериях. И получилось 10 колоний с нашим уникальным фрагментом мтДНК и 4 лишних, современных. И вот тут мы с удовлетворением решили: всё, наш результат прошел первую проверку, мы можем повторять все операции и получать каждый раз ту самую необычную последовательность ДНК.
Матиас приступил к “проходке” вдоль ДНК. Для этого он использовал другие праймеры. Такие, которые строили отрезки ДНК, частично перекрывающиеся с нашим первым, но и удлиняющие его по нити мтДНК (см. рис. 1.2). И снова мы увидели, что в некоторых из этих фрагментов отклонения в ДНК ни на какие современные не похожи. За несколько следующих месяцев Матиас получил 13 кусочков ДНК разной длины, повторив все опыты по меньшей мере дважды. По ходу дела мы встретились с естественными трудностями интерпретации – а что делать, если любая молекула ДНК подвержена мутациям. И причины мутаций могли быть самыми разнообразными: и древние химические модификации, и ошибки секвенирования, и редкие, но все же встречающиеся вариации мтДНК в клетках одного индивидуума. Тут помогла тактика, которую я придумал, еще работая с древней ДНК животных (см. снова рис. 1.2). Для каждой позиции мы принимали за норму такой нуклеотид (А, Т, Г или Ц), который встречается в этой позиции чаще всего во всех размноженных (амплифицированных) и прочтенных последовательностях. Также мы ввели требование, чтобы нуклеотид, стоящий в определенной позиции, был найден по крайней мере в двух независимых повторах. Это было нужно, потому что в некоторых случаях, крайне редких, ПЦР может стартовать только с одной нити. И тогда, в результате подобной ошибки в ПЦР или нарушения в самой ДНК, будут амплифицироваться только клоны этой одной нити, но не комплементарной ей, и в итоге все нуклеотиды конкретной позиции будут совершенно одинаковы. Если в двух экспериментах ПЦР давали разные результаты, то мы повторяли эксперимент третий раз и смотрели, какой из вариантов с ним сойдется. Матиас получил в результате 123 последовательности и затем, прикладывая один кусочек к другому, сложил эту мозаику в участок длиной в 379 нуклеотидов. И это был тот самый изменчивый участок мтДНК. С учетом наших критериев правдоподобия нуклеотидных позиций это был тот самый кусочек ДНК, который некогда работал в живом неандертальце (или неандерталке). Собрав длинный отрезок “нашей” ДНК, мы подобрались к самой волнующей части – к сравнению его с аналогичными современными человеческими фрагментами.
И вот мы сравниваем наш 379– нуклеотидный участок неандертальской мтДНК с аналогичными участками у 2051 современного человека со всего света. И находим, что неандертальская ДНК отличается от каждой из современных в среднем в 28 позициях. А ДНК современных людей отличаются друг от друга в среднем семью нуклеотидами (речь идет, естественно, об одном конкретном участке мтДНК). Получается, что неандертальские различия вчетверо больше современной вариабельности.
Затем мы посмотрели – вдруг имеются какие-то указания на большее сродство неандертальской ДНК к современной европейской? Такое вполне могло бы быть, потому что эволюция неандертальцев была сосредоточена на территории Европы и Западной Азии. И некоторые палеонтологи убеждены, что европейцы своим происхождением обязаны именно неандертальцам. Чтобы понять, так ли это, мы сравнили неандертальскую последовательность отдельно с европейскими вариантами (у нас было 510 европейских последовательностей), азиатскими (478) и африканскими (494). Среднее число различий со всеми тремя группами оказалось одинаковым – по 28 нуклеотидов. Это означало, что европейская мтДНК отличается от неандертальской ровно настолько же, насколько африканская и азиатская. Тогда мы подумали: возможно, среди европейской выборки найдутся отдельные индивиды, у которых мтДНК больше других похожа на неандертальскую; подобные отклонения могли бы проявиться, передай неандертальцы европейцам свои митохондриальные гены. Проверили и эту гипотезу: самые похожие последовательности имели “всего” 23 отличия против средних 28. В африканской и азиатской выборках такие же отклонения в сторону неандертальцев составили 22 и 23 нуклеотида соответственно. В итоге мы, во-первых, выяснили, что неандертальская мтДНК резко отличается от современной во всех частях света, во-вторых, не обнаружили никаких свидетельств какой-то особой связи между европейцами и неандертальцами.
Рис. 1.2. Реконструкция участка мтДНК, извлеченного из кости неандертальца, ти пового образца из долины Неандерталь. Верхняя строчка – соответствующая эталонная последовательность современного человека. Каждая нижеследующая строчка – это один амплифицированный фрагмент из неандертальского образца. В тех позициях, где современные и древние нуклеотиды не отличаются, я поставил точки; там, где различия нашлись, я их указал. Самая нижняя строчка – это то, что получилось после наложения фрагментов друг на друга.
Наши требования к определению “особых” нуклеотидов соблюдались строго: нуклеотид должен был найтись в конкретной позиции в двух независимых экспериментах и отличаться от эталонной последовательности в большинстве полученных фрагментов. Из: Matthias Krings et al. Neandertal DNA sequences and the origin of modern humans. Cell 90, 19–30 (1997).
Понятно, что, занимаясь простым подсчетом различий, мало что поймешь об истории той или иной области ДНК. Найденные различия представляют собой мутации, имевшие место в эволюционном прошлом. Но, как мы знаем, некоторые типы мутаций случаются чаще других, и в одних позициях нуклеотиды больше склонны к мутированию, чем в других. В таких позициях могут происходить не одна и не две мутации, особенно если речь идет о частых видах мутаций.
Поэтому, чтобы представить ход трансформации конкретного участка ДНК, нужно составить модели мутирования для каждой позиции; в особенности тех, что мутировали, как мы предполагаем, не единожды, затирая предыдущие нуклеотидные варианты. В результате такого моделирования вырисовывается дерево, его конечные веточки представляют собой последовательности ДНК, которые сходятся к определенной предковой последовательности.
Предковые последовательности – это точки схождения отдельных веточек (рис. 1.3). Проделав эту процедуру с ДНК современных людей, мы увидели, что все они собираются к одной точке, к одному общему предку.
В принципе подобного результата мы и ожидали, еще в восьмидесятых он был получен Аланом Уилсоном. Ведь каждый из нас несет только один тип мтДНК и не может обмениваться с другими членами популяции участками этой ДНК. Митохондриальная ДНК передается нам только от матери, поэтому те матери, у которых нет дочерей, не смогут передать свою мтДНК по наследству. И тогда ее мтДНК исчезнет из популяции. Поэтому в каждом поколении некоторые линии мтДНК изымаются из оборота. Следовательно, в какой-то момент должна была существовать женщина – ее называют митохондриальной Евой, – которая несла ту единственную мтДНК, которая не вымерла и по мере своей истории мутировала, изменялась, давая начало другим линиям мтДНК, существующим у современных людей. Тут срабатывает простая вероятность – все линии вымерли, а одна какая-то осталась.
Рис. 1.3. Дерево мтДНК, показывающее предковые линии современных людей; все они сходятся к митохондриальной Еве (отмечено кружком), жившей до общего митохондриального предка с неандертальцами. Порядок ветвления дерева выведен на основе сортировки различий в мтДНК, числа в точках ветвления показывают статистическую вероятность того, что реконструкция данного узла верна. Из: Matthias Krings et al. Neandertal DNA sequences and the origin of modern humans. Cell, 90, 19–30 (1997) с изменениями.
По нашим расчетам выходило, что неандертальская мтДНК не соединялась с линией митохондриальной Евы. Неандертальская линия уходила в прошлое дальше нашей общей митохондриальной праматери. Этот вывод обрадовал нас несказанно! Еще бы, ведь он доказывал, что мы не ошиблись и, вне всяких сомнений, имеем дело с неандертальской ДНК. И потом, из него явствовало, что мы с неандертальцами (по крайней мере, наши с ними ДНК) глубоко различны.
С помощью моделей нам с коллегами удалось подсчитать, как давно жил носитель предковой мтДНК, объединяющей нас и неандертальцев. В общем случае число различий между двумя независимо существующими линиями мтДНК указывает, сколько потребовалось поколений, чтобы эти различия накопились. Если скорость мутирования известна и принимается постоянной, то число различий пересчитывается на количество поколений и, соответственно, на время. Конечно, в далеких группах животных, например у мышей и обезьян, скорость мутирования сильно разнится. Но у близких групп, таких как люди, неандертальцы и человекообразные обезьяны, скорость мутирования более или менее одинакова. Поэтому такие расчеты времени жизни последнего общего предка неандертальцев и людей (точнее, их мтДНК) вполне реальны. По нашим данным и моделям получилось, что мт-предок всех современных людей (то есть митохондриальная Ева) жила примерно 100–200 тысяч лет назад, как и было прежде подсчитано Аланом Уилсоном и его соавторами. А общий предок, а точнее прародительница, давшая начало и неандертальской последовательности, и всем современным, существовала примерно 500 тысяч лет назад. Иными словами, она старше митохондриальной Евы, праматери современного человечества, в три-четыре раза.
Чудесно! Наконец-то я окончательно убедился, что мы прочитали кусочек именно неандертальской ДНК, которая решительно отличалась от человеческой. Но теперь, чтобы опубликовать результаты, нам предстояло преодолеть третий барьер. Мы должны были найти независимую лабораторию, которая повторила бы наши результаты. Не обязательно было проверять всю последовательность целиком, достаточно было прочитать часть ее, но такую, которая бы содержала одну или несколько нуклеотидных замен, отличающих неандертальца от нас. Так или иначе, необходимо было, чтобы независимые эксперты доказали, что мы имеем дело не со странной химерой, обосновавшейся где-то в нашей лаборатории, а с настоящей ДНК из древней кости. Но к кому обратиться? Это такой тонкий вопрос…
Конечно, многие без раздумий согласились бы принять участие в подобном потенциально высокорейтинговом проекте. Но что, если в выбранной лаборатории не будет приличной технологии очистки от загрязнений, что, если они плохо знакомы с нашими методиками? У них же тогда никакая древняя ДНК не выделится и не размножится. В этом случае наши результаты будут считаться невоспроизводимыми, а значит, публиковать их нельзя. Ни в одной лаборатории, насколько я знал, не работали в таком режиме стерильности, как у нас, но все же мы остановились на группе Марка Стоункинга, специалиста по популяционной генетике в Пенсильванском университете. Я с ним познакомился в восьмидесятых в Беркли, когда работал после аспирантуры, он тоже там проходил стажировку после аспирантуры у Алана Уилсона.
Марк Стоункинг был среди первооткрывателей митохондриальной Евы, он участвовал в разработке гипотезы “из Африки”. Согласно этой гипотезе люди современного типа появились в Африке 100–200 тысяч лет назад и оттуда распространились по всему миру, заместив все другие формы людей, например неандертальцев в Европе, без всякого перемешивания. Я уважал в нем проницательность и честность, к тому же с ним легко было иметь дело. А еще у него была аспирантка Энн Стоун, серьезная и целеустремленная девушка, которая раньше, в 1992–1993 годах, работала у нас в лаборатории. Она изучала мтДНК из скелетных остатков индейцев, поэтому, безусловно, была знакома с нашими методами. Если кто и сможет повторить наши эксперименты, как мне виделось, то это она.
Я связался с Марком. Как я и думал, и он, и Энн с радостью согласились попробовать, и мы разделили последний костный кусочек, переданный нам Ральфом. Сообщили Марку и Энн, какой фрагмент мтДНК они должны попытаться размножить (амплифицировать) – такой, чтобы уж точно попасть хотя бы на одну, но характернейшую неандертальскую замену. Но больше ничего им не послали – ни праймеров, ни реагентов. Только кусочек кости в запечатанной пробирке, которую не открывали с самого Бонна. Такие предосторожности сводили к минимуму вероятность переноса загрязнения из нашей лаборатории в их. И конечно, мы не сказали, в какой позиции должна найтись замена: не потому, что я не доверял Марку и Энн, а потому, что хотел подстраховаться даже от бессознательной подгонки результата. Короче, Энн должна была синтезировать праймеры и все прочее сама, ничего не зная о конечном результате.
Так что, отправив быстрой почтой пробирку с косточкой, нам оставалось только ждать. Обычно на такого рода эксперименты уходит много времени, больше, чем рассчитываешь.
То праймеры вовремя не подвезут, то реактив окажется “грязным”, с человеческой ДНК, или лаборант заболевает как раз в день эксперимента, когда он должен загрузить секвенатор самыми важными образцами. Нам казалось, что мы ждали вечность. Но вот как-то вечером раздался звонок из Пенсильвании. Это была Энн. Я сразу по голосу понял, что новости не отрадные. Она нашла 15 различных вариантов того самого участка ДНК, который мы ей задали.
Но все они были современные. Какое сокрушительное поражение!
Что не так? Неужели нам попалась какая-то шальная современная ДНК? Я не мог в это поверить. Если наш вариант от какого-то современного животного, то почему он так близок к человеческому? А если это все же какой-то современный человек, то очень уж странный – по ДНК у него в четыре раза больше отличий от остального человечества, чем у всех других людей между собой. А может, это какая-то старая ДНК, в которой определенные позиции особо подвержены химическим атакам неизвестной природы? Но в этом случае мы бы получили нечто похожее на современную ДНК с дополнительными изменениями и у нас бы не вышло по этой ДНК филогенетическое дерево со сколько-нибудь внятными разветвлениями. И к тому же в этом случае Энн получила бы ту же последовательность, что и мы. Вероятно все же, что у Энн в экстрактах оказалось гораздо больше загрязнений, чем у нас, и они заглушили слабый молекулярный сигнал неандертальской ДНК – это единственное логичное объяснение, какое приходило мне в голову. И что тогда делать? К Ральфу за новыми костными образцами мы больше не могли обращаться: с таким исключительно ценным материалом нужно работать наверняка, а у нас неизвестно что получится, если в этот раз мы потерпели неудачу.
И мы вот как подумали. Пусть у Энн в образцах больше загрязнений, но если она отсеквенирует тысячи молекул, то среди них найдутся и очень редкие варианты, похожие на наши. Мы, пока суд да дело, провели эксперименты и подсчитали, что наши ПЦР мы начинали с 50 молекул мтДНК. Для сравнения: пылевые частицы, которые могут быть источником загрязнений, содержат десятки, а то и сотни тысяч молекул мтДНК. Ясно, что подобная “поисковая” экспедиция с огромной вероятностью грозит обернуться неудачей.
Я обговорил эти проблемы с Матиасом. А потом мы обсудили ситуацию на лабораторном совещании, где присутствовали все посвященные в тонкости выделения древних ДНК. Я считаю подобные расширенные совещания исключительно полезными, за время своей работы я не раз убеждался в этом. Нашими удачами в поворотные моменты исследований мы обязаны именно таким собраниям. На этих встречах неожиданно рождаются идеи, которые никогда бы не пришли в голову, целиком занятую одной задачей. К тому же часто бывает, что ученый, влюбленный в свою тему или погруженный по уши в текущий проект, должен, так сказать, встретиться с реальностью, рассказать вслух и защитить свои идеи, иначе можно легко принять желаемое за действительное. Зачастую на таких совещаниях я выступаю как модератор, направляя разговор и отмечая стоящие предложения.
Вот и тогда на нашей рабочей встрече выработался план. Мы решили, что попросим Энн использовать праймеры, которые не подходят к современным ДНК, зато подошли бы к гипотетическому неандертальскому фрагменту: последний нуклеотид в последовательности праймера должен быть специфически “неандертальским”. С такого праймера современная ДНК будет стартовать и амплифицироваться с трудом, зато, найдись там неандертальская последовательность, вероятность выловить ее здорово повышается! Мы все обсудили, в особенности можно ли будет считать работу Энн независимым исследованием, ведь она будет искать с нашей подсказкой. Конечно, если бы у Энн все получилось само собой, без всякой предварительной информации, то это было бы просто превосходно. Но ведь мы собирались раскрыть ей для синтеза праймеров всего одну замену, а две другие, которые должны объявиться в последовательности, пусть останутся тайной. Мы ей не скажем. И если она их найдет, эти специфические замены, то это будет достаточным доказательством, что “наша”
ДНК – настоящая, неандертальская, из косточки. На том мы и порешили, этот путь казался нам вполне обоснованным.
Энн была передана необходимая информация. И она заказала нужные праймеры. Мы стали ждать. А уже была середина декабря, и Энн нас предупредила, что собирается улететь на рождественские каникулы к родителям в Северную Каролину. Не мог же я приказать ей отменить поездку, хотя, конечно, очень хотелось. Но она позвонила. Через две недели. Энн получила пять молекул из своего секвенатора. И все они содержали те самые две нуклеотидные замены, которых мы ждали, из неандертальской последовательности. Те самые, которых нет (или они крайне редки) у современных людей. Какое огромное, бесконечное облегчение!
Рождественские каникулы мы заслужили. Позвонили Ральфу в Бонн, обрадовали его хорошими новостями и разъехались.
В то Рождество в компании биологов я отправился в Альпы, на далекие лыжные склоны у австрийской границы, как часто делал в мой мюнхенский период. Но тогда, даже летя вниз по склонам головокружительных заснеженных долин, я в мыслях сочинял статью, где впервые – впервые! – будет выложена последовательность ДНК неандертальца. То, что мне предстояло описать, кружило голову куда сильнее, чем самые крутые склоны ледяных Альп.
Вернувшись в лабораторию после Рождества, мы с Матиасом засели за статью. Перед нами встал важный вопрос, где ее публиковать. Очевидный вариант представляли британский Nature или его американский аналог Science, самые уважаемые в научном сообществе и цитируемые в прессе, если бы не их жесткие требования к размеру публикаций. А мне хотелось иметь возможность описать все детально – не только убедить мир, что у нас все по-настоящему получилось, но и познакомить научное сообщество с нашими скрупулезными методами получения и анализа древней ДНК. Вдобавок я несколько разочаровался в обоих изданиях: они то и дело печатали статьи о древних ДНК, эффектные и громкие, но не отвечающие тем научным критериям, которые моя команда считала необходимыми. Складывалось такое впечатление, что они скорее опубликуют статью, которая заинтересует первую полосу New York Times, чем ту, результаты которой надежны и неопровержимы.
Я обсудил все это с Томасом Линдалем, шведским ученым, работавшим в лондонской лаборатории Фонда исследования рака. Известнейший эксперт в области повреждений ДНК, мягкий в общении, Томас не отступал, если дело касалось научной истины. Я его считал в некотором роде наставником, с тех пор как в 1985 году шесть недель изучал химические повреждения в древних ДНК у него в лаборатории. Томас предложил отослать статью в журнал Cell, очень уважаемое издание, которое специализируется на молекулярной биологии и биологии клетки. Если опубликоваться в этом журнале, то для научного сообщества это будет означать, что секвенирование древней ДНК – твердое достижение молекулярной биологии, а не просто яркий заголовок с сомнительной сердцевиной. Вдобавок Cell брал и длинные статьи.
Томас позвонил редактору, прославленному Бенджамину Льюину, чтобы заранее заронить интерес, потому что наша рукопись была несколько нетипична для этого журнала. Льюин дал нам добро, предупредив, что рукопись должна пройти обычное в таких случаях рецензирование. Вот такие у нас были прекрасные новости. Теперь у нас оказалось достаточно журнального пространства, чтобы в подробностях описать все эксперименты и представить все результаты, убедившие нас, что перед нами самая настоящая неандертальская ДНК.
Я до сих пор считаю эту статью одной из моих лучших. В ней описаны и тщательнейшие методы реконструкции последовательности мтДНК, и почему найденную нами последовательность можно считать подлинной, и доказательства того, что наша последовательность не является вариацией уже известных современных. И как мы пришли к выводу, что неандертальцы не оставили генетического наследия в мтДНК современного человека. Наши выводы соотносились с моделью эволюции “из Африки”, предложенной Уилсоном, Стоункингом и их коллегами. Мы так и написали в своей работе: “Последовательность мтДНК неандертальцев, таким образом, подтверждает сценарий, согласно которому люди современного типа сформировались сравнительно недавно в Африке как отдельный вид и вытеснили неандертальцев, совсем или практически без смешения с ними”.
Мы обсудили все мыслимые возражения, какие смогли придумать. Например, мы специально отметили, что наша мтДНК отсылает лишь к небольшой части генетической истории вида. Так как мтДНК передается только по материнской линии, она отражает “женскую” часть истории. Получается, что, если неандертальцы и скрещивались с современными им людьми, мы могли бы это заметить только в случае, если бы неандерталки переходили из своей группы в человеческую. Чего, вполне возможно, и не было. Из более поздней человеческой истории известно, что группы с разным социальным статусом встречались, взаимодействовали между собой, почти всегда скрещивались и оставляли потомство. Такие взаимодействия происходили более или менее по одному сценарию: чаще всего в воспроизводстве участвовал партнер из социально доминантной группы, а дети оставались в материнской группе. Мы, конечно, не знаем, как было принято себя вести в этом смысле у людей 35 тысяч лет назад, когда они пришли в Европу и встретились с неандертальцами. Мы даже не знаем, были ли они социально доминантной группой хоть в каком-нибудь понятном нам, теперешним, смысле. Но совершенно ясно, что, выявив женскую линию наследования, мы увидим только половину истории.
МтДНК наследуется специфическим образом, и это тоже накладывает определенные ограничения. Как уже упоминалось, отдельная молекула мтДНК не обменивается частями со своими товарками. Далее, если у женщины рождаются только сыновья, то ее мтДНК исчезает из генофонда. Получается, что даже если в Европе мтДНК и передавалась от неандертальцев к людям в какой-то момент от 35 до 30 тысяч лет назад, то она могла исчезнуть просто по воле случая. Это конкретное ограничение не распространяется на хромосомы в клеточном ядре; вспомним, что хромосомы парные, одна хромосома достается нам от отца, а другая от матери.
Когда у нового организма формируются сперматозоиды или яйцеклетки, хромосомы сходятся и снова расходятся, будто в сложнейшем танце, в процессе которого они обмениваются своими частями. Таким образом, если бы нам удалось изучить несколько фрагментов ядерного генома у отдельного индивида, мы бы получили несколько вариаций генетической истории популяции. В результате, даже если какие-то части нуклеотидной последовательности, полученной от неандертальцев, и потеряются, другие вполне могут сохраниться. Так, имея перед глазами много частей ядерного генома, мы бы увидели картину человеческой эволюционной истории, гораздо менее исковерканную случайностями.
Наша работа прошла рецензирование в Cell и была принята к публикации. Как это принято в большинстве крупных изданий, редакция настояла, чтобы мы не раскрывали результаты исследований до выхода номера, для нас это был выпуск от 11 июля 1997 года.
Они подготовили анонс, и я вылетел в Лондон на пресс-конференцию, которая должна была состояться в день выхода журнала. Моя первая пресс-конференция! И я впервые испытал на себе, как это – быть центром пристального внимания прессы. К своему удивлению, я даже получил некоторое удовольствие, разъясняя суть нашей работы, представляя выводы и рассказывая про возможные возражения. Не сказать чтобы это было легко, ведь я со своими данными угодил прямо на поле сражения, которое уже больше десяти лет вели антропологи.
Битва началась с появления гипотезы “из Африки”. Алан Уилсон с коллегами обосновали ее в основном на базе вариаций мтДНК современного человека. Вначале палеонтологическое сообщество приняло гипотезу в штыки. В то время в качестве рабочей гипотезы принималась так называемая мультирегиональная модель: считалось, что современный человек произошел от общего предка Homo erectus, эволюционируя независимо и более или менее одновременно на нескольких континентах. Палеонтологи усматривали в группировках современных людей глубокие исторические корни: по их мнению, предками современных европейцев были неандертальцы и, может быть, ранние европейские гоминины; современные азиаты произошли от каких-то архаичных форм, восходящих от синантропов. Тем не менее все больше и больше уважаемых ученых, среди них, например, Крис Стрингер из лондонского Музея естественной истории, склонялись к гипотезе “из Африки”, потому что именно она лучше всего объясняет полный массив данных палеонтологии и археологии. Криса пригласили на пресс-конференцию,
и он объявил во всеуслышание, что прочтение неандертальской ДНК для палеонтологии – это примерно то же, что высадка на Луну для эры космических исследований. Я, конечно же, был рад услышать такие слова из его уст, хотя они и не явились для меня неожиданностью. Но еще больше я радовался, что даже у моих “противников”, у “мультирегионалистов”, находилось доброе слово для нашей работы или хотя бы для нашей методики. Особенно мне было приятно, когда мой самый ярый оппонент и завзятый спорщик Милфорд Уолпофф из Мичиганского университета прокомментировал в Science, что “если кто-то и способен был провести такую работу, то только Сванте”.
В общем, такого эффекта от статьи я не ожидал. Ее цитировали на первых полосах главных газет, новость передавали по радио и транслировали по телевидению по всему миру.
Всю следующую неделю после публикации я провел на телефоне с журналистами из разнообразных изданий. Я работал над исследованиями древней ДНК с 1984 года, и постепенно у меня рождалось убеждение, что неандертальскую ДНК выделить возможно. Прошло девять месяцев с того момента, как Матиас поднял меня с постели, заявив, что выданная секвенатором ДНК не человеческая. У меня было время, чтобы свыкнуться с этой мыслью, а вот остальной мир новость, похоже, совершенно потрясла. Когда шумиха в прессе немного улеглась, я смог выдохнуть, осмотреться, оценить сделанное и задать себе вопрос: “А что дальше?”