Эмбриональные адаптации

Эволюционная история любого вида определяет те его структуры и процессы, на которые может действовать естественный отбор. История и адаптация переплетаются друг с другом. Это привело к поразительному разнообразию личиночных морфологии. В некоторых группах сохраняются сходные типы развития и сходные личиночные стадии, несмотря на резкие различия морфологии взрослых особей. Так, у морских желудей и других ракообразных сохраняется считающаяся примитивной личинка науплиус, а у зародышей млекопитающих имеются структуры, напоминающие жаберные дуги рыб. Подобные случаи легли в основу закона Бэра, а позднее - геккелевского закона рекапитуляции. Известны, однако, и противоположные примеры. У некоторых насекомых, очень сходных на стадии имаго, личинки сильно различаются вследствие дивергентных личиночных специализаций. Такие случаи и существование специализированных структур, связанных с развитием (например, внезародышевые оболочки и плацента млекопитающих), представляют собой временные приспособления, по которым зародыши и личинки могут очень сильно отклоняться от предковых или даже родственных форм.

Зародышевые и личиночные стадии, хотя они должны обладать всеми атрибутами, необходимыми интегрированным и жизнеспособным организмам, тем не менее представляют собой стадии некоего динамического процесса, связанного с дифференцировкой и ростом в пределах зародыша. Если мы согласны с тем, что изменения этих процессов создают механическую основу для достижения морфологической эволюции, то тогда характер адаптации, лежащих в основе экспрессии генов, которые контролируют зародышевые стадии развития, представляет очень большой интерес.

В гл. 7-9 были приведены данные, показывающие, что гены действительно контролируют морфологическое развитие. В настоящей главе мы рассмотрим два главных аспекта экспрессии этих генов: генетическую стоимость развития в смысле доли генома, отдаваемой развитию, и специализации в организации генома, необходимые для поддержания развития.

 

Сколько генов необходимо для развития?

К счастью, существуют методы, позволяющие оценить количество генетической информации, имеющейся у высших организмов. Один из самых тонких таких методов - классическая менделевская генетика. Главная трудность, связанная с этим методом, заключается в удивительно малом числе организмов, которые достаточно подробно изучены генетически, чтобы предоставить нам желаемые данные. В сущности, на сегодняшний день лишь один организм - плодовую мушку Drosophila melanogaster - можно считать достаточно хорошо изученной генетически. С тех пор как в 1910 г. Т. Морган и его ученики впервые внесли дрозофилу в лабораторию, по одному этому скромному насекомому было собрано внушительное количество информации. С помощью химических мутагенов и рентгеновых лучей у дрозофилы были индуцированы многие тысячи мутаций, разбросанных по всему ее геному. Современный каталог мутаций D. melanogaster - свидетельство усердия генетиков - занимает свыше 500 страниц.

Эта обширная коллекция мутаций, а также умение получать новые создают возможность для выявления зависимости между генами и морфологическими, метаболическими, морфогенетическими или поведенческими признаками организма. Мутации можно использовать для получения двух основных типов информации относительно развития: это, во-первых, важнейшие сведения относительно функции отдельных процессов онтогенеза и их регуляции, получаемые путем анализа способов, которыми мутации вмешиваются в такие процессы; во-вторых, это информация (она нас, собственно, здесь и интересует) о числе генов, контролирующих процессы развития, которая в свою очередь дает нам возможность оценить долю генома, участвующего в онтогенезе как таковом.

Каждый отдельный ген может дать ряд различных мутантных аллелей, проявляющихся в виде различных фенотипов; поэтому число генов, участвующих в том или ином процессе, нельзя оценить с помощью такой привлекательной по своей простоте процедуры, как подсчет мутаций. Рассмотрим две мутации, воздействующие на один определенный фенотипический признак. Вопрос о том, относятся ли эти две мутации к одному или к двум генам, решается при помощи стандартного теста на комплементацию.

Число групп комплементации, регулирующих развитие дрозофилы, можно оценить, взяв выборку мутаций какого-либо одного класса и определяя путем экстраполяции общее число генов этого класса во всем геноме. Такая экстраполяция основана на двух допущениях. Первое из них состоит в том, что гены, имеющие одинаковые функции, распределены либо в одной хромосоме, либо во всем геноме случайным образом; т.е. гены, выполняющие в развитии близкие функции, не образуют кластеров. За некоторыми важными исключениями, рассмотренными в гл. 8, это допущение кажется разумным. Второе допущение заключается в том, что гены, несущие сходные функции, мутируют с одинаковой частотой и что их мутации одинаково легко выявить. Это допущение не выполняется отдельными генами, которые оказываются более мутабильными, чем большинство других, но оно, по-видимому, оправданно применительно к большой выборке генов. Можно выявить мутации, блокирующие развитие различными способами, и сгруппировать их в определенные категории. По каждой категории собирают как можно больше мутаций, но сделать исчерпывающую выборку, в которой геном насыщен мутантными генами желаемой категории, конечно, невозможно. Поэтому берется ненасыщающая выборка, которую надо затем статистически расширить. Для этого необходимо, чтобы гены, попавшие в выборку просто потому, что они мутировали, действительно представляли собой случайную выборку из того класса, который интересует исследователя.

Какие классы генов исследователь считает существенными для развития, зависит от особенностей развития изучаемого организма. Важно помнить, что дрозофила - голометаболическое насекомое, т.е. ее развитие сопровождается полным превращением, и личинка по своей морфологии, физиологии и поведению совершенно не похожа на взрослую муху. При этом личиночные структуры не превращаются непосредственно в соответствующие имагинальные структуры. Муха - это своего рода феникс: большая часть ее личиночных тканей распадается и поглощается тканями взрослой особи, развивающимися из имагинальных дисков, находящихся в личинке. Таким образом, в этом организме на самом деле имеются две морфогенетические системы, в которых может осуществляться генная функция, играющая решающую роль в развитии взрослой особи. Первая система действует во время эмбриогенеза, когда происходит образование составных частей и морфологии личинки. Вторая система определяет становление, поддержание и пролиферацию имагинальных дисков в личинке и их дифференцировку, приводящую к формированию взрослой особи.

Первая из этих систем - личиночное развитие - состоит в действительности из двух разделенных во времени систем действия генов. Содержащаяся в яйце информация, необходимая для ранних стадий развития, представляет собой продукты действия генов во время оогенеза. По прошествии этого периода зависимости от генных продуктов, созданных во время оогенеза, в зародыше начинается активная транскрипция, поставляющая информацию, необходимую для дальнейшего развития. Таким образом, у дрозофилы в набор важных для развития генов должны входить гены, наследуемые по материнскому типу (т.е. функционирующие во время оогенеза), гены, функция которых имеет жизненно важное значение в течение зародышевого или личиночного развития, и гены, специфически воздействующие на развитие имагинальных дисков. Для дрозофилы сделаны оценки генов всех этих трех классов.

Ганз (Gans) и его сотрудники, а также Молер (Moller) выделили большое число мутаций с материнским эффектом для генов, локализованных в Х-хромосоме (обсуждение хромосом дрозофилы см. гл. 3), а Раис и Герен (Rice, Garen) выделили такие мутации, локализованные в третьей хромосоме. Существуют два типа мутаций с материнским эффектом. В первом случае самки производят морфологически аномальные яйца (например, с дефектами яйцевой оболочки), а во втором - яйца, которые кажутся нормальными, но не могут завершить развитие. Нас интересуют только мутации этого последнего класса. Как видно из табл. 10-1, Ганз выявил 42 мутации этого класса, Молер - 146, а Раис и Герен - 6. Проведенные затем тесты на генетическую комплементацию показали, что все эти мутации распадаются на 30, 60 и 5 отдельных групп комплементации соответственно, т. е. некоторые из этих мутаций возникли в результате повторных попаданий в один и тот же ген.

Таблица 10-1. Оценки общего числа генов с материнским эффектом в геноме дрозофилы

Прежде чем приступить к анализу этих мутаций, следует напомнить предостережение, высказанное Томасом Гексли: «Математику можно сравнить с наисовершеннейшей мельницей, которая размелет ваш продукт в самую тонкую муку, но при этом то, что вы получите, зависит от того, что вы положите на жернова...». Используя допущения о случайном размещении генов и их одинаковой мутабильности, число немутировавших генов можно оценить при помощи распределения Пуассона. При этом исходят из допущения высокой вероятности того, что у большинства генов данного класса не возникло ни одной мутации, у небольшого числа возникло по одной мутации, а вероятность двух мутаций на ген еще меньше. Количественная зависимость между группами генов с отсутствием мутаций, одной и двумя мутациями описывается выражением

где n 1 - число генов, мутировавших один раз, n 2 - число генов, мутировавших дважды, и n 0 - число генов, у которых не обнаружено ни одной мутации. Численные значения для n 1 и n 2 можно получить по данным комплементации для любого класса.

На основании данных Ганза и его сотрудников n 0 получается равным 53, а по данным Молера п 0 равно 38 при оценках общего числа генов в Х-хромосоме, наследуемых по материнскому типу, равных 83 и 98 соответственно. С учетом характера оценок совпадение двух последних чисел следует считать очень хорошим; можно принять, что в Х-хромосоме имеется примерно 90 генов, жизненно важных для эмбриогенеза, и что продукты этих генов образуются в результате их активности во время оогенеза. Точно так же из данных Раиса и Герена можно получить n 0 = 8 и nобщее=13 для генов этого класса, локализованных в третьей хромосоме. Расхождения между оценками для Х-хромосомы и третьей хромосомы интересны, но объяснить их нелегко, потому что третья хромосома содержит примерно вдвое больше ДНК, чем Х-хромосома, и такое несовпадение нельзя отнести за счет различий в величине изученных выборок. Поэтому создается впечатление, что гены с материнским эффектом находятся преимущественно в Х-хромосоме.

Если допустить, что вторая хромосома - аутосома, сходная по содержанию ДНК с третьей хромосомой, - сходна с ней также и по своей организации, то в ней также, вероятно, имеется 13 генов с материнским эффектом. Последняя аутосома - очень маленькая четвертая хромосома - судя по ее относительным размерам, должна содержать один ген с материнским эффектом. Если суммировать все эти оценки, то получится, что в геноме дрозофилы имеется в общей сложности примерно 117 генов с материнским эффектом, причем 90 из них локализованы в Х-хромосоме и, судя по результатам изучения третьей хромосомы, - еще примерно 27 таких генов локализовано в аутосомах.

Для того чтобы оценить число генов, необходимых для зародышевого развития, но не относящихся к классу генов с материнским эффектом, нам придется прибегнуть к несколько иному методу. Можно взять случайную выборку летальных мутаций и определить число тех из них, которые детальны в период зародышевого развития. Затем путем экстраполяции можно установить общее число таких деталей во всем геноме, используя долю эмбриональных деталей среди всех летальных мутаций в случайной выборке для определения общего числа генов в данном геноме, способных давать летальные мутации. Мы здесь и пользуемся этим методом, с той разницей что наши случайные выборки летальных мутаций были взяты из двух маленьких, но репрезентативных участков генома, насыщенных летальными мутациями.

Первое требование состоит, конечно, в том, чтобы получить оценку общего числа генов в геноме дрозофилы. Джадд (Judd) и его сотрудники в результате интенсивного генетического анализа небольшого участка Х-хромосомы установили, что число полос в политенных хромосомах дрозофилы почти соответствует числу генов, определенному методом генетической комплементации. Общее число полос, различимых на политенных хромосомах Drosophila melanogaster (рис. 10-1), равно 5000, а по разумной оценке общее число генов также равно 5000. Излишне говорить, что с тех пор как в 1972 г. была впервые предложена эта оценка, она горячо оспаривалась генетиками, но дальнейшие исследования продолжали подтверждать примерное соответствие между числом полос и числом генов.

Рис. 10-1. Микрофотография политенных хромосом слюнной железы Drosophila melanogaster (фотография любезно предоставлена R. Lewis).

Доля этих 5000 генов, способных давать летальные мутации, была определена в двух работах: Шеннон (Shannon) и ее сотрудников и Хочмена (Hochman). Шеннон и др. исследовали мутации в небольшом участке Х-хромосомы между генами zeste и white, который, как показано на рис. 10-2, содержит 13 полос и 13 генов, поддающихся идентификации. Хочмен изучил подобным же образом маленькую четвертую хромосому, содержащую всего 50 полос, в которой он идентифицировал 43 гена. Из 13 генов, локализованных в участке Х-хромосомы, изученном Шенноном и др., только 2 не дают летальных мутаций, а из 43 генов четвертой хромосомы, выявленных Хочменом, - только 6, т.е., по-видимому, эти гены не имеют жизненно важного значения для дрозофилы. На основании экстраполяции от этой ограниченной выборки можно считать, что примерно 85% из 5000 генов дрозофилы способны давать летальные мутации.

Рис. 10-2. Идентификация генов, локализованных в небольшом участке X-хромосомы Drosophila melanogaster, расположенном между генами zeste и white. Тринадцать идентифицированных генов соответствуют тринадцати видимым дискам (Kauffman et al., 1975; с изменениями).

Подвергнув эти обнаруженные и нанесенные на карты летали морфогенетическому анализу, Шеннон и др. и Хочмен установили, что 1/10 и 5/37 соответственно были эмбриональными деталями. Если относительная частота эмбриональных деталей среди всех деталей точно отражает общее их число в геноме, то в таком случае, как это суммировано в табл. 10-2, у дрозофилы имеется от 425 до 550, или примерно 500 генов, способных давать мутации не просто летальные, но летальные именно во время зародышевого развития. Суммируя эту оценку с оценкой числа деталей с материнским эффектом, получаем, что для ранних стадий эмбриогенеза и для формирования функционирующей личинки необходимо 617 генов.

Таблица 10-2. Оценка общего числа эмбриональных леталей в геноме дрозофилы

Оценку числа генов, необходимых для развития и поддержания имагинальных дисков при отсутствии у зародыша каких-либо дефектов, можно произвести на основании результатов, полученных Ширном и Гереном (Shearn, Geren). Эти исследователи выбрали летальные мутации, которые допускали внешне нормальный эмбриогенез и личиночное развитие, но вызывали гибель во время метаморфоза. Было установлено, что эти мутации обусловливают либо дефекты имагинальных дисков, либо полное их отсутствие. Всего было выделено из третьей хромосомы 57 мутаций такого типа. Тесты на комплементацию среди этих 57 мутаций выявили 52 группы комплементации, или гена. Тем же способом, который использовался для подсчета генов с материнским эффектом, было установлено, что для генов этого класса в третьей хромосоме n 0 = 384. Таким образом, теоретически общее число генов в третьей хромосоме, функция которых необходима для нормального развития имагинальных дисков, равна 436. Кисе (Kiss) и его сотрудники обнаружили мутации этого класса также в Х-хромосоме. Поскольку эти мутации представляют собой сцепленные с полом летали, которые нельзя подвергнуть стандартному тесту на комплементацию, Кисе и сотр. были вынуждены провести более сложный анализ, описывать который здесь нет необходимости. По полученной ими оценке для развития функции имагинальных дисков жизненно необходимо 118 генов, локализованных в Х-хромосоме. Если допустить, что во второй и четвертой хромосомах, судя по содержанию в них ДНК по сравнению с третьей хромосомой, локализовано 436 и 20 таких генов соответственно, то общее число генов во всем геноме, необходимое для развития имагинальных дисков, составит приблизительно 1000.

Итак, в целом для нормального течения эмбриогенеза и метаморфоза необходимо 1617 генов, т. е. примерно 30% общего числа генов, определяемого методами менделевской генетики.

Следует подчеркнуть, что в эти оценки совершенно не входят гены некоторых типов - гены, существующие в множественных копиях, такие как гены гистонов, рибосомных РНК (рРНК) и транспортных РНК (тРНК), которые обсуждаются далее в этой главе. Рассмотренными нами способами обнаружения мутаций вряд ли можно выявить гены, существующие в нескольких идентичных копиях. Кроме того, наши оценки, по-видимому, не учитывают гены, определяющие жизненно важные (housekeeping) функции мухи на протяжении всей ее жизни. Так, например, действие мутации, затрагивающей синтез цитохрома с, не будет обладать временной специфичностью, подобно рассмотренным выше мутациям. Если все эти рассуждения верны, то в соответствии с оценкой, полученной путем отбора генов, необходимых для развития, вероятно, можно считать, что у дрозофилы генетическая стоимость развития от яйца до взрослой мухи составляет 30% общего числа генов в геноме.

 

Генетическая стоимость развития на молекулярном уровне

Попытки перенести оценки числа генов, необходимых для развития дрозофилы, на другие организмы сталкиваются с двумя проблемами. Во-первых, геном дрозофилы, по крайней мере в некоторых существенных отношениях, организован, по-видимому, несколько иначе, чем геномы большинства других животных. Вполне возможно, что генетические заключения, сделанные на дрозофиле, окажутся ошибочными при перенесении их на другие организмы. Второе затруднение связано с определением гена. Классическое определение, принятое генетиками, носит в значительной степени операциональный характер: ген определяется по его воздействию на жизнеспособность или на видимый фенотип. К сожалению, генетический анализ большинства организмов, изучаемых эмбриологами, находится лишь в зачаточном состоянии. Для определения числа активных генов у этих животных применяют другой, молекулярный, подход. У молекулярных биологов операциональное определение гена обычно означает нуклеотидную последовательность ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность белка. Хотя существуют методы, позволяющие разделять белки, относительно часто встречающиеся в клетке, и определять их число, экспериментально оценить число видов редких белков почти невозможно. К счастью, удается определить число различных присутствующих в клетке мРНК и таким образом оценить число функционирующих генов. Определение гена молекулярных биологов в конечном счете во многих случаях придет в соответствие с определением генетиков. Однако далеко не ясно, все ли гены обязательно продуцируют мРНК и содержит ли данная мРНК всю информацию, имеющуюся в гене, с которого она транскрибирована.

Зародыши располагают двумя источниками мРНК: теми мРНК, которые запасаются в яйце во время оогенеза, и теми, которые синтезируются в клетках зародыша в процессе развития. Главное назначение больших и разнообразных запасов мРНК в яйце состоит в том, чтобы дать возможность только что оплодотворенному яйцу начать выполнение грандиозной программы белкового синтеза и обеспечить снабжение клетки белками, необходимыми для сборки ядер, мембран и других субклеточных структур в период быстрого дробления. После того как в результате дробления возникнет достаточное количество ядер, сам зародыш становится способным поддерживать такой уровень синтеза мРНК, который обеспечивает синтез белка, необходимого для дальнейшего развития. Каждый отдельный вид мРНК представляет в зародыше кодирующую часть нуклеотидной последовательности определенного структурного гена. Если обратиться к табл. 3-1, то вряд ли останутся сомнения, что такие матричные последовательности отражают только некоторую часть генома. Очевидно также, что многие регуляторные гены, играющие важную роль в морфогенезе, вовсе не участвуют в синтезе мРНК. Следовательно, используя в качестве показателя числа генов, необходимых для развития, разнообразие мРНК, мы просто упустим из виду очень важный класс генов, который поддается выявлению методами менделевской генетики, потому что мутации этих генов приводят к изменениям фенотипа или к гибели зародышей на разных стадиях развития, как это было описано в предыдущем разделе данной главы. Точно оценить количественный эффект этого расхождения невозможно, но, по счастью, между регуляторными генами и генами, представленными в виде копий мРНК, все-таки существует известное соответствие. Гены, функционирующие как регуляторы морфогенеза, транскрибируются, по крайней мере в некоторых случаях. РНК, обнаруженные Кальтгоффом (Kalthoff) в яйцах насекомого Smittia (см. гл. 4), по-видимому, представляют собой транскрипты генов этого класса, потому что эти РНК обеспечивают фактор, необходимый для дифференцировки переднего конца зародыша. Далее многие структурные гены действительно играют важную роль в развитии и морфогенезе. Гены, детерминирующие белки хориона (оболочка яйца у насекомых), которые рассматриваются несколько подробнее в следующем разделе этой главы, служат полезными примерами генов этой категории. Отдельные гены, кодирующие белки хориона, включаются и выключаются по определенному расписанию в процессе морфогенеза оболочки яйца. Белки хориона несут, разумеется, структурные, а не регуляторные функции, но тем не менее если не произойдут переключения соответствующих генов или если ген окажется дефектным, то это может привести к сборке модифицированной или дефектной структуры.

Использование разнообразия мРНК для оценки числа генов таит в себе и другой источник недоразумений. Чисто генетические методы дают возможность выделять мутации, затрагивающие определенные процессы или периоды развития. Эти мутации выявляют гены, специфически влияющие на онтогенез, а не те гены, которые необходимы для метаболизма или поддержания структуры клеток на всех стадиях развития. Матричные РНК зародышей содержат как последовательности, необходимые для определенных стадий развития, так и последовательности, обеспечивающие жизненно важные функции, и обе эти группы последовательностей вносят свой вклад в создание общего разнообразия популяции мРНК. Разграничить эти две группы последовательностей можно лишь при помощи экспериментов, в которых мРНК зародышевых стадий сравнивают с мРНК взрослых тканей, с тем чтобы определить долю последовательностей, содержащихся в зародышах и являющихся общими для всех стадий. Эти последовательности можно отнести к числу обеспечивающих жизненно важные функции.

Измерения разнообразия мРНК производят, используя методы гибридизации нуклеиновых кислот, сходные с описанными в гл. 3. Однако, вместо того чтобы ренатурировать комплементарные цепи ДНК, кодирующую цепь геномной ДНК гибридизуют с РНК. Поэтому подсчет числа экспрессируемых на данной стадии генов можно производить, определяя долю ДНК, гибридизующейся с мРНК, взятой на любой стадии развития.

Такие оценки можно производить для ряда организмов с разной степенью полноты и успеха. Значения разнообразия мРНК, а тем самым числа активных генов, ответственных за продукцию белков в яйцах и зародышах некоторых первично- и вторичноротых, представлены в табл. 10-3. Оценки разнообразия мРНК, приведенные в этой таблице, получены либо для всей цитоплазматической РНК, либо (предпочтительнее) для РНК, связанной с полисомами, а поэтому, как принято считать, действительно определяющей синтез белка. Полисомная РНК с большей вероятностью содержит лишь «настоящие» мРНК, чем вся цитоплазматическая РНК, однако даже к результатам, полученным на полисомной РНК, следует относиться с осторожностью. Большая часть последовательностей РНК, выявляемых методом гибридизации, слишком редки (представлены небольшим числом молекул), чтобы их можно было идентифицировать по их презумптивным белковым продуктам; их принадлежность к мРНК нельзя считать строго установленной.

Оценки числа активных генов, содержащихся в яйцах и личинках дрозофилы, основанные на данных по гибридизации нуклеиновых кислот, оказываются в общем выше, чем оценки числа генов, специфически необходимых для личиночного развития, произведенные генетическими методами. Это неудивительно, так как следует ожидать, что экспрессируются не только гены, специфичные для развития, но и гены, обеспечивающие жизненно важные потребности организма. В среднем опубликованные оценки разнообразия мРНК близки к генетическим оценкам общего числа генов у дрозофилы. Однако недавно Циммерман и др. (Zimmerman et al), используя методы, позволяющие выявить все классы мРНК, обнаружили в личинках дрозофилы примерно 14500 последовательностей мРНК. Это более чем вдвое выше числа, предсказанного Джаддом и его сотрудниками на основании проведенного ими генетического анализа. Для того чтобы вскрыть причины такого расхождения, необходимы более точные данные о специфичной индивидуальности предполагаемых генов, подсчитываемых этими двумя весьма различными методами.

Таблица 10-3. Разнообразие цитоплазматических РНК, содержащихся в яйцах и зародышах1)

1) Оценка числа генов производилась по числу обнаруженных видов РНК, исходя из допущения, что в среднем РНК содержит 1500 нуклеотидов. Выражение, используемое для такой оценки (принимая, что транскрибируется только одна цепь ДНК), следующее: размер уникальной части генома, выраженный числом нуклеотидных пар, умноженный на фракцию, представленную в виде РНК, умноженный на два, равен сложности РНК в нуклеотидах. Сложность РНК в нуклеотидах, деленная на среднее число нуклеотидов на мРНК, равна числу видов мРНК.

2) Оценки разнообразия РНК в яйцах относятся ко всей РНК, предположительно к мРНК, потому что белковый синтез в яйцах слишком незначителен, чтобы можно было отделить фракцию функционирующих мРНК от других цитоплазматических РНК.

3) Общая цитоплазматическая РНК.

4) мРНК, выделенная из полисом, участвующих в белковом синтезе.

У других организмов, приведенных в табл. 10-3, разнообразие генов, экспрессирующихся в процессе развития в виде мРНК, выше, чем у дрозофилы. Подлинный смысл этого неясен, однако вполне возможно, что различия в разнообразии представляют собой один из аспектов парадокса значений С (несоответствие между морфологической сложностью и количеством ДНК в геномах организмов).

Самые подробные исследования разнообразия мРНК, регулируемого в процессе развития, принадлежат Дэвидсону (Е. Davidson) и его сотрудникам, работавшим на морских ежах Strongylocentrotus purpuratus. Они (см. Galau et al., 1976) сравнивали разнообразие мРНК в тканях развивающихся и взрослых особей. Кроме того, эти исследователи поставили перед собой и другую задачу, возможно, более существенную, чем просто установление числа генов; они пытались оценить число генов, специфичных для определенной стадии развития, и число генов, экспрессирующихся на нескольких разных стадиях и в клетках взрослого организма. Полученные ими данные, приведенные в табл. 10-3, вскрывают любопытный факт. Число генов, экспрессирующихся как белки, в процессе развития морского ежа явно уменьшается, несмотря на резкое возрастание морфологической сложности и дифференцированности в период между началом дробления и стадией плутеуса. Так, мРНК яйца содержат последовательности, имеющиеся также и в мРНК гаструлы, но половина последовательностей, имевшихся в яйце, в гаструле отсутствует. Бластула и плутеус содержат большую часть последовательностей, имеющихся в гаструле, но, кроме того, у них есть и другие последовательности. Были изучены также три ткани взрослого морского ежа, что было просто подвигом, так как взрослый морской еж - это, в сущности, известковая коробка, наполненная гонадами и не содержащая почти ничего другого. Разнообразие мРНК в тканях взрослых особей невелико: в любой ткани число генов, экспрессирующихся в виде мРНК, составляет примерно 2-4 тысячи. Хотя разнообразие мРНК в этих тканях гораздо ниже, чем в гаструле, тем не менее около 1,5-2 тысяч имеющихся у них последовательностей те же, что и у гаструлы. Интересно, что во всех трех тканях этот набор общих с гаструлой последовательностей одинаков.

Быть может, эти 1,5-2 тысячи генов обеспечивают жизненно важные функции, тогда как остальные необходимы для зародышевого развития или поддержания особенностей клеточных типов взрослого организма? О вероятности такого заключения свидетельствуют результаты определений разнообразия мРНК у организмов с крайне простой морфологией, таких как бактерии или грибы. Разумно ожидать, что у таких организмов морфологической организации уделяется очень небольшая часть генной активности, которая направлена главным образом на синтез белков, участвующих в метаболизме, поддержании клеточной структуры и репликации клеток. Как установили Хан (Hahn) и его сотрудники, в клетках Escherichia coli содержится 2300 различных последовательностей мРНК, что, в сущности, соответствует всему геному, принимая, что транскрибируется только одна цепь ДНК. Подобным же образом Херефорд и Росбаш (Hereford, Rosbash) обнаружили, что у дрожжей - одного из самых простых эукариотических организмов - экспрессируются 3000-4000 видов последовательностей мРНК. Другой простой эукариотический организм - гриб Achlya ambisexnalis, который изучали Тимберлейк (Timberlake) и его сотрудники, - содержит примерно 2 или 3 тысячи различных последовательностей мРНК.

Существуют и другие эукариоты с такой же простой морфологией, но при этом обладающие высоким разнообразием мРНК и различиями в генной экспрессии в клетках тех очень немногих типов, из которых они состоят. У гриба Neurospora crassa, который изучали Дутта и Чаудхури (Dutta, Chaudhuri), в мицелии экспрессируются примерно 10 000 генов, а в конидиях - только около 5000. Сходным образом Фиртель (Firtel) наблюдал, что из примерно 16000 генов, экспрессирующихся на протяжении жизненного цикла слизевика Dictyostelium discoideum, примерно 11 000 специфичны для стадии дифференцировки, а около 6000 экспрессируются на всех стадиях. Эти результаты противоречат данным Зентинге (Zantinge) и его сотрудников, обнаруживших, что из примерно 10000 генов, экспрессируемых у гриба Schizophyllum commune, свыше 90% являются общими для морфологически различных типов мицелия. В целом все эти наблюдения о разнообразии генов, экспрессирующихся у простых организмов, интерпретировать трудно. Наблюдаемое высокое разнообразие, возможно, обусловлено отчасти тем, что в этих исследованиях изучалась вся клеточная РНК. Между тем, как показали недавние работы Фиртеля и его сотрудников на Dictyostelium, большая часть этих разнообразных РНК никогда не транслируется в белки. По-видимому, только половина обнаруженных Фиртелем последовательностей РНК служит матричными РНК. Если то же самое относится также к грибам Neurospora и Schizophyllum, то это поможет приблизить оценки числа экспрессируемых генов к данным о разнообразии мРНК у дрожжей и у Achlya. Наиболее разумный подход состоит, возможно, в том, чтобы рассматривать самые низкие числа генов как минимальные их числа, необходимые для обеспечения жизненно важных функций. У некоторых форм большие изменения числа экспрессируемых генов сопровождают довольно простую морфологическую дифференцировку, однако другим формам, не очень сильно отличающимся от первых по своим морфогенетическим возможностям, по-видимому, достаточно очень небольшого числа генов. И опять-таки, ввиду отсутствия надежных данных о функциях экспрессируемых генов мы полагаем, что случаи, в которых экспрессируется небольшое число генов, могут оказаться более полезными для установления минимального числа генов, действительно участвующих в морфологической дифференцировке.

Сравнительно низкое разнообразие мРНК в тканях взрослых морских ежей позволяет считать, что для поддержания дифференцированного состояния у животных необходимо относительно небольшое число генов, экспрессируемых в виде белков. К такому заключению приводят также исследования на дифференцированных тканях высших организмов, как, например, работа Хасти и Бишопа (Hastie, Bishop) на мышах и Акселя (Axel) и его сотрудников на курах. В почках, печени и головном мозге мышей и в яйцеводах и печени кур было обнаружено около 12000 различных мРНК. Как у мышей, так и у кур лишь 10-15% мРНК были специфичны для какой-либо одной ткани. Все прочие мРНК были общими для разных тканей. Данные о том, что 1000-2000 генов, экспрессируемых в виде белков, достаточно для идентификации отдельных тканей, совпадают с результатами, полученными на морских ежах; однако остается открытым вопрос о том, почему такое большое число последовательностей - около 10 000 - встречается в нескольких совершенно различных тканях.

Возможно, что на самом деле положение еще сложнее, чем это вытекает из упомянутых выше исследований. Хан и его сотрудники (Hahn et al.) изучали разнообразие мРНК в головном мозге мыши методом гибридизации, позволяющим выявлять более редкие последовательности мРНК, чем те, которые наблюдали Хасти и Бишоп, а также Ван-Несс и сотр. (Van-Ness et al.), и обнаружили 170000 различных мРНК. Следует помнить, что головной мозг - необычайно сложный орган, состоящий, возможно, из клеток нескольких сот типов и подтипов. Поэтому высокое разнообразие мРНК отражает, быть может, высокую степень разнообразия клеток в этой ткани.

Камалей и Гольдберг (Kamalay, Goldberg) обнаружили также, что в тканях высшего растения - табака - большое число генов экспрессируется в виде мРНК. В листьях, стебле, корне, лепестках, пыльниках и завязи содержится около 25000 последовательностей. Примерно две трети их содержатся во всех тканях, а 6000-10000 специфичны для отдельных тканей.

Однако нас здесь интересует генетическая стоимость онтогенеза как такового. Быть может, располагая оценками всего лишь по двум организмам, делать обобщения рискованно. Как у дрозофилы, так и у морского ежа Strongylocentrotus относительно большая доля генов, экспрессируемых в какое-то ограниченное время в течение жизненного цикла, экспрессируется специфическим образом во время онтогенеза. Ответить на главный вопрос - какая часть этих генов контролирует морфогенез - в настоящее время просто невозможно. В целом доля генов, связанных с морфогенезом, возможно, и велика, однако, сколь это не парадоксально, число генов, на самом деле регулирующих морфогенез, может быть небольшим. Многие структурные гены, необходимые для морфологических процессов онтогенеза, поставляют продукты, без которых невозможна сборка отдельных морфологических структур. Между тем эти гены практически не поставляют регуляторной информации; более того, регуляции подвержены их собственные функции. Гены этого типа нельзя, однако, считать несущественными, так как продукты некоторых из них, например тубулины, актины или белки клеточной поверхности, создают механизмы, обеспечивающие изменение формы клеток и клеточные движения, непосредственно участвующие в морфогенезе. Большая часть контрольных функций, выполняемых регуляторными генами, этими «серыми кардиналами» генетики, очевидно, состоит в том, чтобы обеспечивать гармоничную экспрессию специфичных для онтогенеза структурных генов. Будь число регуляторных генов очень велико, взаимодействия между ними были бы столь сложны, что жизнеспособные эволюционные изменения оказались бы почти невозможными. О том, что число этих генов невелико, во всяком случае в тех нескольких случаях, для которых имеются количественные оценки числа регуляторных генов, свидетельствуют приведенные в гл. 3 данные, показывающие, что у двух гавайских дрозофил форму головы детерминируют 10 или менее генов. Относительно небольшое число генов определяет основные особенности разных сегментов у дрозофилы (большая часть головных сегментов и судьба сегментов тела детерминируется 15 генами; см. гл. 8) и число пальцев у млекопитающих или число амбулакров у иглокожих (гл. 5).

 

Переключение генов и мультигенные семейства

Простой подсчет числа генов, активность которых необходима для нормального развития, позволяет оценить сложность онтогенеза. Однако подобная оценка будет вводить в заблуждение, если не учитывать, что специфичные для развития структурные гены не экспрессируются во всем зародыше в течение всего процесса развития. Экспрессия генов регулируется как в пространстве, так и во времени. Типы локализации, обсуждавшиеся в гл. 4, имеют решающее значение для установления первоначального распределения в зародыше групп детерминированных клеток. Хотя такие явления локализации представляют собой непременное условие онтогенеза, процесс развития, по существу, слагается из каскада событий все возрастающей сложности.

Первоначальная локализация, устанавливающаяся в процессе дробления, создает лишь грубую разметку простой морфологии раннего зародыша, которая обычно коренным образом изменяется в результате морфогенетических событий, происходящих в процессе гаструляции и последующего органогенеза. Клетки, судьбы которых детерминируются во время дробления или позднее, отличаются своим определенным местоположением в зародыше и специфичными только для них одних типами генной экспрессии. Разнообразие мРНК, экстрагируемых из целых гаструл или личинок, отражает совокупность разнообразий мРНК клеток нескольких типов.

Возрастание сложности с течением онтогенеза требует, чтобы процессы, приводящие к дифференцировке и морфогенезу, обладали двумя характеристиками: 1) события должны происходить в правильном временном соотношении друг с другом; 2) между дифференцирующимися участками зародыша должно существовать взаимодействие.

Многие структурные гены, экспрессирующиеся лишь на определенных стадиях развития, не только регулируются во времени, но и обладают интересной особенностью - они принадлежат к мультигенным семействам. Конечно, не все гены, включаемые и выключаемые во время развития, являются членами таких семейств; многие из них, вероятно, представлены в геноме лишь в одном экземпляре. Однако число существующих мультигенных семейств удивительно велико, и их экспрессия почти во всех случаях связана с регулируемым в процессе развития переключением генов. Мультигенные семейства дают зародышу возможность с течением развития и изменением как метаболизма, так и архитектуры клеток и зародыша удовлетворять свои изменяющиеся потребности в белках, имеющих сходную, но не идентичную функцию. Поскольку многие мультигенные семейства содержат гены, продукты которых образуются в больших количествах, так что их легко выделить и подвергнуть исследованию, эти семейства уже оказали большую помощь в изучении генных переключений.

Наше определение мультигенного семейства несколько отличается от определения, данного Худом (Hood) и его соавторами. Мультигенное семейство - это группа генов, близкогомологичных по своим нуклеотидным последовательностям и обладающим близкими или перекрывающимися фенотипическими функциями. Число генов в семействе может варьировать от нескольких копий, как в случае глобинов, до нескольких сот копий, как в случае гистонов и структурных РНК. Множественность и другие характеристики хорошо изученных мультигенных семейств представлены в табл. 10-4.

Таблица 10-4. Некоторые мультигенные семейства 1)

1) Представленные в этой таблице данные взяты из следующих работ: Bloemandal (1977), Brown et al, 1977; Brown and Dawid, 1968; Chambon et al., 1979; Childs et al., 1979; Cleveland et al., 1980; Cohen et al., 1976; Efstratiadis et al., 1979; Fuchs and Green, 1978; Goldsmith and Basehoar, 1978; Goldsmith and Clermont-Rattner, 1979; Hardison et al., 1979; Hennig, 1975; Hood et al., 1975; Jones et al., 1979; Kemphues et al., 1979, 1980; Kindle and Firtel, 1978; Kitchen, 1974; Kitchen and Brett, 1974; Lacy et al., 1979; MacDonald et al., 1980; Newrock et al., 1977; Raff et al., 1982; Schaffner et al., 1978; Scheller et al., 1981; Schuler and Keller, 1981; Sim et al., 1979; Wahli et al, 1979; Wood et al, 1977.

2) Неоднозначность числа генов, входящих в данное семейство, обусловлена филогенетическими различиями, и ее не следует расценивать как неопределенность данных. Так, например, у млекопитающих главный кластер гистоновых генов содержит 10 копий, а у морских ежей - до 1200. Поэтому в графе указано 10-1200.

3) Приведенные цифры относятся к отдельным семействам. Так, например, имеется много семейств генов тРНК, несущих 61 кодон для 20 аминокислот, содержащихся в белках. Множественность близких семейств варьирует. Существует много семейств генов для тРНК и несколько подсемейств гистоновых генов; большинство перечисленных в таблице генов распадается на одно или несколько подсемейств.

Известно большое число мультигенных семейств. В некоторых из них высокоповторяющиеся сателлитные последовательности вообще не транскрибируются. Другие, в том числе многие семейства с умеренно-повторяющимися последовательностями, транскрибируются и дают последовательности РНК, которые, по-видимому, не транслируются в белки. Функцию этих последовательностей РНК еще предстоит установить. Однако многие мультигенные семейства состоят из самых настоящих структурных генов с хорошо выраженной функцией, среди которых есть гены для структурных РНК - рибосомных, 5S и тРНК, а также гены для широкого спектра белков. К числу белков, кодируемых мультигенными семействами, относятся белки, играющие важную роль в подвижности клеток и создании их формы, - такие как актины и тубулины; белки, важные для морфогенеза, - такие как коллагены, кератины и белки хориона; некоторые сывороточные белки; белки-переносчики кислорода - гемоглобины; некоторые мембранные белки; гистоны, играющие важную роль в структуре хромосом; запасные белки желтка, а также антитела. Расположение некоторых из этого множества мультигенных семейств в хромосомах известно, так что можно выделить несколько вполне определенных типов их расположения. Они показаны на рис. 10-3. Гены некоторых структурных РНК расположены по типу тандемных повторов, т.е. ряд идентичных генов для одного и того же продукта сцеплены, образуя последовательность ген - спейсер - ген - спейсер. Участки, находящиеся между структурными генами, иногда транскрибируются, а иногда нет. Кодирующие функции этих генов неизвестны, а поэтому их резонно считать спейсерами, разделяющими тандемные структурные гены. Гены, образующие мультигенное семейство, не обязательно идентичны. Например, в семействе генов, кодирующих близкие, но не идентичные β-глобины, гены, экспрессируюшиеся в определенной последовательности в развитии некоторых млекопитающих, сцеплены так, как это показано на рис. 10-3, Б. Кластер близких генов сам может служить основной единицей в наборе тандемных повторов. Гены, кодирующие гистоны морских ежей и других высших организмов, образуют кластеры, организованные таким образом, как это показано на рис. 10-3, В. Наиболее хорошо известен кластер, определяющий синтез основной массы гистонов в зародыше морского ежа. Этот кластер образован структурными генами для пяти отдельных видов гистонов, расположенными следующим образом:

- (спейсер - Н2А - спейсер - Н3 - спейсер - H2В - спейсер - Н4 - спейсер - H1 - спейсер) -

Рис. 10-3. Типы организации мультигенных семейств. А. Идентичные гены, сцепленные тандемно, как в случае генов рибосомной РНК. Б. Близкие, но неидентичные гены, сцепленные тандемно, как в случае генов глобина. В. Скопление неидентичных генов, как в случае гистоновых генов зародышей морских ежей, у которых эти скопления тандемно сцеплены. Г. Близкие гены, рассеянные по нескольким хромосомам, как в случае генов актинов или тубулинов.

Главные типы гистонов связаны очень далеким родством, и каждый из них фактически состоит из нескольких подтипов, образуя пять гистоновых мультигенных семейств. Таким образом, в каждое из семейств для H1, Н2В, НЗ и Н4 гистонов входит не менее четырех или пяти различных гистоновых генов, а в семейство Н2А - семь генов или более. Некоторые члены главных семейств гистоновых генов образуют кластеры, подобные приведенным выше; ясно, однако, что не все гистоновые гены организованы таким образом.

Мультигенные семейства возникли в процессе эволюции в результате дупликаций (или репликаций более высокого порядка) генов, существовавших в одном экземпляре. Такие начальные дупликации или множественные репликации приводят к образованию тандемных генов. В некоторых случаях сохраняется большое число идентичных тандемных генов. Коррегирующий механизм, обеспечивающий сохранение идентичности таких генов, как гены 18- и 28S-рибосомной РНК, зависит, вероятно, от поддержания тандемной организации. В некоторых из более мелких тандемных семейств за дупликацией следовала дивергенция генов, в результате чего возникали близкие, но не идентичные гены. В случае генов β-глобина такое положение сохранялось на протяжении длительного эволюционного времени. В других случаях близкие гены, например гены тубулинов или актинов, организованы так, как это показано на рис. 10-3, Г. Эти гены разбросаны по одной или нескольким хромосомам. Все изученные до сих пор разнообразные мультигенные семейства позволяют считать, что членство в таком семействе мало влияет на функцию продукта данного гена, а затрагивает лишь регуляцию его экспрессии. Существование этих семейств и их функция в развитии обусловлены, по-видимому, двумя главными причинами. Первая, и сама по себе менее интересная, причина состоит в том, что некоторые генные продукты необходимы лишь на протяжении короткого времени, но в огромных количествах. В этих случаях мультигенные семейства образованы большим числом идентичных генных копий, обычно соединенных тандемно. Так организованы гены рибосомных РНК; в результате их транскрипции образуются огромные количества рибосомной РНК, необходимой для сборки рибосом, которые клетка использует при белковом синтезе. Хороший, хотя и экстремальный пример потребности в функции генов рибосомной РНК содержится в работе Брауна и Дэвида (Brown, David) по рибосомным генам ооцитов лягушки Xenopus laevis. Образование новых рибосом начинается только после гаструляции, так что в начале развития зародыш целиком зависит от запаса рибосом, накопленных во время оогенеза. Запас этот довольно солидный - яйцо Xenopus содержит примерно 1012 рибосом. Соматические клетки Xenopus содержат по 450 копий генов рибосомной РНК на каждый гаплоидный набор ДНК. Этого достаточно для удовлетворения потребностей относительно небольших соматических клеток, но даже такое множество генов не может обеспечить синтез рибосомной РНК в количестве, необходимом яйцу. Браун и Дэвид установили, что число этих генов амплифицируется в ооцитах, возрастая еще в 4000 раз. Несколько иная стратегия используется при оогенезе для обеспечения 5S-PHK, также необходимой для сборки рибосом. Каждый гаплоидный набор ДНК Xenopus laevis содержит 24000 копий главного специфичного для ооцитов гена 5S-PHK. В соматических клетках транскрибируются другие гены, образующие менее многочисленное семейство генов 5S-PHK.

Вторая причина связана с тем, что мультигенные семейства должны обеспечивать переключение генов в процессе развития. Семейства, содержащие близкие, но не идентичные гены, продуцируют сходные продукты, каждый из которых специфически необходим или клеткам различных типов, или на разных стадиях развития. Наиболее хорошо изученным примером служат небольшие мультигенные семейства, содержащие глобиновые гены. Эволюционные связи между глобинами человека, установленные на основании их аминокислотных последовательностей, представлены на рис. 10-4. Предковый гемоглобин дивергировал от миоглобина примерно ко времени возникновения хордовых, в конце докембрия. В свою очередь предковый β-глобин дивергировал от предкового α-глобина примерно 500 · 106 лет назад, на заре истории позвоночных, в раннем палеоцене. Фетальная γ-цепь дивергировала от β-цепи самое большее 200 · 106 лет назад, в самый начальный период истории млекопитающих. Наконец, δ-цепь (вариант β-глобина), входящая в качестве минорного компонента в нормальный гемоглобин взрослого человека, дивергировала от β-цепи примерно 40 · 106 лет назад. Гены α-цепей образуют небольшое мультигенное семейство из трех членов, а гены β-цепей - семейство из семи генов.

Рис. 10-4. Распределение генов α- и β-подобных глобинов человека. На шкале указана длина хромосомной ДНК в килобазах. Глобиновые гены изображены в виде прямоугольников. Черные поперечные полосы соответствуют кодирующим последовательностям, а белые участки-нитронам. Псевдогены (ψ) изображены в виде чисто белых прямоугольников. Транскрипция в направлении 5'–>3' идет слева направо (Efstratiadis, 1980).

Функциональная молекула гемоглобина - это тетрамер, состоящий из двух субъединиц α-типа и двух субъединиц β-типа, т.е. α2β2. У человека имеется 7 образующих кластер генов глобинов β-типа, расположенных так, как это показано на рис. 10-4. Два из них кодируют Aγ- и Gγ-цепи, обнаруженные в фетальном гемоглобине α2γ2; два гена, δ и β, кодируют цепи, экспрессируемые после рождения ребенка в преобладающих (α2β2) и минорных (α2δ2) видах гемоглобина. У человека имеется также другой глобин β-типа ε и глобин α-типа - ζ, которые экспрессируются только в эмбриональном гемоглобине ζ2ε2. Два других члена β-семейства, ψβ1 и ψβ2, - неэкспрессирующиеся псевдогены. Расписание переключения синтеза с одного глобина на другой в процессе развития человека показывает изменение времени экспрессии генов глобина и мест, в которых они экспрессируются.

На ранних стадиях зародышевого развития ζ-и ε-цепи синтезируются содержащими ядро мегалобластами, образующимися в желточном мешке. Этот синтез быстро снижается и на шестой неделе развития заменяется синтезом другого типа, в котором безъядерные эритроциты, происходящие из стволовых клеток печени и селезенки, синтезируют α- и γ-глобиновые цепи, характерные для плода. На поздних стадиях развития плода костный мозг становится главным местом синтеза глобинов. Вскоре после рождения происходит вторичное переключение глобинового синтеза и переход к синтезу гемоглобина взрослого типа (adult). У этого переключения есть одна очень существенная особенность: переход от одного типа синтеза к другому связан с генной регуляцией в отдельных стволовых клетках, а не просто с заменой стволовых клеток, продуцирующих γ-глобин, на стволовые клетки, продуцирующие β-глобин, потому что во время переключения отдельные эритроциты вырабатывают как γ-, так и β-глобиновые цепи.

Переключение глобиновых генов - общее правило для всех позвоночных, однако типы переключения удивительно разнообразны даже среди млекопитающих. У человека имеются хорошо различимые эмбриональные, фетальные глобины и глобины взрослого типа. Фетальный гемоглобин обладает более высоким сродством к кислороду, чем материнский гемоглобин, что облегчает перенос кислорода через плаценту к плоду. Однако, как показано в табл. 10-5, не у всех млекопитающих имеются ясно выраженные фетальные гемоглобины. У грызунов, хищных и лошадей, например, на стадии плода происходит прямой переход от синтеза эмбриональных глобинов к глобинам взрослого типа. В этих случаях сродство к кислороду гемоглобина взрослого типа, находящегося в эритроцитах плода, по-видимому, как-то модулируется содержащимися в цитоплазме малыми молекулами, так что кровь плода обладает более высоким сродством к кислороду, чем материнская кровь.

Организация генов β-глобинов может быть очень сходной даже у организмов, у которых обнаружены существенные различия в типах переключения. Как видно из табл. 10-5, у кроликов синтезируются эмбриональные β-подобные глобины, называемые ε(Υ) и ε(Ζ), но у них нет фетального β-глобина, эквивалентного γ-цепям человека. Вместо этого плод синтезирует β-цепи взрослого типа. Лейси (Lacy) и ее сотрудники, а также Хардисон и др. (Hardison et al.) установили, что гены β-глобина у кролика образуют кластер, очень сходный с кластерами, имеющимися у человека, и что в процессе развития происходит переключение отдельных генов этого кластера. Два гена, соответствующие по своему местоположению γ-генам в кластере β-генов человека, показанном на рис. 10-4, экспрессируются у зародыша, вероятно для того, чтобы продуцировать ε-цепи. Ген, соответствующий по своему положению δ-гену человека, по-видимому, не экспрессируется ни на одной стадии развития, а ген, соответствующий гену β-глобина взрослого человека, выполняет ту же функцию у кролика.

Таблица 10-5. Переключения генов гемоглобина у некоторых млекопитающих

(по данным Hardison et al., 1979; Kitchen, 1974; Kitchen, Brett, 1974)

Глобины иллюстрируют роль переключения в экспрессировании последовательного ряда генов, непосредственно участвующих в метаболических функциях; существуют, однако, и более сложные системы мультигенов, продукты которых непосредственно участвуют в экспрессии генов или в морфогенезе. В некоторые из таких семейств входит большое число генов, экспрессия которых регулируется в ходе развития.

Гистоновые гены, лучше всего изученные у морских ежей, хорошо иллюстрируют адаптацию, состоящую в использовании мультигенных семейств для обеспечения как синтеза больших количеств белка, необходимых на ранних стадиях развития, так и переключений, необходимых для последовательной экспрессии генов ряда близких белков. В процессе дробления число ядер, а тем самым и содержащихся в них хромосом, быстро растет, увеличиваясь вдвое за каждые 10-20 мин. Гистоны, необходимые для обеспечения сборки хромосом во время быстрого дробления, могут поступать либо из белков, запасенных в яйце, как это показали Вудленд и Адамсон (Woodland, Adamson) на лягушке Xenopus, либо за счет усиленного синтеза гистонов в дробящемся зародыше, как установили Кедес (Kedes) и его сотрудники для морских ежей. Количество гистоновых генов, необходимых для этих двух стратегий, различно. В яйце лягушки гистоны медленно накапливаются в течение нескольких недель или месяцев оогенеза, тогда как в зародыше морского ежа они синтезируются за несколько часов. Яйцо морского ежа содержит лишь около 25% гистоновой мРНК, необходимой для синтеза гистонов при дроблении; остальная мРНК транскрибируется в процессе дробления. Вследствие этого главное семейство гистоновых генов представлено у морского ежа гораздо большим числом копий, чем у лягушки (или у человека). У морских ежей число копий этих генов колеблется от 300 до 1200, тогда как у Xenopus и у человека, по данным Бирнстила и др. (Birnstiel) и Вилсона (Wilson) и его сотрудников, их всего 10-20.

Как установлено, у морских ежей гистоновый синтез регулируется сложным комплексом переключений, что приводит как к временным, так и к тканеспецифичным изменениям. Ньюрок (Newrock) и его сотрудники описали во всех подробностях сложную последовательность этих изменений, впервые обнаруженных Рудерманом и Гроссом (Ruderman, Gross). Из пяти главных гистонов морских ежей три (H1, H2A и Н2В) представлены на ранних стадиях дробления специфичными для этих стадий подтипами, образующимися в результате кратковременного синтеза. Далее происходит синтез гистонов других подтипов, специфичных для отдельных стадий и последовательно сменяющих друг друга, как это показано на рис. 10-5. Подтипы каждого гистона, специфичные для дробления, сменяются в процессе дробления подтипами α-гистонов, а затем на стадии бластулы β-, γ- и другими подтипами. Эксперименты Ньюрока и его сотрудников, Кункеля и Вейнберга (Kunkel, Weinberg) и Чайлдса и др. (Childs et al.) показывают, что замены гистоновых белков происходят в результате постепенных и последовательных изменений в синтезе гистоновой мРНК. Каждый подтип - продукт отдельного гена, относящегося к тому же семейству, что и гены, кодирующие другие подтипы. Замена гистонов одного подтипа гистонами другого подтипа приводит к изменению белкового состава хромосом по мере развития. Такие изменения могут привести к «ремоделированию» хроматина, что имеет потенциально важное значение для дифференцировки клеток зародыша.

Рис. 10-5. Экспрессия членов гистоновых мультигенных семейств в процессе развития зародыша морского ежа. Толщина поперечных полос схематически отражает уровень синтеза белка или количество присутствующей мРНК. Обратите внимание, что синтез гистонов контролируется путем регуляции как трансляции, так и синтеза мРНК, потому что, хотя запасенные в яйце мРНК имеются в наличии на ранних стадиях развития, немедленной их трансляции не происходит (Newrock et al., 1977; Childs, Maxson, Kedes, 1977-с изменениями; использованы дополнительные данные для определения сроков начала трансляции гистонов на запасенной мРНК: Wells et al., 1981, а также Wells, Cohen, неопубликованные данные).

Переключения не ограничиваются такими белками, как глобины и гистоны, участвующие главным образом в обеспечении внутренних потребностей клетки. Некоторые переключения тесно связаны с морфогенезом. Например, микротрубочки, которым принадлежит ведущая роль в клеточном движении и создании формы клетки, состоят из α- и β-тубулинов, синтез которых обеспечивается небольшими мультигенными семействами. Э. Рэфф (Е. Raff) и ее сотрудники установили, что синтез этих тубулинов в процессе развития дрозофилы регулируется путем переключений. Некоторые виды тубулинов синтезируются на протяжении всего развития, но синтез по меньшей мере одного β-тубулина включается, а затем выключается в течение короткого периода эмбриогенеза. Кемпхьюз и др. (Kemphues et al.) обнаружили существо вание тканеспецифичного β-тубулина, экспрессирующегося только в семенниках. Этот специфичный для семенников β-тубулин необходим для сборки очень специализированной структуры - аксонемы хвоста сперматозоида.

Кафатос (Kafatos) и его сотрудники исследовали роль переключателей мультигенов в морфогенезе на примере белков хориона, образующих оболочку яйца, у шелкопряда. Если рассматривать невзрачную на вид оболочку яйца при помощи сканирующего или обычного электронного микроскопа, то обнаруживается ее изящная поверхностная структура, которая, несомненно, понравилась бы Д'Арси Томпсону. На рис. 10-6 показана поверхность хориона шелкопряда Antheraea polyphemus. Главные особенности строения этой оболочки - выстилающие ее шестиугольники, соответствующие местам, где прежде находились фолликулярные клетки, и выступающие вверх дыхательные структуры, удачно названные аэропилями. Видное на переднем плане углубление - это микропиле, через которое при оплодотворении в яйцо проникает сперматозоид. На поперечном срезе можно видеть, что хорион обладает легкой, но механически прочной структурой, укрепленной внутренними перекладинами. Хорион секретируется слоем фолликулярных клеток, синтезирующих белки; число различных белков хориона, синтезируемых у шелкопряда, приближается к 200. Эти белки можно разбить на пять больших классов, различающихся по молекулярной массе и последовательностям аминокислот. Белки, входящие в каждый класс, кодируются семейством близких генов, но, как показали Джонс и др. (Jones et al.), в пределах надсемейства белков хориона обнаружена, кроме того, значительная близость между ограниченными участками, или доменами, белков, принадлежащих к различным семействам. На близость генов, кодирующих эти белки, указывают также данные Мэрией Гольдсмит (Marian Goldsmith) и ее сотрудников о том, что у тутового шелкопряда Bombyx mori многие гены, кодирующие белки, относящиеся к этим семействам, организованы в три кластера, локализованные в одной и той же хромосоме.

Рис. 10-6. Структура поверхности оболочки яйца шелкопряда Antheraea polyphemus. На переднем плане микропиле с концентрическими рядами выстилающих клеток вокруг, а на заднем плане - многочисленные аэропиле (структуры, обеспечивающие дыхание) (Regier, Mazur, Kafatos, 1980; в этой работе дано подробное описание хориона).

Экспрессия генов, кодирующих белки хориона, регулируется рядом переключений. Сим и др. (Sim et al.) установили, что на ранних стадиях развития хориона преобладает синтез членов трех семейств белков с высокой молекулярной массой, а на средних и поздних стадиях-синтез белков, относящихся к двум семействам с низкой молекулярной массой. При помощи соответствующих проб, состоящих из клонов рекомбинантной ДНК генов хориона, Симу и др. удалось выявить виды мРНК, соответствующие клонированным генам. Изменяющийся спектр синтезируемого белка отражает изменения спектра синтезируемой мРНК в фолликулярных клетках.

Два наблюдения, сделанные недавно в лаборатории Кафатоса, убеждают в том, что гены, детерминирующие развитие хориона, близки не только эволюционно и функционально; они, кроме того, расположены в определенном порядке, координирующем их экспрессию. У тутового шелкопряда Bombyx mori известна мутация, которая приводит к развитию дефектного хориона в результате делеции участка ДНК, содержащего примерно половину генов хориона. Утрачиваемые при этом гены относятся главным образом к тем, которые экспрессируются на поздних стадиях хориогенеза, позволяя предполагать, что гены собраны в кластеры в зависимости от сроков их экспрессии. Использование клонов ДНК, полученных путем рекомбинации фрагментов ДНК, которые содержат более одного гена, специфичного для хориона, дало возможность Джонсу и Кафатосу исследовать генную организацию с точки зрения временной регуляции экспрессии. Расположение генов в двух таких клонах показано на рис. 10-7. Эти два клона содержат различные гены, но в каждом клоне имеется по две копии этих генов. Гены эти принадлежат к разным подсемействам хорионных генов, но их экспрессия координирована. Гены, изображенные на рис. 10-7 в верхнем фрагменте, используются в середине хориогенеза, а гены нижнего фрагмента - в конце этого процесса. В обоих случаях физически смежные пары генов, по-видимому, остаются сцепленными при транскрибировании и между каждой парой находится общий для них регуляторный элемент.

Рис. 10-7. Расположение двух совместно реагирующих наборов генов, кодирующих белки хориона. Показаны два клона, несущие собранные в кластеры гены белков хориона шелкопряда. Гены 18 и 401 кодируют два различных белка, синтезируемые на поздней стадии сборки хориона, а гены 10 и 292 - еще два разных белка, синтезируемые в середине Периода сборки хориона. Транскрипция этих спаренных генов, разделенных коротким 5'-спейсером (белые участки), происходит в противоположных направлениях. В каждом гене есть небольшая 5'-кодирующая последовательность (черные участки), за которой следует большой интрон (пунктир). Повторяющиеся гены и окружающие их последовательности образуют кластеры. Штриховкой показаны отдельные спейсерные участки, положение которых в спейсерах варьирует (Jones, Kafatos, 1980).

В процессе эволюции строение хориона у близких видов шелкопрядов претерпело разнообразные изменения. Примером служат хорионы Anthemea polyphemus и A. pernyi (рис. 10-8). Эти виды дивергировали, возможно, еще 10-30 млн. лет назад; эта оценка, однако, несколько сомнительна ввиду недостатка палеонтологических данных по этим крупным бабочкам, что, впрочем, неудивительно. Возникло ли изменение морфологии хориона в результате изменения самих структурных генов, кодирующих белки хориона, или изменения в регуляции их экспрессии? Эксперименты, проведенные недавно в лаборатории Кафатоса, показали, что эти гены действительно изменились, но в ограниченных пределах. Морфологические различия отражают главным образом различия в генной экспрессии. Относительные сроки экспрессии генов хориона у обоих видов Antheraea оказались одинаковыми, что особенно интересно, учитывая, какое большое значение имеют относительные сроки наступления различных процессов для изменений развития в ходе эволюции. Различия в экспрессии генов хориона носят количественный характер, выражаясь в резких различиях количеств некоторых мРНК хориона.

Рис. 10-8. Поверхность хориона у яиц двух видов Antheraea. А. Поверхность хориона A. polyphemus. Микропиле находится в центре расширения на темной полосе, опоясывающей яйцо. Две широкие белые полосы образованы аэропилярными структурами. Широкие участки по обе стороны от них лишены этих структур. Б. Поверхность хориона A. pernyi, целиком покрытая аэропилярными структурами (Подробные описания структуры хориона см. Kafatos et al., 1977, и Regier et al., 1980; фотографии любезно предоставлены G. Mazur и F. С. Kafatos)

У генов, кодирующих белки хориона, возникают мутации, помогающие выявить функции этих переключающихся генов в морфогенезе. Белки хориона у Drosophila melanogaster кодируются гораздо менее многочисленным семейством генов, чем у шелкопрядов, - в него входит, вероятно, всего 20 генов. Мутация одного из этих генов, недавно рассмотренная Дайган (Digan) и ее сотрудниками, приводит к нарушению морфологии хориона, указывая на то, что по крайней мере один из белков хориона играет какую-то роль в организации его структуры.

Гены, кодирующие белки хориона, в сущности, вновь вернули нас к вопросу о числе генов, который рассматривался в предыдущих разделах этой главы. Многочисленность генов, участвующих в сборке одного только хориона, и их сложные переключения позволяют думать, что для многих морфогенетических процессов развития необходима экспрессия большого числа близких генов. Справедливость такого предположения подтверждается примерами гистонов, тубулинов, актинов и других белков, синтезируемых зародышами. После того как эти белки, прежде считавшиеся продуктами одного или самое большее нескольких генов, были изучены более подробно, стало очевидно, что их появление в процессе развития на самом деле обеспечивается целыми семействами структурно близких и функционально координированных генов.

Для развития необходима экспрессия большого числа структурных генов. Многие регулируемые в процессе развития структурные гены принадлежат к семействам эволюционно близких генов, возникшим от одного предкового гена путем дупликации и дивергенции. Близкие многочисленные гены создают возможность для тонкой настройки экспрессии структурных генов, с тем чтобы отдельные гены экспрессировались в течение строго определенных периодов развития или в определенных группах клеток. Так, например, все β-глобины выполняют в общем, в зародыше и во взрослом организме, одну и ту же функцию, но делают это несколько разными способами и с различной эффективностью. Мультигенные семейства наделяют организмы эволюционной пластичностью, так что изменение сроков или места экспрессии одного из членов такого семейства не влияет на экспрессию других его членов. Возможно, что таким образом облегчается диссоциация процессов развития в эволюции.