Рождение биоэнергетики

... 1968 год. Маленький, ослепительно белый итальянский городок Полиньяно на берегу Адриатического моря изнывает от майого зноя. А во дворце графа Мьяни полумрак и прохлада. За овальным столом, покрытым толстым зеленым сукном, течет неспешная беседа. Здесь симпозиум, но не в древнем смысле, который, вероятно, был бы уместнее в этом старинном доме («симпозиум» — «собрание с вином и женщинами»). На столе нет вина, а немногие женщины в зале — сплошь ученые дамы.

История новой науки

Один из научных симпозиумов, которым сегодня нет числа, в общем-то закончен. Полсотни биохимиков собрались с разных концов света на несколько дней, чтобы оценить глубину своего неведения о сущности одного из обычных для биологии чудес. Завтра они разъедутся по домам, так и не узнав, каким именно образом живое существо использует окружающий мир для получения необходимой ему энергии. Позади доклады о, маленький фактах и больших идеях, споры здесь, во дворце, и на морском берегу, размышления в тиши нашего временного, но комфортабельного пристанища — отеля, вырубленного прямо в нависающей над морем скале.

Да, ясности еще нет. Нет точного знания, которое позволяет, например, собрать автомобиль по изготовленному конструктором чертежу. Надо еще работать и работать. Это понимают все: и скептики, и оптимисты, сидящие за зеленым столом, — скромнейший старец сэр Г. Кребс, первооткрыватель самого знаменитого, названного в его честь биохимического цикла, нобелевский лауреат, чье имя еще при жизни было выбито на медали, вручаемой за особые заслуги перед наукой Федерацией европейских биохимиков; Л. Эрнстер из Швеции, по-птичьи склоняющий голову набок и посверкивающий из-под седых бровей острым взглядом голубых глаз; грузный, флегматичный американец Б. Прессман; отчаянные спорщики — итальянцы Э. Квальярелло, Дж. Аццоне, С. Папа...

Вдруг австралиец Э. Слейтер, похожий с виду на пастора, поднимает два пальца и говорит:

— Нам нужно выбрать имя. Давайте, наконец, как-нибудь назовем то, чем мы с вами занимаемся.

Будь Слейтер красноречивей, он сказал бы, наверно, что настал час поднять свой собственный флаг, что в нашем деле забрезжила надежда на успех, что уже виден путь к нему, долгий и трудный путь, в конце которого нам, может быть, откроется чертеж механизма, изобретенного природой, чтобы обеспечить энергией все проявления жизни.

Сначала разъять живую клетку на молекулы, отобрать среди них только те, что отвечают за энергообеспечение клетки, пока она жива, и затем воссоздать из этих молекул трансформирующий энергию механизм — вот путь познания, если мы хотим уяснить, как клетка обеспечивает себя энергией.

Похожий путь однажды уже одолели биологи, исследовавшие другое свойство живого существа, столь же универсальное, как функция энергообеспечения, а именно способность производить себе подобных. Оказалось, что среди великого множества веществ, составляющих клетку, есть только одно, наделенное возможностью создавать свою копию, — это особый биополимер — дезоксирибонуклеиновая кислота, ДНК. Из клетки удалось выделить ДНК и белок — фермент, помогающий этой молекуле при ее воспроизводстве (репликации). Затем были найдены условия для того, чтобы два партнера — ДНК и фермент — вели синтез новых молекул ДНК из соответствующего строительного материала — нуклеотидов.

На взгляд химика, ДНК и белок — весьма сложные молекулы. Для биолога это предельно простая система, поскольку дальнейшее ее упрощение с неизбежностью ведет к потере биологического свойства. Расщепив полимерные молекулы ДНК и белка на мономеры (нуклеотиды и аминокислоты), мы получаем смесь низкомолекулярных соединений, лишенную всякой способности к самовоспроизведению. Вот почему молекулярная генетика имеет дело с макромолекулами. Это справедливо и для других разделов молекулярной биологии — науки, изучающей ту или иную биологическую функцию на уровне макромолекул или их комплексов.

Молекулярная биология — есть биология высокомолекулярных соединений. Не может быть биологии низкомолекулярных веществ. Тем более нельзя говорить о субмолекулярной биологии, квантовой биологии и т. п. Фактически эти термины лишены смысла и лишь вводят в заблуждение.

Но хоть молекулы биополимеров и сложны, они все же индивидуальные химические соединения. Поэтому уровень точности знаний, достигнутый химией, в принципе достижим и в молекулярной биологии. Здесь биология впервые становится действительно точной наукой в самом своем существе.

Нет сомнений, что прорыв биологии на точный молекулярный уровень должен иметь самые важные последствия как для науки, так и для практической деятельности человека. И в общем-то можно понять амбиции молекулярных биологов, рассматривающих изучение каждой из фундаментальных функций живой клетки как самостоятельную научную отрасль, которая имеет право на свое собственное имя.

Любое проявление жизни связано с затратами энергии. Живое существо, пусть даже такое мелкое, как бактерия, — это чрезвычайно сложная и совершенная система, создание которой потребовало миллионы веков эволюционного развития. Чтобы поддерживать существование такой системы, стремящейся перейти в более устойчивое с точки зрения термодинамики неживое состояние, необходим постоянный приток свободной энергии.

Мозг, лишенный доступа кислорода, погибает через несколько минут. В других органах также происходят необратимые изменения при нарушении доставки энергетических ресурсов, хотя этот трагический момент наступает чуть позже, чем в мозге.

Правда, описаны бактерии, все еще сохраняющие нормальную жизнедеятельность в течение нескольких часов после исчерпания внешних источников энергии. Но это уже один из тех рекордов, которые преподносит нам время от времени мир микробов с их поразительной способностью приспосабливаться к неблагоприятным условиям.

Итак, одна из функций, присущих всему живому, — способность к энергообеспечению за счет тех или иных внешних энергетических ресурсов. Как же назвать науку, изучающую энергообеспечение живых существ? Тогда, в Поликьяно, после недолгого спора остановились на биоэнергетике.

(Слово «биоэнергетика» вошло в обиход с легкой руки А. Сцент-Дьердьи, прославившегося в свое время выделением первого витамина — аскорбиновой кислоты. Так называлась небольшая книжка, опубликованная Сцент-Дьердьи в 1956 году. В этом труде можно было, как всегда, найти множество увлекательных мыслей и гипотез, но случилось так, что испытание временем выдержало лишь слово, вынесенное автором на обложку.)

Сначала в некоторых биологических центрах появились группы, лаборатории, отделы биоэнергетики (одним из первых был отдел биоэнергетики в МГУ, созданный в 1965 году). Затем с конца 60-х годов стали издаваться журналы и сборники по биоэнергетике, пошли симпозиумы, конференции, курсы под этим названием. И вот сегодня биоэнергетика — одно из популярных научных направлений со своим кругом идей, объектов и методов, своими лидерами и соперничающими школами, словом, интернациональный организм, живущий и развивающийся по собственным законам.

Вслед за известными успехами этой ветви биологии пришла мода и появилась тенденция писать слово «биоэнергетика» во всех случаях, где речь идет об энергетическом аспекте живых систем, невзирая на степень их сложности. В этом смысле первым биоэнергетиком нужно признать Платона, размышлявшего о судьбе пищи в организме. Что же до современных исследователей, пытающихся добыть точные сведения о биологических преобразователях энергии, то их придется величать «молекулярными биоэнергетиками».

В этих очерках я буду держаться того определения биоэнергетики, о котором мы договорились семнадцать лет назад в Полиньяно, «в час жаркого весеннего заката». Не общие соображения и не внешнее, всегда приблизительное описание превращений энергии в клетке, а точный чертеж биологического трансформатора — вот цель, смысл, «сверхзадача» биоэнергетики. В этой книге я хочу рассказать о том, как биоэнергетики пытаются решить свою сверхзадачу. Речь пойдет об успехах и неудачах молодой науки, о людях, посвятивших себя биоэнергетике, и о путях, которые они выбирают.

Я не могу обещать вам легкого чтения. Если вы взялись за эту книгу, чтобы узнать кое-что о новой науке - биоэнергетике, вам придется иногда напрягать свой интеллект. Моя цель — ввести вас в круг основных идей и сведений о молекулярном механизме одной из важнейших функций живого организма — функции энергообеспечения.

В первой части книги речь пойдет об истории становления биоэнергетики и основных понятиях этой отрасли биологии. Более детальное рассмотрение устройства главных биологических преобразователей энергии — белков — генераторов тока, этих электростанций размером в молекулу, можно найти во второй части.

По ходу рассказа я попытаюсь показать, как делается современная наука. Излагая свои работы более подробно, чем некоторые результаты других ученых, я надеюсь на снисхождение читателей: рассказчик, говоря о событии, всегда стремится подробнее описать эпизод с его непосредственным участием. Биоэнергетика — очень молодая наука. Еще нет учебника, к которому можно было бы отослать любознательного читателя. Есть лишь обзорные статьи, доступные только специалистам. И если мне удастся понизить барьер в восприятии новых представлений об энергообеспечении живых организмов, то я сочту, что эта книга выполнила свою основную задачу.

 

Как клетка получает и использует энергию

Чтобы жить, надо работать. Эта житейская истина вполне приложима к любым живым существам. Все организмы: от одноклеточных микробов до высших животных и человека — непрерывно совершают различные типы работы. Таковы движение, то есть механическая работа при сокращении мышц животного или вращении жгутика бактерии; синтезы сложных химических соединений в клетках, то есть химическая работа; создание разности потенциалов между протоплазмой и внешней средой, то есть электрическая работа; перенос веществ из внешней среды, где их мало, внутрь клетки, где тех же веществ больше, то есть осмотическая работа. Помимо перечисленных четырех основных типов работы, можно упомянуть образование тепла теплокровными животными в ответ на понижение температуры окружающей среды, а также образование света светящимися организмами.

Что такое энергетический обмен

Все это требует затрат энергии, которая черпается из тех или иных внешних энергетических ресурсов. Первичным источником энергии для биосферы служит солнечный свет, усваиваемый фотосинтезирующими живыми существами: зелеными растениями и некоторыми бактериями. Создаваемые этими организмами биополимеры (углеводы, жиры и белки) могут затем использоваться в качестве «топлива» всеми остальными — гетеротрофными — формами жизни, к которым относятся животные, грибы и большинство видов бактерий.

Биополимеры пищи могут быть весьма разнообразны: это сотни различных белков, жиров и полисахаридов. В организме происходит распад этого «топлива». Прежде всего полимерные молекулы распадаются на составляющие их мономеры: белки расщепляются на аминокислоты, жиры — на жирные кислоты и глицерин, полисахариды — на моносахариды. Общее количество различных типов мономеров измеряется уже не сотнями, а десятками.

В дальнейшем мономеры превращаются в небольшие по величине моно-, ди- и трикарбоновые кислоты с числом углеродных атомов от 2 до 6. Этих кислот всего десять. Их превращение замкнуто в цикл, названный циклом Кребса в честь его первооткрывателя,

В цикле Кребса происходит окисление карбоновых кислот кислородом до углекислого газа и воды. Именно образование воды в результате реакции молекулярного кислорода с водородом, отщепленным от карбоновых кислот, сопровождается наибольшим выделением энергии, в то время как предшествующие процессы служат главным образом лишь подготовкой «топлива». Окисление водорода кислородом, то есть реакция гремучего газа (О2+2Н2 = 2Н20), в клетке разбито на несколько стадий, так что освобождающаяся при этом энергия выделяется не сразу, а порциями.

Так же порциями происходит освобождение энергии, поступающей в виде кванта света, в клетках организмов-фотосинтетиков.

Итак, в одной и той же клетке существует, во-первых, несколько реакций освобождения энергии и, во-вторых, множество процессов, идущих с поглощением энергии. Посредником этих двух систем, совокупность которых называется энергетическим обменом, служит особое вещество — аденозинтрифосфорная кислота (АТФ).

 

АТФ клетки - разменная валюта

Для энергетического обмена клетки очень важны так называемые сопряженные химические реакции. В каждой такой реакции связываются воедино два различных процесса: один, сопровождающийся выделением энергии, и другой, требующий ее затрат. В результате оказывается, что первый (энергодающий) процесс становится движущей силой для второго процесса, потребляющего энергию.

В начале 40-х годов известный биохимик Ф. Липман высказал гипотезу, что различные реакции освобождения энергии в клетке всегда сопряжены с одной и той же реакцией, а именно синтезом АТФ из ее предшественников — аденозиндифосфорной кислоты (АДФ) и неорганической ортофосфорной кислоты (Н3РО4). С другой стороны, реакции расщепления (гидролиза) АТФ до АДФ и Н3РО4 сопряжены, по Липману, с совершением различных типов полезной работы. Другими словами, образование АТФ служит универсальным накопителем энергии, а расщепление АТФ — универсальным поставщиком энергий.

Еще до публикации гипотезы Липмана советские ученые, В. Энгельгардт и В. Белицер, установили, что внутриклеточное дыхание, то есть окисление водорода карбоновых кислот кислородом, сопряжено с синтезом АТФ. Образование АТФ было показано также при гликолизе (расщепление углеводов до молочной кислоты в отсутствие кислорода), В 50-е годы американский биохимик Д. Арнон продемонстрировал синтез АТФ у растений за счет энергии света.

В то же время были описаны многочисленные случаи энергообеспечения работы клетки за счет гидролиза АТФ. Выяснилось, что синтез белков, жиров, углеводов, нуклеиновых кислот из соответствующих мономеров «оплачивается» энергией АТФ. В. Энгельгардт и М. Любимова обнаружили расщепление АТФ сократительным мышечным белком. Это открытие позволило понять, каким образом обеспечивается энергией работа мышцы. К настоящему времени несомненна причастность АТФ также и ко многим другим процессам, потребляющим энергию.

Итак, клетка использует энергетические ресурсы, чтобы получить АТФ, а затем тратит этот АТФ, чтобы оплатить различные виды работы.

 

Где и как образуется АТФ?

Первой системой, для которой выяснили механизм образования АТФ, оказался гликолиз — вспомогательный тип энергообеспечения, включающийся в условиях нехватки кислорода. При гликолизе молекула глюкозы расщепляется пополам и полученные обломки окисляются до молочной кислоты.

Такое окисление сопряжено с присоединением фосфорной кислоты к каждому из фрагментов молекулы глюкозы, то есть с их фосфорилированием. Последующий перенос фосфатных остатков с фрагментов глюкзы на АДФ дает АТФ.

Механизм образования АТФ при внутриклеточном дыхании и фотосинтезе долгое время оставался совершенно неясным. Было известно только, что ферменты, катализирующие эти процессы, встроены в биологические мембраны — тончайшие пленки (толщиной около одной миллионной доли сантиметра), состоящие из белков и фосфорилированных жироподобных веществ — фосфолипидов.

Мембраны — важнейший структурный компонент любой живой клетки. Внешняя мембрана клетки отделяет протоплазму от окружающей клетку среды. Клеточное ядро окружено двумя мембранами, которые образуют ядерную оболочку — преграду между внутренним содержимым ядра (нуклеоплазмой) и остальной частью клетки (цитоплазмой). Кроме ядра, в клетках животных и растений находят еще несколько структур, окруженных мембранами. Это эндоплазматическая сеть — система мельчайших трубочек и плоских цистерн, стенки которых образованы мембранами. Это, наконец, митохондрии — шарообразные или вытянутые пузырьки размером мельче ядра, но крупнее компонентов эндоплазматической сети. Диаметр митохондрии обычно около микрона, хотя иногда митохондрии образуют ветвящиеся и сетчатые структуры протяженностью в десятки микрон.

В клетках зеленых растений, помимо ядра, эндоплазматической сети и митохондрий, находят еще и хлоропласты — мембранные пузырьки более крупные, чем митохондрии.

Каждая из этих структур выполняет свою, специфическую биологическую функцию. Так, ядро — вместилище ДНК. Здесь происходят процессы, лежащие в основе генетической функции клетки, и начинается сложная цепь процессов, приводящая в конечном итоге к синтезу белка. Этот синтез завершается в мельчайших гранулах — рибосомах, большая часть которых связана с эндоплазматической сетью. В митохондриях происходят окислительные реакции, совокупность которых называется внутриклеточным дыханием. Хлоропласты отвечают за фотосинтез.

Клетки бактерий устроены проще. Обычно они имеют только две мембраны — внешнюю и внутреннюю. Бактерия — это как бы мешок в мешке, а точнее, очень мелкий пузырек с двойной стенкой. Здесь нет ни ядра, ни митохондрий, ни хлоропластов.

Существует гипотеза, что митохондрии и хлоропласты произошли из бактерий, захваченных клеткой более крупного и высокоорганизованного существа. Действительно, биохимия митохондрий и хлоропластов во многом напоминает бактериальную. Морфологически митохондрии и хлоропласты тоже в известном смысле подобны бактериям: они окружены двумя мембранами. Во всех трех случаях: в бактериях, митохондриях и хлоропластах — синтез АТФ происходит во внутренней мембране.

Долгое время считалось, что образование АТФ при дыхании и фотосинтезе протекает аналогично уже известному превращению энергии при гликолизе (фосфорилирование расщепляемого вещества, его окисление и перенос остатка фосфорной кислоты на АДФ). Однако все попытки экспериментально доказать эту схему оканчивались неудачей.

 

Муравьиный язык

Для меня эта история началась четверть века назад, когда на третьем курсе биофака МГУ я решил заняться тем, что сейчас мы называем биоэнергетикой, рискованной в общем-то областью биологии. Как правило, здесь ничего не увидишь, не уловишь на слух и не пощупаешь руками. Приходится доверять приборам, способным улавливать слабые отклики событий, сопутствующих превращениям энергии в мельчайших крупинках живой материи.

Здесь нет ничего сложнее, чем угадать единственно правильный путь среди тысячи, казалось бы, равных возможностей. И нет ничего проще, чем придумать новую гипотезу: достаточно располагать неким минимумом сведений и способностью логически мыслить.

В детстве я увлекался муравьями: в лесу искал их «столицы», следил за дорожками, расчищенными и утоптанными маленькими тружениками. Показывал приятелям разные виды муравьев, давая им собственные названия, а однажды под 'большим секретом сообщил своим друзьям, что узнал «муравьиный язык», и потом все лето сочинял истории, которые будто бы рассказывали мне мои шестиногие собеседники. Мальчишки верили или просто делали вид, что верят, приняв тем самым правила игры.

Муравьиный язык

Но вот в конце лета в компании появилась девочка постарше. Мое общение с муравьями ей показалось сомнительным, и она решила вывести фантазера на чистую воду. Неподалеку от нашей дачи был муравейник моих любимцев — крупных неторопливых черно-красных муравьев, которых я окрестил «красношейками». Втайне от нас девочка выкопала около муравейника небольшую ямку.

- Узнай у своих муравьев, откуда взялась эта ямка? — попросила она.

Что делать? Я выбрал «красношейку» поголовастей, посадил его в ямку и через минуту-другую водворил его на свою ладонь. Я внимательно наблюдал за беспорядочными движениями его усиков, мучительно соображая, кто бы мог вырыть злосчастную ямку! Я сразу понял, что это проверка. Но кто же мог меня проверять, кроме самой девочки, ведь ребятам очень нравились и рассказы о муравьиных войнах, и изготовление кораблей для Муравьевой поиски исторических мест муравьиных баталий. Не могли же они сами разрушить весь этот замечательный мир! Значит, моей обличительнице никто не помогал!

— Муравей говорит, что эту ямку вырыла ты! Носком туфли!

Этот свой детский триумф я вспомнил на первой студенческой практике в Чашникове, когда среди предложенных нам самостоятельных работ по зоологии беспозвоночных обнаружил одну «муравьиную» тему. Сильно волнуясь, я спросил у преподавателя, можно ли заняться муравьями именно мне. Согласие было получено, и, взяв с собой определитель насекомых, я немедля отправился в ближайший лес на поиски местных муравьев.

Вскоре выяснилось, что здесь тоже водится мой любимый «красношейка», который в действительности называется «красногрудый древоточец». По-латыни его имя звучало для меня как гимн: Camponotus herculianus. Это торжественное сочетание звуков говорило само за себя, особенно рядом с названием суматошного рыжего «лесняка», который оказался всего лишь муравьем лесным, Formica rufa rufa.

Целыми днями я пропадал в лесу, испытывая чувство, которое можно сравнить с утолением жажды или радостью встречи после долгой разлуки с любимой женщиной, потерянной, казалось, навсегда.

Когда я рассказал о своей работе «Муравьи и защита растениями нектара от муравьев» на кафедре зоологии беспозвоночных, мне предложили специализироваться по этой кафедре. Соблазн был велик. Поступая в МГУ, я собирался стать биохимиком, но эту сложную науку изучают на старших курсах. А сейчас на столе лежит мой первый научный опус, уже получивший одобрение такого признанного мирмиколога (специалиста по муравьям), как профессор Арнольди, а доцент Абрикосов, высокий старик с пристальным взглядом голубых глаз и тонкими длинными пальцами собирателя коллекций, рассказывает мне о дальних экспедициях и повадках полюбившихся с детства беззащитных трудолюбивых созданий.

Но я решил все же пойти в биохимики.

Мне не довелось больше заниматься муравьями, однако я никогда не жалел о днях, потраченных на мирмикологию. Эта скромная наука позволила почувствовать гармонию бесконечно сложного мира, каким оказывается любой живой организм под внимательным взглядом биолога. Я убежден, что такого рода занятия дают хороший иммунитет против поспешных упрощенных решений, которые часто предлагают нам химики и физики, пришедшие в биологию, так сказать, со стороны.

Что же до языка муравьев, то он был недавно открыт, и не без помощи биохимиков. Оказалось, что муравьи располагают, если угодно, «химическим» способом передачи информации. Они выделяют пахучие вещества разных типов, каждое из которых — сигнал к тому или иному коллективному действию.

Если, например, муравей находит добычу, неподъемную для одного, он возвращается к муравейнику, непрерывно орошая свой путь летучим эфиром определенного состава. Второй муравей, случайно наткнувшись на этот след, воспринимает запах эфира как сигнал, что надо бежать в сторону ослабления запаха, то есть в направлении, противоположном тому, куда отправился первый муравей, а стало быть, к неподъемной добыче. Так же поступают и другие муравьи, напавшие на след первого, и вскоре у добычи оказывается достаточное количество «носильщиков».

Обладая набором эфиров, выделяемых муравьями, можно управлять полчищами насекомых, заставляя, например, бесчисленную муравьиную семью в какой-то момент сняться с обжитого места, покинуть муравейник и отправиться по прочерченному вами на земле маршруту.

 

Митохондрии производят АТФ в пробирке

На кафедре биохимии животных, куда я попал после экскурса в мирмикологию, опыт обычно начинали с того, что животному отрезали голову. Уже сам по себе этот акт, в научных протоколах обозначавшийся как «декапитация», символизировал биохимический подход к изучению жизненных явлений. Биохимик стремится анализировать их на более простых, чем организм, системах, таких, как органы, ткани, тканевые срезы, клетки, внутриклеточные частицы и, наконец, индивидуальные вещества биологического происхождения. Чем проще объект, тем вернее успех, и так вплоть до предела, за которым исчезает интересующее нас биологическое свойство.

Митохондрии производят АТФ в пробирке

В биоэнергетике середины 50-х годов «точка исчезновения интереса» лежала на уровне митохондрий. Опыт ставили следующим образом. У обезглавленной только что крысы (кролика, голубя и т. п.) извлекали печень, разрезали ножницами на кусочки размером 1—3 кубических миллиметра и смешивали с раствором специально подобранного состава, предотвращающим немедленное разрушение митохондрий и порчу их ферментов.

Затем смесь гомогенизировали, то есть измельчали до такого состояния, чтобы разрушить оболочки клеток. Для этой цели применяли несложный прибор, состоящий из мотора, тефлонового пестика и широкой стеклянной пробирки, диаметр которой чуть больше толщины пестика. Вращение пестика приводило к разрыву клеток, попавших в зазор между внутренней стенкой пробирки и пестиком. В результате клеточное содержимое смешивалось с добавленным раньше раствором, и подучался так называемый гомогенат.

Следующая стадия - выделение митохондрий из гомогената, в котором содержатся и другие компоненты— клеточные ядра, обломки оболочки и различных внутриклеточных мембран и, наконец клеточный сок — жидкая часть протоплазмы.

Каждый из этих компонентов имеет свой характерный удельный вес, что и используется для их разделения. В принципе разделение должно произойти само по себе, если просто оставить пробирку с гомогенатом стоять достаточно долгое время. Сначала на дно осядут самые тяжелые частицы — неразрушенные клетки и кусочки ткани, затем появится слой ядер и обломков клеточной оболочки. Потом настанет черед митохондрий и т. д. Кстати, именно так выделяют эритроциты из крови, оставляя кровь постоять в пробирке или капиллярной трубке. В этом суть РОЭ — реакции оседания эритроцитов — известного всем медицинского анализа крови.

Но эритроциты — это клетки, а интересующие нас митохондрии — внутриклеточные частицы и, стало быть, нечто более мелкое, чем клетки. Их диаметр всего несколько микрон; состоят митохондрии из белков и легких жироподобных веществ — фосфолипидов и поэтому оседают очень медленно. Чтобы ускорить этот процесс, применяют центрифугирование. Вращение пробирки, помещенной в центрифужный ротор, многократно увеличивает силу тяжести. Если задать такую скорость вращения, чтобы сила тяжести возросла в 10 тысяч раз, то нескольких минут оказывается достаточно, чтобы отбросить митохондрии на дно пробирки.

...Передо мной центрифужная пробирка, а в ней коричневый осадок, похожий на печеночный паштет. Здесь должны быть миллиарды отдельных митохондрий. Так ли это? Посмотрим в микроскоп. На пределе увеличения видны чуть вытянутые частицы. Они находятся в беспорядочном движении - броунируют. Добавляю каплю красителя «янус зеленый». Если частицы окрасятся в зеленый цвет, значит, это митохондрии. Частицы зеленеют. Пока все идет нормально. Но к чему еще способны эти митохондрии, безжалостно вырванные из привычной среды и лишенные своих партнеров по протоплазме?

В 1949 году американцы Э. Кеннеди и А. Ленинджер доказали, что изолированные митохондрии печени способны на главное — они окисляют вещества кислородом и за счет получаемой таким образом энергии синтезируют АТФ. Спустя шесть лет тот же опыт повторил на кафедре биохимии животных МГУ дипломник из ГДР Г. Шарфшверт. Мне, студенту-третьекурснику, надо овладеть его ремеслом, ведь через год он уедет в Берлин вместе со всеми секретами этого тонкого опыта.

Я взбалтываю осадок митохондрий, прилив к нему все тот же «щадящий» раствор, дополненный окисляемыми веществами и фосфатом, и помещаю суспензию в сосудик Варбурга — смешное создание фантазии стеклодувов, похожее на толстую бабу с ведрами на коромысле. Сосудик прикрепляется к манометру и помещается в водяную баню с температурой 37 градусов (пусть хоть температура будет как в организме!).

Теперь все внимание на уровень жидкости в манометре. Если в митохондриях протекают окислительные реакции, должен потребляться кислород и давление в сосудике будет падать. И действительно, манометр регистрирует падение давления. Митохондрии «дышат»!

Что же, полдела сделано. Остается посмотреть, не уменьшилось ли количество фосфата; ведь он один из субстратов реакции фосфорилирования, и его количество должно убывать, если дыхание сопряжено с синтезом АТФ. Вынимаю сосудик из бани, набираю в пипетку трихлоруксусную кислоту...

Вдруг вспоминаются лето, школьные каникулы. Я ловлю прыткого черного жука, перебегающего прогретую солнцем утоптанную дорожку. Опять жужелка — ничего интересного, только на руках остается резкий, необычный запах... Теперь я уже знаю, что это запах трихлоруксусной кислоты. Она денатурирует белки-ферменты, и жужелица использует ее как «химическое оружие» против своих врагов. А я сейчас убью этим оружием митохондрии, чтобы мгновенно остановить все протекающие в них ферментативные процессы.

Еще час работы, и проведена цветная реакция на неорганический фосфат. Он действительно убывал в сосудике с митохондриями. Биологические трансформаторы энергии действовали!

 

Факт или артефакт?

Профессор С. Северин, узнав, что вслед за Шарфшвертом я освоил заокеанскую методику, попросил применить ее к другому объекту: вместо печени крысы надо было взять грудную мышцу голубя. План моего руководителя состоял в том, чтобы воспроизвести на мышечных митохондриях окислительный синтез АТФ, уже описанный для печени, и посмотреть, не будет ли регулироваться этот процесс карнозином и ансерином — двумя специфичными для мышц веществами с неясной биологической функцией, открытыми его учителем В. Гулевичем в начале века.

Факт или артефакт?

Я выделил митохондрии из голубиных мышц и, поколдовав с растворами для сосудиков Варбурга, вскоре получил синтез АТФ, сопряженный с окислением одной из карбоновых кислот— пировиноградной. Тогда я взял аскорбиновую кислоту, которая в опытах на печеночных митохондриях тоже окислялась сопряженно с образованием АТФ. К моему удивлению, окисление этого второго вещества протекало без синтеза АТФ.

Я повторил опыт с митохондриями печени в условиях, идентичных тем, что были подобраны для мышц, и вновь получил убыль фосфата как с пировиноградной, так и с аскорбиновой кислотами. Новый опыт с мышцей, и опять тот же странный результат: с одной кислотой дыхание и фосфорилирование, а с другой — такое же (по скорости) дыхание, но никакой убыли фосфата.

Проще всего мое наблюдение было бы отнести в разряд артефактов, то есть всех тех многочисленных явлений, которые отсутствуют в живой природе и создаются искусственно в условиях биологического эксперимента. Как говорится, снявши голову, по волосам не плачут. Убили животное, искромсали, размозжили его ткани, так стоит ли удивляться, что один из механизмов жизнедеятельности работает теперь в каком-то неполноценном режиме, когда при сжигании пищи в митохондриях энергия еще освобождается, но уже не используется для производства АТФ.

Мне шел тогда двадцать второй год. Опыт с двумя кислотами, по-разному окислявшимися в митохондриях голубиных мышц, был первым моим новым наблюдением: ведь раньше таких экспериментов никто не ставил. В этом нетрудно было убедиться, так как работы по энергетике митохондрий в то время проводились всего в нескольких лабораториях и собрать литературу по исследуемому вопросу не составляло большого труда, И что же, мое первое наблюдение — артефакт?

С этим унизительным, как мне казалось, выводом я никак не мог примириться. Не торопил меня подписаться под таким заключением и профессор Северин. Он снисходительно наблюдал мой энтузиазм, сопутствовавший началу работы, а потом разочарование нелепым результатом.

— Корень ученья горек, а плод, Володя, поверьте мне, кислый! — сказал руководитель однажды, когда я вновь пришел к нему с очередным вариантом опыта, принесшим все тот же неутешительный итог.

Вскоре я прекратил опыты и засел за литературу, чтобы посмотреть, не видел ли кто-нибудь нечто столь же странное пусть не в моей системе, а в аналогичной. Ведь если даже мой результат и смахивал на артефакт, то артефакт этот был какой-то необычный, не поддающийся простому объяснению.

Допустим, что митохондрии как-то «сломались» при их выделении из мышц, но почему эта поломка сказалась только на судьбе одного из двух окисляемых веществ? Ведь окисляются они через общий путь, так называемую дыхательную цепь ферментов, и именно в дыхательной цепи происходит таинство превращения энергии дыхания в энергию АТФ.

Я допоздна засиживался в библиотеке, конспектируя статьи по митохондриям, и в конце концов обнаружил одно наблюдение, сделанное А. Ленинджером в опыте с митохондриями печени, когда два вещества, причем вовсе не те, что выбрал я, тоже окислялись в двух различных режимах: одно с фосфорилированием, а другое без.

Ну что же, теперь я не одинок! Пусть знаменитый Ленинджер оставил без внимания обнаруженный им парадокс — для него ведь это далеко не первая тайна, которую посчастливилось подсмотреть у природы. А я еще подожду выбрасывать свое наблюдение в мусорную корзину для артефактов.

Итак, два вещества окисляются одним и тем же путем, но с разным результатом. Бред!

А что, если биохимики, изучая митохондрии, недосчитались еще одного окислительного пути? Если дыхательных цепей не одна, а две? Или цепь одна, но работать она может в двух режимах, из которых только один сопряжен с синтезом АТФ?

Так возникла мысль, которую я впоследствии назвал гипотезой о двух путях окисления.

Если бы в те дни мне сказали, что идея такого рода уже высказана год назад, и не кем-нибудь, а все тем же Ленинджером, я бы, конечно, очень огорчился. Но, к счастью, редкий источник — Гарвеевская лекция, где Ленинджер говорил о двух путях, дошел до Москвы с большим опозданием, когда работа по проверке гипотезы уже шла полным ходом. Я говорю «к счастью», потому что сознание первооткрывателя было движущей силой тогдашней моей работы. Лишь с годами возник бескорыстный интерес к тому, как же все-таки объясняются все эти чудеса, и пришло понимание того, что главное — быть на верной дороге, пусть даже указанной другими.

 

Стриженные голуби

Будь я физиком или химиком, я заинтересовался бы прежде всего, как устроены два пути окисления. Но я биолог, и потому моей первой заботой было удостовериться, что два пути реально существуют и действуют в организме. Меня не отпускал прежний страх: а вдруг артефакт? Как же решить эту проблему?

Призовем на помощь логику. Два пути, два режима. Один дает накопление энергии (образуется АТФ), другой ведет к рассеянию энергии (образуется тепло). Простейшая мысль — первый путь полезен, второй бесполезен, если не вреден: ведь это растрата топлива.

Стриженные голуби

Но не будем спешить с выводами, иначе мы рискуем попасть в положение профана, утверждающего, что автомобиль сломан, на том основании, что при отключенном сцеплении двигатель работает вхолостую.

Итак, один режим — выделение энергии и ее использование, другой — выделение без использования, то есть вся энергия идет в тепло. Но справедливо ли то, что полезность дыхания мы видим только в его способности поставлять АТФ? Ведь бывает же и противоположная ситуация, пусть необычная, но все же реальная, когда не АТФ, а тепло оказывается необходимым в первую очередь. Именно так обстоит дело с теплокровными животными при резком понижении температуры.

Давайте поставим животное на грань замерзания и посмотрим, не переключит ли оно свое дыхание на холостой ход? Если даже в таких крайних условиях ничего подобного не случится, то животное не умеет отключать дыхание от фосфорилирования, а два пути окисления — артефакт.

...Однажды к моему другу зоологу С. Маслову зашел Д. Афанасьев, аспирант кафедры высшей нервной деятельности. Он собирался заниматься гипотермией у птиц и искал подходящую модель.

— Чепуха, понимаешь ли, какая-то получается, — жаловался Дима. - Держу стриженого голубя в холодильнике при минус 20 градусах с вентилятором. Через 15 минут измеряю его температуру: на пять-шесть градусов снижена. Вот, думаю, и модель гипотермии! Так нет же, на другой день охлаждаю того же голубя еще раз, а он там битый час сидит — и хоть бы что, никакой гипотермии нет и в помине!

Чепуха. А может быть, это вовсе не Димина модель, а наша? Ведь если уж кому нужны кратчайшие пути теплопродукции, так это как раз такому животному, которое лишено систем так называемой физической терморегуляции (у птиц — оперения). Оно может поддерживать постоянство своей температуры при охлаждении исключительно за счет увеличения выработки тепла в тканях.

Мне не приходилось видеть ничего более жалкого, чем голубь без перьев. Дрожащий иссиня-красный комочек, стыдливо переминающийся с ноги на ногу и посматривающий с укоризной на своих мучителей. Нет, такой не вынесет двадцатиградусного мороза с ветром!

Спустя полчаса после начала опыта мы вынули из холодильника полумертвую птицу с температурой тела около 30 градусов вместо нормальной для голубя 41,5. Измерили дыхание и синтез АТФ в мышечных митохондриях. Оба показателя были близки к норме. Дыхание по-прежнему сопровождалось синтезом АТФ. Да, видно, не умеет голубь разобщать дыхание и фосфорилирование...

А может быть, умеет, да не успевает за те полчаса, которые длится наш жестокий опыт? Продлить его невозможно, несчастное животное просто умрет. Единственный выход— повторить охлаждение, дав голубю какое-то время на передышку.

На следующий день поведение голубя разительно отличалось от той трагической картины, что мы видели накануне. Снизив температуру на два-три градуса, голубь умудрился каким-то образом остановить дальнейшее остывание тела. Через три часа после начала охлаждения, заглянув в очередной раз в холодильник, мы обнаружили, что голубь ведет себя вполне бодро и как-то даже агрессивно посматривает на нас из своего ледяного плена. Ну а как там его митохондрии?

Есть разобщение! Дыхание отключилось от синтеза АТФ. Энергия больше не накапливалась, а тотчас превращалась в тепло.

Потом такой же опыт был проделан на мышах, и вновь при повторном охлаждении наблюдалось разобщение дыхания и фосфорилирования. Охлаждаясь впервые, мыши, как и голуби, не успевали (в наших суровых условиях опыта) отключить синтез АТФ и гибли, если охлаждение не прекращалось. С. Маслову удалось продлить им жизнь инъекцией искусственного разобщителя динитрофенола, вещества, о котором было известно, что оно нарушает сопряжение дыхания и фосфорилирования при добавлении к митохондриям.

Совсем недавно, спустя двадцать лет после этих опытов, нашу работу повторили молодые биоэнергетики, норвежец Г. Грав и американец с Аляски А. Блике, использовав мышечные митохондрии совсем другого животного — детенышей северных морских котиков. Оказалось, что в естественных условиях, плавая в холодных, около шести градусов, водах Берингова моря, котики имеют высокую скорость дыхания, которое не зависит от того, синтезируется АТФ или нет. Сопряжение дыхания с фосфорилированием можно было упрочить, выдерживая котиков на воздухе при плюс 20 градусах.

Любопытно, что Г. Грав и А. Блике впали, по-видимому, в ту же ошибку, как когда-то и я с Гарвеевской лекцией А. Ленинджера. Они вели свою работу, не зная о наших опытах двадцатилетней давности, и свою публикацию в журнале «Сайенс» представили как открытие новой, термогенной функции нефосфорилирующего дыхания в мышцах. Что же», их заблуждение (если оно было невольным) наверняка помогло преодолеть необычайные трудности работы с митохондриями на острове Св. Павла, где им пришлось ставить эти опыты.

Опыты на котиках подтвердили, что в естественных условиях действует механизм, который был обнаружен нами в лабораторном эксперименте и назван термо-регуляторным разобщением дыхания и фосфорилирования.

 

Бурый жир

Теплопродукция — дополнительная функция мышечной ткани. Мышца выполняет роль грелки, так сказать, по совместительству с механической работой. Но есть ткань, которая, как оказалось, специализирована на образовании тепла. Это бурый жир.

В верхней части спины теплокровных зоологи давно уже обнаружили островки жировой ткани необычного для жира коричневого цвета. Они облегают крупные кровеносные сосуды, идущие к головному мозгу. Особенно много этой ткани у новорожденных. С возрастом ее количество уменьшается, и только у впадающих в зимнюю спячку животных бурый жир сохраняется в значительном количестве на протяжении всей жизни.

Бурый жир

Так вот, выяснилось, что коричневый цвет необычной жировой ткани обусловлен митохондриями, которыми буквально забиты ее клетки. Физиологи давно уже подозревали участие бурого жира в терморегуляции. Когда же стало ясно, что он богат митохондриями, а митохондрии такой ткани, как мышца, способны при охлаждении переводить свое дыхание на холостой ход, возникла мысль посмотреть, как там у бурого жира с энергетикой. Работы велись в основном в трех лабораториях: Р. Смитом в США, О. Линдбергом в Швеции и 3. Драхотой в Чехословакии. И вот что обнаружилось.

Митохондрии бурого жира содержат почти в 10 раз меньше синтезирующего АТФ фермента по сравнению с митохондриями других тканей. В то же время количество ферментов дыхания находится на обычном уровне. Тем самым система, ответственная за освобождение энергии, оказывается в огромном избытке по сравнению с системой запасания энергии. Уже сам по себе этот факт свидетельствует, что не синтез АТФ, а образование тепла - главная функция митохондрий бурого жира. Такое предположение было подтверждено прямыми опытами, когда исследовали животных, подвергнутых охлаждению. В митохондриях бурого жира наблюдалось сильное разобщение дыхания и фоефорилиро вания.

В этой связи стала понятной своеобразная локализация бурого жира в организме: он согревает кровь, притекающую к мозгу. Благодаря открытию эффекта разобщения в митохондриях бурого жира удалось заполнить недостающее звено в цепи событий, совершающихся при пробуждении животного от спячки.

...Задолго до холодов хомяк оборудует себе зимнюю квартиру. Это глубокая нора, в которую ведет узкий вход. С наступлением морозов хомяк заделывает вход соломой, чтобы нору не продувало студеными ветрами. Теперь можно и соснуть до весны. Хомяк уютно устраивается в гнезде из сена, что припасено в дальнем конце норы, и засыпает. Но сон этот необычный. Постепенно тело хомяка остывает, все жизненные процессы замирают, вернее, замедляются, и не как-нибудь, а в такой степени, чтобы поддерживать температуру на минимальном уровне, чуть-чуть выше нуля.

Давайте проведем теперь такой опыт. Разворошим соломенную заглушку у входа в нору. Если в степи мороз, то холод быстро проникнет внутрь норы. И что же хомяк? Замерзнет? Ведь просыпаться ему еще рано, до весны далеко!

Не беспокойтесь, ничего страшного не произойдет. Хомяк вскоре пробудится от холода, как просыпаемся и мы с вами, если мороз заползет в спальный мешок. Проснется, заделает как следует вход и заляжет снова досматривать многосерийный сон про жаркое лето...

— Все это, конечно, забавно, но при чем тут биоэнергетика? — спросите вы.

А дело было так.

Снижение температуры в норе немедленно зарегистрировали холодовые рецепторы кожи, которые бодрствуют даже при зимней спячке, когда все прочие органы чувств отключены. Нервы доставили сигнал бедствия по точному адресу — в мозг, в терморегуляторный центр гипоталамуса. Оттуда, из центра, понеслись ответные сигналы — приказы органам и тканям. Но как их выполнить, ведь температура органов слишком низка, чтобы ответить активными действиями на пришедший приказ?

Есть ткань, способная к самосогреванию, — это бурый жир. В ответ на сигнал из гипоталамуса нервные окончания в буром жире начали выделять гормон, норадреналин. Он был заготовлен впрок в специальных пузырьках, которыми нафаршированы нервные окончания. Вся нехитрая задача на этом этапе, чтобы пузырьки полопались. Ломать - не строить, и вот уже содержимое пузырьков выплеснулось в узкую щель между мембраной нервного окончания и клеткой бурого жира,

На поверхности клетки 6ypprq жира особые белки (рецепторы) связали норадреналин. Белки эти, пронизывающие насквозь внешнюю мембрану клетки, активировали внутри клетки фермент аденилатциклазу, та сделала из АТФ циклический АМФ — особое вещество — регулятор ферментов, а этот последний присоединился к ферменту протеинкиназе. Протеинкиназа фосфорилировала следующий фермент — липазу. В результате липаза перешла в активное состояние и расщепила жир на глицерин и жирные кислоты.

Жирные кислоты — наиболее калорийное топливо для митохондрий и одновременно активатор для особого белка, переключающего дыхание на холостой ход. Активировалось холостое дыхание митохондрий, повысилась температура ткани.

С повышением температуры быстрее заработали дыхательные ферменты, значит, увеличилось образование тепла. Налицо автокатализ. За топливом (жирными кислотами) дело не стало. Ведь в клетках бурого жира, кроме митохондрий, есть еще и жировые кайли (на то он и жир!).

Разогрелся бурый жир, повысилась температура крови в сосудах, окруженных бурым жиром, теплая кровь поступила в мозг, а затем и в другие органы. Температура тела поднялась, зверек проснулся!

Вы спросите, зачем такая сложная, многоступенчатая система сигналов? Так ведь это же каскад усиления! Одна молекула гормона активирует одну молекулу аденилатциклазы, которая производит уже не одну, а множество молекул циклического АМФ. Каждая молекула циклического АМФ может активировать одну молекулу протеинкиназы, которая, в свою очередь, фосфорилирует множество липаз, и т. д. А на выходе повышение температуры, которое активирует все без исключения звенья каскада. Ответ такой системы на воздействие нарастает лавинообразно. Ну как тут хомяку не проснуться?

Образование тепла бурым жиром лишь частный случай из удивительной области регуляции биохимических процессов. О каждом из таких механизмов можно написать отдельную книгу. Однако наш главный интерес лежит сейчас в иной плоскости. Рассказ о хомяке и буром жире я здесь привел главным образом для того, чтобы показать существование специального биологического устройства, переводящего дыхание на холостой ход.

Итак, дыхание может быть отключено от фосфорилирования. Этого можно достичь искусственно, добавив динитрофенол или какое-либо другое вещество-разобщитель. Подобный эффект возникает и естественным путем в живом организме при воздействии холода. Таков феномен терморегуляторного разобщения окисления и фосфорилирования, открытый сначала в мышцах, а затем в ткани бурого жира.

Стало быть, окисление без фосфорилирования не артефакт, а реально существующий биохимический процесс. Именно этим свойством: способностью разобщать механизм освобождения энергии от механизма ее последующего накопления дыхание отличается от гликолиз — процесса, который наряду с дыханием призван обеспечивать клетку необходимой энергией.

В предыдущей главе мы уже говорили, что синтез АТФ, сопряженный с дыханием, первоначально пытались уподобить описанной ранее реакции образования АТФ при гликолизе. Это был в общем-то естественный этап познания, когда неизвестное явление стремятся свести к комбинации уже известных фактов. Однако гликолиз — процесс, неразрывно связанный с фосфорилированием. Поэтому никакие аналогии с гликолизом не в состоянии помочь нам разобраться в механизме термо-регуляторного разобщения дыхания и фосфорилирования.

Так как же должно быть устроено сопряжение двух процессов, чтобы была возможность их разобщения? Я вновь и вновь задавал себе этот вопрос и не находил разумного ответа.

 

Жертва «закона Паркинсона»

В 1961 году на Всемирном биохимическом конгрессе в Москве выступал с пленарной лекцией американец Д. Грин. Я слушал доклад со всевозрастающим волнением. Казалось, еще шаг, и группа Грина в Мэдисоне решит проблему превращения энергии при дыхании и фотосинтезе.

— Эту работу мы закончим к следующему конгрессу, — пообещал докладчик.

Можно ли сомневаться в его успехе?

Профессор Грин — блестящий специалист по окислительным ферментам. Ферментные комплексы, названные его именем, — излюбленный объект биоэнергетиков. Грин возглавляет институт энзимологии в университете штата Висконсин, славящийся своим сказочно дорогим оборудованием и неправдоподобными масштабами работы. Там рядами стоят десятки ультрацентрифуг, там за один день перерабатывают сотни килограммов бычьих сердец, за которыми будто бы посылают на чикагские бойни специальный самолет!

Прошло три года. Вновь конгресс биохимиков. Председательствующий Э. Слейтер дает Дж. Уэбстеру слово для внеочередного сообщения чрезвычайной важности. Уэбстер — правая рука Грина. Должно быть, Грин выполнил свое обещание? Так и есть: Уэбстер сообщает об успехе решающего эксперимента.

Это торжество Грина и, казалось бы, хороший повод для других биоэнергетиков сменить тему. Но стоит ли спешить, особенно если вы, подобно Э. Ракеру из Корнелльского университета, что в Итаке, посвятили биоэнергетике не один год жизни?

Ракер решает повторить опыты Уэбстера и сразу же, в самом начале работы, обнаруживает несоответствие: один из белков в Итаке движется на электрофореграмме не так, как в Мэдисоне. Ракер звонит Грину, чтобы поделиться своими сомнениями. Тот и слушать не хочет: какие там еще несоответствия?

— Мой Уэбстер прав, и точка!

Ракер задет за живое: своим глазам он верит больше, чем всей армии гриновских сотрудников.

И вот Ракер в Мэдисоне. Грин продолжает упорствовать. Ракер просит показать ему электрофореграмму. Грин посылает за Уэбстером. Тот появляется и, узнав о причине вызова к шефу, уходит в соседнее здание за протоколами опытов... Уходит и не возвращается. Более того, профессор Уэбстер исчезает! Его не могут разыскать ни в лаборатории, ни дома, ни у коллег по институту.

Грин в замешательстве. В конце концов и без помощи Уэбстера он находит протоколы и шаг за шагом проверяет результаты опытов. И тут всплывает чудовищный факт: в решающем измерении радиоактивности, когда определялось включение меченого фосфата в органическую фракцию, налицо явный разброс данных. При этом в опытных пробах (где ожидали включение фосфата) дальнейший расчет ведется по максимальным величинам, а в контроле (где такого включения быть не должно) по минимальным. Разность тех и других величин записывается в итог опыта и преподносится как его окончательный результат.

...Спустя месяц Уэбстер объявится в другом конце США, в Майами, и напишет Грину невразумительное письмо в свое оправдание, а еще через несколько недель Грин сделает сообщение на съезде американских биохимиков и разошлет его текст своим вчерашним конкурентам — биоэнергетикам. Название доклада «О вкладе Джорджа Уэбстера в изучение дыхательного фосфорилирования». Это чистосердечное признание в невольном обмане, на который толкнул его сотрудник-фальсификатор.

Но раскаяние не спасет профессора Грина. С тех пор ни один серьезный журнал не примет его статьи, и Грин будет публиковаться только в трудах Национальной академии наук (США), где он как академик защищен от критики рецензентов.

Казалось бы, жестокий и наглядный урок! Однако, как это ни удивительно, история Грина и Уэбстера повторяется спустя несколько лет. На сей раз другой почтенный биоэнергетик становится жертвой недобросовестности своей аспирантки, пытавшейся провести все тот же «роковой» эксперимент с включением фосфата.

Не подумайте, что биоэнергетика богаче проходимцами, чем любая другая наука. Чтобы убедиться в этом, достаточно прочесть, например, статью А. Лука «Плутовство в науке и облик ученого» в Вестнике АН СССР за 1980 год (№ 1). Приведу только один случай, описанный автором.

«В непрекращающемся жарком споре о том, наследуется ли талант, сторонники гипотезы наследственной одаренности обильно ссылались на работу по этим проблемам английского психолога С. Барта. Противник этой гипотезы американец Л. Камин, усомнившись в некоторых данных Барта, отправился за океан для изучения протоколов и архивных материалов. Однако никаких материалов он не обнаружил. Более того, оказалось, что Барт сфабриковал свои данные и подтасовал цифры, которые впоследствии перекочевывали из одной статьи в другую. Несколько позже обнаружилось, что два автора, которые одобрительно цитировали работу Барта в своих статьях на страницах редактируемого Бартом журнала и которых он, в свою очередь, цитировал в подтверждение собственных взглядов, на самом деле были плодом его воображения».

Выдумать не только факты, но еще и коллег, подтвердивших несуществующие наблюдения! Да, это, по-видимому, вершина научного плутовства!

Что же касается Грина, то он, быть может, дал жертвой «закона Паркинсона», который гласит: «Успех в научной работе порождает такое увеличение ее финансирования, что дальнейшее продолжение работы становится невозможным». Честь выступать с пленарным докладом на всемирном биохимическом конгрессе Грин заслужил работами, выполненными им самим и небольшой группой тщательно отобранных молодых сотрудников-энтузиастов. Шеренги ультрацентрифуг, самолет для бычьих сердец, армия случайных людей, чтобы; обслуживать громоздкую технику, — все это пришло позже как следствие уже достигнутых, успехов. Видимо, в какой-то момент Грин не совладал со свалившимся на него богатством,

Однако вряд ли его трагедию можно объяснить одним только «законом Паркинсона». Ведь в 1965 году, когда произошли описанные здесь события, Грин был уже давно сложившимся ученым с большим опытом руководства научным коллективом. И тем не менее он попался на удочку проходимца, которому, кстати говоря, выплачивали огромную зарплату, одну из самых высоких в институте.

Причину случившегося нам нужно искать в той ситуации, которая сложилась к этому времени в биоэнергетике.

В развитии каждой науки когда-то наступает звездный час, приближение которого лихорадит даже самые холодные и расчетливые умы. Так произошло с биоэнергетикой в 60-е годы.

В те времена звездный час переживали молекулярные биологи. Уже открыли двойную спираль ДНК. Шумно отпраздновали победу над тайной генетического кода. Расшифровали пространственную структуру первых ферментов. А вот биоэнергетики, не уступавшие «нуклеинщикам» и энзимологам в своих честолюбивых мечтах, все еще не могли ответить на вопрос, каким таким образом живая клетка обеспечивает себя необходимой энергией.

Такая ситуация казалась тем более странной, что давно уже были налицо все предпосылки решения этой проблемы. Стало ясно, какими энергетическими ресурсами пользуются те или иные живые существа. Были найдены и получены в чистом виде ферменты, усваивающие эти ресурсы. Не составило большого труда определить, в каких частях клетки происходят энергетические превращения. Однако сам принцип, на котором базируется действие основных биологических преобразователей энергии, остался неясным, как и прежде.

 

Ложная аналогия

Как мы уже знаем из предыдущих глав, живая клетка превращает энергетические ресурсы, например пищу, в такие вещества, которые могут быть окислены определенным ферментом. При окислении вещество (назовем его АН2) теряет электроны и протоны, которые присоединяются к другому, восстанавливаемому веществу (В). Выделяющаяся при окислительной реакции энергия используется для синтеза АТФ путем соединения неорганического фосфата с АДФ:

АН2 + В + АДФ + Н3РО4 → А + ВН2 + АТФ + Н2О

Невероятно, чтобы такая химическая реакция происходила в одну стадию — это потребовало бы одновременного взаимодействия всех четырех веществ, написанных в левой части уравнения. Поэтому приходится предположить, что процесс протекает с участием фермента в несколько этапов. Например:

АН2 + фермент → АН2 • фермент.

АН2 • фермент + В → А - фермент + ВН2

А - фермент + Н3РО4 → А - фосфат + фермент + Н2О

А • фосфат + АДФ → А + АТФ.

Именно так образуется АТФ при брожении или гликолизе, «подсобных» механизмах энергообеспечения, включающихся в условиях нехватки основных энергетических ресурсов: у растений - света, у животных и бактерий — кислорода или окисляемых кислородом веществ.

Ложная аналогия

В общем-то неудивительно, что механизм образования АТФ при дыхании и фотосинтезе вначале стремились объяснить по аналогии с уже изученными к тому времени брожением и гликолизом. Казалось, замени бродильный фермент на дыхательный или фотосинтетический, и та же система реакций будет образовывать АТФ за счет световых квантов или питательных веществ, сжигаемых кислородом.

Эта точка зрения, названная «химической схемой», стала общепринятой концепцией биоэнергетики в 50—60-е годы. В ее основу были положены хорошо известные факты, свидетельствовавшие о ключевой роли окислительных ферментов в дыхательном и фотосинтетическом синтезе АТФ. Но что это за роль?

Казалось бы, ясно: катализ окислительных реакций и их сопряжение с синтезом АТФ. Поэтому во многих лабораториях предпринимались отчаянные усилия заставить ферменты дыхания и фотосинтеза реагировать с АДФ и фосфатом, как того требовала схема.

Биоэнергетики шли дорогой, уже пройденной при изучении брожения. Сперва разрушали клетку, потом из множества внутриклеточных ферментов выделяли тот, который катализировал нужную окислительную реакцию. И наконец, к раствору очищенного фермента добавляли восстановитель, окислитель, АДФ и фосфат и смотрели, не получится ли АТФ.

Так вот, АТФ не получался!

Напрасно искусные экспериментаторы составляли всевозможные смеси белков, субстратов и солей, варьируя до бесконечности условия проведения реакции. С легкостью удавалось воспроизвести в пробирке окислительный процесс, но освобождающаяся энергия превращалась в тепло, вместо того чтобы использоваться для синтеза АТФ. Сообщения о синтезе АТФ в растворе дыхательных ферментов всегда оказывались в конце концов случайной ошибкой или преднамеренной фальсификацией, как это было, например, с Уэбстером.

В то же время более сложные системы, сохранявшие черты надмолекулярной организации биологических объектов: кусочки тканей, клетки, митохондрии и хлоропласты — или даже образующиеся при их разрушении ультразвуком мельчайшие пузырьки, окруженные мембраной, - все они в определенных условиях образовывали АТФ. Но стоило изменить условия, и даже на этих сложных объектах дыхание утрачивало связь с синтезом АТФ.

Уже первые исследователи дыхательного синтеза АТФ обратили внимание на ту необычайную легкость, с которой фосфорилирование ускользает, а дыхание переключается на «холостой ход». Сопряжение дыхания с фосфорилированием обнаружил Владимир Александрович Энгельгардт в 1930 году. А спустя несколько лет другой Владимир Александрович, Белицер, описал условия, когда дыхание отключалось от фосфорилированил и протекало без образования АТФ, несмотря на высокую скорость окислительной реакции. Так было открыто явление, названное разобщением дыхания и фосфорилирования. Именно этот факт оказался камнем преткновения для химической схемы биоэнергетики.

 

Парадокс веществ-разобщителей

Тот факт, что окисление может быть отключено от фосфорилирования, впервые описан при изучении брожения. Если сбраживать сахар в среде, где фосфат (Н3РО4) заменен на арсенат (H3AsO4), то брожение идет с большей скоростью, но без образования АТФ. Подобным образом действует арсенат и на дыхание: в присутствии арсената система дыхания перестает запасать энергию в форме АТФ. Именно арсенат был первым разобщителем дыхания и фосфорилирования в опытах В. Белицера. Казалось бы, это наблюдение лишь подчеркнуло еще раз сходство механизмов дыхания и брожения, чего и требовала химическая схема.

Осложнения начались с 1948 года, когда Ф. Липман неожиданно обнаружил, что дыхание разобщается и таким веществом, как динитрофенол, причем его требуется гораздо меньше, чем арсената. В отличие от арсената динитрофенол совсем непохож на фосфат. Фермент может принять арсенат за фосфат, но чтобы он перепутал фосфат- с динитрофенолом?.. Кстати, динитрофенол не действовал на брожение, и это могло бы зародить сомнения в сходстве механизмов дыхательной и бродильной энергетики.

Несколько лет эффект Липмана считали одним из курьезов, которыми не так уж бедна биохимия. Однако затем последовали наблюдения, показавшие, что разобщить дыхание и синтез АТФ можно не только динитрофенолом, но и салициловой кислотой, дикумаролом, перфторпинаколом, производными бензимидазола и фенилгидразона.

...Теперь, рассказывая студентам историю о разобщителях, я пишу формулы этих веществ на доске в конце первого часа лекции и предлагаю подумать о том, что же роднит разобщители между собой и почему все они одинаково: действу ют на дыхание?

Наиболее смышленым хватает пятнадцати минут перерыва, чтобы найти правильный ответ: все разобщители способны переносить протоны через мембрану. Науке для этого потребовалось больше пятнадцати лет. От частного в общем-то вопроса о действии веществ разобщителей биоэнергетики пришли к одному из крупнейших открытий современной биологии.

 

Начало пути

Однажды, просматривая в библиотеке биофака новые журналы, я наткнулся на короткую статью в «Нэйчер» под названием «Сопряжение окисления и фосфорилирования механизмом хемиосмотического типа». Автор П. Митчел — новое имя в биоэнергетике. И термин «хемиосмотический» тоже новый. Новое имя, новое слово и небывалый, смахивающий на фантазию подход кетарой проблеме.

...Пройдут годы, и заметка в журнале «Нэйчер» за 1961 год станет самой цитируемой работой по биоэнергетике, а ее автор — лауреатом Нобелевской премии, присужденной вопреки традициям этих премий, не за открытие какого-то нового явления, а за догадку о его существовании.

Питер Денис Митчел родился 29 сентября 1920 года в Митчепе (графство Суррей, Англия). Сын лейтенанта британской армии был отдан родителями в Тонтонский королевский колледж. Затем он студент колледжа Иисуса в Кембриджском университете. В 1943 году выпускник университета, бакалавр искусств.

В том же году Митчел начинает работать над диссертацией под руководством профессора Д. Даниэлли. Еще в 30-е годы Даниэлли прославился как автор изящной концепции о молекулярном строении биологических мембран. После отъезда Даниэлли из Кембриджа Митчел переходит в группу по изучению ферментов, которую возглавлял известнейший энзимолог М. Диксон (энзимология — наука о ферментах).

Чтобы стать кандидатом наук (в Англии это называется «доктор философии»), Митчелу потребовалось семь лет. Вторую диссертацию — на звание доктора наук — он так и не защищал, шагнув в 1974 году сразу в члены Королевского общества.

Студентом Митчелу довелось слушать лекции Д. Флеминга. Это было время, когда из английских госпиталей выходили фронтовики, чью жизнь спас Флемингов пенициллин. И в общем-то неудивительно, что темой своей первой научной работы молодой биолог выбрал механизм действия пенициллина на бактерии.

Сначала было исследовано включение меченого фосфата в нуклеиновые кислоты. Пенициллин тормозил этот процесс. В столь сложной системе, как живая клетка, такой эффект мог объясняться либо прямым действием пенициллина на синтез нуклеиновых кислот, либо влиянием на какой-то отдаленный этап обмена веществ, либо на клеточную стенку и перенос фосфата из среды в клетку. Именно тогда Митчел впервые уловил притягательную силу тайны, окружавшей роль фосфата в энергетике живых существ.

Но пройдут годы, прежде чем он вплотную займется этой проблемой. Пять лет после защиты диссертации Митчел работает демонстратором на кафедре биохимии Кембриджского университета, а затем его приглашают старшим преподавателем на кафедру зоологии в Эдинбург. В течении следующих восьми лет, проведенных здесь, в Шотландии, он мало печатается, не спешит с продолжением опытов по действию пенициллина. Постепенно он приходит к убеждению, что история с пенициллином всего лишь частный случай, за которым стоят куда более сложные вопросы.

Митчел как-то издалека, медленно, исподволь приближается к основной проблеме биоэнергетики. Сначала мысль о том, нельзя ли отнести пенициллин к загадочным разобщителям, благо в эту группу попадают самые разные по строению вещества. Казалось бы, взять да поставить опыт вроде того, что описал Ф. Липман еще в 1948 году! Но далеко ли Он продвинется вперед, если даже докажет, что пенициллин действительно разобщитель?

Одним разобщителем больше - невелико открытие! Не лучше ли поразмыслить над тем, что такое вообще разобщение дыхания и фосфорилирования? Ясно, что здесь дело в каком-то нарушении механизма, сопрягающего эти два процесса. А что это за сопрягающий механизм?

Митчел внимательно анализирует бытовавшие в то время; взгляды на природу дыхательного фосфорилирования. Казалось бы, ему, биохимику, должна импонировать химическая; схема сопряжения, объяснявшая энергетику дыхания наподобие уже известной энергетики брожения. Но как объяснить действие разобщителей?

Интуиция энзимолога (недаром Диксон — один из его учителей!) подсказала Митчелу, что динитрофенол и вся разномастная группа разобщителей не могут быть аналогами фосфата. Ферменты слишком разборчивы к объектам своей деятельности — субстратам, чтобы ошибаться так грубо.

Но что, если разобщители действуют не на фермент, а на его окружение?

Дыхательные ферменты отличаются от ферментов брожения тем, что они не плавают в клеточном соке, а прикреплены к мембранам. Так, может быть, именно мембрану и атакуют разобщители? Но зачем нужна мембрана ферментам вообще и дыхательным ферментам в частности? Вот вопрос, которым занялся Митчел, вспомнив беседы с другим своим наставником -Даниэлли, основателем учения о мембранах.

До Митчела биохимики, изучавшие мембранные ферменты, рассматривали мембрану как штатив, к которому эти ферменты крепятся. Считалось, что ферментативные процессы развертываются на поверхности, а не в «толще» мембраны. Такое мнение основывалось на факте, что субстраты ферментов — это, как правило, водорастворимые вещества. Казалось бы, они не должны проникать в сердцевину мембраны, сделанную из жира.

Однако для целой группы процессов транспорта веществ было с несомненностью установлено, что водорастворимые соединения проходят каким-то образом через жировой барьер мембраны внутрь клетки. Если, допустим, глюкоза, вообще нерастворимая в жирах, переносится через внешнюю мембрану клетки (а это факт!), почему бы не предположить, что она может быть атакована каким-то из мембранных ферментов прямо в мембране?

До Митчела химическими превращениями в мембранах практически не занимались. Изучение транспорта веществ через мембраны оставалось уделом физиологов-«транспортников». Биохимики рассматривали мембрану как помеху, от которой следует поскорее избавиться, чтобы перевести исследуемый фермент в раствор и там уже заняться им вплотную, используя весь арсенал энзимологии.

Столкнувшись с проблемами биоэнергетики, Митчел был поражен отсутствием каких бы то ни было контактов биохимиков с «транспортниками». Между ними лежала пропасть. И он занялся наведением мостов.

 

Чисто умозрительное построение

Итак, перед нами задача: сопрячь процесс дыхания с образованием АТФ, использовав каким-то образом свойства мембраны. Давайте рассмотрим еще раз реакцию синтеза АТФ:

АДРОН + НОР → АДPOP + Н2О

Молекула Н2О при образовании АТФ, обозначенного здесь АДРОР (буквами Р показаны атомы фосфора), может получиться из остатка гидроксила (ОН-), отщепляемого от неорганической фосфорной кислоты (обозначенной НОР), и иона водорода, или протона (Н+), взятого от аденозиндифосфата (АДРОН).

Вода — продукт не только синтеза АТФ, но и дыхания, которое, как мы уже знаем, формально описывается реакцией взрыва гремучего газа:

2Н2 + О2 → 2Н2О

с той разницей, что в процессе участвует не молекулярный водород, а органические вещества — субстраты дыхания, поставляющие атомы водорода для образования воды.

Чисто умозрительное построение

Если две реакции, образующие общий продукт, протекают в одной пробирке, то они в конце концов могут лишь замедлить друг друга. В то же время наша цель: объяснить почему дыхание активирует, увлекает за собой реакцию фосфорилирования аденозиндифосфата неорганической фосфорной кислотой. Итак, введя в поле нашего зрения воду, мы все еще не продвинулись к цели.

Вврочем, не совсем так. Появилась маленькая зацепка, ниточка, потянув за которую, можно попытаться распутать клубок.

Нам нужно, чтобы дыхание влияло на фосфорилирование, и эта цель достигнута: влияние уже есть. Беда в том, что оно направлено не в, ту сторону, куда хотелось бы: дыхание затрудняет реакцию фосфорилирования вместо того, чтобы облегчать ее. Но ведь мы не учли еще один непременный компонент системы — мембрану. Плохо, если вода, образующаяся при дыхании, и вода, образующаяся при синтезе АТФ, выделяются по одну и ту же сторону от мембраны, то есть в один и тот же отсек. Это равносильно протеканию двух реакций в одной пробирке. А что, если два процесса образуют воду по разные стороны от мембраны?

Тогда дыхание будет создавать избыток воды, образуя ее, например, слева от мембраны.

Допустим теперь, что синтез АТФ приводит к выделению воды справа от мембраны. Создается ситуация, когда синтез АТФ как бы компенсирует нехватку воды справа относительно возросшей (из-за дыхания) «концентрации воды» слева. Тем самым, в принципе говоря, тормозящее влияние дыхания на фосфорилирование должно смениться благоприятным эффектом: дыхание создает избыток продукта (воды) по одну сторону мембраны, а фосфорилирование уравнивает количества воды в двух отсеках, образуя воду по другую сторону мембраны. Таким образом, дыхание повышает вероятность реакции синтеза АТФ. Другими словами, дыхание сопрягается с фосфорилированием. Наконец-то!

Гипотеза всегда основывается на предположениях. Она может быть отвергнута, если хотя бы одно из предположений противоречит уже известным фактам. Нет ли таких противоречий в «водной»: гипотезе сопряжения?

К сожалению, есть. В предложенной схеме дыхание образует, а фосфорилирование нивелирует различие в количестве воды в двух отсеках, разделенных мембраной. Чтобы такая система работала, мембрана должна быть непроницаемой для воды. Если не выполнено это условие, избыток воды, образуемой слева от мембраны за счет дыхания, «утечет» на другую ее сторону, где воды меньше. В результате там количество воды повысится без всякого фосфорилирования, и энергия, выделившаяся при дыхании, будет безвозвратно потеряна.

Так вот, давно известно, что биологические мембраны проницаемы для воды. Они вообще не могут служить барьером для таких маленьких нейтральных молекул, как Н2О. Умозрительное построение «водной гипотезы» рушится!

Но может быть, из тех же блоков удастся создать что-нибудь более устойчивое?

 

Хемиосмотическая гипотеза

На, чем же мы споткнулись? На том, что мембраны — негодный барьер для воды, продукта дыхания и фосфорилирования. Но из чего получается вода, например, при фосфорилировании? Из иона водорода (Н+), отнятого от АДФ, и гидроксила (ОН-), отнятого от фосфата. Так ведь Н+ и ОН- — заряженные частицы, ионы, а для ионов мембраны, как правило, практически непроницаемы!

Химиосмотическая гипотеза

Итак, нам нужно, чтобы при синтезе АТФ получались не вода, а ионы Н+ и ОН-, да еще; по разные стороны мембраны.

Если бы теперь дыхание тоже образовывало не воду, а Н+ и ОН-, то можно; было бы так расположить ферменты в мембране, чтобы при дыхании ион Н+ выделялся слева от мембраны, а при фосфорилировании — справа от нее. Тогда окажется, что дыхание образует слева от мембраны кислоту, справа - щелочь, а процесс форфорилирования просто-напросто нейтрализует кислоту и щелочь!

Таким образом, реакция нейтрализации кислоты и щелочи, образованных дыханием, станет движущей силой процесса синтеза АТФ.

Чтобы завершить строительство «интеллектуального собора», - остается лишь догадаться, как именно дыхание образует кислоту и щелочь.

Известно, что окисление субстратов дыхания кислородом катализируется дыхательными ферментами. Они бывают двух типов, Одни присоединяют атомы водорода, другие присоединяют электроны. Если окислить донор водорода (AH2) ферментом — акцептором электронов (С), то одним из продуктов реакции окажутся ионы Н+:

AH2 + 2C → A + 2Ce- + 2H+

Если теперь восстановить кислород посредством Се-, то произойдет потребление ионов Н+:

2Ce- + O + 2H+ → 2C + Н2O.

Вот мы и свели концы с концами!

Такова хемиосмотическая гипотеза Митчела. Oна схематично изображена на рисунке.

Oкисление субстрата АН2 (реакция 1) ферментом — акцептором электронов, который не указан, чтобы не усложнять схему, происходит на левой поверхности мембраны. В результате электроны присоединяются к ферменту, а протоны уходят в воду.

Затем электроны переносятся ферментом на правую сторону мембраны и там восстанавливают молекулярный кислород или какой-нибудь другой акцептор водорода (в общей форме обозначен буквой В). Вещество В, присоединив электроны, связывает ионы Н+ справа от мембраны, превращаясь в ВН2.

Синтез АТФ (реакция 2) происходит таким образом, что два иона Н+ отщепляются от АДФ и фосфата справа от мембраны, компенсируя потерю двух Н+ при восстановлении вещества В. Один из кислородных атомов фосфата переносится на другую сторону мембраны и, присоединив два иона Н+ из левого отсека, образует ШО. Остаток фосфорила присоединяется к АДФ, давая АТФ.

По схеме Митчела, показанной на рисунке, роль дыхания в синтезе АТФ ограничивается созданием избытка Н+ на одной стороне мембраны по сравнению с другой ее стороной. Дыхание как бы сгущает, концентрирует ионы Н+ в одном из двух отсеков системы, разделенных мембраной. Это означает, что оно совершает осмотическую работу. Затем осмотическая энергия, накопленная в виде разности концентраций ионов Н+ между левым и правым отсеками, расходуется на химическую работу, то есть на синтез АТФ.

Вот почему Митчел назвал свою схему «хемиосмотической гипотезой». Она выгодно отличается от старой, «химической» схемы, приведенной на странице 36, по крайней мере в одном своем аспекте. Митчел обошелся без неуловимых промежуточных продуктов вроде АН2 • фермент, А • фермент и А • фосфат. Ему вообще не нужны были какие-либо специальные продукты, общие для реакций дыхания и фосфорилирования. По Митчелу, связующим звеном двух процессов служат водородные ионы.

Итак, хемиосмотическая гипотеза освободилась от одного из недостатков старых схем. В то же время она объяснила два ранее непонятных момента: необходимость мембран и механизм действия веществ-разобщителей.

Совершенно очевидно, что устройство, придуманное Митчелом, нуждается в двух пространствах, разделенных мембраной, непроницаемой для ионов Н+ и ОН-. Любое нарушение изолирующих свойств мембраны, например повышение ее проницаемости для Н+, то есть протонной проводимости, должно подавлять процесс синтеза АТФ. Что касается дыхания, то при повышении проводимости оно ускорится, так как перенос водорода и электронов, уже не приводящий к накоплению энергии, «покатится под гору», превращая всю энергию дыхания в тепло.

Так ведь это же и есть разобщение дыхания и фосфорилирования: тот самый феномен, над объяснением которого бились авторы «химических» гипотез, заставляя динитрофенол уподобиться фосфату в реакции с ферментом!

Митчел обратил внимание на то, что все разобщители — растворимые в жирах слабые кислоты, имеющие в своем составе обратимо связывающийся протон. Так возникло предположение, что разобщители служат переносчиками протонов через мембрану. Они связывают Н+ на той ее стороне, где дыхание создает избыток ионов водорода, затем диффундируют, неся лишний протон, через мембрану, и освобождают Н+ в противоположном отсеке, где водородные ионы в дефицит

 

Корни гипотезы

Пожалуй, только два факта (оба негативного свойства!) были положены Митчелом в основу его гипотезы в далеком уже 1961 году. Это невозможность найти химические продукты, которые были бы общими для дыхания и фосфорилирования, и необъяснимость роли мембран и действия разобщителей в рамках традиционных представлений, почерпнутых из аналогии с брожением.

Однако было бы ошибочным полагать, что хемиосмотическая гипотеза возникла совсем уж на пустом месте. Еще в 1945 году швед Г. Лундегард писал о возможности образования кислоты и щелочи мембранными окислительными ферментами. Лундегард был первым, кто «уложил» дыхательный фермент поперек мембраны, увидев в этом механизм концентрирования ионов. В 40-е годы эту гипотетическую концепцию подхватили И. Конвей и Т. Брейди, стремившиеся таким способом объяснить механизм образования кислоты в желудке. В начале 50-х годов ту же мысль обсуждали в Англии Р. Деви, А. Огстон и Г. Кребс (тот самый Кребс, имя которого увековечено на карте обмена веществ в связи с циклом карбоновых кислот). В 1960 году известный биохимик Р. Робертсон, избранный впоследствии президентом Академии наук Австралии, писал о разделении зарядов как о первичной стадии получения энергии, необходимой для синтеза АТФ.

Однако все эти предположения существовали сами по себе, разрозненно, их авторы не пытались создать единую схему, признанную объяснить механизм превращения энергии в митохондриях. Выдвинув гипотезу о разделении Н+ и ОН- при синтезе АТФ, Митчел заполнил недостающее звено, замкнул «протонный цикл» и создал непротиворечивую концепцию, позволяющую понять природу сопряжения между дыханием и фосфорилированием.

 

Одна из многих гипотез?

в 1961 году схема Митчела в краткой форме была тотчас напечатана журналом «Нейчер» (трудности с публикациями возникнут позже!).

Новую концепцию восприняли первоначально как еще одно умозрительное предположение в длинном ряду биоэнергетических гипотез. В начале 60-х годов была большая мода на эти гипотезы. Поскольку речь шла о главных системах энергообеспечения живых клеток, ясно было, что победителя ждет хороший приз, и каждый уважающий себя биоэнергетик спешил выдвинуть собственную схему энергетического сопряжения. Гипотезы возникли и, не выдержав испытания опытом, гибли, чтобы уступить место новым предположениям.

Некоторые из них казались столь фантастичными, что не удостаивались проверки: никто не спешил вкусить сомнительного вида плод, и он, перезрев, падал и исчезал в «быстром и мутном потоке информации». Это случалось прежде всего тогда, когда сам автор гипотезы не делал попытки проверить предсказательную силу своих постулатов.

Поначалу казалось, что такая судьба уготована и хемиосмотической теории. Шли годы, а Митчел все молчал. Прошел даже слух, что он вовсе удалился от дел.

 

Глинн Хауз. Ослы и дети

Митчел действительно не ставил опыты по проверке своей концепции. Вскоре после первой публикации гипотезы он тяжело заболел и решил оставить работу в университете, с начальством которого у него всегда были нелады. Он покинул Эдинбург и на деньги, только что полученные по наследству, купил ферму на самом юге Англии, в медвежьем (по английским понятиям) углу, в нескольких милях от маленького городка Бодмин, графство Корнуэлл. Эти места известны нам по Конан Дойлу («Собака Баскервиллей»): Бодмин расположен чуть к югу от тех мрачных болот, где произошли захватывающие события с участием Шерлока Холмса. Научных учреждений в этих краях нет, зато сохранились легенды о пиратах, избравших окрестности Бодмина местом своего последнего прибежища на английских островах.

Прежний владелец фермы, получив причитавшуюся ему сумму, поспешил удалиться, оставив Митчелу стадо коров, которых доктор философии вынужден был доить собственноручно, чтобы предотвратить их страдания.

На территории фермы находились развалины старинного дома, принадлежавшего во времена наполеоновских войн британскому адмиралу. Как показали раскопки, под адмиральским домом были погребены еще более древние развалины каменного строения, где жило когда-то семейство некоего Глинна, начавшего платить подати королю чуть ли не тысячу лет тому назад.

Митчел решил восстановить дом адмирала, а заодно и дом Глинна, заключенный в его недрах. Были приглашены архитектор и бригадир строителей, с которыми Митчел немедленно рассорился. Других в Бодмине достать было непросто, и хозяин решил сам взяться за постройку. Он нанял двух каменщиков.

- Чудесные простые люди, — рассказывал мне Митчел, - жаль только, что один из них совершенно неожиданно оказался беглым каторжником, осуждённым за убийство!

Когда полиция заинтересовалась одним из новых его коллег, Митчелу пришлось сколачивать другую артель. Эта задача была не без труда решена, и на, силоне холма у живописной речки Фой стали помаленьку вырисовываться очертания двухэтажного дома с дорическими колоннами вдоль фасада.

Здоровье Митчела пошло на поправку. Причиной тому была смена занятий, образа жизни и климата, а также, по-видимому, аскорбиновая кислота, которую он принимал в огромных количествах, следуя рецепту Л. Полинга (довольно редкий случай, когда один нобелевский лауреат по химии излечил другого, будущего нобелевского лауреата по химии).

Обосновавшись на новом месте и выздоровев, Митчел завел двух ослов — животных, которые, как он однажды мне признался, вызывают у него наибольшую симпатию. Других ослов в графстве Корнуэлл не было. По утрам Митчел запрягал одного из них в коляску и вез своих многочисленных детей в школу («Чтобы школа, — как говорил он, — не вызывала у детей слишком уж большой неприязни»). Затем отправлялся на ферму (в его руках она оказалась выгодным предприятием) или разъезжал по окрестностям в поисках развалившихся замков. Их восстановление стало новой страстью Митчела. Вплоть до недавнего времени один день в неделю он посвящал архитектурному надзору за возрождением какого-либо утраченного шедевра старинной архитектуры в Корнуэлле.

 

«Глинновские лаборатории»

Мир в Глинн Хаузе был взорван, когда однажды Митчел решил просмотреть пачку научных журналов за последние два-три года. С надеждой листал он страницы многочисленных статей по биоэнергетике. Что сталось с его гипотезой? Быть может, получены факты, ее подтвердившие? Или она опровергнута? Нет, хуже. Она не замечена.

Ах так! Митчел немедленно берется за организацию лаборатории, чтобы поставить опыты и проверить свою догадку. Он сразу же отказался от мысли вернуться в Эдинбург или любой другой город. Хватит с него тамошнего начальства и воздуха, отравленного автомобилями (еще один штрих к портрету: Митчел с одним из сыновей конструировал электромобиль). Лаборатория должна быть здесь, в Глинн Хаузе. Его собственная лаборатория — предприятие, независимое от всякой научной и ненаучной бюрократии.

А деньги? Что же, можно построить коттеджи и сдавать их дачникам. Кроме того, есть еще и доход от фермы! Но захочет ли кто-нибудь поехать в такую глушь, чтобы помочь ему в экспериментах? Посмотрим, не откликнется ли «старая гвардия», сотрудники его давно распавшейся группы в Эдинбурге.

Откликнулась Дж. Мойл. Пройдет несколько лет, и это имя прославится среди биоэнергетиков, но пока Мойл - безвестная и единственная соратница Митчела в его начинании. Нет слов, как благодарен он ей. И во вновь основанном научном предприятии под громким названием «Глинновские лаборатории для стимулирования фундаментальных биологических исследований» Митчел решает иметь двух директоров: это Мойл и он сам. Не беда, что директоров двое, а в их подчинении только один лаборант. Самоотверженность должна быть вознаграждена, и немедленно! Так Мойл стала директором.

Для лаборатории, размещенной в нескольких комнатах на первом этаже Глинн Хауза, Митчел закупил самое необходимое - центрифугу, полярограф, изотопов, реактивы. И начались опыты.

 

Первые опыты Митчела и Мойл

Митчел взялся за то, что было доступно при его более чем скромном оборудовании и, мягко говоря, не совсем укомплектованном штате.

Гипотеза предсказывала, что дыхание должно образовывать по одну сторону от мембраны кислоту, а по другую — щелочь. Так давайте в процессе дыхания мерить кислотность среды, благо для этого не требуется ничего, кроме рН-метра — простенького прибора, состоящего из пары электродов и вольтметра.

Первые опыты Митчела и Мойл

Из Печени белых крыс выделяли митохондрии, помещали их в бескислородные условия, а затем начинали реакцию окисления добавкой кислорода. Не изменится ли кислотность среды, в которой инкубируются митохондрии?

Первые опыты — первые неудачи. Но, может быть, рН-метр слишком груб, чтобы почувствовать небольшие сдвиги в концентрации Н+ ионов? Митчел становится стеклодувом и конструирует изящную ячейку совсем маленького объема и очень чувствительный электрод.

Вновь опыт с добавкой кислорода... Есть! Прибор регистрирует изменение рН. Среда закисляется, А что, если добавить вместо кислорода АТФ?

Снова закисление! Именно этого можно было ожидать, если бы АТФ расщеплялся той системой, которая в присутствии кислорода синтезирует АТФ.

Митчел и Мойл направляют в «Нэйчер» краткое сообщение, что их опыты подтверждают хемиосмотическую гипотезу.

 

«Варшавская битва». Поражение

Апрель 1966 года. Варшава. Европейский съезд биохимиков. Англичанин Б. Чэпел рассказывает о своих опытах с фосфолипидными мицеллами — полыми внутри сферическими частицами, стенки которых сделаны из жироподобных веществ, полученных из биомембран.

Oказывается, мицеллы отвечают на добавки веществ-разобщителей и антибиотика валиномицина точно такими же изменениями концентрации ионов калия и водорода, как митохондрии в опытах Митчел а и Мойл. Стало быть, разобщители и валиномицин атакуют липидный компонент системы, а не белки-ферменты: в мицеллах ферментов просто нет. Напомним, что сторонники «химических» схем сопряжения считали мишенью действия разобщителей именно ферменты. Казалось бы, новое подтверждение гипотезы Митчела? Oднако Чэпел пока уклоняется от такого вывода.

'Варшавская битва'. Поражение

После Съезда австралиец Э. Слейтер и польский биохимик Л. Войчак собирают семинар. Присутствует узкий круг специалистов по энергетике митохондрий. Среди них (впервые!) Митчел. Более того, ему оказана честь председательствовать на одном из заседаний.

Митчел использует вводное слово председателя, чтобы изложить хемиосмотйческую концепцию. В поддержку своей гипотезы он приводит полученное с Дж. Мойл данные опытов на рН-метре. Встает Б. Чане:

— А что будет, если в вашем, доктор опыте добавить вещество, связывающее ионы

— Я так полагаю, что ничего особенного не случится.

— Мы добавили такое вещество, и. все ваши изменения кислотности исчезли! Добавили кальция - и они возникли вновь. По-видимому, вы обнаружили какой-то побочный эффект» сопутствующий переносу кальция в митохондрии.

С Митчелом я впервые познакомился в Варшаве, Чанса знал уже пять лет, с Московского международного конгресса биохимиков. Двое спорящих являли собой разительный контраст: англичанин Митчел немного сутулый, с крупной головой и высоким лбом, редеющей шевелюрой чуть вьющихся седеющих волос, вспыльчивый и добродушный, как мистер Пикквик, и Чане? стройный, подтянутый американец с прямыми, гладко зачесанными назад волосами и жестким взглядом «морского волка» (в свои 54 года он стал чемпионом мира по парусным гонкам). Чане старше Митчел а на восемь лет, но он кажется моложе своего противника, динамичнее и гораздо приспособленней к спору.

Пытаясь опровергнуть Митчела, Чане применил свою «тяжелую артиллерию» физического эксперимента: прецизионный спектрофотометр для мутных сред, быструю регистрацию параметров в миллисекундной шкале времени и т. д. Митчел мог противопоставить этой новейшей американской технике лишь свой скромный самодельный рН-метр.

Вслед за Чансом Митчел а атакуют другие участники семинара.

А что же Чэпел? Он молчит...

Я прошу у Митчела слова. Но тот забыл о своих функциях председателя, смешался и потерял контроль над собранием. Вновь говорит Чане, Его слова как приговор несостоявшейся теории:

- Идея фантастична, результаты опытов неясны!

У меня сохранилась фотография: Митчел за кофе в перерыве между заседаниями, сразу после поражения. Рядом Чэпел. Митчел что-то доказывает своему собеседнику. Тот, отвернувшись, всем своим видом демонстрирует сомнение.

 

Серебряный звук трубы

Варшавский съезд стал одним из ключевых моментов в моей научной судьбе. После завершения работ по терморегулярному разобщению в мышцах (помните опыт со стрижеными голубями?) я понял: чтобы идти вперед, надо знать, как устроен загадочный механизм, сопрягающий дыхание с синтезом АТФ.

Вначале я отдал дань химической схеме. Но опыты, что мы вели с И. Севериной и Ю. Евтодиенко в одном из институтов на улице Вавилова, давали непредсказуемые результаты. Мы обнаружили кое-какие новые эффекты и даже открыли, сами того не желая, сильнейший дыхательный яд, но не приблизились к решению проблемы.

Я жил тогда у Калужской заставы. На моем пути к улице Вавилова был пустырь. Местами из-под песка пробивались зеленые ростки. Я загадал: если за лето пустырь покроется травой, мы на верной дороге. Вернувшись в конце августа из отпуска, я вновь увидел пустырь. По нему гулял ветер, закручивая песчаную пыль в маленькие смерчи. Земля осталась бесплодной.

К весне 1966 года стало ясно, что мы в тупике. В красной папке, где я обычно хранил программы будущих опытов моих сотрудников, впервые появился листок под девизом «План отступления». За мною тогда уже был отдел биоэнергетики в новой лаборатории, только что созданной в МГУ одним из отцов молекулярной биологии, академиком А. Белозерским.

Непросто было преодолеть инерцию. Идут опыты, публикуются статьи, делаются дипломные и аспирантские работы, и вдруг появляется шеф (шеф-то, кстати, без году неделя!) с сообщением, что прежний его план ни к черту, а двигаться нужно совсем в другую сторону...

Я все медлил, откладывал решающий разговор с ребятами в лаборатории и с таким вот настроением поехал в Варшаву. А здесь знакомство с Митчелом, баталия между ним и Чансом и, наконец, сокрушительное поражение Митчела.

Но не это, другое всплывает в памяти прежде всего, когда я вспоминаю Варшавский съезд. Полутемный конференц-зал, огромный экран, и на нем по темному фону белая кривая, неудержимо стремящаяся вниз. Опыт Б. Чэпела. Липидные мицеллы теряют калий, когда к ним добавили динитрофенол и валинамицин.

Выходит, мы три года искали то, что никто не терял! Не умный, всемогущий белок, а глупый липид, от которого только и требуется, что создать белку подходящие условия для его сложной работы, беспомощный, инертный жир — вот в действительности кто главное действующее лицо во всей этой драме под названием «разобщение».

Из Варшавы я отправился в Краков. Поезд пришел поздно вечером. Была темная, влажная весенняя ночь. По улицам прекрасного незнакомого города я отправился искать гостиницу. Вдруг где-то почти над моей головой в черном апрельском небе грянул тревожный серебряный звук трубы и оборвался на полуноте. Эти легендарный трубач с башни Марьяцкого собора возвещал о появлении врагов у городских стен и, сраженный вражеской стрелой, умолкал, не допев свою звонкую песню... С тех пор всякий pаs, когда я мысленно обращаюсь к весне 1966 года, из недр памяти возникает белая по черному фону кривая Чэпела и этот трубач на Марьяцком соборе.

 

Первая «Серая книга» Митчела

Вернувшись в тишину своего Глинн Хауза, повторил тот опыт, которым сокрушил eгo в Варшаве Чане. Напрасно Мойл вглядывалась в показания рH-метра: кислород не вызывал зачисления, если в среде было вещество, связывающее кальций. Так что же, Чане был прав там, в Варшаве? В этом конкретном опыте - да.

Первая 'Серая книга' Митчела

Такую гипотезу, как схема Митчела, нельзя доказать, имея в руках один только простейший рН-метр. Ни ее нельзя и опровергнуть столь простым способам!

А все-таки при чем тут кальций? Насколько велико в действительности должно быть закисление, если работает дыхательная цепь, закрепленная поперек митохондриальной мембраны?

Митчел садится за письменный стол, а опыты временно препоручает своей верной сотруднице Мойл и лаборанту.

Временно?

Нет, навсегда. Отныне Митчел уже, как правило, не участвует в опытах. Он пишет книгу. Свою первую книгу с подробным изложением хемиосмотическрй теории.

Собственно, книга была начата еще до Варшавы. Но в окончательном виде она была готова лишь к концу мая 1966 года. Не рассчитывая найти сколько-нибудь серьезное издательство, которое решилось бы на публикацию подробного описания только что публично отвергнутой гипотезы, Митчел напечатал книгу сам, на ротапринте.

Так появилась на свет брошюра в сером картонном переплете, на котором значилось: «Хемиосмотическое сопряжение в окислительном и фотосинтетическом фосфорилировании». Книга была разослана участникам варшавской дускуссии.

В конце того же 1966 года Митчела поддержала его Alma mater — Кембриджский университет, где согласились опубликовать сокращенный вариант «Серой книги» в «Байолоджикал ревьюз».

В своей книге, ныне одной из самых широко цитируемых работ по биоэнергетике, Митчел рассмотрел механизмы реакций, которые могли бы сопровождаться переносом протонов и электронов через мембраны. Там же содержался ответ на конкретный вопрос, в какой степени среда инкубации с митохондриями должна закисляться при добавлении кислорода. Расчет дал курьезный результат: оказалось, что Митчел и Мойл не могли увидеть закисления среды в своих опытах 1965 года, если бы это закиеление было обусловлено одним только разделением Н+ и ОН- в митохондриальной мембране.

Дело в том, что разделение противоионов должно создавать разность электрических потенциалов (ее обозначают Δψ) между двумя разграниченными мембраной отсеками. Если при дыхании ионы Н+ окажутся снаружи митохондрии, а ионы ОН- внутри, то внутренность митохондрии зарядится отрицательно, а внешний объем - положительно. Величина Для будет тем больше, чем больше противоионов будет разделено мембраной.

Но Δψ не может возрастать беспредельно. Чем выше величина отрицательного заряда внутри митохондрий, тем труднее дыханию поддерживать процесс разделения ионов Н+ и ОН-. В какой-то момент разделение зарядов прекратится. Это случится тогда, когда выигрыш в энергии при реакциях дыхания окажется недостаточным, чтобы покрыть энергетический дефицит, возникающий при разделении противоионов. Именно в этот момент дальнейшая зарядка электрической емкости мембраны станет невозможной.

Сопоставляя электрическую емкость мембраны и выделение энергии в процессе дыхания. Митчел заключил: мембрана зарядится так быстро, что кислотность снаружи митохондрий не успеет измениться сколько-нибудь заметным образом.

Не подрывает ли этот расчет хемиосмотическую гипотезу? Ведь мы говорили все время о нейтрализации кислоты и щелочи.

Оказывается, что нет.

Обратимся еще раз к схеме Митчела. Согласно гипотезе синтез АТФ рождает положительные заряды (Н+) во внутреннем пространстве митохондрий, то есть в отсеке, заряжающемся за счет дыхания отрицательно. Та же реакция синтеза АТФ приводит к уменьшению количества положительных зарядов (Н+) снаружи митохондрий, то есть там, где дыхание создает знак «плюс». Таким образом, синтез АТФ нейтрализует работу дыхательной системы, не только поставляя кислоту в защелачивающийся дыханием внутренний отсек митохондрии, но и образуя в этом отсеке положительные заряды. Тем самым дыхание может служить движущей силой для процесса фосфорилирования, даже не образуя сколько-нибудь заметной разности концентраций водородных ионов. Достаточно создания Δψ).

Но что же в таком случае измеряли Митчел и Мойл в своих первых опытах? Откуда взялось закиеление и что за магический эффект вещества, связывающего кальций?

Если закисление действительно было связано с работой дыхательных ферментов, то в условиях опыта электрическая емкость мембраны не ограничивала процесса разделения противоионов при дыхании.

Что, если в отрицательно заряженную внутреннюю полость митохондрии проникал какой-нибудь катион, например, кальций?

В своих опытах Митчел и Мойл не добавляли ионов кальция, но специально и не освобождались от них. Источником кальция могли быть реактивы, да и сами митохондрии. Но если все обстоит именно так, то давайте добавим кальций, и закисление должно возрасти... Митчел попросил свою сотрудницу поставить этот опыт. Закиеление резко увеличилось!

Таков был ответ Чансу. Но еще не доказательство гипотезы; скорее свидетельство ее непотопляемости теми средствами, которые употребил в Варшаве знаменитый яхтсмен.

 

Протонофоры

«Серая книга» Митчела окончательно укрепила мое убеждение, что новая концепция достойна стать рабочей гипотезой биоэнергетики, заменив неудачную химическую схему. К тому времени мы уже были подготовлены к принятию хемиосмотической гипотезы всем предшествующим развитием своих работ: открытием эффекта двух путей окисления, а затем терморегуляторного разобщения в мышечных митохондриях и, наконец, отрицательным итогом опытов по проверке одного из вариантов химической схемы.

В частности, Митчел давал простой ответ на вопрос о том, как можно представить себе быстрое переключение дыхания на холостой путь, например, при охлаждении организма. Напомним, что, по Митчелу, дыхание образует избыток ионов водорода по одну сторону мембраны митохондрии, а при синтезе АТФ эти избыточные ионы водорода потребляются. Достаточно повысить проницаемость мембраны для протонов, как Δψ и разность рН исчезнут без всякого синтеза АТФ, дыхание пойдет без фосфорилирования, а вся энергия окислительных реакций превратится в тепло.

Впоследствии оказалось, что в разобщении на холоде участвуют свободные жирные кислоты, которые действительно повышают проницаемость мембран для водородных ионов. Но это уже следующая история.

В 1966 году сотрудник института биофизики Е. Либерман задался целью получить искусственные мембраны с такими же электрическими характеристиками, что и мембраны биологические. Он добавлял к фосфолипидам, из которых делали искусственные мембраны, различные вещества и смотрел, не снизится ли сопротивление до величин, характерных для внешней мембраны нейрона, популярного объекта электрофизиологических исследований. Одним из соединений, снижающих сопротивление, оказались жирные кислоты. Именно эти вещества, как мы думали, могут играть роль природных разобщителей.

В том же году А. Ленинджер, уже упоминавшийся нами известный биоэнергетик и автор самого знаменитого учебника по биохимии, поставил опыт по действию динитрофенола на искусственную мембрану. Как и у Е. Либермана, это была так называемая черная: мембрана из фосфолипидов (черная — значит, такая тонкая, меньше длины волны видимого света, что уже не преломляет световых лучей). Мембрана закрывала небольшое отверстие в тефлоновои перегородке, разделяющей кювету на два отсека. В, каждый, из отсеков погружено по электроду, между ними вольтметр. В этой простой системе легко измерить сопротивление черной мембраны. Так вот оказалось, что добавка дицитрофенола в оба отсека кюветы или даже в один из них заметно снижает сопротивление мембраны.

Сопоставив эти два наблюдения: одно, сделанное в Пущине, и другое — в Балтиморе, — с результатами Б. Чэпела на фосфолипидных мицеллах, я решил, что перед нами прекрасная модель для проверки одного из постулатов хемиосмотмческой теории, а именно концепции разобщителей как переносчиков водородных ионов.

Как-то поздно вечером, возвращаясь из МГУ с знаменитого биологического семинара И. Гельфанда вместе с Е. Либерманом, я предложил ему взять несколько разобщителей и проверить их действие на сопротивление черных мембран. Он немедленно согласился, заметив с воодушевлением, что это будет его первый опыт, где в равной степени окажется интересным как положительный, так и отрицательный результат.

Сначала Е. Либерман испытал два вещества, в сто раз отличавшиеся по разобщающей активности: слабый разобщитель динитрофенол и сильный с длинным названием тетрахлортрифторметилбензимидазол (ТТФБ). Добавление динитрофенола снижало сопротивление мембраны, что уже не было новостью после опытов Ленинджера. А как поведет себя мембрана после добавления ТТФБ? Первое впечатление — от капли этого вещества она просто лопнула. Но нет, мембрана-то есть, а вот ее сопротивление — оно катастрофически снизилось.

Измерение показало, что ТТФБ снижает сопротивление черной мембраны примерно в сто раз сильнее, чем динитрофенол.

Из 18 атомов, образующих молекулу ТТФБ, только один — атом водорода. Если ТТФБ — переносчик водородных ионов, то можно было бы думать, что замещение этого единственного водорода (кстати, легкоотщепляющегося) должно лишить вещество его способности разобщать дыхание и фосфорилирование и понижать сопротивление черной мембраны. Опыт подтвердил и это предположение.

Затем был взят еще десяток разобщителей, и всегда вещества, более активные в опытах с митохондриями, были более активны и на искусственных мембранах. Кроме того, удалось предсказать разобщающее действие веществ, ранее не подозревавшихся в этом качестве. Если выяснялось, что определенное химическое соединение создает протонную проводимость в черных мембранах, то можно было не сомневаться: оно разобщит дыхание и фосфорилирование в последующем опыте с митохондриями. Это правило не знало исключений.

Так был сделан вывод о справедливости предположения Митчела, касающегося природы феномена разобщения.

Вещества, повышающие протонную проводимость искусственных и биологических мембран, я окрестил «протонофорами».

 

Красные флажки на карте

Работа по протонофорам вызвала ожесточенные споры, которые теперь, спустя 15 лет, кажутся уже не слишком интересными. Важно, что опыты оказались достаточно простыми, чтобы их воспроизвел любой биофизик, способный «повесить» черную мембрану на отверстие в тефлоновой перегородке. Вскоре термин «протонофор» замелькал на страницах научных статей, и изучение протонофоров стало новым направлением науки о мембранах.

Митчел воспринял приятную для себя весть по-своему. Он завел большую географическую карту мира и воткнул в Москву красный флажок.

Когда в 1975 году молодой сотрудник нашей лаборатории И. Козлов посетил Тлинн Хауз, он обнаружил, что карта усеяна красными флажками: так Митчел отмечал места, откуда приходили вести о подтверждении хемиосмотической теории.

Красные флажки на карте

Но в 60-е годы, о которых сейчас у нас идет речь, до победы было еще далеко. Не утихали схоластические споры вокруг бесчисленных гипотез энергетического сопряжения, причем каждый из авторов тщился защитить свое детище от нападок, забывая о том, что в науке важно не кто первый, а кто прав. Если автор получал результат, противоречащий его предположениям, но подтверждающий гипотезу Митчела, то он принимался перекраивать свою концепцию вместо того, чтобы идти вперед, следуя за опытом, а не за мертвой схемой «бумажной биохимии».

Еще в 1964 году американцы С. Мур и Б. Прессман описали интереснейшее явление: повышение калиевой проводимости мембраны митохондрий под действием валиномицина. Оказалось, что в присутствии этого антибиотика митохондрии начинают жадно поглощать калий в ответ на включение дыхания. Такой факт хорошо согласовывался с идеями Митчела. Ведь если дыхание создает разность потенциалов со знаком «минус» внутри митохондрий, то ион К+ должен идти внутрь, к минусу, как только повысится калиевая проводимость митохондриальных мембран.

Однако сами авторы вместо этого естественного (теперь!) объяснения придумали сложнейшую схему, чтобы как-то увязать свои результаты с химической гипотезой. Они еще долго потом держались за свою точку зрения, хотя уже в 1967 году А. Лев в СССР и независимо П. Мюллер в США показали, что валиномицин создает специфическую калиевую проводимость в черных мембранах. В том же 1967 году Митчел и Мойл использовали открытия Мура, Прессмана, Льва и Мюллера, добавив валиномицин вместо кальция в своих опытах с митохондриями на рН-метре. Предсказание гипотезы состояло в том, что ионы калия в этих условиях будут способствовать закислению среды при добавке кислорода подобно тому, как это делают ионы кальция. Опыты полностью подтвердили такое предположение.

Ионы калия оказались удобнее, чем ионы кальция.

В отличие от кальция они не связываются с содержимым митохондрий и не повреждают их структуры, даже если накапливаются там в достаточно больших количествах. Именно это обстоятельство позволило Митчелу и Мойл определить величину разности потенциалов (Δψ) на мембране дышащих митохондрий. Удалось измерить также и разность концентраций ионов Н+ между митохондриями и средой (сокращенно ДрН).

Зная Δψ и ΔрН, Митчел подсчитал общую величину протондвижущей силы, то есть потенциальной энергии ионов Н+ (протонов), выделяющихся из митохондрий при дыхании и «стремящихся» вернуться назад, внутрь митохондрий, туда, где создалась нехватка положительных зарядов и более щелочная среда. Протондвижущая сила, или протонный потенциал, оказалась порядка четверти вольта. Эта величина соответствовала энергетическому дефициту, который необходимо было покрыть при синтезе АТФ из АДФ и фосфата, если принять, что на каждую синтезированную молекулу АТФ внутрь митохондрий возвращаются два иона Н+.

Вряд ли такое количественное соответствие могло быть простой случайностью. Это наблюдение явилось еще одним доводом в пользу хемиосмотической гипотезы.

Однако оппоненты Митчела поставили под сомнение правомочность исходной предпосылки всей этой серии опытов. Где гарантия, говорили они, что валиномицин прошивает мембрану митохондрий насквозь, а не открывает ионам калия доступ к некой калиевой АТФазе, ферменту, который мог бы транспортировать калий внутрь митохондрий? К тому времени уже был описан во внешней мембране животных клеток фермент, переносящий калий за счет энергии гидролиза АТФ.

Митчелу нечего было возразить, но в душе он уже уверовал в свою правоту. Я помню его доклад в 1968 году на очередном европейском биохимическом съезде в Праге. Ученый вышел на трибуну в помятом дорожном пиджаке и принялся расхаживать, мягко ступая по сцене, победоносно поглядывая поверх стекол очков своими желтыми, немного кошачьими глазами. Время от времени он подходил к доске и, склонив набок крупную голову, рисовал по памяти графики опытов. Ему не смогла испортить настроение даже пропажа чемодана со всеми слайдами и парадным костюмом.

В кулуарах следом за Митчелом ходил пожилой, небольшого роста англичанин и поспешно записывал все его высказывания в дискуссиях, которые немедленно вспыхивали в компании биоэнергетиков, как только среди них появлялся вчерашний затворник из Бодмина. Меня заинтриговала эта фигура, слишком уж не соответствовавшая своей, по-видимому, секретарской роли.

— Кто это преследует Митчела? - спросил я у одного из своих английских коллег.

— Да это Гревил. Ему заказали обзор о гипотезе Митчела для одного из журналов, вот он и собирает материал!

А что же Чане? Чане, считавший своим долгом задать вопрос любому докладчику, чье выступление он удостоил своим присутствием, на сей раз хранил необычное молчание, как будто все происходящее его вовсе не касалось. Может быть, капитан спустил паруса, заметив неблагоприятное для себя направление ветра?

Тем временем Митчел пишет вторую «Серую книгу» и вновь издает ее на свой страх и риск. Потом ее публикуют полностью в международном журнале по биофизике в виде одной огромной статьи. Молодой американский биоэнергетик П. Хинкль, вскоре после этого приехавший к Митчелу поработать, говорил мне, что он никогда не видел такого счастливого человека, как Митчел, и такой счастливой семьи, как обитатели Глинн Хауза.

 

Конформационная гипотеза

Тем не менее борьба еще не окончена, и не только из-за калиевой АТФазы. Появляется на свет божий новая, так называемая конформационная гипотеза сопряжения. Она пытается избавиться от наиболее вопиющих недостатков химической схемы, не прибегая к протонному потенциалу. Автор конформационной концепции, американский биохимик П. Бойер, сразу же отказался от аналогий с брожением. Он не признавал мифических промежуточных продуктов вроде фосфорилированных ферментов дыхания. Предполагалось вместо этого, что перенос электронов дыхательным ферментом создает некую «напряженную конформацию», то есть сжимает молекулу фермента как пружину. Затем «конформационная энергия» передается АТФ-синтетазе, образующей прочный комплекс с дыхательным ферментом. Релаксация (расслабление) напряженной АТФ-синтетазы ведет к синтезу АТФ.

Напряженная конформация, расслабление... Это все было взято из энергетики мышечного сокращения. Если химическая схема уподобляла систему дыхательного фосфорилирования брожению, то конформационная брала в основу биохимию белков мышц, которыми долгие годы занимался Бойер.

Две концепции — калиевой АТФазы и конформационного сопряжения — были противопоставлены хемиосмотической гипотезе на рубеже 60—70-х годов. Вокруг этих концепций дружно сплотились бывшие сторонники химической схемы, чтобы противостоять протондвижущей силе. Тогда их было еще большинство. Но с каждым годом увеличивалось число сторонников Митчела, множились красные флажки на карте в Глинн Хаузе.

 

Ягендорф, Витт, Булычев и другие

Корнелльский университет в Итаке (штат Нью-Йорк), как мне объяснили по приезде в этот симпатичный городок на севере США, специализируется в подготовке ветеринаров и управляющих отелями. Не знаю уж, кому из них более интересен фотосинтез: ветеринарам, чьи подопечные нагуливают вес, поедая продукты фотосинтеза, или управляющим отелями, которым приходится следить, помимо прочего, за пальмами в гостиничных холлах.

Так или иначе в Корнелльском университете работал А. Ягендорф, специалист по фотофосфорилированию, то есть синтезу АТФ за счет энергии света в хлоропластах. До этого он провел некоторое время в лаборатории Митчела и, вернувшись в Итаку, решил проверить предсказательную силу новой гипотезы. Ягендорф поместил хлоропласты сначала в кислую, а потом в щелочную среду, измеряя при этом количество АТФ. Все манипуляции производились в темноте. Оказалось, что такая процедура ведет к образованию АТФ, как если бы мы на минутку выключили свет.

Система фотофосфорилирования работает без света. Удивительно?

А почему бы и нет, если, по Митчелу, свет нужен для синтеза АТФ только затем, чтобы разделить Н+ и ОН- и образовать разность электрических потенциалов между внутренним пространством хлоропласта и окружающим раствором. Перенеся хлоропласты из кислой среды в щелочную, мы, так сказать, своими руками создаем необходимую разность концентраций водородных ионов, которая будет поддерживать какое-то время синтез АТФ без всякого света.

Городу Итаке красный флажок!

Университет в Западном Берлине. Лаборатория профессора X. Витта. Исследуется электрохромный эффект Штарка: способность некоторых красителей менять свой спектр при помещении в сильное электрическое поле. Оказывается, пленки, приготовленные из смеси пигментов, содержащихся в хлоропластах, демонстрируют этот эффект. Интересно, конечно, но какое он имеет отношение к делу?

Самое прямое. Освещение хлоропластов вызывает спектральный сдвиг, подобный эффекту Штарка. Так, может быть, свет создает электрическое поле на хлоро-пластной мембране, где как раз и находятся исследованные Виттом пигменты? Тщательный анализ свидетельствует в пользу этого предположения.

Еще один флажок на карте...

А. Булычев, В. Андрианов, Г. Курелла и Ф. Литвин, сотрудники биофака МГУ, ставят опыты на растениях с очень крупными хлоропластами. В один из хлоропластов удается ввести микроэлектрод. Выясняется, что освещение вызывает образование разности потенциалов между хлоропластом и цитоплазмой клетки, куда введен другой электрод.

Рука Митчела тянется к красному флажку. Напрасно. Над Москвой красный флажок уже есть.

Но не думайте, что в Москве все шло так уж гладко. Когда я впервые рассказывал о хемиосмотической гипотезе на одной из всесоюзных конференций, то председательствующий быстро погасил мой пыл. Гипотеза, как было сказано, напомнила ему 20-е годы, когда все химические события в организме объясняли изменением баланса «кислых и щелочных едкостей». Шутка имела большой успех у аудитории.

На Международном ботаническом конгрессе, проходившем в нашей стране, физик Д. Чернавский выступил с заявлением о совершенной невозможности существования хемиосмотического механизма из сугубо теоретических соображений. Он говорил по-русски, а переводчика не было, так что один мой знакомый англичанин из всего выступления Чернавского понял только одно слово «Митчел», повторявшееся множество раз.

— Как все же у вас поддерживают Митчела! — сказал мне потом англичанин.

 

«Чудо-ионы»

После опытов с протонофорами мы взялись за проверку следующего постулата хемиосмотической гипотезы, а именно ее, так сказать «электрической части».

Митохондрия или хлоропласт - сложная штука, целое натуральное хозяйство внутри клетки, Может быть, когда-то это была самостоятельная клетка микроба, вступившего на путь симбиоза с более крупным хозяином. В митохондриях и хлоропластах есть множество ферментов, в том числе неизученных. Может статься, что среди них скрывается и калиевая АТФаза. Поэтому далеко не безопасно мерить разность электрических потенциалов (Δψ), используя природные ионы типа калия, как это сделал Митчел. Лучше бы взять ион искусственный, синтетический, непохожий ни на кого из своих природных собратьев. Но будет ли чужеродный ион проникать через митохондриальную мембрану?

'Чюдо-ионы'

К сожалению, скорее всего нет. Чтобы удерживать образуемую дыханием Δψ, мембрана не должна пропускать ионы. Только очень узкий круг вполне определенных, «избранных» природных ионов имеет возможность пройти через мембрану митохондрий. Среди них ион кальция, который избирательно накапливается в митохондриях при участии особого переносчика, локализованного в митохондриальной мембране. Но ион кальция не годится по той же причине, что и калий (а вдруг в митохондриях есть кальциевая АТФаза, подобная, к примеру, той, которую обнаружили в некоторых других типах мембран).

Давайте подумаем, почему ионы не проходят через мембрану в отстутствие веществ-переносчиков или специальных ионных каналов?

Все природные мембраны сделаны из жиров и «жирных» белков, то есть полипептидных цепей с высоким содержанием гидрофобных аминокислот. Итак, мебрана жирная. Ионы же в водном растворе окружены связанными молекулами воды («водной шубой»), и их сродство к жиру крайне низко. Именно поэтому мебрана — барьер для ионов.

Как же природа преодолевает эту трудность, столкнувшись с необходимостью повысить ионную проницаемость мебран? Обратимся к валиномицину, простейшему и наиболее изученному природному переносчику ионов (ионофору). Как показали академик Ю. Овчинников и его коллеги, валиномицин связывает ион калия своими гидрофильными карбонильными группами. При этом гидрофобные остатки аминокислот и оксикислот, образующих валиномицин, оказываются обращенными наружу, а калий занимает центральную полость молекулы антибиотика. Теперь калий окружен не водной шубой, а гидрофобными остатками, имеющими большое сродство к жиру. Так ион калия получает пропуск на вход в митохондрию.

Но такой пропуск нам не годится. Валиномицин очень разборчив в отношении иона-партнера и не связывает даже близкий по свойствам к калию ион натрия, Что уж говорить о неприродных ионах!

А если взять какое-нибудь синтетическое соединение, в котором заряд экранирован гидрофобными заместителями? Не обойдется ли такой ион без пропуска?

Е. Либерман завел свой старенький автомобиль и отправился по московским химическим институтам в поисках «чудо-иона», который, он был твердо уверен, пылится где-нибудь на полке у людей, не способных даже выговорить без запинки слово «фосфорилирование».

Вскоре Либерман вернулся к себе в подвал на Ленинском проспекте, 33, где в недрах одного из академических институтов у него была лабораторная комната. Портфель отяжелел от склянок с невиданными для биохимика веществами. Теперь уже его сотруднице Л. Цофиной пришлось встретиться с трудностями в произношении: «фенилдикарбаундекаборан...» Это анион, имеющий форму усеченного шара, сделанного из атомов бора. Кроме того, там есть фенильный остаток и отрицательный заряд, «размазанный» по всей этой ни на что природное не похожей молекуле, названной для краткости ФКБ-. А вот еще один анион: тетрафенилбор (ТФБ-). Он устроен попроще: четыре фенильных остатка, а в центре бор. Его «электрический антипод» — катион тетрафенилфосфоний (ТФФ+). Он построен так же, как ТФБ-, но вместо бора — фосфор, и в результате заряд «плюс».

— Почему вы взяли такое сложное для синтеза вещество, как ФКБ-? — спросил меня как-то сотрудник американской фирмы по производству реактивов, только что наладивший за океаном выпуск ФКБ- на продажу.

Я не стал его огорчать историей случайной находки ФКБ- и сказал, что это самый лучший среди проникающих синтетических анионов.

Либерман, Цофина и их сотрудники обнаружили, что искусственные мембраны практически не создают препятствия для движения ФКБ-. Несколько меньшей, но все же достаточно высокой проникающей способностью обладали также и кое-какие другие из реквизированных Либерманом ионов.

Но как поведут себя ионы-безбилетники в митохондриях? На этот вопрос вскоре смог дать ответ наш сотрудник А. Ясайтис. Оказалось, что они успешно заменяют калий и валиномицин в опытах «а lа Митчел и Мойл...».

Вскоре Либерман придумал простой метод измерения «чудо-ионов», и мы получили возможность непрерывно следить за концентрацией этих ионов в растворе.

Проникающие синтетические ионы вели себя в полном соответствии с предсказанием хемиосмотической гипотезы. При включении дыхания катионы послушно направлялись внутрь митохондрий, к минусу, а анионы наружу, к плюсу. Мы назвали это явление электрофорезом проникающих ионов (по аналогии с известным методом разделения заряженных веществ в электрическом поле). Но действительно ли дело в электрофорезе?

Что же, давайте еще раз проверим предсказательную силу «электрической» концепции.

Если обработать митохондрии ультразвуком, они распадутся на мелкие замкнутые пузырьки, окруженные как бы вывернутой наизнанку мембраной: в пузырьках грибовидные выросты АТФ-синтетазы смотрят наружу, в то время как в митохондриях они обращены внутрь. Изменение ориентации мембраны должно повлечь за собой и изменение направления электрического поля.

Опыт — и вновь удача! При дыхании или гидролизе АТФ наблюдалось поглощение анионов (а не катионов, как в опытах с митохондриями).

И в митохондриях, и в вывернутых пузырьках эффекты дыхания и АТФ полностью предотвращались разобщителями-протонофорами.

Когда я доложил результаты наших опытов на съезде европейских биохимиков в Мадриде в 1969 году, это вызвало яростную атаку со стороны Чанса. Он сразу понял, что работа с синтетическими ионами позволяет заполнить недостающее звено в цепи доказательства «электрической части» Митчеловой схемы. Чане четырежды выступал по поводу моего семиминутного сообщения, и мне пришлось мобилизовать все резервы, чтобы сдержать грозного противника.

Вернувшись из Испании, Чане тотчас воспроизвел опыты с синтетическими ионами. Для уточнения деталей был послан в Москву его «полномочный представитель» доктор А. Гозалбес. Осенью того же 1969 года в одном из биохимических журналов появилось сообщение Б. Чанса и соавтора, где эффект проникающих ионов был воспроизведен и истолкован в рамках схемы Митчела. Казалось, теперь уж наш капитан действительно спустил паруса.

Впоследствии проникающие синтетические ионы были неоднократно использованы в других лабораториях. Этим методом было выявлено образование разности электрических потенциалов на митохондриях из разных тканей, на бактериях и хлоропластах, то есть на всех основных типах мембранных структур, в которых образуется АТФ. Чтобы не перечислять каждый раз непривычные названия синтетических ионов, Д. Грин предложил всех их назвать «Скулачев-ионами», обозначая катионы Sk+, а анионы Sk-. Это, конечно, глубоко несправедливо, ведь за «чудо-ионами» ездил на машине не я, а Либерман.

 

История повторяется

Симпозиум по биоэнергетике 8-го Международного биохимического конгресса был вынесен в Люцерн. Других симпозиумов в сентябрьские дни 1970 года в Люцерне не проводилось, и потому любой оказавшийся там биохимик наверняка имел представление о митохондриях, П. Митчеле и Б. Чансе. Здесь можно было спокойно обсудить «классическую проблему» биоэнергетики, не опасаясь, что ваш собеседник на полуфразе вдруг сорвется с места и побежит на заседание слушать тех, кто синтезирует гены.

Собрание в Люцерне производило немного странное впечатление. Всюду царила та атмосфера напряженного ожидания, что возникает в компании, когда все уже в сборе, кроме виновника торжества. В торопливой и сбивчивой манере прочел свой доклад П. Митчел. Против него вновь выступили Э. Слейтер, Л. Эрнстер, Ф. Аццоне. Англичанин отвечал необычно резко, раздраженно. Его противники запальчиво возражали. Нельзя было не заметить, что в их докладах вновь появились варианты старой химической схемы, с которыми они вряд ли решились бы выйти на трибуну год назад. И снова Чане яростно отрицал право хемиосмотической концепции на существование, будто не он, а его двойник печатно признал в прошлом году Митчелово кредо.

— Вы видели статью Хантера? — В обращенном ко мне вопросе Митчела с трудом скрывается тревога.

В кулуарах Люцернского симпозиума о Хантере говорили все, хотя сам он в Швейцарию не приехал. Всеобщее возбуждение вызвала серия из четырех статей за подписью А. Пэйнтер и Ф. Хантера, появившаяся в одном из последних номеров «Сообщений по биохимии и биофизике». Сам факт, что этот международный журнал, предназначенный для срочных кратких публикаций, отступил от своих правил и принял целую серию статей одних и тех же авторов, свидетельствовал о сенсационном характере представленных материалов. Знакомство с работой подтверждало это впечатление.

В статьях Пэйнтер и Хантера из университета в Сент-Луисе сообщалось о синтезе АТФ в водном растворе, содержащем всего один небольшой по размеру белок — цитохром с. Процесс прекращался разобщителями, хотя никаких мембран в системе не было и не могло быть.

Этот результат оказался в вопиющем противоречии с концепцией Митчела. Его подтверждение означало бы конец хемиосмотической гипотезы: ведь у Пэйнтер и Хантера не было двух отсеков, разделенные преградой, и потому не могло происходить никакого разделения кислоты и щелочи, положительных и отрицательных зарядов!

Эпиграфом к одной из глав своей книги «Биоэнергетические механизмы» Э. Ракер взял слова Т. Гексли: «Трагедия науки: один гнусный маленький факт убивает прекрасную гипотезу». Но как человек, умудренный опытом современной биохимии с ее хитросплетениями путей обмена веществ и длинными рядами логических построений, Ракер, мудрый Ракер так комментировал великого биолога — «наблюдателя природы» прошлого века: «Давайте, однако, принимать эти гнусные факты такими, как они есть: в лучшем случае это косвенные данные, а подчас и артефакты. Прежде чем выносить заключение об убийстве, удостоверимся, что перед нами действительно труп. Хорошая гипотеза, право же, стоит нескольких гнусных маленьких фактов и нескольких сот негативных экспериментов».

Вернувшись в Москву, я прежде всего решил повторить опыты Пэйнтер и Хантера, благо их система была до чрезвычайности простой. Первые попытки — и неудача. Может быть, не те реактивы? Возьмем другие и проведем реакцию еще раз...

Эта проверка стоила мне нескольких седых волос, а нашей аспирантке Т. Гудзь пары месяцев короткого аспирантского срока. Стремясь повторить чужой опыт, я не надеялся на лавры победителя (они все равно достались бы Хантеру в случае подтверждения его работы). Отрицательный результат также не продвигал нас вперед Он мог лишь приглушить голос сомнения (а вдруг тогда, пять лет назад, в Варшаве, я ступил на ложный путь и повел своих товарищей «дорогой никуда», которых так много в науке?). Так кто же прав: Ф. Хантер там, в Сент-Луисе, или мы здесь, в Москве?

Еще до опытов по проверке Пэйнтер и Хантера я написал в отчете о Люцернском симпозиуме для «Успехов современной биологии»: «Известный оптимизм в отношении результатов предполагаемой проверки внушает огромный опыт Хантера в области окислительного фосфорилирования... По широте фронта исследований них продуктивности группа в Сент-Луисе всегда уступала ведущим американским центрам, таким, как лаборатории Ленинджера, Чанса, Грина, Ракера. Однако работы Хантера, не слишком яркие по своему значению, неизменно отличались высоким запасом прочности: за двадцатилетний срок ни одна из них не была опровергнута или поставлена под сомнение. Вот почему публикация Хантера была воспринята без того скепсиса, с которым встречали в последнее время любые работы, претендующие на решение проблемы окислительного фосфорилирования»

...Спустя несколько месяцев до нас дошел слух, что все данные сенсационных статей двух американцев фальсифицированы. Вскоре стали известны подробности этого нового скандала в биоэнергетике. Пэйнтер, как за шесть лет до этого Уэбстер у Грина, использовала разброс данных по включению меченого фосфата в АТФ, чтобы убедить Хантера, руководителя ее аспирантской работы, в том, что в растворе происходит синтез АТФ. Вот вам и аккуратист Хантер! Что же, и на старуху бывает проруха!

 

Карфаген должен быть разрушен!

Уже после первого нашего совместного опыта с разобщителями в 1966 году Е. Либерман заявил, что хемиосмотическая гипотеза доказана. Мне полученный результат показался условием необходимым, но недостаточным. Чтобы решить спор, мы затеяли работу с синтетическими ионами. По ее завершении у меня исчезли последние сомнения. Действительно было установлено, что и дыхание и гидролиз АТФ могут образовывать разность электрических потенциалов (Δψ) и разность концентраций водородных ионов (ΔрН), то есть протонный потенциал:

Карфаген должен быть разрушен!

дыхание → протонный потенциал ← АТФ.

Приняв, что второй процесс обратим, мы получим:

дыхание → протонный потенциал → АТФ.

Другими словами, дыхание и фосфорилирование связаны через протонный потенциал,

Синтез АТФ за счет искусственно созданной ΔрН был обнаружен еще А. Ягендорфом. O том, что Δψ также может служить источником энергии для фосфорилирования, говорили опыты Б. Прессмана, поставленные в 1967 году. Митохондрии выдерживали с ионами калия и затем помещали в среду без калия. Для повышения калиевой проводимости мембран добавляли валиномицин. Выход ионов калия из митохондрий в бескалиевую среду создавал нехватку положительных зарядов внутри митохондрий. Если бескалиевая среда содержала АДФ и фосфат, то синтезировался АТФ.

Сопоставив эти данные с результатами опытов, описанных выше, я решил, что настало время объявить о доказательстве Митчелова принципа сопряжения.

Доклад на Европейском биохимическом съезде в Варне в 1971 году показался мне подходящим случаем, чтобы выступить с этим заявлением.

Бог мой, что тут началось! После более чем оживленной дискуссии, выплеснувшейся в кулуары конгресса, один из оппонентов заметил, что даже Митчел, отсутствовавший в Варне, вряд ли счел бы мое выступление своевременным. Действительно, спустя некоторое время я получил конверт со штемпелем «Бодмин» и посланием Митчела, где он писал, что считает меня слишком большим энтузиастом хемиосмотической теории.

Мы вновь увиделись с ним через год, на следующем съезде европейских биохимиков. Митчел председательствовал на моей лекции, и я не без волнения вновь показал уже несколько затертый заключительный слайд своего варненского доклада, сопроводив его латынью: «Ceterum censeo Carthaginem delendam esse!» («При всем том я думаю, что Карфаген должен быть разрушен!»)

Председатель уже не возражал. Видно, латынь пришлась по душе выпускнику колледжа Иисуса в Кембридже! Желтые глаза Митчела лучились, он, кажется, даже приоткрыл от удовольствия рот, показав язык нашим оппонентам в зале,

- Вы будете держать флаг, - сказал мне Митчел, уезжая в Англию накануне постсимпозиума по биоэнергетике, где предполагалось нелицеприятное обсуждение конкурирующих теорий. Он вообще (а после Варшавы в особенности) не любил открытых дискуссий.

— Мой компьютер работает медленно, — говорил он, постукивая пальцем по своему высокому лбу.

Бой на постсимпозиуме пришлось принять мне.

Что же возразили наши противники?

Их главный аргумент состоял в том, что митохондрия слишком сложна, чтобы имеющийся в наших руках материал был достаточен для вывода о сопрягающей роли протонного потенциала.

- Почему вы думаете, — спрашивали меня, - что протонный потенциал стоит между дыханием и АТФ, а не где-нибудь в стороне? Например:

дыхание → АТФ → протонный потенциал или

протонный потенциал → дыхание → ? → АТФ?

Напрасно я говорил о том, что хемиосмотической гипотезой предсказаны явления, мысль о существовании которых не могла даже прийти в голову, если придерживаться любой другой схемы. Оппоненты были неумолимы. Практически все маститые биоэнергетики, присутствовавшие в зале, не разделяли моей точки зрения.

После истории с Уэбстером и Грином, Пэйнтери Хантером они уже ничему не верили на слово. Каждый хотел на собственном опыте убедиться в правоте логического построения и отсутствии альтернативных объяснений.

 

Протеолипосомы

Итак, к 1972 году дискуссия между сторонниками хемиосмотической теории и ее противниками переместилась в новую плоскость. Если раньше ставилось под сомнение само существование протонного потенциала, то теперь речь шла лишь о том, как образуется этот потенциал и какова его роль в энергетике клетки.

Очередной вопрос, на который предстояло ответить, состоял в следующем: действительно ли есть два пути образования протонного потенциала: один, использующий энергию дыхания, и другой, использующий энергию АТФ, или существует лишь один такой путь (либо дыхание, либо АТФ).

Протеолипосомы

Чтобы решить эту проблему, необходимо было разделить ферменты, участвующие в дыхании и гидролизе АТФ, и показать, что каждый из них, взятый в отдельности, может образовать протонный потенциал. Следовало сперва разобрать мембрану митохондрий на части — разделить белки и липиды, потом очистить какой-либо один тип белков, например дыхательный фермент, и после этого посмотреть, может ли этот фермент образовать протонный потенциал.

— Позвольте, - возразите вы, — но ведь протонный потенциал — это трансмембранная потенциальная энергия протонов, а мембрану-то мы уже разрушили!

— Ну и что? Сначала разрушили, а теперь сделаем, да такую, что в ней будет только один тип белков - дыхательный фермент!

— А если природная мембрана, однажды разрушенная, вообще не может быть воссоздана? Если мембрана происходит от мембраны, как клетка от клетки?

— Волков бояться — в лес не ходить.

Э. Ракер волков не боялся (хотя бы потому, что, как говорят, в штате Нью-Йорк они давно вывелись). И вот в Корнелльском университете началась работало самосборке мембран. Многие месяцы подряд японский стажер Я. Кагава испытывал разные белки, фосфолипиды и способы разрушения мембран, пока наконец один из вариантов опыта не принес надежду на успех. Взяв фосфолипиды из сои и фермент АТФазу из митохондрий бычьего сердца, Кагава растворил их в воде с помощью одной из желчных кислот. Затем он осторожно удалил желчную кислоту и обнаружил, что в растворе получились пузырьки, способные расщеплять АТФ. Скорость распада АТФ повышалась динитрофенолом, что могло бы свидетельствовать о генерации протонного потенциала на мембранах пузырьков.

Незадолго до опытов Кагавы в лабораторию Ракера возвратился из годичной стажировки П. Хинкль, посланный Ракером к Митчелу на выручку. Хинкль не только освоил новую теорию, но и провел в Глинн Хаузе ряд изящных опытов с митохондриями, исследуя один из дыхательных ферментов, цитохромоксидазу. Вернувшись в Итаку, Хинкль заразил Ракера своим митчельянством так, что тот стал первым из признанных корифеев биоэнергетики, кто поддержал Митчела.

Если АТФаза и АТФ-синтетаза, рассуждали Ракер и Хинкль, — это один и тот же фермент, а роль дыхания состоит только в том, чтобы образовать протонный потенциал, необходимый для фосфорилирования, тогда стоит лишь включить в АТФазные пузырьки Кагавы еще и дыхательный фермент, как они, эти пузырьки, начнут образовывать АТФ за счет дыхания.

Ракер засучил рукава белоснежного халата и взялся встраивать цитохромоксидазу в АТФазные пузырьки Кагавы.

Вскоре в американском биохимическом журнале появилось сенсационное сообщение, подписанное Э. Ракером и его лаборанткой А. Кандраш, о самосборке системы дыхательного фосфорилирования. Пузырьки, содержащие АТФазу и цитохромоксидазу, образовывали АТФ при окислении аскорбиновой кислоты. Синтез АТФ полностью прекращался добавлением разобщителей-протонофоров.

Услышав об открытии Ракера, я попросил А. Ясайтиса наладить получение таких же пузырьков здесь, в Москве. Сказано — сделано! И вот уже передо мной три пробирки: водной пузырьки с АТФазой, в другой — с цитохромоксидазой, а в третьей — с двумя этими ферментами вместе. Попробовали проникающие ионы. Как и следовало ожидать, в белково-липидных пузырьках происходил электрофорез синтетических ионов.

Источниками энергии для транспорта наших ионов могли служить: в АТФазных пузырьках — гидролиз АТФ, в цитохромоксидазных — дыхание, а в смешанных — оба эти процесса. Восстановителем цитохромоксидазы служил водорастворимый белок цитохром с.

Удалось приготовить цитохромоксидазные пузырьки двух типов: одни с цитохромом с внутри и другие с цитохромом с снаружи. В первом случае внутренность пузырьков должна заряжаться положительно, во втором — отрицательно. Чтобы проверить, правильно ли это предположение, были взяты два очень близких по структуре, но разных по заряду иона — ТФБ- и ТФФ+. Оказалось, что при дыхании пузырьки с цитохромом с внутри поглощают ТФБ-, а пузырьки с цитохромом с снаружи поглощают ТФФ+.

Так сбылось еще одно предсказание гипотезы, а в целом был сделан новый шаг вперед. Теперь я уже мог ответить моим критикам: протонный потенциал есть общий продукт двух разных ферментативных систем — дыхательной и АТФазной.

Вообще мне чрезвычайно понравились эти самые фосфолипидные пузырьки, инкрустированные очищенным белком, — простейшая модель, где еще сохранялась интересовавшая нас функция, то есть преобразование химической энергии в электрическую. Я назвал такие пузырьки протеолипосомами, и это имя, кажется, прижилось.

Занятно следить за новыми словами, которые ты придумал, чтобы выпустить в большой мир. Вводить новые слова приходится не ради забавы, а по необходимости, чтобы как-то назвать невиданный раньше предмет, явление или свойство.

Бывает, что слова отражают характер их создателей, которые иногда, не задумываясь о последствиях, пускают в обиход научных статей поспешные творения лабораторного жаргона. Мне кажется, что термин «дигидрокодегидрогеназа» придумал человек либо очень скучный, либо не очень внимательный к своей речи. Но он был первооткрывателем, и термин этот, хоть и неблагозвучный, продержался в биохимической литературе десятки лет, пока не была расшифрована химическая структура так неудачно названного вещества. Потом это слово бесследно исчезло из языка, уступив место буквенному сокращению его структурной формулы.

Иной раз язык активно противится новому слову, выталкивает его, не принимая неудачника в свое лоно. Академик М. Колосов рассказывал мне, что термин «алкоголиз», то есть лизис (расщепление) какого-либо вещества алкоголем, употребленный в посмертном издании трудов академика М. Шемякина, корректоры упорно исправляли на «алкоголизм», и, хотя на всех стадиях корректуры злосчастное «м» безжалостно вымарывалось, в самый последний момент в типографии все же восстановили эту букву, уверенные, что она случайно потерялась на предыдущей стадии полиграфического процесса.

Особенно трудны, а иногда и просто опасны неологизмы, связанные с переводом вновь возникшего термина на иностранный язык. Так, в своем труде о Марсе Дж. Скипарелли написал по-итальянски canali, имея в виду борозды. Затем это слово было механически перенесено в английский и другие языки, что определенно способствовало созданию бума вокруг несуществующих марсианских каналов.

Решив опубликовать по-английски работу о протеолипосомах, я долго не мог придумать, как назвать операцию включения белка в липидный слой мембраны. В конце концов остановился на глаголе inlay («инкрустировать»). Когда же потребовалось соответствующее причастие («инкрустированный»), я написал «inlayed», забыв, что inlay - глагол неправильный, как и lay, от которого он происходит, и его причастная форма должна писаться «inlaid».

Свою ошибку я обнаружил лишь после того, как статья вышла в свет. Старейшее в мире издательство «Элзевир», что в Голландии, не заметило моей оплошности, и не существующее в английском языке слово «inlayed» смотрело теперь на меня с набранного крупным шрифтом заглавия статьи.

Я долго сокрушался по поводу своей безграмотности. Представьте же себе мое изумление, когда спустя несколько лет после этого случая я вдруг обнаружил свое «inlayed» в статье известного мексиканского биохимика. Повторяя наши опыты и производя ту же операцию включения белка в мембрану, он употребил причастие «inlayed». Потом я встретил такое же написание у своего коллеги из Индии, затем у немца, а недавно в статье группы американских авторов. Видимо, «inlayed» стало термином.

 

Драчев и бактериородопсин

Л. Драчев никогда специально не изучал ни биологии, ни химии. Даже в школе. В связи с военным временем и нехваткой учителей вместо этих предметов преподавали математику.

Окончив физфак МГУ, он занялся ионосферой, а потом лазерами. Нас познакомил Либерман. Он же сагитировал Драчева включиться в биоэлектрическую эпопею. С легкой руки ректора МГУ Р. Хохлова Драчев стал сотрудником нашей лаборатории.

Услышав истории о проникающих ионах, протеолипосомах и прочих премудростях биоэнергетики, Драчев флегматично заметил, что электричество, если его действительно генерируют мембранные белки, хорошо бы мерить вольтметром и амперметром.

Мы сами знали, что хорошо бы, и потому не сочли мнение Драчева за снобизм чужака-физика. Проникающие ионы, электрохромизм в опытах Витта или открытые позже флуоресцентные красители, реагирующие на Δψ, — это все же косвенные методы. А в столь сложной системе, как биологическая, одно прямое измерение стоит сотен косвенных. Например, такое чуждое для живой клетки вещество, как ТФБ-, совершенно неожиданно оказалось восстановителем для одного из ферментов в хлоропластах. А ведь ТФБ- считали биологически инертным соединением! Так что мы сразу согласились с Драчевым.

Однако как прямо измерить производство электричества белками? Вводить микроэлектрод в митохондрию? Но она слишком сложна.

Мое воображение уже было отравлено гениальной простотой протеолипосом. Микроэлектрод в протеолипосому? Так ведь она всего 0,1 микрона в диаметре!

Нет, это не путь. А если включить белок — генератор тока в черную искусственную мембрану? Тогда бы мы измерили разность потенциалов и ток обычными электродами, помещенными в растворы по обе стороны от перегородки, отверстие в которой закрыто мембраной. Но как включить белок в черную мембрану?

Белки, генераторы электричества, как и другие мембранные белки, в воде нерастворимы. Попробуем добавить их к раствору фосфолипидов в декане, который применяют обычно для образования черной мембраны. А какой взять белок?

Конечно, тот, что может использовать энергию света! Добавлять растворы окисляемых веществ или АТФ в таком опыте неудобно: черная мембрана вообще непрочна. Это, по существу, оболочка мыльного пузыря. Да еще белковые включения, которые, вероятно, прочности мембране не прибавят! Капля любого раствора может ее разрушить. Свет, безусловно, удобнее.

Итак, должен быть какой-то из белков, участвующий в усвоении энергии света, то есть в фотосинтезе.

Как раз в это время У. Стокениус и Д. Остерхельтв США описали новый тип светочувствительных белков бактериородопсин. Как выяснилось, у солелюбивых бактерий есть фиолетового цвета белок, содержащий, подобно зрительному пурпуру глаза — родопсину, — производное витамина А — ретиналь. Было получено косвенное указание на то, что бактериородопсин может переносить через мембрану водородные ионы за счет энергии света, заменяя содержащие хлорофилл белки обычных организмов-фотосинтетиков.

В конце 1973 года академик Ю. Овчинников организовал проект «Родопсин» для сравнительного исследования животного и бактериального пигментов. Мы занялись изучением бактериородопсина, используя препарат, полученный в Институте биофизики Л. Чекулаевой, тогда сотрудницей лаборатории Л. Каюшина. Были приготовлены протеолипосомы с бактериородопсином в качестве белка. Затем методом проникающих ионов была доказана способность бактериодопсина превращать свет в разность электрических потенциалов.

Я хорошо помню эти опыты. Особенно удачно они шли по воскресеньям, когда в опустевшей лаборатории никто не ходил мимо прибора и тончайшая фосфолипидная мембрана, измеряющая концентрацию ФКБ-, стояла, не лопаясь, в течение нескольких часов кряду. Я включал и выключал свет, наслаждаясь стабильностью и воспроизводимостью обнаруженного явления. Бактериородопсин работал как часы: протеолипсомы безотказно поглощали анионы (ФКБ-) в ответ на свет и отдавали их в среду в ответ на «тьму». Приходя после опыта домой, я развешивал ленты самописца по стенам, чтобы полюбоваться ими на сон грядущий.

Бактериородопсин оказался действительно на редкость стабильным генератором протонного потенциала. Эту его способность не могло убить нагревание до 100 градусов, помещение в 0,1 N кислоту и, как мы выяснили вместе с сотрудниками Овчинникова, даже расщепление белка в трех местах протеолитическим ферментом. Поэтому неудивительно, что было решено попытать счастья с прямым измерением разности потенциалов, используя именно бактериородопсин. План был прост: добавить бактериородопсин к смеси для приготовления черной мембраны и посмотреть, не приведет ли освещение такой мембраны к генерации тока.

Никогда не прощу своим товарищам, что они не позвали меня к прибору, когда впервые осветили мембрану с бактериородопсином. Осторожный Драчев, улыбаясь и пощипывая бородку, сообщил мне о генерации фототока лишь на следующий день.

Так в прямом опыте была доказана способность индивидуального белка превращать энергию света в электричество.

 

Суп из топора

Справедливости ради надо сказать, что разность потенциалов, генерируемая на свету, в первом опыте Л. Драчева не превышала 20 милливольт. Это примерно в 12 раз меньше величины, необходимой для энергообеспечения процесса фосфорилирования. Причиной, вызвавшей резкое занижение фотопотенциала, был двоякий характер ориентации бактериородопсина в черной мембране: часть молекул белка генерировала ток одного направления, а другая часть - противоположного. Это и неудивительно, ведь черная мембрана симметрична, и в идеале фотопотенциал не должен был образовываться вовсе. Если все же его удалось обнаружить, то лишь из-за небольшого случайного превышения количества белка, встроившегося, скажем, с левой стороны мембраны, над белком с правой ее стороны.

Как же упорядочить ориентацию бактериородопсина в искусственной мембране? Первоначально мы не знали даже, с какого конца подступиться к проблеме. Но нам повезло: решение вскоре было найдено совершенно случайно.

Как-то наш молодой сотрудник А. Семенов ставил опыт с протеолипосомами, поглощавшими на свету проникающие анионы ФКБ-. Варьируя состав раствора с протеолипосомами, он добавил в смесь сульфат магния. Никаких изменений добавка не вызвала, и Семенов совсем было собрался прекратить эксперимент, но в этот момент в лабораторию зашел кто-то из его знакомых.

За приятной беседой сотрудник забыл о своем намерении сменить не оправдавшую его ожиданий пробу и вновь включил свет. К своему удивлению, он обнаружил, что теперь свет вызывает заметно больший эффект, чем десять минут назад. Семенов включил свет еще раз и, убедившись, что явление не исчезло, отправился на поиски шефа, чтобы похвалиться своим маленьким открытием. На эти поиски ушло еще четверть часа.

— Смотрите, как вырос фотоэффект, — сказал он и вновь включил свет.

Перо самописца резко метнулось к краю измерительной шкалы и, пока мы обалдело следили за поистине циклопическим фотоэффектом, застряло в краевой перфорации ленты и начало рвать бумагу в напрасных попытках продвинуться дальше. Я быстро освободил перо из плена, а Семенов переключил шкалу вольтметра с 10 на 100 милливольт.

На сей раз фотоэффект удалось записать. Это был огромный потенциал, который рос на глазах. Так продолжалось еще около часа, после чего лопнула черная мембрана, использовавшаяся в этом опыте для измерения концентрации анионов ФКБ-. Мы поставили новую мембрану и на всякий случай еще раз загрубили шкалу, полагая, что за время установки мембраны эффект еще более возрос.

Включили свет - перо вздрогнуло и отползло, словно нехотя, на два миллиметра в сторону. Повторное освещение дало тот же жалкий результат. Немедленно у прибора был созван консилиум лучших умов лаборатории, находившихся в пределах досягаемости. Пока судили да рядили, как объяснить только что наблюдавшийся и внезапно утраченный гигантский фотоэффект, прошло какое-то время, и Семенов для очистки совести еще разок осветил ячейку с протеолипосомами.

- Смотрите! Он вернулся! - услышали мы у себя за спиной торжествующий возглас.

И правда, эффект-богатырь возник вновь. Налицо было какое-то медленно развивающееся явление, исчезавшее всякий раз, когда мы заменяли одну измерительную мембрану другой. Стало быть, измерительная мембрана, а вовсе не протеолипосомы, подвергалась действию сульфата магния.

Чтобы убедиться в правоте этой, казалось бы, очевидной посылки (если не протеолипосомы, значит, измерительная мембрана, ведь больше ничего в нашей системе просто нет), мы добавили сульфат магния в омывающий искусственную мембрану раствор, не содержащий протеолипосом. Спустя час в тот же раствор внесли протеолипосомы и измерили фотоэффект. Если дело в мембране, то свет должен бы вызвать образование большой разности потенциалов.

Не тут-то было! Перед нами вновь был эффект-пигмей! Однако со временем он увеличился и через час-полтора достиг огромных размеров.

Что же это получается? В системе всего два компонента: протеолипосомы и искусственная мембрана, и оба они, отдельно взятые, устойчивы к действию сульфата магния. Тем не менее сульфат магния действует, да так мощно! А может быть, секрет его магического влияния надо искать в каком-то эффекте, требующем одновременного присутствия и протеолипосом и мембраны?

В дальнейшем оказалось, что сульфат магния можно заменить хлористым магнием, но не хлористым калием. Это указывало, что действующее начало — ион магния.

Известно, что двухвалентные катионы магния и кальция нейтрализуют отрицательные заряды на поверхности фосфолипидных мембран, образуя прочные комплексы с анионами фосфатных групп фосфолипида. Именно эти отрицательные заряды предотвращают слипание фосфолипидных пузырьков друг с другом. Быть может, в нашей системе магний вызывал слипание протеолипосом друг с другом?

Но для чего в таком случае искусственная мембрана? Нет, это не объяснение.

А вдруг протеолипосомы склеиваются с искусственной мембраной, ведь она тоже состоит из фосфолипидов? Тогда возникающий со временем высокий фотопотенциал мог бы в принципе иметь ту же природу, что в опытах Л. Драчева: бактериородопсин протеолипосом, приклеившихся к искусственной мембране, генерирует на свету разность потенциалов, которая регистрируется нашим вольтметром. В результате мембрана, предназначенная для регистрации количества анионов ФКБ-, измеряет вовсе не этот параметр, а непосредственно работу бактериородопсина как электрического генератора.

Проверить такое предположение не составило большого труда. Мы просто повторили опыт, но без анионов ФКБ-. Это был, так сказать, суп из топора: система для измерения проникающих анионов содержала все компоненты, необходимые, чтобы произвести такое измерение, за исключением самих анионов. И что же: со временем развился мощный фотоэффект. Его величина оказалась гораздо большей, чем в первых опытах Л. Драчева, когда мембрану образовывали из смеси бактериородопсина и фосфолипидов.

Последующее разбирательство показало, что в системе «протеолипосомы — искусственная мембрана» бактериородопсин всегда ориентирован таким образом, что он транспортирует протоны из омывающего раствора внутрь приклеенных к мембране протеолипосом. Так мы получили систему, где из двух противоположно включенных биологических фотобатарей осталась одна.

Используя новый метод, нам удалось добиться фотопотенциалов до 0,3 вольта, что превышает величину, необходимую для энергообеспечения синтеза АТФ.

Затем последовали годы работы по проверке других белков — генераторов протонного потенциала, совершенствованию метода встраивания белков в мембрану, стабилизации самой мембраны. Выдающиеся качества Л. Драчева как виртуозного физика-экспериментатора позволили разработать универсальный метод, позволяющий измерять перенос протонов внутри мембраны за время, равное одной десятимиллионной доле секунды.

Сегодня опыт Л. Драчева воспроизведен в десятках других лабораторий у нас в стране и за рубежом. Электрическая часть хемиосмотической гипотезы получила свое окончательное подтверждение.

 

Последняя капля

О своей догадке, что бактериородопсин может быть генератором протонного потенциала, мне рассказал У. Стокениус в феврале 1973 года в Нью-Йорке. Он разложил свои графики на столе, креслах и необъятной двуспальной кровати в номере отеля и спросил, что я, как митчельянец, обо всем этом думаю. Вскоре выяснилось, что он не меньший митчельянец, чем я, и что мы думаем с ним одинаково: открыт новый тип фотосинтеза, где вместо хлорофилла работает бактериородопсин.

Из Нью-Йорка я отправился в Итаку, к Э. Ракеру, и рассказал ему о данных Стокениуса. По реакции собеседника я понял, что все это он слышит впервые. Помнится, у меня даже были сомнения, имею ли я право рассказывать о бактериородопсине без разрешения Стокениуса, и я даже порывался позвонить ему в Сан-Франниско. Но Ракер отговорил меня, сказав, что сейчас в Калифорнии четыре часа утра и вряд ли Стокениус будет в восторге от звонка.

Последняя капля

А пять месяцев спустя Ракер уже докладывал на очередном международном биохимическом конгрессе о своей совместной работе со Стокениусом. Это был знаменитый «опыт с химерой».

Ракер и Стокениус взяли АТФ-синтетазу из митохондрий сердца быка, бактериородопсин из галофильных бактерий и фосфолипиды из соевых бобов и получили новый тип составленных из веществ всех трех царств живого мира: животного, бактериального и растительного. Протеолипосомы при освещении синтезировали АТФ.

Бычья АТФ-синтетаза катализировала фотофосфорилирование! Это был результат, чудовищный с точки зрения сторонника химической или конформационной схемы сопряжения.

Даже самым яростным противникам хемиосмотической теории было ясно, что бактериородопсин не может образовывать каких-либо химических соединений предшественников АТФ. Не могла идти речь и об обмене конформационной энергией между бактериородопсином и бычьей АТФ-синтетазой. Для этого потребовался бы тесный контакт двух названных белков, а было известно, что бактериородопсин занимает обширные участки (бляшки до 0,5 микрона в длину) в мембране бактерии, причем никаких других белков в этих бляшках не обнаруживается. Бактериородопсин делает свое дело без помощников.

«Оппозиция сдается!» писал мне в эти дни из Америки П. Хинкль.

Да, опыт Ракера и Стокениуса был воистину последней каплей, склонившей чашу весов в пользу хемиосмотической гипотезы.

В те дни мне довелось посетить Митчела в его Глинн Хаузе. Помню покрытые нежнейшей, только что взошедшей травой холмы, аллею вечнозеленых деревьев, ведущую к дому, и сам дом: освещенная жилая часть и затемненные лабораторные комнаты. В те январские дни 1974 года Англия пыталась бороться с энергетическим кризисом, сократив рабочую неделю. Митчел был этим страшно недоволен и грозился поставить на ближайшем холме ветряк, чтобы стать независимым от государственной энергетики.

Мне отвели большую комнату с нереально высоким потолком и огромными окнами, за которыми дремал сад. Был полный штиль.

Пытаясь уснуть, я обратил внимание на боль в ушах. Меня охватило какое-то беспокойство. Что-то было не так. Я не сразу сообразил, что все дело в тишине. В доме было абсолютно тихо. На милю вокруг ни жилья, ни шоссе, ни железной дороги. Я понял, что, пожалуй, впервые в жизни нахожусь в полной тишине. Пришло на ум, что Г. Лундегард, предтеча Митчела, тоже жил в уединенном доме, где размещалась его лаборатория... Уснуть мне удалось, лишь положив под голову ручные часы.

 

Принцип Митчела

В хронологии своих встреч с Митчелом я обнаружил правильную периодичность: познакомившись в 1966-м, мы затем виделись раз в два года, по четным годам. Лишь после 1974 года наступил четырехлетний перерыв, и автора хемиосмотической гипотезы я повстречал вновь только в 1978-м, на съезде в Дрездене, где ему вручали высшую награду Федерации европейских биохимических обществ — медаль Г. Кребса. Это был уже не первый знак официального признания. За два-три года Митчел стал членом Королевского общества Великобритании, получил золотую медаль международного научного фонда США, премию Филдберга, а также и другие премии в Бостоне, в Нью-Йорке.

Свою лекцию перед европейскими биохимиками в Дрездене он мог, казалось бы, выдержать в спокойных тонах, популярно изложив суть своей уже доказанной и всемирно знаменитой гипотезы. Так нет же, он вновь, как и прежде, перегрузил доклад чрезмерным обилием идей и фактов, чтобы в конце неистово обрушиться на М. Викстрема, А. Ленинджера и кое-кого из других биоэнергетиков, теперь уже занятых, по существу, разработкой деталей его теории.

Принцип Митчела

Речь шла о механизме образования и использования протонного потенциала в биологических мембранах. Согласившись с тем, что протонный потенциал есть фактор, сопрягающий дыхание и фосфорилирование, биоэнергетики занялись исследованием устройства ферментов, образующих протонный потенциал. Посыпались самые различные предложения: каждый имел наготове свой собственный «чертеж» белка - генератора электроэнергии. Вот тут-то фигура Митчела вновь оказалась в самом центре полемики.

Дело в том, что еще в 1966 году, в первой «Серой книге» он имел неосторожность дать конкретные схемы главных узлов постулированного им механизма превращения энергии. Впоследствии Ракер счел это за достоинство и даже вывел некое правило, звучащее примерно так: «Если вы выдвинули блестящую новую гипотезу, но не изложили ее в деталях, вас, вероятно, будут игнорировать. Если вы хотите привлечь внимание к своему детищу, без колебаний включите в изложение несколько пунктов, которые несущественны для главной темы, но зато могут быть атакованы оппонентами». Отсутствие резонанса от первой краткой публикации Митчела в 1961 году Ракер объясняет именно тем, что неясно было, как атаковать новую гипотезу.

Нет слов, подробнейшее изложение теории, данное в 1966 году, было куда уязвимей для критики. Каждый мог найти здесь себе подходящую мишень: и специалист по АТФазам, и тот, кто занимался дыхательными ферментами, мембранолог и исследователь фотосинтеза, микробиолог и биофизик-теоретик.

Многие из деталей схемы Митчела, по-видимому, не универсальны для всех генераторов протонного потенциала, а некоторые вообще неверны. Однако главное было схвачено абсолютно верно: использование энергетических ресурсов ведет к образованию протонного потенциала, который расходуется затем на синтез АТФ.

Вот почему Митчел имеет право сегодня сказать словами булгаковского Мастера: «О, как я угадал! Как я все угадал!»

В общей форме утверждение, которое я бы назвал «принципом Митчела», можно записать так:

энергетические ресурсы клетки → протонный потенциал → АТФ.

Это один из фундаментальных законов, определяющих жизнедеятельность организмов, поскольку он лежит в основе двух важнейших процессов энергообеспечения клетки — фотофосфорилирования и дыхательного фосфорилирования. Поэтому трудно переоценить вклад Митчела в развитие современной биохимии, и, когда в октябре 1978 года радио принесло весть о решении Нобелевского комитета по химии присудить ему премию, я не был удивлен.

П. Хинкль, выступая на семинаре в нашей лаборатории спустя несколько дней после этого события, сравнил его с присуждением такой же премии биохимикам - соотечественникам Митчела двадцать лет назад. По меткому выражению Хинкля, идея протонного потенциала имеет такое же значение для биоэнергетиков, как концепция двойной спирали ДНК для молекулярных биологов, изучающих наследственность.

Вечером я пригласил Хинкля к себе в гости, и мы подняли тост за Питера Митчела, гения-одиночку XX века.

 

Нобелевский лауреат

И вновь нарушился «периодический закон» моих встреч с Митчелом. Нового нобелевского лауреата я увидал уже на следующий, 1979 год. Это произошло в Детройте, где собралась конференция биоэнергетиков в связи со знаменательной для них датой — шестидесятипятилетием Э. Ракера.

Составители программы поставили доклад Митчела непосредственно перед моим. В тот день я очень опасался, что, сосредоточившись на предстоящем мне выступлении, упущу что-нибудь существенное из речи Митчела, всегда отличавшегося стремлением сказать за полчаса то, на что не хватило бы и целого часа. Однако тревоги оказались напрасными. За какие-то восемь месяцев, прошедших со встречи в Дрездене, Митчел изменился сильней, чем за двенадцать предшествующих лет нашего с ним знакомства. Слава, всемирное признание сделали то, чего не смогло совершить время. Куда исчез торопливый докладчик, стремящийся выплеснуть на слушателей избыток новых идей и гипотез? С трибуны вещал почтенный метр, «оракул из Бодмина».

Нобелевский лауреат

Впервые на моей памяти доклад Митчела не вызвал ни вопросов, ни обсуждения.

«Быть может, биоэнергетики оробели перед первым среди них нобелевским лауреатом?» — утешал я себя, размышляя о причине гробового молчания, последовавшего за выступлением Митчела. Однако, восстановив в памяти его доклад, я вынужден был признать, что на сей раз он просто не сказал ничего нового.

Из Детройта все направились в Канаду, в Торонто, где предстоял 11-й Всемирный биохимический конгресс. Один из симпозиумов назывался «Биоэнергетика». Его должен был открыть своим докладом Митчел. И вот я в зале отеля «Ройял Йорк». Председательствующий приветствует англичанина как нобелевского лауреата. Забитый до отказа зал (толпятся в открытых дверях, стоят в проходах) встречает овацией появление Митчела. Здесь и те, что отдали годы жизни доказательству хемиосмотической гипотезы, и те, кому до совсем недавнего времени она казалась фантазией, и просто люди, пришедшие взглянуть на триумф «золушки из ученых», как назвала Митчела в эти дни одна из канадских газет.

Я внимательно вглядываюсь в лица окружающих. Вот низкорослый, худой и остроносый немец, президент международной организации биоэнергетиков М. Клингенберг стоя аплодирует Митчелу. Но мне вспоминаются совсем другие времена. 1972 год, Амстердам, доклад Митчела. В первом ряду Клингенберг. Посреди лекции он внезапно встает и демонстративно покидает зал. Проходя мимо меня, он на миг задерживается и громким шепотом бросает:

— Я знаю, вы друг Митчела, так обучите его, ведь он безграмотен!

А вот Л. Эрнстер, профессор из Стокгольма, член Нобелевского комитета. Не с его ли легкой руки получил Митчел свою премию? Многие годы Эрнстер был сторонником старой химической гипотезы сопряжения, но уже в 1968 году я стал свидетелем его разговора с молодым голландцем К. Ван Дамом:

- Говорю тебе, Карел, все новое теперь от Митчела, вот и твоя работа по митохондриям тоже.

- Нет уж, Ларе, это мое, кровное, — петушится Ван Дам.

Эрнстер, мрачно рассматривая на просвет рюмку с коньяком, бросает:

— Врешь, не твое, Митчелово!

Там, дальше в зале, Дж. Мойл, постоянная сотрудница Митчела, поседевшая за опытами по доказательству его идей. Каждый день на крошечном старом автомобиле она отправлялась в Глинн Хауз из своей бедно обставленной квартирки в Бодмине, положив на пустующее сиденье рядом с собой сверток с бутербродами, чтобы в лаборатории не объесть, не дай бог, за ленчем своего профессора.

Аплодисменты стихают. Митчел читает доклад. Это в общем тот же текст, что в Детройте. Лауреат не счел нужным извлечь урок из неудачи, постигшей его по ту сторону канадской границы. Не счел нужным? А если не смог? Нет, это уж слишком! В такое поверить нельзя, особенно мне, кому посчастливилось общаться с этим выдающимся человеком и видеть в действии всю мощь его интеллекта.

На следующий день мы встречаемся с ним в спокойной обстановке. Надо непременно посоветоваться о докладе, который мне предстоит завтра, Это не обычный доклад, даже вообще не доклад, а лекция, пленарная лекция перед всеми восемью тысячами делегатов конгресса. Такое бывает в жизни один раз, и кто, как не Митчел, может помочь мудрым советом. Но сначала волнующий меня вопрос.

— Какой сегодня ваш главный интерес?

— Пытаюсь добыть два миллиона фунтов стерлингов!

— ?

— Хочу основать в Бодмине университет. Да вот беда: все говорят, что мы умные, но денег не дают!

Поскольку в этой новой беде я Митчелу не помощник, перевожу разговор на свою работу.

— Вы читали мою гипотезу в «ФЭБС Леттерз» о роли натрия-калиевого градиента?

— Конечно, читал, Влади (Митчел почему-то именно так сократил мое имя). Ваша гипотеза напоминает банковскую операцию, когда... — Тут началась такая финансовая премудрость, которая была явно за пределами моих познаний в английском языке и в этой не актуальной для меня сфере человеческой деятельности.

Митчел возбудился, в его глазах снова возникли искорки, которые я так любил наблюдать в прошлые годы, но внезапно из глубин памяти всплыла картина совсем другого рода,

...Митчел в Глинн Хаузе за завтраком. Ему приносят почту: письма, несколько научных журналов, справочник английских яхт-клубов (Митчел хоть и не чемпион, но заядлый яхтсмен) и пачку свежих газет. Он быстро и безошибочно выхватывает из всей этой кипы газету на розовой бумаге и погружается в чтение, забыв об остывающем в чашке ароматном кофе. Розовый бумажный лист хрустит и мнется в его нервно сжимающихся пальцах. Я читаю название газеты, которому в верхней части листа нехотя уступили место бесконечные столбцы цифр: «Файнэншл тайме».

Когда Митчел купил Глинн Хауз, он приобрел заодно пять миль земли по правому берегу рекиФой. Потом выяснилось, что в Корнуэлле владение берегом еще не дает права ловить в реке рыбу, и он отдельно за какую-то страшную сумму купил право на рыболовство. Однажды, проснувшись утром, он подумал, как это будет ужасно, если какой-то фабрикант построит заводик напротив его дома, и купил противоположный берег. Отпуск он решил проводить на Эгейском море и приобрел там большой кусок одного из греческих островов. Хобби Митчела - старинные замки, что он скупает и восстанавливает в Корнуэлле, — тоже, видимо, стоит денег немалых. А деньги любят счет, даже если ты получил от дядюшки несметное богатство. Вот что заставляет Митчела предпочесть газету финансистов из Сити любому другому чтению за утренним кофе...

Так было еще до премии. Что же удивительного, если теперь, увенчанный высшей наградой, он окончательно погряз в финансовых делах, оправдываясь идеей основать собственный университет. И я подумал: «Не приведи господь найти тебе еще и эти два миллиона фунтов, что требуются для университета. Ведь тогда уже не избежать всех последствий действия неумолимого закона Паркинсона!»

В этот вечер в Торонто я так и не смог обсудить с ним волновавших меня проблем. Я был убит: мне не о чем разговаривать с Митчелом! Впервые мы расстались, не наметив места и срока следующей встречи.

С Митчелом я больше не виделся. Год спустя он прислал мне оттиск своей новой небольшой работы по регуляции АТФ-синтетазы в хлоропластах. Среди авторов статьи были неизвестные имена, а под заглавием значилось: Глинновский исследовательский институт, Может быть, Митчел удовлетворил свои амбиции простейшим способом, переименовав-лабораторию в институт, чтобы вновь взяться за свое настоящее дело? И как бы в подтверждение этой мысли я получил вскоре письмо от П. Хинкля: Митчел направил куда-то запрос о финансировании новой программы опытов с цитохромоксидазными протеолипосомами.

«Я наконец остался в полном одиночестве, но это лишь укрепляет меня в вере, что я прав!» — писал Митчел Хинклю по поводу своей старой схемы, объяснявшей устройство одного из дыхательных генераторов протонного потенциала.

Я облегченно вздохнул: это почерк прежнего неистового Митчела, готового дать бой за любую свою идею на уже, казалось бы, незащитимом рубеже.

 

Ароморфoзы в науке и «комплекс Герострата»

Статью об истории биоэнергетики Ракер назвал «От Пастера до Митчела». О чем же говорит, что дает эта история? В общем, то же, что и анализ развития любой другой науки. Сначала накопление фактов, затем догадка о закономерности, призванной их упорядочить и объяснить, всеобщее отрицание новой гипотезы, затем открытие новых предсказанных ею фактов и как результат принятие гипотезы, после чего она именуется уже теорией или законом.

За последние полвека в нашей области было несколько подобных периодов, связанных с именами, таких первооткрывателей, как Ломан и Липман (АТФ и его роль в энергетике), Энгельгардт (дыхательное фосфорилирование и АТФаза миозина), Кребс (цикл карбоновых кислот) и, наконец, Митчел (протонный цикл).

Ароморфозы в науке и «комплекс Герострата»

Наш замечательный биолог-эволюционист академик А. Северцов, анализируя историю возникновения современных организмов, ввел понятие ароморфоза. Ароморфоз - это такое изменение структуры живого существа, которое позволяет ему захватить новый обширный ареал. Выход водных позвоночных на сушу, то есть переход от рыб к земноводным, или завоевание воздушного океана с появлением птиц, — вот типичные примеры ароморфоза. За ароморфозом следуют другие структурные изменения, призванные обеспечить наилучшее приспособление к новой среде обитания и проникновение в ее специфические ниши. Эти явления Северцов назвал идиоадаптацией. За ароморфозом всегда следует множество идиоадаптаций, одна из которых в конце концов может оказаться предтечей нового ароморфоза.

Нечто подобное происходит и в эволюции научной мысли.. В этом смысле создание хемиосмотической гипотезы, приведшей к доказательству протонного цикла, можно сравнить с ароморфозом.

Следовательно, на вопрос, что предстоит биоэнергетике в ближайшем будущем, мы вправе ответить: разработка деталей новой теории, ее многочисленных следствий и конкретных вариантов, реализуемых различными типами биологических систем. И где-то на одном из этих путей нас ждет новый ароморфоз — прорыв на следующий горизонт знаний.

Таков, так сказать, долгосрочный прогноз. А пока мы имеем перед собой весь спектр явлений, сопутствующих успеху: резкий рост популярности победившей идеи в смежных областях науки и околонаучных сферах, появление моды на ранее гонимое направление, а также бесплодные попытки разрушить вновь созданный «интеллектуальный собор».

Эту последнюю тенденцию я бы назвал «комплексом Герострата». Прославиться тем, что ты сжег храм Артемиды Эфесской — вот ярчайший пример деяний честолюбца, не способного к созиданию. В науке такие люди, как правило, действуют вполне безнаказанно, окруженные ореолом смельчаков, бросивших вызов общепринятому мнению, и симпатиями вчерашних противников недавно победившей гипотезы. Иногда им удается прорваться на страницы центральных научных журналов, что порождает цепь ответных публикаций, которая вскоре пресекается ввиду бесплодности дискуссии.

В биологии «комплекс Герострата» может расцвести особенно пышно из-за сложности и огромного многообразия объектов исследования. Допустим, перед вами сообщение о новом, не виданном ранее штамме какой-нибудь экзотической бактерии, и автор утверждает, к примеру, что фотофосфорилирование в этом случае обходится без мембран и потому не может быть понято в рамках концепции протонного потенциала. Что это — прецедент, ниспровергающий, казалось бы, доказанную закономерность? Или, может быть, артефакт, а то и вовсе результат научной недобросовестности?

Так сразу на этот вопрос не ответишь, и, если редакция журнала решается отказать такому автору в публикации, он громко жалуется на несправедливость и «Митчелов терроризм».

 

Йоги и биоэнергетика

Успехи биоэнергетики породили моду на это слово, которое иногда стали применять в самых неожиданных и неподходящих случаях.

— Вы пойдете сегодня на лекцию о биоэнергетике? — спросил меня сотрудник Карадагской биостанции. — Читает заезжий специалист из Балашихи.

Биоэнергетика — моя специальность, и я в общем-то представляю себе, кто и где у нас занимается этой наукой. Но ни фамилия лектора, ни название подмосковного городка не вызвали никаких ассоциаций. Удивительно, как я упустил из виду своего балашихинского коллегу?

— А чем он занимается в биоэнергетике?

— Он йог.

Так вот в чем дело! Ситуация сразу прояснилась. Федот, да не тот!

И все же я пошел на лекцию, хотя заранее знал, что ее смысл будет так же далек от биоэнергетики, как полюс от солнечного Карадага.

В одной из комнат белого здания биостанции, где шум прибоя и свежий ветер врываются в открытые окна, собралось человек сорок, в основном, как и я, отпускники. Вышел лектор, пожилой, но еще очень бодрый загорелый человек. Из-под клочковатых бровей — пристальный взгляд гипнотизера или скорее даже проповедника. Да и лекция — не научный доклад, а проповедь о том, как пробудить тайные могучие силы, дремлющие в каждом из нас, направить по своей воле сгусток особой «биологической энергии» (вот она, биоэнергетика!) в любую часть нашего тела или даже за его пределы: к другим людям, животным или неодушевленным предметам.

И если в речи коллеги из Балашихи и были научные термины и логические построения, то они звучали как дань времени, когда все верное должно быть научно обосновано. И напрасно было спрашивать докладчика, как доказывается, например, его утверждение, что энергия солнца может прямо, без посредников, усваиваться человеческим организмом для пополнения «биологической энергии». В религии нужна вера, а не аргументы. Уже само стремление доказать ее догму - ересь.

Глядя на лица слушателей, я поймал себя на мысли, что большинство этих людей пришло сюда за верой. Атеизм требует от человека смелости. Ведь приходится жить с сознанием того, что некого просить о защите от игры слепого случая. Культ бога или живого кумира или хотя бы вера в знамения и приметы облегчает бремя страха перед случаем. Помогает создать удобную иллюзию, что исполнение нехитрого ритуала и соблюдение известных правил хотя бы отчасти защитит человека перед лицом внешнего мира, способного в миг уничтожить ваше благополучие, каким бы прочным оно ни казалось минутой раньше. В нашем обществе с его традиционным атеизмом любая религия, закамуфлированная под науку, имеет шанс найти свой круг приверженцев.

И раньше-то с йогой непросто было разобраться широкой публике. Религия? Философия? Или особая физкультура? А теперь оказывается еще и незаслуженно забытое направление науки, да такое, что претендует стать над современной физикой, биологией и медициной.

Однако назвать себя «сверхбиологами» или «сверхбиофизиками» проповедники не решаются: будет нескромно. «Парапсихологами»? Но приставка «пара» (около) несовместима с амбицией любого верования. Так как же определить эту загадочную сферу деятельности, где оперируют без ножа, исцеляют на расстоянии, поднимают предметы, не прикладая рук, и жестами заставляют распуститься бутоны цветов?

А что, если — «биоэнергетика», раз уж речь идет о некой особой форме энергии, присущей живым существам?

Простите, но место занято! Наука биоэнергетика уже есть.