Пространственная организация и происхождение формы

Главная проблема, стоящая перед биологами, занимающимися изучением развития, - объяснить механику процессов, в результате которых из одноклеточной зиготы образуется морфологически более сложный многоклеточный взрослый организм. С генетической точки зрения это влечет за собой необходимость объяснить, каким образом закодированная в ДНК одномерная информация реализуется в трехмерной структуре организма. Программа развития слагается из связанных между собой явлений двух типов - клеточной дифференцировки и становления пространственной структуры. Возможность отделить друг от друга эти два аспекта онтогенеза нетрудно продемонстрировать на довольно простом примере. Если произвести биохимический анализ правой и левой рук человека и перечислить все образующие их мышцы, сухожилия, кости и т. п., то они окажутся идентичными. Между тем одного взгляда на эти два органа достаточно, чтобы убедиться в том, что они не идентичны. Одна рука не может заменить другую. Еще яснее это видно при сравнении руки и ноги. В настоящей главе мы и попытаемся выяснить, каким образом возникают эти различия, т.е. как происходит развитие пространственной структуры и формы. В конечном счете эволюцию и морфологии, и клеточной дифференцировки следует понимать именно в контексте становления пространственной структуры.

Один подход к изучению процесса онтогенеза был выдвинут в 40-х годах Уоддигтоном (Waddington). В процессе своего развития клетка проходит то, что Уоддингтон назвал эпигенетическим ландшафтом. Эпигенетический ландшафт (рис. 9-1) представляет собой равнину, изрезанную рядом долин. Долины берут начало на возвышенном конце равнины и тянутся вниз; при этом они постепенно расходятся, заканчиваясь каждая в своей особой точке на нижнем конце равнины. Клетка движется от верхнего конца равнины к нижнему по системе долин. В каждой точке ветвления клетка должна принять некое морфогенетические решение, в результате чего ее потенции к развитию ограничиваются. Находясь на верхнем конце ландшафта, клетка теоретически может достигнуть каждой из особых конечных точек. Однако, после того как она примет свое первое решение, например в первой точке ветвления, ей останется доступным только одно из подмножеств конечных точек. Клетка начинает свой путь в состоянии тотипотентности, но постепенно ее возможности становятся все более и более ограниченными в результате принимаемых ею решений. Уоддингтон назвал этот процесс канализацией. По своим общим свойствам процесс канализации приложим как к клеточной дифференцировке, так и к становлению пространственной структуры. Точки принятия решений - развилки долин - подвержены воздействиям внешних сил, например гормональных стимулов или индукции, а решение зависит от обусловленной генетически реакции клетки на данный стимул. Как станет ясно из дальнейшего, наблюдаемые нами решения, которые клетка принимает в процессе онтогенеза, относятся к типу «или-или», и их можно рассматривать как ряд двоичных решений типа «направо-налево». Расстояние от верхнего конца ландшафта к нижнему соответствует времени развития. Эту модель можно использовать как для мозаичного, так и для регуляционного развития, просто перемещая точки ветвления долин либо к верхнему, либо к нижнему концу холма соответственно. Хотя данная модель в том виде, в каком она здесь описана, позволяет представить себе процесс развития, она не объясняет его. Кроме того, эта модель статична, поскольку в ней формально не представлен процесс клеточного деления. Тем не менее идея о ряде канализирующих событий очень важна и отражается, например, в развитии конечности позвоночных, в частности в детерминации осей, определяющих отличие правой конечности от левой.

Рис. 9-1. Эпигенетический ландшафт Уоддингтона. Шарик на вершине изображает клетку, а долины под ним - различные пути развития, по которым она может пойти (Waddington, 1966).

 

Детерминация осей конечностей

Итак, правая рука отличается от левой, но как возникает различие между ними? Описание этого процесса дал Гаррисон (Harrison) на основании изучения развития конечностей аксолотля. Конечности Ambystoma при первом появлении имеют вид латеральных утолщений мезодермы на тех участках боковых поверхностей животного, где впоследствии развиваются ноги. Развитие ноги зависит от этой мезодермы, потому что пересадка ее кусочков на другие участки вызывает образование ног в нетипичных местах. Эктодерма, покрывающая закладки конечностей, такой способностью не обладает. Если вырезать целиком презумптивную область конечности и пересадить ее на боковую поверхность тела реципиента с той же стороны, с которой она была взята у донора, и с сохранением полярности, то из эксплантата разовьется полная конечность с такой же полярностью, как у нормальной конечности реципиента. Если же пересадить эксплантат на противоположную сторону реципиента, то из него разовьется конечность, передне-задняя полярность которой будет противоположна таковой у нормальной конечности реципиента. В то же время дорсо-вентральная полярность будет у них одинаковой. Если тот же зачаток конечности повернуть на 180° и пересадить его на ту же сторону реципиента, на какой он был у донора, дорсо-вентральная полярность опять-таки будет соответствовать норме. Следовательно, детерминирована только передне-задняя ось, но не дорсо-вентральная. Проделав такой же эксперимент с зачатком конечности, взятым у донора, который был немного старше, Гаррисон обнаружил, что дорсо-вентральная ось также стала детерминированной. Сходные эксперименты с использованием трансплантатов, повернутых относительно проксимально-дистальной оси, показали, что эта ось детерминируется в последнюю очередь. Из всего этого можно сделать вывод, что детерминация осей конечности происходит примерно таким же образом, как канализация событий на эпигенетическом ландшафте. Принимается ряд решений - переднее или заднее, дорсальное или вентральное, проксимальное или дистальное, - последовательно распределенных во времени, причем каждое из них сопровождается ограничением изначальных морфогенетических потенций. Остается, однако, неясным, как осуществляются эти ограничения. Какого рода информацию получает клетка в точке принятия решения и какова природа ее реакции? Не имея возможности дать точные ответы на эти вопросы, можно получить некоторое представление о них, рассмотрев две связанные с ними концепции: эмбриональных полей и позиционной информации.

 

Становление пространственной организации и спецификация местоположения

Презумптивную область ноги, которую пересаживал Гаррисон, можно рассматривать как эмбриональное поле. В более общем смысле поле - это участок зародыша или группа клеток, в пределах которых может происходить регуляция. На примере поля конечности зародыша амфибии можно убедиться, что если удалить часть презумптивной конечности, то из оставшихся клеток тем не менее формируется нога со всеми ее обычными частями. Иными словами, оставшиеся клетки, если операция была произведена на достаточно ранней стадии развития, способны отреагировать на нехватку и заменить элементы, которые были удалены. Это установил Т. Морган (Т. Н. Morgan) еще до того, как он основал Американскую школу генетики. Он понимал, что такой процесс может происходить двумя основными способами: в первом случае недостающие структуры замещаются в результате клеточных делений, восполняющих удаленный материал; во втором случае регенерация поля происходит в отсутствие клеточного деления. Первый способ он назвал эпиморфозом, примером которого служит регенерация конечности у амфибий. Второй способ он назвал морфоллаксисом, наилучшим примером которого служит ранний зародыш в целом. У этих двух типов регуляции есть общая черта, состоящая в том, что клетки, образующие данное поле, способны определять и запоминать информацию о своем положении в пределах этого поля.

Для того чтобы объяснить регуляторное поведение клеток в пределах полей, Л. Вольперт (Lewis Wolpert) и его сотрудники сформулировали концепцию позиционной информации. Эта информация, сообщаемая клетке, содержит указание о ее местоположении по отношению к другим клеткам, и именно эта информация определяет план, в соответствии с которым развивается зародыш или поле. Чаще всего позиционная информация рассматривается как градиент какого-либо вещества (иногда называемого морфогеном), которое распределяется по полю так, что его концентрация постепенно изменяется от высокой к низкой.

Многие концепции позиционной информации возникли в результате исследований развития, начатых Сондерсом (Saunders) и его сотрудниками, а затем - работ Вольперта и его коллег на презумптивном зачатке крыла цыпленка. Почка крыла цыпленка развивается вначале так же, как почка конечности амфибии. По мере того как эта почка удаляется от главной оси тела, образуя лопастевидную конечность, из содержащейся в ней мезенхимы формируется хрящевой скелет конечности. Первыми появляются проксимальные элементы, а затем дистальные, т.е. пальцы. Дефинитивный скелет конечности изображен на рис. 9-2. На основании экспериментов с использованием меток из частиц угля были составлены карты зачатков элементов скелета. Было установлено, что по мере роста почки конечности, происходящего в проксимально-дистальном направлении, к ней добавляются все более и более дистальные структуры. Вначале появляется плечевая кость, затем лучевая и локтевая, позднее кости запястья и наконец фаланги пальцев. Эксперименты, проведенные Вольпертом и его сотрудниками, показали, что в процессе этого проксимально-дистального роста регуляция выражена слабо. Если они удаляли с дистального кончика почки конечности покрывающую ее эктодерму (которая не индуцирует морфогенез конечности) и часть лежащей под ней мезодермы, то дальнейший рост конечности прекращался. Если эти ткани удаляли в ранние сроки, то развивалась только плечевая кость. Если их удаляли немного позднее, то формировались плечевая, лучевая и локтевая кости, но ни запястье, ни пальцы не развивались. Такая последовательность во времени хорошо соответствовала карте зачатков, составленной по результатам экспериментов с применением меток. Эта карта изображена на рис. 9-2 (под схемой нормального крыла). Следует отметить, что удаление ткани из развивающейся почки производилось задолго до появления каких-либо признаков морфогенеза или клеточной дифференцировки. Следовательно, план строения конечности подвергался воздействию до того, как становились заметными явные признаки дифференцировки. Чтобы объяснить полученные результаты, Вольперт высказал мнение, что клетки мезодермы, лежащие под концевой верхушечной эктодермой, составляют то, чему он дал название прогрессивной зоны. Мезенхимные клетки в этой зоне не детерминированы, но в результате деления и роста на дистальном конце позади них, на проксимальной границе, остаются клетки, детерминированные к формированию специфических структур крыла; однако какие именно структуры будут формироваться, зависит от того момента времени, когда дочерние клетки покидают прогрессивную зону. Чем позднее данная клетка покидает эту зону, тем дистальнее формирующаяся структура. Поэтому судьба каждой клетки детерминируется в зависимости от времени, а не просто от ее местоположения в зачатке.

Рис. 9-2. Строение костных элементов крыла курицы (А) и результаты пересадок почек конечностей на разных стадиях развития (Б и В). Стадии развития на рис. А указывают сроки спецификации различных частей конечности: 18 - плечевая кость; 19 и 20 - лучевая и локтевая; 21-25 - область запястья; 26-28 - фаланги пальцев. Четыре выделенные на почках конечности области (Б и В) соответствуют зачаткам более проксимальных элементов конечности. Справа (Б1 и B1) показаны конечности, развивающиеся у реципиентов, которым были сделаны пересадки. У реципиента, находившегося на стадии 24, которому был пересажен кусочек более ранней почки конечности (стадия 19), образовалось крыло с тандемной дупликацией (Б1), тогда как при реципрокной комбинации образовалась конечность, в которой недостает проксимальных элементов (B1). (Wolpert, Lewis, Summerbel, 1975; с изменениями.)

Такой тип регуляции относится к классу эпиморфозов, потому что при этом необходимо клеточное деление. Для проверки этой гипотезы были произведены реципрокные пересадки предполагаемой прогрессивной зоны между «молодыми» и «старыми» почками конечности. Очень показательные результаты этих экспериментов схематически представлены на рис. 9-2. Если использовать в качестве донора почку конечности, у которой детерминированы только плечевая кость и проксимальные части лучевой и локтевой костей, а более «старую» почку, у которой детерминация достигла уровня запястья, - в качестве реципиента, то разовьется конечность с тандемно дуплицированными плечевой, лучевой и локтевой костями. При реципрокной пересадке наблюдаются нехватки элементов, которые дуплицировались в предыдущем эксперименте; образуется конечность, у которой запястье выступает прямо из боковой поверхности тела. Эти результаты полностью согласуются с гипотезой прогрессивной зоны и позволяют считать возможным, что положение определяется (специфицируется) не только в пространстве, но и во времени. Еще один момент, касающийся процесса спецификации, состоит в том, что позиционная информация не ограничивается только спецификацией судьбы данной клетки в чисто морфологическом аспекте. К такому выводу можно прийти, изучив область запястья крыла. Рассмотрение рис. 9-2 показывает, что развитие сравнительно маленького запястья занимает довольно много времени по сравнению с другими более крупными костями верхней конечности. Изучение относительной величины зачатков для каждого отдела верхней конечности показало, что изначально все они имеют одинаковые размеры; это означает, что миграция из прогрессивной зоны протекает равномерно во времени, различия же касаются динамики пролиферации разных отделов после спецификации. Запястье растет меньше, чем другие отделы крыла. Поэтому один из аспектов спецификации состоит, очевидно, в детерминации относительной скорости роста, а не только различной морфологии.

 

Спецификация передне-задней полярности

Можно представить себе, что спецификация передне-задней полярности развивающегося крыла устанавливается позиционной информацией примерно таким же образом, как устанавливается проксимально-дистальная ось. Однако, хотя спецификация этой полярности происходит во взаимодействии с прогрессивной зоной, уточнение местоположения осуществляется, скорее, в форме градиента - от высокой концентрации в задней части почки крыла до низкой в ее передней части. Поэтому предполагается, что передне-задняя ось детерминируется системой, сходной с системой, участвующей в регуляции типа морфоллаксиса. Считают, что позиционная информация, обеспечивающая спецификацию передне-задней оси, содержится в группе мезодермальных клеток, расположенных на заднем краю почки конечности, которая примыкает к задней некротической зоне, упоминавшейся в гл. 7. Эта группа клеток была открыта Сондерсом (Saunders) и его сотрудниками и получила название зоны поляризующей активности (ЗПА). Если пересадить ЗПА на передний край развивающейся почки конечности, у которой в результате окажутся две ЗПА, то у развившегося из этой почки крыла возникнет зеркально-симметричная дупликация таких дистальных структур, спецификацию которых осуществляет прогрессивная зона в какое-то время после трансплантации ЗПА. Элементы, которые ко времени пересадки уже были специфицированы, не дуплицируются. Результаты этих экспериментов схематически представлены на рис. 9-3. На нем показаны также результаты пересадки ЗПА в середину почки конечности. Это также приводит к дупликации, но не зеркально-симметричной. Полученные результаты были интерпретированы как свидетельство того, что ЗПА служит источником позиционной информации. Передне-задняя упорядоченность в расположении, например, пальцев крыла определяется в результате считывания клеткой концентрации соответствующей информации: высокая концентрация соответствует 4-му пальцу, а низкая - 2-му. Как показано на рис. 9-3, Б, если поместить трансплантат на передний край почки конечности, то возникает градиент с двумя вершинами и впадиной в середине; это и приводит к зеркально-симметричной дупликации. Если же поместить трансплантат в центр почки, то возникает двойной градиент, расположенный тандемом, что приводит к примерно тандемной же дупликации пальцев. Небольшая впадина между двумя ЗПА приводит к зеркально-симметричной дупликации 4-го пальца; 2-й же палец вообще не образуется, потому что ни в одной точке градиента концентрация не достигает такого низкого уровня, который необходим для спецификации этой структуры.

Число дуплицирующихся структур зависит от возраста почки конечности в момент трансплантации; при этом дуплицируются только те элементы, которые к этому времени еще не мигрировали из прогрессивной зоны. Следовательно, передне-задняя ось на самом деле детерминируется двумя взаимодействующими параметрами позиционной информации: расстоянием от ЗПА и временем выхода клеток из прогрессивной зоны. Эта двойственная природа позиционной информации присуща не только данной системе; она была использована при попытке объяснить тип эпиморфной регуляции, наблюдаемой при регенерации конечностей у таракана и тритона, и в имагинальных дисках дрозофилы. Френч, Брайант и Брайант (French, Bryant, Bryant) высказали гипотезу, интересную в том отношении, что она позволяет в значительной степени объяснить явления, связанные со всеми этими тремя системами.

Рис. 9-3. Детерминация передне-задней оси конечности курицы зоной поляризующей активности (ЗПА). А. Нормальная конечность и гипотетический градиент позиционной информации, источником которой служит ЗПА (область, покрытая пунктиром), расположенная на заднем краю почки конечности. Б и В. Результаты пересадок ЗПА на передний край и в середину почки конечности, в остальном нормальной (Ede, 1978).

 

Становление пространственной организации и полярные координаты

Хадорн (Hadorn) и его ученики обнаружили, что если у личинки третьего возраста дрозофилы удалить один из имагинальных дисков и пересадить его путем инъекции новой личинке-реципиенту, то он будет дифференцироваться вместе с этим реципиентом. Более того, если диск разрезать на части, то каждый его фрагмент самостоятельно дифференцируется, образуя часть тех структур, которые образовал бы этот диск при нормальных обстоятельствах, причем из каждого отдельного фрагмента развиваются специфичные для него структуры. Часть такого рода карты для диска крыла представлена на рис. 9-4. Эти эксперименты показали также, что в имагинальных дисках не происходит регуляции типа морфоллаксиса. У них наблюдается, однако, эпиморфоз. Если фрагменты имагинального диска поместить не в личинку, а в брюшко взрослой самки дрозофилы, то в результате клеточных делений они растут, но не дифференцируются. Если выращивать фрагменты на протяжении недели, а затем пересадить их в метаморфизирующую личинку, то они дифференцируются, образуя вполне согласованные структуры. Если разрезать диск на две неравные части, то из большего фрагмента дифференцируются и те структуры, которые в норме образуются из клеток меньшего фрагмента. Что касается меньшего фрагмента, то он образует собственный зеркально-симметричный дубликат. Результаты двух таких экспериментов схематически изображены на рис. 9-4.

Можно представить себе, что положение клеток в пространстве определяется набором радиальных и угловых координат, причем положение каждой клетки задается особой парой сигналов. Если имагинальный диск разрезать на две части, то в результате смыкания поверхностей разреза в каждой части приходят в соприкосновение такие позиционные значения, которые обычно не примыкают друг к другу. При наличии подходящих условий (например, при выращивании в брюшке взрослой самки) это соприкосновение индуцирует рост и клеточное деление. Рост, согласно модели, возникнет в том случае, если различные угловые либо радиальные значения позиционной информации окажутся в непосредственном контакте. Клетки, образующиеся в результате этого процесса, воссоздадут недостающую позиционную информацию в общем таким же образом, как прогрессивная зона моделирует почку конечности цыпленка. Чтобы объяснить результаты, наблюдаемые при разрезании имагинального диска на два неравных фрагмента, Френч, Брайант и Брайант сформулировали правило кратчайшей интеркаляции. Его легче всего понять на примере, приведенном на рис. 9-4, В. Маленький фрагмент интеркалирует (восстанавливает) позиционные значения 4 и 5, потому что это кратчайший путь по отношению к двум сохранившимся на данном фрагменте угловым значениям (6 и 3). Концептуально эта модель сходна с моделью линейного градиента, в которой данный участок градиента способен регенерировать только более низкие позиционные значения. Большой фрагмент интеркалирует ту же самую недостающую информацию (позиционные значения 4 и 5 на окружности), но тем самым он восстанавливает полную окружность и создает всю необходимую позиционную информацию. Маленький фрагмент дуплицируется, а большой регенерирует; это и дает требуемый экспериментальный результат. Необходимо ввести еще одно правило - правило полной окружности; согласно этому правилу, для создания дистальных структур (участки, специфицируемые в центре круга) необходимо регенерировать все угловые позиционные значения. Из этого последнего правила есть несколько исключений. Однако они не умаляют фундаментальной полезности данной модели как способа представить себе, каким образом процесс онтогенеза извлекает пространственную организацию из видимого отсутствия формы. При этом не следует забывать, что такие модели представляют собой абстракции очень сложных клеточных и генетических событий и в лучшем случае могут дать лишь приближенное представление о процессах, происходящих в действительности. Необходимо постоянно помнить слова Уоддингтона о том, что «...эмбриональное поле - это, в сущности, концепция, пригодная в сфере рассуждений, относящихся к многомерным пространствам. Любую попытку свести ее к трем или даже четырем измерениям плюс одна переменная поля следует рассматривать как решительное абстрактное упрощение, которое может быть оправдано для некоторых особых целей, но к которому всегда следует относиться с большой осторожностью».

Брайант и его сотрудники обнаружили, что позиционная информация, содержащаяся в имагинальных дисках, по-видимому, одинакова во всех дисках. У тех фрагментов дисков крыла, которые при нормальных условиях дуплицируются, можно индуцировать регенерацию, культивируя их совместно с реципрокными фрагментами, убитыми облучением. Убитые фрагменты не поставляют в регенерирующую структуру живые клетки, но, по-видимому, могут поставлять ей позиционную информацию. Информация эта может поступать, очевидно, не только от данного, но и от любого другого диска.

Рис. 9-4. Объяснение результатов регенерации и дупликации диска крыла у Drosophila melanogaster с помощью модели полярных координат. А. Примерная карта зачатков диска крыла. Б и В. Слева - два вида разреза этого диска. В обоих случаях меньший фрагмент дуплицируется, а в большем происходит регенерация недостающих элементов. Результат представлен справа от каждого разрезанного диска в терминах модели полярных координат. Новообразованные секторы показаны точками. Правила регенерации, соответствующие этой модели, изложены в тексте. (French, Bryant, Bryant, 1976.)

Приведем конкретный пример: проксимальный дуплицирующийся фрагмент диска крыла, подобный изображенному на рис. 9-4, А, можно индуцировать к регенерации дистальных структур крыла, выращивая его в присутствии убитых дистальных фрагментов диска крыла или диска жужжальца. Этот результат согласуется с данными о том, что гомеозисные мутации вызывают трансформации, которые сериально гомологичны, т.е. дистальные части антенны превращаются в дистальные части ноги. Отсюда следует, что позиционная информация во всех имагинальных дисках одинакова; различие состоит в том, как она интерпретируется. Было показано, что эта очевидная универсальность позиционной информации выходит даже за видовые границы. Тикле (Tickle) и его сотрудники показали, что ЗПА, взятая из задней части почки конечности мыши, способна передать информацию, необходимую для установления положения передне-задней оси конечности у цыпленка. Пересадив ЗПА мыши на передний край почки конечности цыпленка, можно индуцировать развитие у цыпленка добавочных пальцев. Сходный результат получили Фаллон и Кросби (Fallon, Crosby), используя ЗПА из зародышей черепахи. Поэтому создается впечатление, что информация, специфицирующая поле развивающейся конечности у позвоночных, в процессе эволюции оставалась неизменной, а изменения коснулись реакции клеток на эту информацию. Характер этой реакции почти наверное определяется различиями в генной экспрессии или, если говорить прямо, во включении генетических переключателей.

 

Роль двоичных переключателей в интерпретации позиционной информации

Возможный характер генетической реакции на позиционную информацию был описан в некотором формальном смысле Кауфманом (Kauffmann). Согласно его модели, гены, реагирующие на позиционную информацию, представляют собой набор двоичных переключателей, образующих каскады или сети. Эта модель схематически изображена на рис. 9-5. Первый ген этого пути, или каскада, дерепрессируется поступающей позиционной информацией. Эту активацию легче всего представить себе как простую реакцию на концентрацию. Если относительная концентрация морфогена достаточно высока, то переключатель приводится в соответствующее положение. Продукт первого гена в сети вызывает последующие переключения, активирующие другие гены, а продукты этих генов в свою очередь могут активировать новые локусы, что приводит к образованию каскада. Первоначальный ввод информации в систему не обязательно должен быть единичным; в модель вполне можно заложить множественные вводы, создавая избыточность и тем самым наделяя систему гомеостатическими свойствами. Если подходить к этой модели с позиций эпигенетического ландшафта Уоддингтона, то можно представить себе, что клетка проходит через ряд развилок, ведущих в долины, где на каждой развилке приводится в действие переключатель и принимается некое решение. Таким образом, на стадии выхода в каждой клетке запечатлен иерархический набор решений, связанных с выбором положений переключателей и представляющих собой уникальное отражение ее онтогенеза. Модель эта достаточно точно отражает реальное положение вещей, в чем можно убедиться на примере развития имагинального диска крыла у дрозофилы.

Гарсиа-Беллидо (Garcia-Bellido) и его сотрудники показали, что развитие диска слагается из ряда процессов компартментализации; иначе говоря, подобно тому как это происходит с полем конечности амфибии, оси данного имагинального диска определяются в результате ряда последовательных событий. Так же как и в случае поля конечности, сначала устанавливается передне-задняя ось, а за ней следуют дорсо-вентральная ось и три последовательных ограничения вдоль проксимально-дистальной оси. Каждый из образующихся при этом компартментов отделен от других, и клетки, находящиеся в одном из них, при нормальном течении развития неспособны преодолевать границы между компартментами. В крыле и груди имаго каждая клетка имеет единственное место назначения, связанное с рядом канализирующих событий, через которые она проходит в течение развития. Кауфман рассматривает эти события как отражающие ряд принятых двоичных решений. Так, клетку, находящуюся на переднем дистальном кончике крыла, следует пометить как передняя/не задняя, дорсальная/не вентральная, крыловая/не грудная, дистально-крыловая/не проксимально-крыловая. Используя модель химической волны, первоначально постулированную Тьюрингом (Turing), можно математически показать, что исходное эмбриональное поле можно последовательно подразделить серией узловых линий, положение которых зависит от первоначальной формы этого поля и от динамики роста, могущей изменить его форму или размеры. Диск крыла приближенно имеет форму эллипса. Рассмотрев особенности роста этого диска, можно предсказать местоположение узловых линий. Как показано на рис. 9-6, сходство между спроектированными на имагинальный диск действительными границами компартментов и расположением и последовательностью узловых линий очень велико. Кауфман, Шимко и Треберт (Kauffman, Shymko, Trabert) провели сходное сопоставление, спроектировав узловые линии на зародыш, находящийся на стадии клеточной бластодермы. В этом случае различные участки зародыша специфицируются в результате ряда последовательных двоичных решений. Как схематически показано на рис. 9-7, эта модель предсказывает, что зародыш делится поперек сначала надвое, затем на четыре части, далее на восемь и наконец делится в дорсо-вентральной плоскости. В пределах каждой ограниченной таким образом области клеткам можно приписать двоичный адрес при помощи четырех гипотетических переключателей, которые могут находиться в состоянии либо 0, либо 1. Так, первый переключатель находится в состоянии 1 в передней половине и в состоянии 0 - в задней. В следующем наборе зон, определяемых узловыми линиями, второй переключатель находится в состоянии 0 в передних и задних четвертях и в состоянии 1 - в двух центральных четвертях. В результате продолжения такого комбинаторного кодирования каждая область получает свое особое обозначение.

Рис. 9-5. Схема гипотетического набора генных переключателей, образующих замкнутый контур. Внешний индуктор или индукторы (морфогены) активируют ген А, который в свою очередь активирует ген В, ген В - ген С, а ген С - снова ген А, так что образуется замкнутый контур. Затем внешний индуктор можно удалить, но система остается при этом «включенной». В данной системе гены В и С действуют также и за пределами контура, активируя другие локусы (Kauffman, 1972; с изменениями).

Рис. 9-6. Схема реальных и теоретических пограничных линий между компартментами в имагинальном диске крыла Drosophila melanogaster. А. Линии наложены на карту презумптивных зачатков диска. Цифры возле каждой линии указывают на последовательность, в которой, согласно наблюдениям, границы между компартментами ограничивают потенции клеток в этом диске (пунктирная линия 4 на самом деле не наблюдалась). Б. Линии, предсказанные моделью Тьюринга для эллипса. Сходство между двумя схемами поразительно (Kauffman, Shymko. Trabert, 1978; с изменениями).

Аналогичная система обозначений была привлечена для того, чтобы объяснить, каким образом детерминируется индивидуальность каждой имагинальной структуры, образующейся в различных сегментах. Так, различным имагинальным дискам можно дать обозначения, используя коды с комплектом из пяти переключателей. Конечно, этой модели внутренне присуща известная иерархия, причем некоторые сегменты и диски в этой иерархии более тесно связаны между собой, чем другие. Этот аспект данной модели хорошо согласуется с замечаниями Хадорна (Hadorn) относительно трансдетерминационных событий между имагинальными дисками: когда фрагменты дисков, выращиваемых в культуре, переходят из одного детерминированного состояния в другое, это происходит совсем случайным образом. Как и в комбинаторном коде, при этом выявляется некая иерархия. Кроме того, некоторые трансдетерминации никогда не происходят, например диск крыла никогда не превращается в хоботок. Кауфман объясняет это тем, что в дифференцировке этих двух структур участвуют два набора переключателей, и для такого превращения оба они должны вступить в действие, что представляется в высшей степени маловероятным. Помимо того что комбинаторный код позволяет объяснить трансдетерминационные взаимоотношения, он согласуется также с гомеозисными превращениями, наблюдаемыми у дрозофилы. Используя кодовые обозначения, примененные для различных областей бластодермы (рис. 9-7), и наложив на эту карту положение имагинальных дисков, развившимся из них имагинальным структурам можно дать обозначения в соответствии с комбинаторным кодом.

Рис. 9-7. А. Ряд пограничных линий, разделяющих компартменты, наложенные на зародыш дрозофилы на стадии клеточной бластодермы. Каждый компартмент несет предложенные Кауфманом метки по двоичному коду, специфицирующие индивидуальность каждого сегмента. Ε - глаз; А - антенна; Pb - хоботок; Р - переднегрудь; L1, L2 и L3 - 1-я, 2-я и 3-я ноги; W - крыло; Н - жужжалъце; Abd - брюшко; G - половые органы (Kauffman, Shymko, Trabert, 1978). Б. Микрофотография сегментированного зародыша дрозофилы, сделанная с помощью сканирующего электронного микроскопа. Обозначения на микрофотографии указывают сегменты, из которых, как предполагается, развиваются имагинальные структуры, указанные на рис. А. (Фотография любезно предоставлена д-ром F. R. Turner.)

Большую часть гомеозисных превращений, наблюдаемых среди этих структур, можно объяснить изменениями в одном переключателе. Так, для того чтобы антенна (1010) превратилась во вторую ногу (1110), достаточно одного переключения 0 —> 1. Это, в сущности, и проделывает мутация Antennapedia, и Кауфман высказывает мнение, что некоторые гомеозисные локусы, возможно, представляют собой гены-переключатели, необходимые для расшифровки позиционной информации. Переключатели эти обладают еще одним свойством, которое также исследовал Кауфман. После того как ген включен или активирован, он остается в таком состоянии. Гены, очевидно, обладают памятью. Предполагается, что эта память существует в форме ряда «замкнутых контуров». Согласно этой модели, после того как под действием какого-либо внешнего сигнала (например, позиционной информации) первый ген контура приходит в активное состояние, он активирует второй локус, который в свою очередь активирует третий. Как второй, так и третий локусы сами могут функционировать как активаторы, дерепрессирующие другие локусы. Как показано на рис. 9-5, в этом простом варианте одним из локусов, дерепрессируемых третьим геном, является первый ген. В таком случае ген 3 участвует в создании петли обратной связи, которая будет усиливать первоначальную активацию гена 1. Кроме того, можно представить себе, что гены 2 и 3 сами поддерживаются в активном состоянии другими локусами, еще больше усиливая действие контура. Простым конкретным примером системы этого типа служит лактозный оперон Escherichia coli. Снабжая клетки Е. coli лактозой, можно индуцировать у них синтез фермента β-галактозидазы. Однако, для того чтобы стала возможной индукция, в клетку должно проникнуть некоторое количество субстрата. Это происходит следующим образом. Вначале в бактерию просто просачивается лактоза, индуцируя синтез соответствующего катаболического фермента и пермеазы. Синтезированная пермеаза включается в плазматическую мембрану клетки, облегчая перенос в клетку лактозы. Первоначальная активация данной системы зависит, таким образом, от проникновения в нее лактозы, что в свою очередь зависит от концентрации. При субоптимальных концентрациях синтез ферментов не индуцируется и клетки не смогут использовать лактозу в качестве источника углерода. Если популяцию Е. coli выращивать при такой концентрации лактозы, которая чуть выше индуцирующего уровня, то клетки постепенно приобретают способность использовать этот сахар. При этом одни клетки индуцируются, а другие нет. Если, в то время когда примерно половина составляющих популяцию клеток индуцирована, концентрацию лактозы понизить путем разведения до субоптимального уровня, то клетки, которые уже были индуцированы, остаются в этом состоянии, а неиндуцированные остаются неиндуцированными. Эти свои состояния клетки сохраняют даже после деления, т.е. дочерние клетки «помнят». Такую «память» обеспечивает пермеаза, включающаяся в мембраны индуцированных клеток. Пермеаза облегчает перенос лактозы через клеточные мембраны, даже если концентрация ее невелика. Это в свою очередь индуцирует дальнейшее образование пермеазы, усиливающей состояние индуцированности. Следовательно, составляющие популяцию клетки находятся в двух альтернативных состояниях - активированном и неактивированном. Однако, для того чтобы приблизить эту ситуацию к гипотетической ситуации Кауфмана, необходимо наличие внутреннего индуктора для лактозного оперона, который поддерживал бы его активность даже в отсутствие внешнего индуктора. Как и в случае теории позиционной информации, эти идеи о генных переключателях и комбинаторном кодировании создают теоретическую основу, в рамках которой можно рассматривать генетическую регуляцию развития. На самом деле недавние данные о генетической регуляции основного типа сегментации у зародыша дрозофилы показали, что в деталях модель комбинаторного кодирования неверна; однако идея о последовательной компартментализации вполне оправданна.

 

Возникновение сегментов

Сегментация зародыша дрозофилы в своей основе выглядит как ряд латеральных впячиваний зародышевой полоски, образующихся почти одновременно на стадии гаструляции. Несмотря на кажущийся мозаичный характер этого процесса, можно показать, что индивидуализация каждого сегмента происходит постепенно, начиная с дробления, до того как отдельные сегменты окончательно обособятся. Наложение на зародышей лигатур на стадии дробления, произведенное в нескольких лабораториях (Vogel; Herth, Sander; Schubiger, Wood), показало, что становление специфических особенностей каждого отдельного сегмента можно нарушить в разной степени, в зависимости от возраста дробящегося зародыша. Чем раньше накладывается лигатура, тем серьезнее нарушение. Полный набор сегментов детерминируется не раньше, чем будет достигнута стадия клеточной бластодермы. Во время дробления, по-видимому, должно происходить взаимодействие между различными участками зародыша, необходимое для возникновения нормальной сегментации. Возможная природа этого взаимодействия и генетическая регуляция процесса сегментации рассмотрены в ряде изящных морфогенетических и генетических исследований, проведенных Нюсслейн-Фольгардом и Вейсхаузом (Niisslein-Volhard, Weischaus).

Как уже отмечалось в гл. 7, Нюсслейн-Фольгард охарактеризовал два гена, наследуемые по материнскому типу, которые резко нарушают полярность зародыша. Мутации в этих двух локусах, bc (bicaudal) и dl (dorsal), приводят к тому, что гомозиготные мутантные самки продуцируют соответственно зародышей с двумя задними концами или с двумя дорсальными сторонами тела. Возможно, что эти два локуса содержат гены, продукты которых создают исходную позиционную информацию, детерминирующую основные передне-заднюю и дорсовентральную оси зародыша. Кодируют ли эти локусы саму информацию или же они необходимы для ее переработки - не известно. Однако, поскольку эти гены наследуются по материнскому типу, предполагается, что эта информация встраивается в яйцо во время оогенеза. На основе результатов экспериментов с наложением лигатуры можно думать, что окончательное становление сегментов происходит в результате дальнейшего уточнения информации об этих основных осях. Вместе с тем дело не ограничивается простым механическим распределением информации, поставляемой материнским организмом. Число сегментов, их местоположение, полярность и индивидуализация - все это должно быть определено (специфицировано). В одном из аспектов такой спецификации участвуют гомеозисные локусы, обсуждавшиеся в гл. 8. Эти локусы принимают участие в спецификации индивидуальных особенностей отдельных сегментов; они, по-видимому, действуют главным образом после оплодотворения и не проявляют материнского эффекта. Другие гены определяют число сегментов и их полярность. Недавно Нюсслейн-Фольгард и Вейсхауз обнаружили гены, детерминирующие все более детальное расчленение основных осей зародыша на определенное число сегментов. Подобно гомеозисным генам, определяющим индивидуальные особенности отдельных сегментов, эти гены экспрессируются в течение зародышевого развития. При помощи генетических и эмбриологических тестов была идентифицирована группа из 20 таких локусов, определяющих характер сегментации и особенности отдельных сегментов. Мутации в этих локусах не имеют материнского эффекта; они приводят к образованию фенотипов, у которых нарушено формирование сегментов, и являются летальными. Эти мутации не охарактеризованы полностью в генетическом и морфологическом отношении, поэтому неясно, все ли 20 генов специфически участвуют в сегментации или некоторые из них оказывают на этот процесс плейотропное воздействие. Однако 20 идентифицированных локусов, по-видимому, близки к общему числу таких генов в геноме дрозофилы.

Несмотря на предварительный характер анализа этих локусов, дефинитивные фенотипы мутантов дают некоторые указания о характере участия генов в становлении сегментации у зародыша. Более того, благодаря этим мутантам возникли интересные предположения об участии гомеозисных генов в вероятной интеграции процесса сегментации и в спецификации индивидуальных особенностей отдельных сегментов. Гены, определяющие сегментацию, можно разбить на основании создаваемых ими дефинитивных фенотипов на три широкие категории. Во-первых, это gap-локусы, приводящие к потере групп смежных сегментов; во-вторых, pair-rule-локусы, обусловливающие попарное слияние соседних сегментов, что приводит к уменьшению числа сегментов вдвое; и в-третьих, это локусы, изменяющие полярность сегментов; при этом зародыш содержит нормальное число сегментов, но каждый из них состоит из двух передних половинок, зеркально обращенных друг к другу.

Мутанты по двум из gap-локусов имеют фенотипы, представляющие интерес для обсуждаемой нами темы. Это мутации knirps и Rg (pbx) (Regulator of postbithorax). В результате мутации в локусе knirps развиваются зародыши с нормальным передним и задним концами тела, но с единственным большим брюшным сегментом там, где в норме должны находиться брюшные сегменты 1-7. Этот фенотип схематически изображен на рис. 9-8. Делеции локуса Rg (pbx) приводят как бы к реципрокному «выпадению» сегментов по отношению к выпадению, вызываемому делецией knirps. Вместо трех грудных и части гнатоцефалических сегментов образуется один большой сегмент, сходный с брюшным. Кроме того, седьмой и восьмой брюшные сегменты не разделяются. В обоих случаях из больших участков клеточной бластодермы и зародышевой полоски, которые в норме образуют несколько сегментов, формируется только по одному крупному структурному элементу. В широком смысле такое нарушение можно интерпретировать как результат какого-то дефекта в генетической программе клеток, находящихся в специфичных участках зародыша; этот дефект обусловливает неспособность клеток реагировать на информацию, поставляемую материнским организмом через яйцо. В пользу такого утверждения свидетельствует фенотип зародышей с делецией как локуса Rg (pbx), так и комплекса генов bithorax (BX-C). Делеция комплекса ВХ-С приводит к превращению брюшных сегментов в грудь. У зародышей с двойной делецией число сегментов такое же, как у зародышей Rg (pbx) - , но все эти сегменты грудные. Поэтому выпадение, наблюдаемое у зародышей Rg (pbx), приводит к нехватке некоторого участка тела у раннего зародыша и не зависит от наличия сегментов, обладающих особенностями грудных. Другими словами, ген Rg (pbx) + определяет способность передней части зародыша к образованию сегментов и действует до индивидуализации сегментов или независимо от этого. В связи с этим последним соображением интересно отметить, что выпадающие у зародыша Rg (pbx) передние сегменты-это именно те сегменты, индивидуализация которых детерминируется комплексом ANT-C (Antennapedia). Поэтому правильное функционирование этого gap-локуса - необходимая предпосылка для экспрессии комплекса ANT-C.

Среди pair-rule-генов обнаружены мутанты двух типов. Примером одних служит локус prd (paired), примером других - локус ftz (fushi tarazu). Мутация prd приводит к «слиянию» задней части одного сегмента с передней частью другого в норме следующего за ним сегмента. Зародышевая полоска мутантного зародыша образует только половину нормального числа сегментов, каждый из которых вдвое шире нормального. Эти двойные сегменты схематически изображены на рис. 9-8; они состоят из средне- и заднегруди, первого и второго брюшного сегментов, третьего и четвертого брюшного и т.д. Возможно также слияние нижнегубного сегмента и переднегруди. Другой локус, ftz, входит в состав комплекса ANT-C (см. рис. 9-8), занимая на генетической карте место между гомеозисными локусами pb (proboscipedia) и Scr (Sex combs reduced). Так же как и локус prd, он приводит к «слиянию» сегментов, однако это слияние сдвинуто относительно того, которое вызывается локусом prd. Как видно на рис. 9-8, сливаются максиллярный и губной сегменты, первый и второй грудные, третий грудной и первый брюшной, второй и третий брюшные и т. д. Наблюдения над ранними зародышами показали, что это нарушение сегментации выявляется даже на начальных ее стадиях. Зародышевая полоска делится на вдвое меньшее число сегментов, чем в норме, причем все сегменты вдвое шире обычных. Исследование температурочувствительных аллелей локусов prd и ftz показало, что их температурочувствительные периоды (ТЧП) приходятся на очень раннюю стадию развития. Для аллеля ftz ТЧП наступает примерно через 2 ч после начала развития, что соответствует стадии клеточной бластодермы. Кончается ТЧП примерно спустя 4 ч после начала развития, прежде чем зародышевая полоска физически сегментируется. Таким образом, на стадии раннего зародыша происходит генетически регулируемое событие, необходимое для правильного осуществления сегментации.

Рис. 9-8. Гипотетическая последовательность решений, принимаемых в зародыше дрозофилы на ранних стадиях развития для того, чтобы детерминировать индивидуализацию сегментов. Расшифровку буквенных обозначений см. рис. 8-9. Скобки над и под квадратиками указывают домены действия соответствующих генов. Штриховкой обозначены участки зародыша, в которых при мутациях gap и pair-rule нарушена нормальная сегментация. На нижней схеме указаны предполагаемые участки действия гомеозисных локусов; гены приведены в качестве примеров и не могут дать представления об огромном перечне известных генов, оказывающих влияние на характер сегментации. Данная модель описывает в упрощенном виде генетическую регуляцию сложного процесса, который в настоящее время интенсивно изучается.

Отсутствие этой генетической активности также показывает, что в какой-то момент детерминации характера сегментации зародышевая полоска расчленяется на ряд единиц шириной в два сегмента. Подобно локусу Rg (pbx), функция локуса ftz необходима для правильной экспрессии гомеозисных локусов. При попарном «слиянии» сегментов, наблюдаемом у зародышей ftz - , у широкого сегмента, образованного путем слияния двух соседних, проявляются только индивидуальные особенности переднего сегмента. Это наиболее ясно видно на примере слившихся третьего грудного и первого брюшного сегментов. У мутантных зародышей этот большой сегмент обладает только структурами, типичными для грудных сегментов; никаких признаков брюшных сегментов в нем не остается. Поскольку функция локуса bxd (bithoraxoid) заключается в спецификации индивидуальных особенностей первого брюшного сегмента, можно сделать вывод, что отсутствие функции ftz + препятствует экспрессии локуса bxd. Однако активность ftz не связана с индивидуализацией сегментов. Зародыши, у которых отсутствуют локус ftz и комплекс ВХ-С, содержат половину нормального числа сегментов, но все это грудные сегменты. Этого фенотипа следовало ожидать, если локус ftz + , подобно Rg (pbx), вступает в действие раньше гомеозисных локусов, которые в свою очередь функционируют в пределах сегмента того типа, который установился путем спецификации, определяемой gap- и pair-rule-локусами.

В свете этого последнего момента следует также заметить, что слившиеся сегменты позволяют определить ассоциированные функции в пределах комплексов ANT-C и ВХ-С. Как схематически показано на рис. 9-8, областью третьего грудного - первого брюшного сегментов определяются границы территории, на которой действуют локусы bx + , pbx + и bxd + . Все вместе эти гены не могут комплементировать доминантную мутацию Ubx. Сходные территории для действия других сайтов комплекса ВХ-С можно усмотреть в остальных задних спаренных сегментах. Если говорить о комплексе ANT-С, то мутации в локусе pb воздействуют на максиллярный и нижнегубной сегменты. Мутации Scr вызывают трансформации нижнегубного и первого грудного сегментов, а нуль-аллели гена Antp указывают, что для нормального развития второго и третьего грудных сегментов необходим аллель Antp + . Следовательно, эффекты генов, входящих в комплексы ВХ-С и ANT-С, показывают, что эти локусы действуют в области шириной в два метамера. Некоторые из этих областей можно определить по фенотипу ftz; другие выявляются по альтернативным типам слияния сегментов, наблюдаемым у мутантов prd. Подобно gap-локусам, pair-rule-локусы также определяют домены действия гомеозисных локусов, и именно эта их функция связывает между собой данные два вида генов, регулирующие сегментацию. Мутации по локусам, определяющим полярность сегментов, оставляют нормальными число сегментов и их индивидуальные особенности, но вызывают дупликации структур. Эти локусы, вероятно, наиболее близки по своим функциям к гомеозисным генам в том смысле, что они как бы расшифровывают позиционную информацию, которая в свою очередь определяет индивидуальные особенности, а не число метамерных элементов. На основе высказанных выше соображений можно построить связную и не чисто воображаемую картину способа становления сегментарной организации у зародышей насекомых.

 

Модель действия гена в спецификации сегментации

Схематическая картина наших представлений о процессе сегментации изображена на рис. 9-8. Основные оси зародыша детерминируются еще в материнском организме позиционной информацией, которая определяет передний и задний концы яйца и его дорсальную и вентральную стороны. Эти основные координаты затем детализируются различными локусами, контролирующими сегментацию. Первое событие в этом направлении заключается в разделении презумптивной зародышевой полоски на ряд крупных доменов; некоторые из них определяются gap-локусами и содержат по нескольку зачатков сегментов. Вслед за этим вступают в действие pair-rule-гены, подразделяющие эти большие области на меньшие - домены, соответствующие по ширине зачаткам двух сегментов. Эти двухсегментные домены встречаются в виде двух отдельных, но перекрывающихся блоков. Следует заметить, что такое же перекрывание наблюдается между двумя доменами, контролируемыми gap-локусами (см. рис. 9-8). Перекрывание может служить нескольким целям. Во-первых, оно, возможно, усиливает границу между двумя соседними доменами, потому что клетки в этой пограничной области обладают уникальной особенностью: в них активны оба гена. Во-вторых, перекрывание, возможно, действительно разграничивает сегменты, поскольку при этом каждый сегмент ограничивается перекрывающимися спаренными рамками, как это можно видеть у мутантов prd и ftz. Наконец, в-третьих, эти решения, определяющие сегментацию, усиливаются благодаря активности локусов, контролирующих полярность сегментов и поддерживающих соответствующие передне-задние различия в пределах каждого сегмента, первоначально детерминированные для зародыша в целом информацией, полученной от материнского организма. Эти ограничивающие во времени эмбриональные поля в свою очередь служат доменами активации для гомеозисных локусов комплексов ANT-С и ВХ-С.

В настоящее время представляется наиболее вероятным, что гены, входящие в комплексы ВХ-С и ANT-C, обеспечивают расшифровку позиционной информации. Механизм, с помощью которого может происходить расшифровка этой информации, подробно описал Гарсиа-Беллидо. Согласно его гипотезе, гомеозисные локусы, особенно входящие в комплекс ВХ-С, действуют как селекторы или переключатели. Позиционная информация, специфицированная во время оогенеза и уточненная в течение эмбриогенеза, активирует или инактивирует эти локусы в определенной последовательности. В активном состоянии гомеозисные гены вырабатывают продукты, которые избирательно активируют или подавляют батареи других генов. В каждом отдельном сегменте активность как гомеозисных генов, так и тех генов, которые, они в свою очередь регулируют, носит особый характер, свойственный только данному сегменту. Льюис (Е. Lewis) предложил модель, в которой активация комплекса ВХ-С поляризована в хромосоме в проксимально-дистальном направлении; т.е. гены комплекса ВХ-С активируются в определенной последовательности, соответствующей последовательности тех сегментов, в которых они действуют, от переднего конца зародыша к заднему.

Далее Льюис полагает, что проксимально-дистальному порядку расположения локусов в данном комплексе соответствует градиент связывания репрессора, идущий вдоль хромосомы. Чем ближе к переднему концу зародыша лежит данный сегмент, тем выше концентрация репрессора, а следовательно, меньше число активных генов. Результаты недавних анализов локуса Pc (Polycomb), проведенного Льюисом, и локуса esc (extra sex combs), проведенного Стралем (Struhl), служат некоторым подтверждением этой модели активации комплекса ВХ-С. Обе эти мутации вызывают превращение второй и третьей пары грудных ног в первую пару. Это хорошо видно на самцах, у которых половые гребешки имеются на всех трех парах ног - фенотип, сходный с возникающим при некоторых мутациях в локусе Antp. Однако зародыши, несущие летальные аллели в любом из этих двух локусов, фенотипически резко отличаются от мутантов Antp. Все грудные сегменты и брюшные сегменты 1-7 превращены у них в восьмые брюшные сегменты. Эти данные в сочетании с тем фактом, что эффект как мутации Рс, так и мутации esc зависит от числа копий комплекса ВХ-С (т.е. чем больше число имеющихся в наличии генов ВХ-С, тем сильнее выражена трансформация всего зародыша в восьмой брюшной сегмент), позволяют предположить, что продукты генов Ру + и esc могут служить репрессорами комплекса ВХ-С.

Изучение таких локусов, как Рс и esc, а также мутаций в gap- и pair-rule-локусах, показывает, что индивидуализация сегментов регулируется по крайней мере на двух отдельных уровнях. Прямая регуляция гомеозисных генов происходит на уровне транскрипции, но, для того чтобы дерепрессия гомеозисных генов могла проявиться в индивидуализации сегментов, должны совершиться события, определяющие общий план сегментации зародыша.

Модель, представленная на рис. 9-8, удивительно хорошо согласуется с теоретическими рассуждениями Кауфмана. Кауфман рассматривал процесс сегментации как ряд двоичных решении, последовательно подразделяющих яйцо на ряд участков и приписывающих тем самым определенные адреса разным частям зародыша (рис. 9-7). Согласно формальной модели Кауфмана, зародыш делится сначала на две части, затем на четыре, на восемь и т. д. Подобные представления, основанные на выявленных до настоящего времени мутантных фенотипах, слишком упрощают реальные события. Это не означает, однако, что мы отбрасываем самую основу модели Кауфмана, потому что, судя по всему, последовательное подразделение раннего зародыша в самом деле имеет место и это разделение интегрировано с функцией локусов, определяющих индивидуализацию сегментов.

При формальном применении модели можно допустить, что двоичный набор переключателей, подобно уоддингтоновскому эпигенетическому ландшафту, должен быть линейно-упорядоченным и зависимым, т. е. перевод переключателя в одно из двух возможных положений зависит от предшествующего события на этом пути. В некоторых случаях это действительно так и есть. Однако данное условие не является непременным. Известны примеры, когда функции генов, регулирующих фундаментальные морфогенетические события, разобщены. Это было проиллюстрировано в гл. 5 на примере разобщенности процессов морфогенеза и клеточной дифференцировки в развивающейся поджелудочной железе. То же самое относится к сегментации зародыша дрозофилы. Несмотря на то что гены, контролирующие число и индивидуальные особенности сегментов, пространственно интегрированы, у мутантных особей эти две функции могут быть разобщены; т. е. действие gap-локусов не зависит от действия гомеозисных локусов, точно так же как гомеозисные локусы не нуждаются в активности gap-локусов. Именно эта разобщенность или диссоциация и допускает «мелкие переделки» онтогенетического развития в процессе эволюции. Это ясно видно в эволюции насекомых (см. гл. 8). Наблюдаемые у них изменения затрагивают индивидуальные особенности сегментов, но не их число.

 

Выбор фенотипа и морфогенетический потенциал генома

В регуляции развития со стороны генома есть еще один важный аспект. Фенотипы не строго детерминированы единой генетической программой. На морфологии сказываются также негенетические влияния среды, хотя, как это подробно рассматривает Уоддингтон, возможный диапазон фенотипических реакций детерминирован характером генетической программы. И в самом деле, выбор из альтернативных фенотипов представляет собой почти постоянный элемент любого онтогенеза. Фенотипическая пластичность - очень обширная и сложная тема; поэтому мы ограничимся здесь проблемой выбора между альтернативными фенотипами, что составляет часть программы развития вида и служит основой для эволюционных изменений, в чем можно убедиться на некоторых классических примерах гетерохронии. К числу явлений, в которых участвует запрограммированный выбор между фенотипами, относятся половой диморфизм, различие в морфологии личинок и взрослых особей и альтернативные типы морфологии взрослых особей, такие как определяемая условиями среды неотения у амфибий или различные касты у общественных насекомых, обусловленные гормонально. Во всех этих случаях выбор одной из альтернативных программ морфологического развития из всего репертуара возможностей данного генома производят переключатели.

Потенции генома не ограничиваются созданием одной неизменной морфологии; в этом можно убедиться на прекрасном и ярком примере разнообразия каст у термита Amitermes atlanticus. Как у большинства общественных насекомых, семья этих термитов основывается царицей, или маткой, после ее брачного полета. Рожденные царицей потомки образуют популяцию термитов данной колонии. В своей книге «Обитающие во тьме» Скайфе (Skaife) описал различные касты, которые можно обнаружить в зрелой колонии этих организмов: рабочие, солдаты, царицы (или матки) и самки-заменительницы. Представители всех этих каст изображены на рис. 9-9. Как можно видеть на этом рисунке (внизу), особи, относящиеся к разным кастам, сильно различаются по своей морфологии. Глаза и крылья имеются только у половых особей, тогда как рабочие и солдаты слепые и бескрылые. Солдаты отличаются от рабочих и половых особей крупной головой и мощными челюстями. Когда представители всех этих каст вылупляются из яиц, никаких различий между ними заметить нельзя. Следует также помнить, что все члены данной колонии - родные братья и сестры. Примерно в середине периода роста между развивающимися термитами начинают появляться морфологические различия, зависящие от их будущей касты. Вряд ли можно предположить, что эти различия обусловлены генетически, потому что молодые семьи состоят из одних только рабочих, а по мере созревания семьи в ней появляются сначала солдаты, а затем разные категории половых особей. Кроме того, в зрелой семье наблюдаются сезонные колебания числа и категорий половых особей. Таким образом, создается впечатление, что в группе организмов, приходящихся друг другу братьями и сестрами, т.е. имеющих один и тот же генотип, могут возникнуть довольно разнообразные фенотипы, причем все эти фенотипы принадлежат функционально интегрированным организмам.

Несколько лучше известны - главным образом благодаря работам Люшера (Luscher) - механизмы кастовой дифференциации у более примитивных термитов, обитающих под землей. Кастовая дифференциация у этих видов регулируется феромоном, подавляющим образование самок-заменительниц, и главными гормонами насекомых, действующими на развитие. По-видимому, превращение недифференцированных нимф в половых особей происходит под действием экдизона, тогда как высокие уровни ювенильного гормона вызывают превращение нимф в солдат. Таким образом, при эндокринной регуляции кастовой дифференциации, возможно, имеют место конкурентные взаимодействия экдизона и ювенильного гормона.

Роль гормонов в управлении морфогенетическими переключателями при развитии насекомых иллюстрируется далее работами Уилера и Ниджхаута (Wheeler, Nijhout), изучавших развитие солдат у муравья Pheidole bicarinata. Так же как у термитов, в семьях этих муравьев имеются рабочие, солдаты и половые особи. Оказалось, что солдат можно получить из недифференцированных личинок женского пола, если в определенный период последней личиночной стадии обработать их аналогом ювенильного гормона насекомых. Такая обработка приводит к увеличению продолжительности периода роста и изменению размеров личинок ко времени метаморфоза. Эти более крупные особи с более длительным периодом роста и есть солдаты. Как показали Дж. Гексли (J. Huxley) и Вилсон (Wilson), у муравьев аллометрические кривые рабочих особей и солдат совпадают (см. рис. 2-10). Огромные размеры челюстей и головы у солдат - следствие их более крупных общих размеров. У некоторых видов муравьев ситуация более сложная, потому что наклон аллометрических кривых изменяется с увеличением размеров. Известны двух- и трехфазные аллометрические зависимости. Изменение уровней гормонов позволяет установить пороги, с помощью которых муравьиная семья может «выбирать» морфологию, которую приобретает данная личинка во взрослом состоянии.

Рис. 9-9. Развитие дифференциации, приводящее к образованию различных каст у термита Amitermes atlanticus. Все касты в начале развития морфологически одинаковы, но к концу развития приобретают различную морфологию. А. Царица. Б и В. Самки-заменительницы. Г. Рабочий. Д. Солдат (Skaife, 1955; с изменениями).

Это всего лишь два из множества примеров, когда в процессе онтогенеза, направляемого единственным геномом, происходит выбор фенотипа. Потенциальные возможности, возникающие при этом для эволюционных изменений морфологии, очевидны; в гл. 6 были приведены примеры эволюции, связанной с пластичностью, которая создается переключениями развития, ведущими к различным функциональным морфологиям.

Здесь следует привести еще один пример, показывающий, что запрограммированные изменения онтогенеза можно обнаружить и у ископаемых организмов. На рис. 9-10 изображены два аммонита с гетероморфными раковинами, которые когда-то украшали собой позднемеловые моря в западной части Северной Америки. В этих раковинах запечатлена история развития животных, которые их секретировали. Обе раковины свидетельствуют о том, что это развитие делилось на три последовательных периода, причем для каждого был характерен свой особый тип роста. Вначале раковина росла по прямой, а затем в какой-то дискретный момент развития программа роста переключалась и раковина приобретала форму тортикона. Наконец, по мере приближения моллюска к зрелости направление роста вновь изменялось, что приводило к образованию терминальной U-образной жилой камеры. Помимо эстетической привлекательности раковин этих аммонитов они показывают, сколь значительной была морфогенетическая пластичность отдельного вида, допускавшая такие эволюционные изменения формы. Быстрая эволюция гетероморфов, представленная на рис. 2-4, позволяет предполагать, что в эволюции аммонитов использовалась пластичность, создаваемая переключениями с одного типа роста на другой.

Рис. 9-10. Два гетероморфных меловых аммонита из Среднего Запада Северной Америки. У обоих видов Didymoceras nebrascense (А) и D. stephensoni (Б) для раннего периода развития раковины был характерен рост по прямой; затем его сменял период роста по спирали и, наконец, в период зрелости происходило образование последнего витка в иной плоскости (Gill, Cobban, 1973; Scott, Cobban, 1965).

В гл. 7 - 9 мы хотели продемонстрировать, что гены в самом деле контролируют онтогенез и притом весьма специфическими способами, т. е. что существует такое явление, как генетически детерминированная программа развития. Исследование этой генетической программы путем анализа мутаций, воздействующих на развитие, показало, что, хотя мутантные аллели многих генов нарушают развитие, существует небольшая группа генов, мутации которых вызывают совершенно новые эффекты. Эти гены, примером которых служат гомеозисные комплексы дрозофилы, действуют, подобно переключателям, специфицируя альтернативные типы морфогенеза. Мы подробно рассмотрели характеристики гомеозисных генов, потому что это наиболее глубоко изученные гены-переключатели, связанные с развитием. У других организмов также имеются гены-переключатели, которые, вероятно, играют важную роль в принятии решений в процессе развития, но эти гены менее изучены.

Интересная особенность генов дрозофилы, которые «принимают решения» при переключениях, связанных с детерминацией числа сегментов, их полярности и индивидуальных особенностей, состоит в том, что эти гены служат как бы для расшифровки позиционной информации. Как было показано в гл. 4, позиционная информация представляет собой важный элемент развития широкого филогенетического спектра организмов. Однако большинство беспозвоночных и позвоночных животных, служащих классическими объектами исследования в эмбриологии, слишком слабо изучены генетически, чтобы можно было расчленить генетические программы, участвующие в установлении и расшифровке пространственной организации; такую возможность предоставляет только дрозофила, чем и объясняется наша «приверженность к мухам».

Процессы развития можно анализировать классическими генетическими методами, позволяющими выявить гены, несущие регуляторные функции в живом организме. Однако при анализе генной экспрессии мы не ограничены этими методами. В сущности, при изучении большинства организмов следует пользоваться другими методами. Успехи в разработке методов клонирования генов и в тонких исследованиях ДНК и РНК дают возможность изучать гены и генную экспрессию непосредственно в процессе развития. Результаты таких работ обсуждаются в гл. 10 и 11. В гл. 12 сделана попытка свести воедино и переосмыслить материал этих и других глав, положив начало созданию эмбриогенетической основы морфологической эволюции.