В 1749–1761 годах была построена первая каменная Вознесенская церковь с Богоявленским (южным) приделом на месте деревянного храма. В 1763 году храм пострадал от пожара и был восстановлен только в 1768 году. Новая колокольня была пристроена к храму в 1805 году.

По проекту архитектора Н. Легранда в 1818 году было запланировано, разобрав старую церковь, возвести новую. На средства купцов И. Ф. Татаринцева и Ф. Н. Боброва в 1826–1836 годах был сооружен храм в том виде, в котором он существует и сегодня. Автором проекта стал архитектор И. Ф. Львов. Это была первая крупная работа зодчего. Им была также запланирована новая колокольня с ротондой. Но эту часть проекта осуществить не удалось. Старую колокольню лишь в 1902–1903 годах надстроили третьим ярусом по проекту архитектора.

В 1930-х годах церковь была закрыта. Ее использовали в качестве склада. Из собора были конфискованы спецкомиссией по изъятию церковных ценностей абсолютно все иконы, а также драгоценная церковная утварь.

В 1936 году здание перешло в ведение областного краеведческого музея. В начале 70-х годов храм использовался в качестве выставочного зала. Затем, до 90-х годов, здесь велись реставрационные работы. Тверской епархии церковь была возвращена в 1993 году. Позже она стала городским собором.

7 января 1993 года, в праздник Рождества Христова, в соборе была проведена первая служба. В июле 1994 года было возобновлено проведение крестных ходов с Тихвинской иконой Божией Матери из Христорождественского монастыря в собор Вознесения Господня.

В настоящее время в соборе можно увидеть Тихвинскую икону Божией Матери, а также особо почитаемую в Твери икону Божией Матери «Тучная гора». Последняя была написана заново в 1994 году. Причиной стала утрата старинных икон.

В соборе сейчас покоятся мощи священномученика архиепископа Тверского и Кашинского Фаддея, который был убит 31 декабря 1937 года.