Проблема овладения гетерогенным осеменением, как мы видели, в основном разрешается приемами искусственного осеменения. Эти достижения снимают большой ряд трудностей, стоящих перед гибридизатором, большие количества видов переводят в круг возможных ресурсов и тем расширяют поле деятельности гибридизатора. Вместе с тем эта проблема вплотную подводит его к следующим проблемам — к проблеме гетерогенного оплодотворения и к проблеме жизнеспособности гибридного эмбриона.

 

Гетерогенное оплодотворение

Гетерогенным оплодотворением будем называть такое оплодотворение, такое внедрение сперматозоида в яйцо и возбуждение его к развитию, при котором яйцо и сперматозоид, участвующие в оплодотворении, относятся к разным видам, родам, семействами пр. Всегда, когда возникает гибрид, имеет место гетерогенное оплодотворение, но не обратно, ибо не всегда в результате гетерогенного оплодотворения возникает гибрид. Нередко гибридный эмбрион возникает лишь на самый краткий срок и затем погибает, или нее хотя эмбрион и получается, но он оказывается негибридным.

Об этом мы упоминали уже при обсуждении проблемы предела гибридизации. Впервые такое явление наблюдал Леб (1910) при гибридизации иглокожих. Он обратил внимание на Парадоксальный, казалось, факт, что при очень далеких скрещиваниях, которые мы называем ультрагибридизацией, возникающие эмбрионы обнаруживают почти в чистоте материнские признаки и совершенно не обнаруживают отцовских признаков. И это в то время, когда более близкие скрещивания дают гибридов явно промежуточных то своим признакам между признаками родителей. Так, при оплодотворении яиц морского ежа Strongylocentrotus purpuratus близко родственным ему видом St. franciscanus плютеусы (личинки) обнаруживали весьма ясно свой гибридный характер (рис. 85 и 86, глава IX), о чем можно было легко судить по строению первичного скелета. Наоборот, при оплодотворении яиц того же вида спермой морских звезд (относящихся уже к другому классу типа иглокожих, т. е. имеющих отличие от ежей примерно такого порядка, как млекопитающие от птиц или амфибий), что происходило лишь при помощи специальных приемов (щелочью или кальцием), получающиеся плютеусы имели вид, типичный для Strongylocentrotus, скак если бы сперма не принесла в развивающийся зародыш никакого наследственного материала» (рис. 39) (см. Loeb, King and Moore, 1910).

Рис. 39. Псевдогибридные плютеусы морского ежа Strongylorentrotus purpuratus при оплодотворении спермой морских звезд (по Лебу, Кинг и Муру). (Ср. рис. 86 и 87).

Дальнейшими исследованиями было установлено, что при других экспериментальных условиях (комбинация искусственного партеногенеза с естественным осеменением) возможно получить плютеусов,

у которых одна половина тела будет иметь гибридный характер, а другая — опять-таки чисто материнский (Гербст), причем гистологическим анализом было выяснено, что ядра в гибридной половине крупные, диплоидные, а в материнской половине — мелкие, гаплоидные. Очевидно, что в этом случае оплодотворенной оказалась не вся зигота, а только один из бластомеров (рис. 40).

Рис 40. Половинные гибриды Strongylocentrotus × Sphaerachinus; при а — справа ядра гаплоидной, слева диплоидной части, при  b — наоборот (по Гербсту).

В вышеприведенном случае ультрагибридизации дело обстояло так, что чужеродный сперматозоид хотя и проникал в яйцо и производил оплодотворение его, возбуждая к развитию, но сам (в частности его ядро) участия в дальнейшем развитии не принимал. Здесь получаем как бы искусственный партеногенез при помощи чужеродного сперматозоида. Потомки оказываются вовсе не гибридами. Этих потомков Г. Гертвиг предложил называть ложными гибридами (pseudonoth) в противоположность настоящим гибридам (ortonoth).

Однако правильнее вовсе не называть их гибридами или же противопоставлять их уже не «настоящим гибридам» (ортонотам), а просто гибридам. Ложные гибриды могут быть получены разными способами (например повреждением спермы радием — Гертвиги Г. и П.), но гибридизатора они интересовать особенно не могут, так как тут никакой гибридизации нет, а получаются действительно материнские формы (при этом гаплоидные) и дело идет о своеобразном искусственном партеногенезе.

Что касается гетерогенного оплодотворения, в результате которого мы получаем гибридов, то наши сведения о нем сводятся в основных чертах к следующему.

1. Гетерогенное оплодотворение может происходить в очень многих случаях, начиная от близких видов до весьма отдаленных.

2. В общем может быть констатировано, что чем дальше отстоят друг от друга скрещиваемые виды, тем затруднительнее становится оплодотворение и наконец делается вовсе невозможным.

3. Однако строгого параллелизма между таксономической отдаленностью видов и легкостью гетерогенного оплодотворения также не существует, как и между другими элементами получения гибридов (гетерогенным осеменением, жизнеспособностью гибридов).

4. Во многих случаях гетерогенное оплодотворение возможно тогда, когда возникающие эмбрионы оказываются нежизнеспособными.

5. Это однако не исключает важной для гибридизации возможности возникновения жизнеспособных гибридов там, где без специальной помощи гетерогенное оплодотворение не происходит.

6. У нас уже имеются возможности оказывать содействие гетерогенному оплодотворению и получать его и в тех случаях, когда оно естественно не происходит.

Последние два момента выдвигают проблему гетерогенного оплодотворения как самостоятельную проблему гибридагогии. Пункт 6 позволяет нам путем дальнейшей разработки теории и практики помощи гетерогенному оплодотворению расширять гибридоресурсы. Правда, пункт 5 нам пока приходится в значительной мере постулировать, но верность этого постулата оправдывается например тем, что: 1) часто близкие виды обнаруживают совершенно различную способность к гетерогенному оплодотворению (например упомянутый случай Fundulus heteroclitus и F. majalis); 2) при гетерогенном оплодотворении обычно получается низкий процент оплодотворений, даже когда полученные гибриды вполне жизнеспособны (следовательно в этих скрещиваниях оплодотворения многих яиц не произошло, хотя эмбрион мог бы быть вполне жизнеспособным); 3) нередко при реципрокных скрещиваниях одно — оплодотворение получается, а реципрокное не получается, хотя можно думать, что это не связано, с жизнеспособностью гибридов. Только изучив досконально процесс гетерогенного оплодотворения и овладев им, гибридагог сможет выделить в полной мере ту часть гиркона, которая способна давать жизнеспособное гибридное потомство, и очертить тем поле своей деятельности, которое можно будет обрабатывать без разрешения следующей и притом труднейшей проблемы: борьбы с нежизнеспособностью гибридов — проблемы, которая конечно в полной мере, по крайней мере для ультрагибридов, разрешена не будет.

Говоря о проблеме гетерогенного оплодотворения, нужно иметь в виду, что в настоящее время она изучена еще чрезвычайно неполно и притом крайне односторонне. Односторонне в том отношении, что объектами исследований служили лишь виды с внешним оплодотворением — оплодотворением, происходящим вне организма самки в воде, — иглокожие, молюски, амфибии, рыбы и т. п. Что же касается объектов, — особенно интересных (кроме рыб) для народнохозяйственной гибридизации — птиц и млекопитающих, то здесь мы пока почти ничего еще не знаем. У этих объектов оплодотворение столь тесно переплетено с осеменением, что необходимо разработать специальную методику осеменения или оплодотворения in vitro (см. ниже) для того, что бы мы имели возможность изучать эти проблемы раздельно. В самом деле, если мы сейчас констатируем неудачу получения гибридов овец с козами, собаки с лисой или если мы констатируем, что при осеменении фазаном курицы получается низкий процент гибридных цыплят, то мы еще ничего не можем сказать, является ли причиной этого трудность гетерогенного оплодотворения или просто сперматозоиды не доходят в чуждом для них яйцеводе до встречи с яйцом, отмирая по дороге (пли наконец, что эмбрионы оказываются нежизнеспособными).

С другой стороны, мы можем ожидать, что именно у животных с внутренним оплодотворением перспективы гетерогенного оплодотворения могут оказаться особенно широкими. В самом деле несомненно, что виды имеют все основания избегать гетерогенного оплодотворения, в большинстве случаев способного нанести им лишь вред (нежизнеспособностью гибридов или их бесплодием). Поэтому несомненно, что на базе естественного отбора у видов должны были вырабатываться защитные приспособления против возможности гетерогенного оплодотворения. У видов с внешним оплодотворением Такие защитные приспособления должны были приурочиваться к самим гаметам, так как после выбрасывания их в воду родители уже не могут предохранить гаметы от гетерогенного оплодотворения, особенно в богатых фаунах, где по выражению Леба во время нереста морская вода превращается в «суспензию сперматозоидов».

Иное дело например у млекопитающих. Здесь гетерогенному оплодотворению поставлены как правило непреодолимые преграды задолго до проникновения сперматозоида к самому яйцу: экологические преграды, мешающие встрече разных видов, рефлексологические преграды, делающие невозможным сближение самцов одного вида с самками других, механические преграды, делающие невозможным совокупление и эякуляцию, и наконец физиологические преграды, затрудняющие или делающие невозможным для чужого сперматозоида прохождение по длинным путям чужих половых органов до встречи с яйцом. Несомненно, что перечисленные элементы во многих случаях нацело устраняют возможность гетерогенного оплодотворения у млекопитающих и птиц в природе, и «службу защиты вида» от такого оплодотворения естественный отбор может всецело возложить на эти элементы. А так как всякой приспособление при утрате своего значении вообще говоря разрушается в ходе эволюции, то имеются все основания ожидать, что у видов с внутренним оплодотворением сами гаметы лишены уже защитных приспособлений против гетерогенного оплодотворения. Наше предсказание может оказаться неверным лишь при наличии более общих приспособлений клеток животных против проникновения в них инородных белков (реакция типа иммунитета). Однако известные опыты Мерфи (см. ниже главу VII) показали, что например у цыпленка на ранних стадиях его развития ткани эмбриона столь толерантны к чужим белкам, что допускают пышный рост совершенно чуждых трансплантатов (например тканей человека). Можно думать поэтому, что и чужой сперматозоид будет встречаться яйцом млекопитающих и птиц очень толерантно.

Эти соображения заставляют считать изучение гетерогенного оплодотворения у млекопитающих и у птиц (и разработку соответствующей техники) проблемой, чрезвычайно интересной как в гибрида готическом, так и в общебиологическом отношении.

 

Процесс оплодотворения и его элементы

 

Для того чтобы овладеть гетерогенным оплодотворением, получить возможность управлять им и устранять препятствия, необходимо изучить все различные их элементы, входящие в этот сложный процесс, и вскрыть все многочисленные отдельные препятствия, которые могут встать на пути гетерогенного оплодотворения.

Можно наметить следующие элементы процесса оплодотворения:

1) возбуждение яйцом подвижности сперматозоидов;

2) привлечение яйцом сперматозоида и тактическую реакцию сперматозоида на близость яйца;

3) внедрение сперматозоида в яйцо;

4) выделение яйцом оболочки, предохраняющей от полиспермии, без чего часто невозможно правильное оплодотворение;

5) возбуждение яйца к дроблению;

6) движение ядра сперматозоида к ядру яйца и слияние с ним;

7) участие обоих ядер в дроблении.

На каждом из перечисленных участков могут возникнуть препятствия к гетерогенному оплодотворению, и борьба за него должна вестись по всем участкам этого фронта.

 

Усиление активности сперматозоида

Усиление активности сперматозоида при приближении к яйцу наблюдается у многих видов. Повидимому оно особенно свойственно некоторым гетерогенным соединениям; так, Дунгерн (Dungern) считал, что такое усиление активности свойственно только чужой сперме. Лилли (1914) высказал предположение, что это явление может носить специфический характер. Лоб (1915) исследовал этот вопрос экспериментально на морских ежах и звездах. У морских звезд Asterias и Asterina были взяты незрелые яйца, а у морских ежей Strongylocentrotus franciscanus и S. purpuratus — яйца зрелые. У тех же видов была взята сперма и помещена, как и яйца в п/2 растворе NaCl. Здесь сперматозоиды оставались неподвижными. Затем производилось смешение каждого вида яиц с каждым видом спермы в том же растворе. При этом в ряде комбинаций наступала яркая активность, в других же — нет, как видно из таблицы, на следующей странице.

Из этой таблицы можно сделать ряд поучительных выводов. Прежде всего видно сильное возбуждающее действие яиц на сперматозоиды того же вида (клетки большой диагонали, идущей слева сверху. направо книзу). При этом возбуждающее действие оказывают на сперматозоиды, как зрелые, способные к оплодотворению яйца, так и незрелые, к оплодотворению совершенно еще не способные.

Специфичность в активировании спермы яйцами

Действие яиц на чужие сперматозоиды, наоборот, очень разнообразно. Так, яйца обоих видов морских ежей действуют одинаково возбуждающе как на сперму того же вида, так и на сперму другого вида морских ежей. Наоборот, на сперму морских звезд (дело идет, надо помнить, об ультрагибридизации — скрещиваются представители разных классов) яйца ежей действия не оказывают совсем или очень слабое.

Яйца Asterias ведут себя еще более специфично и, возбуждая свою сперму, совершенно не возбуждают спермы другого рода морских звезд. Несколько своеобразным оказывается их более-заметное, хотя и слабое влияние на сперму морских ежей — форм, во всяком случае гораздо более удаленных, чем Asterina.

Наоборот, у Asterina мы видим совершенно неожиданное явление: ее яйца одинаково сильно возбуждают свою сперму и сперму одного из ежей — St. franciscanus, очень слабо — сперму другого вида ежей и совершенно не возбуждают сперматозоидов Asterias, другой звезды.

То же можно сказать и обратно, исходя от спермы, но придется лишь отметить, что сперма морских звезд сильно реагирует на свои яйца и почти или вовсе не реагирует на чужие яйца; сперма St. purpuratus реагирует на яйца обоих видов ежей и слабо — на яйца морских звезд. И наконец сперма St. franciscanus реагирует ярко на свои яйца и яйца другого вида ежей и столь же ярко на яйца морской звезды Asterina и наконец на яйца Asterias реагирует «умеренно активно».

Обсуждая эти опыты, Леб придает повидимому большее значение возбудимости сперматозоида, чем возбуждающему действию яйца. Ол указывает, что и в морской воде для-возбуждения сперматозоидов звезд требуется более сильное воздействие, чем для сперматозоидов ежей.

Во всяком случае несомненно, что проблема возбуждения сперматозоидов яйцами еще очень неясна. Подчеркнем например дне реципрокные встречи Asterina с St. franciscanus: в то время как сперматозоиды St. franc, ярко реагируют на яйца Asterina, при реципрокной встрече не получается никакого эфекта. Уже это одно говорит об отсутствии какой-либо простой связи между возбудителем и таксономическим родством — вывод, чрезвычайно важный для гибридагогии, так как мы видим, что возбуждение может иметь место и при чрезвычайно отдаленных встречах (звезда — еж), которые имеют лишь-общетеоретический интерес, а не практический — вряд ли мы будем-пытаться скрещивать голубя с кроликом, возможность чего допускал. Реомюр.

Необходимо иметь в виду и то, что сам вопрос о роли возбуждения сперматозоида еще не ясен. Так, Леб и Уэстенейс (Loeb a. Wasteneys) — тщетно пытались обнаружить активирующее действие яиц разных морских костистых рыб на сперму тех. же видов.

Таким образом в этом разделе мы встречаемся с необходимостью-дальнейшей разработки следующих проблем: 1) значение возбуждения сперматозоидов яйцом для оплодотворения в связи с различными условиями этого оплодотворения; 2) какими веществами вызывается это возбуждение у разных видов, являются ли эти вещества специфическими видовыми или родовыми, или более общими, какова химическая природа этих веществ (см. ниже), какова природа возбудимости сперматозоидов и какими факторами это возбуждение можно вызвать и т. д.

Очень интересны были бы опыты со смешанными порциями яиц, своего и чужого вида. В предыдущей главе мы видели например опыты Штандфусса, возбуждавшего самцов бабочек, помещая в одну клетку самок как того же, так и другого вида — таким способом ему удавалось заставить возбужденных самцов итти на самок другого вида. Эту идею можно было бы применить и здесь и возбудить активность сперматозоидов некоторым добавлением «своих» яиц, быть может облегчив им проникновение в чужие яйца.

Далее в качестве возбудителя должна быть изучена температура, так как влияние повышения температуры на подвижность спермы уже известно. Несомненно, что поле для экспериментальных исследований под углом зрения содействия гетерогенному оплодотворению здесь еще чрезвычайно широко.

В настоящее время в некоторые из перечисленных вопросов уже внесена доля ясности. Работами главным образом Ф. Р. Лилли, Леба и др. было показано, что в активности сперматозоидов большую роль-играет концентрация в воде водородных ионов и гидроксильных ионов, причем гидроксил-ионы повышают активность, а Н-ионы оказывают тормозящее действие. Что последнее в частности имеет место у некоторых видов, доказывает явление агрегации сперматозоидов: скопляясь случайно вместе, сперматозоиды выделяют такое количество СО2, что их движение замирает, а к образовавшейся кучке направляются другие благодаря, очевидно положительному хемотаксису к повышенной концентрации СО2 — и комки сперматозоидов еще больше нарастают, становясь. видимыми простым глазом (например у червя Nereis).

Более детально природу веществ, выделяемых яйцами, можно исследовать методом так называемой «яичной воды». Помещая в небольшой объем воды значительные количества яиц, можно получить настойку, которую далее можно слить с яиц и изучать действие «яичной воды» на сперматозоиды в отсутствие яиц.

Эта яичная вода (с яиц иглокожих и червей) обладает сильным действием, способным активировать сперматозоиды, вызывать агломерацию и внешне сходную с нею аглютинацию, т. е. слипание, связанное очевидно с каким-то изменением поверхности головки сперматозоида, делающим ее липкой и вероятно играющим роль при оплодотворении.

Лилли установил некоторые черты вещества (веществ), выделяемого яйцами. Оно бесцветно, не проходит через фильтр Беркефельда и через уплотненную фильтровальную бумагу, не подвергается диализу, устойчиво по отношению к высоким температурам и медленно разрушается при кипячении. По некоторым данным сила действия этого вещества пропорциональна квадратному корню на концентрации. Эти признаки указывают на сходство этого вещества с ферментами. Признавая за ним видную роль в оплодотворении, Лилли назвал его «фертллизином» — веществом оплодотворения.

Следует однако иметь в. виду, что подобное вещество удается установить лишь у немногих видов, и обобщать точку зрения Лилли нельзя, на чем особенно настаивает Леб. Нужно также иметь в виду, что эти исследования относились к немногим видам с внешним оплодотворением — и у таких форм, как млекопитающие и птицы, отношения могут быть существенно иными. Так например активизация спермы у млекопитающих и птиц достигается не выделениями яйца, а секретами добавочных желез мужского полового аппарата, и эякулированная сперма у млекопитающих и птиц находится в бурном движении без всякого участия яиц.

Таким образом анализ отношений между яйцом и сперматозоидом должен быть проведен для различных форм конкретно. Данные, полученные на иглокожих и пр., совершенно невозможно переносить на такие формы, Как млекопитающие и птицы, так как там сперматозоиды являются аэробами, а здесь — анаэробами.

 

Привлечение сперматозоида в яйцу

Следующей кардинальной для гибридагогии проблемой является вопрос о том, происходит ли встреча сперматозоида с яйцом в случайном порядке, или же сперматозоид специально привлекается яйцом каким-либо специфическим образом, благодаря которому к яйцу направляются сперматозоиды именно того же вида, а не чужие. Если такого специфического привлечения нет, то задача гибридизатора сразу упрощается — для того чтобы обеспечить встречу, ему достаточно привести яйцо, подлежащее гетерогенному оплодотворению, в соприкосновение с каплей возбужденных сперматозоидов. Если же необходимо со стороны яйца специальное и специфическое привлечение сперматозоида, то проблема осложняется, и гибридизатору необходимо ее разрешать. Впрочем вряд ли вопрос стоит здесь в порядке альтернативы; вероятнее, что в разных случаях в зависимости от различной экологии оплодотворения у разных видов дело обстоит различно, и гибридизатору предстоит исследовать эту конкретную специфику.

Еще со времен Пфефера известно хемотропическое привлечение сперматозоидов папоротника слабыми растворами яблочной кислоты (0,01 %), в то время как живчики мхов не реагируют на эту кислоту, но привлекаются слабым (0,1 %) раствором тростникового сахара; живчики же харовых но реагируют ни на то ни на другое.

Эти наблюдения были многими истолкованы так, что здесь идет речь о специфической реакции сперматозоидов на вещества, выделяемые яйцом как приспособление для привлечения сперматозоидов своего вида. Пфеферу (1881–1885) удалось обнаружить присутствие яблочной кислоты в тех частях папоротника, где размещены архегонии, почему он предположил, что она же имеется и в архегониях. Подобные же эксперименты пропели затем Шибата (Shibata) и Брухман (Bruchmann, 1909). Последний нашел, что сперматозоиды положительно хемотактичны к лимонной кислоте и ее солям. Также хемотактичны они к вытяжке из архегониев. Но при всем том открыть в архегониях лимонную кислоту никак не удается.

Если таким образом у этих растений хемотаксис выращен ясно и может играть роль при оплодотворении, то обобщать эти факты никак нельзя. У иглокожих например ни Буллер (Buller, 1992), ни Дьюитц (Dewitz), ни Леб не обнаружили хемотропизма сперматозоидов к яйцам того же вида. Дэкин (Dakin) и Фордгэм (Fordham, 1924), наоборот, обнаружили явный хемотропизм у морского ежа Echinus esculentus. Лилли настаивал на хемотропизме у видов, с которыми работал и Леб, но Леб решительно возражал ему, как и вообще возражал против гипотезы фертилизина.

Что касается других животных, и в частности млекопитающих и птиц, то данные здесь отсутствуют нацело (см. ниже о работе Пинкуса). Продвижение сперматозоидов вверх по яйцеводам если и носит тропический характер (вероятно реотропизм), то это несомненно не относится к привлечению сперматозоида яйцом.

Таким образом на сегодня этот вопрос остается еще неразработанным и во всяком случае в, положении, совершенно не могущем удовлетворить гибридизатора. Однако можно констатировать, что у некоторых форм, вроде иглокожих, оплодотворение может наступать без всякого хемотропического привлечения сперматозоидов яйцом. Что касается приведенных выше данных ботаников, то Леб считает важным подчеркнуть, что химические вещества, вызывающие тропическое привлечение сперматозоидов к своим яйцам, не имеют по своей химической природе никакого отношения к Test специфическим белкам, которые составляют химическую характеристику вида и дают себя знать в явлениях иммунитета и анафилаксии, преципитиновых реакциях и пр. Это указание Леба представляет несомненный интерес.

 

Внедрение сперматозоида в яйцо

Находящиеся в момент оплодотворения вокруг яйца сперматозоиды возбужденно двигаются it активно внедряются в яйцо. Наблюдая in vitro (см. ниже) оплодотворение яйца кролика сперматозоидами кролика же, Пинкус рисует картину, напоминающую игру в пушбол (большой мяч). Если яйцо свободно от окружающей его слизи, то сперматозоиды с такой силой толкают его, что яйцо начинает кататься по капле — и оплодотворение даже не может осуществиться.

Однако и яйцо не остается совершенно пассивным при оплодотворении, оно посылает навстречу сперматозоиду так называемый воспринимающий бугорок, который можно сравнить с псевдоподией амебоидной клетки. В таком случае поглощение сперматозоида воспринимающим бугорком яйцеклетки оказывается аналогичным фагоцитозу, захватыванию амебоидной клеткой бактерий и частиц. Мы еще не знаем достоверно природы тех сил, которые действуют в случае фагоцитоза, хотя высказывались предположения относительно сил поверхностного натяжения и аглютинации; оба эти явления имеют место на поверхности и быстро обратимы. Следовало бы сказать поэтому, что специфичность, наблюдаемая при процессе оплодотворения, заключается в отличительных свойствах поверхности яйца и сперматозоида.

Различные авторы согласны, что в процессе оплодотворения огромную роль играет именно поверхность яйца, свойства его кортикального слоя. Именно здесь по мнению как Лилли, так и Леба сосредоточены те препятствия, которые мешают как гетерогенному оплодотворению, так в некоторых случаях и самооплодотворению. Роль кортикального слоя в последнем случае была экспериментально показана Морганом (1923) на Ciona intestinalis, у которой самооплодотворение обычно встречается с большими затруднениями. Зрелое яйцо этой асцидии бывает покрыто слоем фоликулярных клеток, остающихся на яйце в качестве оболочки. Сняв эту оболочку, в результате чего вероятно изменились поверхностные свойства яйца, Морган сделал самооплодотворение легко возможным.

Лилли считает, что и при затруднениях к гетерогенному оплодотворению играет роль тоже кортикальный слой и именно на его изменение необходимо направить в этих случаях внимание.

Впервые такую задачу удачно решил Леб. Нормально яйца морского ежа Strongylocentrotus lividus не оплодотворяются спермой морских звезд. Но желая изменить поверхностные условия, Леб прибег к слабому повышению щелочности морской воды (прибавкой едкого натра, аминов и др.). Попытки его удались, и наилучшие успехи достигались при прибавлении 0,6 см3 n/10 NaOH к 50 см3 морской воды. Большая часть яиц при этом оплодотворялась.

Для характеристики роли щелочи в данном случае интересно отметить, что это гетерогенное оплодотворение наступало только в самом щелочном растворе. Если же Леб подвергал яйца и сперму действию щелочи отдельно, а потом помешал их в нормальную воду, — оплодотворения обычно не наступало. При переносе их вместе снова в подщелоченную воду оплодотворение происходило. Таким образом наличие щелочи производит какое-то быстро. обратимое изменение поверхностных свойств гамет, делающее возможным гетерогенное оплодотворение.

Леб (1903) открыл такой же эфект повышенной концентрации кальция, чем ему удалось добиться оплодотворения яиц ежа St. purpuratus спермой звезды Aster.as ochracea и A. capitata спермой офиурид и голотурий, причем. процент оплодотворения достигал 50. Худшие результаты получились со спермой другой звезды — Picnopodia spuria (5 %) и спермой звезды Asterias (1 %).

Этим же методом Годлевскому (1906) удалось оплодотворить яйца неаполитанской морской звезды спермой морской лилии.

Однако этот, метод не оказался универсальным, и уже сам Леб не смог добиться оплодотворения спермой морской звезды яиц другого уже упоминавшегося калифорнийского ежа — St. franciscanus. Хотя сперматозоиды встречались с яйцами и последние образовывали оболочки, но проникновения сперматозоидов наблюдать не удалось. Не удались также попытки оплодотворения яиц ежа Arbacia спермой звезды Asterias.

Несмотря на эти неудачи, опыты Леба имеют для нас исключительное значение, так как они впервые поставили и экспериментально разрешили проблему помощи гетерогенному оплодотворению. Не надо забывать, что в этих опытах дело идет об ультрагибридизации, и если крупные успехи были получены даже здесь, то тем больших результатов мы можем ожидать от дальнейшей разработки этого химического метода при более близких гетерогенных оплодотворениях. Следует отметить, что эти гениальные открытия, сделанные в Америке 30 лет назад, не получили до сих пор никакого практического использования (например хотя бы в рыбоводстве и т. п.), хотя постоянно цитируются в различных книгах по биологии. Это тем более заслуживает быть отмеченным, что Леб же показал, что эти факторы играют роль не только при гетерогенном оплодотворении, но и при нормальном, так как например оно может быть сделано невозможным простым понижением щелочности и содержанием кальцин в воде. В нейтральной среде нормального оплодотворения яиц морских ежей совершенно не наступало несмотря на отличную подвижность сперматозоидов (Леб, 1914; KupeIvieser, 1909, 1912).

Таким образом очевидно, что, уменьшая щелочность окружающей яйцо среды и удаляя из этого раствора CaCl2, мы создаем для проникновения сперматозоида Arbacia в яйцо того иге. вида такие же препятствия, какие в нормальной морской воде задерживают проникновение спермы морской звезды в яйцо St. purpuratus. «Препятствие», задерживающее проникновение спермы Arbacia в яйцо того же вида, созданное этим путем, точно так же быстро обратимо.

Сущность самого препятствия к гетерогенному оплодотворению этими опытами вскрывается еще очень мало. Картина была бы проще, если бы при данной щелочности яйцо было более или менее одинаково доступно различным сперматозоидам. Этого конечно нет. Таким образом вопрос о том, почему при данной среде (например нормальной воде) в яйцо легко проникает свой сперматозоид и вовсе не проникает чужой — нимало не решается. Мы лишь получаем — правда, очень важные — указания, что при повышенной щелочности барьер понижается, делая яйцо доступным даже для чужих сперматозоидов, а при нейтрализации барьер повышается, делая яйцо недоступным даже для своих сперматозоидов.

Сущность «барьера оплодотворения» нам пока не ясна, но открыта возможность экспериментального изменения высоты этого барьера.

Изменение щелочности среды является не единственным фактором, при помощи которого можно изменять «барьер оплодотворения». Так, еще в 1887 г. О. и Р. Гертвиги обнаружили здесь роль возраста яиц иглокожих и показали, что если яйцам дать постоять несколько времени, то они становятся более восприимчивыми к чужой сперме.

Несколько иначе смотрит на вопрос Вернон (1900), занимавшийся тоже многочисленными гибридизациями ежей (см. также Теннент, 1910, 1911).

Что касается других объектов помимо упомянутых, обычных в такого рода, исследованиях (иглокожие, амфибии), то сведения здесь, отсутствуют повидимому нацело. Нацело отсутствуют они в частности и для млекопитающих и птиц. Приходится обратить внимание гибридагогов на этот зияющий пробел, дабы принять меры к его заполнению.

По остальным проблемам оплодотворения, перечисленным выше, сказать нечего. Следует однако еще раз вернуться к вопросу о судьбе сперматозоида, проникшего в чужое яйцо. Далеко не всегда это приводит к действительному оплодотворению, т. е. к возбуждению, к развитию с участием обоих ядер. Купельвизер (1909,1912) заметил, что сперматозоиды молюсков и кольчатых червей проникают иногда случайно в яйца ежа St. purpuratus в нормальной морской воде. В этих случаях развития яиц однако не наступало. Но в других случаях развитие наступает, и сказать сейчас, в чем заключается причина различной реакции яиц на чужие сперматозоиды, — еще невозможно.

Интересно однако проследить, как на границе возможного оплодотворения вариирует участие отцовского ядра в развитии гибрида.

 

Слияние гетерогенных ядер при оплодотворении

Нормальное оплодотворение должно сопровождаться более или менее полным слиянием семенного и яйцевого ядер в процессе оплодотворения.

В гибридных оплодотворениях наблюдающиеся здесь явления, оказываются весьма разнообразными, открывая широкое поле для дальнейших исследований и попыток вмешательства в этот процесс.

В случаях ультрагибридизации, как например при сочетании морской еж × молюск (Купельвизер, 1909), мы видим гибель ядра сперматозоида, и если на некоторых препаратах мы и наблюдаем картину как бы слияния ядер, то это вероятно более или менее случайная картина. Во всяком случае уже в первом делении дробления участвует только материнское ядро. В другом аналогичном случае оплодотворение яиц ржа Echinus спермой кольчатого-червя (Купельвизер, 1912) хотя слияние ядер почти всегда и наблюдается, но уже в первом делении хромосомы отца ведут себя ненормально — не включаются в дочерние ядра первых двух бластомеров. В несколько менее отдаленных скрещиваниях (еж × лилия, Годлевский, 1906) слияние ядер происходит благополучно, и хромосомы обоих родителей участвуют (изучено недостаточно!) в дроблении яйца.

Тем интереснее, что у рыб при значительно более близких скрещиваниях слияние ядер идет с большими затруднениями. Уже по материалам, полученным Менкхгаузом (1904) при гибридизации Fundulus ♂ × ♀ Menidia, можно видеть, пользуясь различием в хромосомах обоих видов, что хотя слияние ядер при этом гетерогенном оплодотворении и происходит, но в веретене первого дробления оба типа хромосом, не перемешиваясь, расположены билатерально двумя группами. В третьем делении дробления эта группировка уже нарушается, и по мере дальнейших делений происходит полное перемешивание в митозах хромосом обоего типа, хотя разница в этих типах сохраняется попрежнему.

Совершенно такую же картину наблюдала М. Моррис (1904) при оплодотворении яиц Fundulus спермой Ctenolabrus. Хромосомы этих рыб тоже отчетливо различны; палочкообразные — у первого вида, точкообразные — у второго (рис. 91).

При сравнении процесса слияния ядер при гомо- и гетерооплодотворении и ясно заметна разница. В чистом оплодотворении оба ядра, подходя друг к другу, быстро сливаются, и только уже после этого центросома делится на две дочерние, и начинается первое деление… При встрече чуждых ядер, наоборот, граница между ними ясно сохраняется и тогда, когда сияют уже две центросомы. Далее после того как оболочка ядер исчезает, видны еще в веретене два остатка ядра, и когда оба ядра наконец сливаются в метафазе — круглые и палочкообразные хромосомы лежат двумя неперемешанными группами. Та же картина сохраняется — и в анафазе и лишь в следующих делениях в расположении хромосом не чувствуется изолированности.

 

Ультрагибридизация

Гибридизация морских ежей с молюсками. В опытах оплодотворения яиц морских ежей спермой молюсков мы имеем дело с попытками гибридизации крайней степени — речь идет о представителях различных типов животного царства. Более отдаленными гетерогенными сочетаниями будут уже лишь сочетания Metazoa × Protozoa и животные × растения. Так как тем не менее в этой «фантастической» гибридизации иглокожих с молюсками мы встречаем ряд интереснейших явлений вплоть до почти правильного оплодотворения, то интересно изучить эти явления подробнее. Здесь мы имеем краткую, но содержательную работу Леба (1908) и подробную работу его ученика — Купельвизера (1909). Они несколько различаются и объектами: у Леба — морской еж Strongylocentrotus franciscanus. и молюск Chlorostoma funebrale, у Купельвизера — преимущественно еж Echnus microtuberculatus и молюск Mytilus.

Для успеха опытов необходимы чистота и предохранение от инфекций. Животные тщательно обмывались пресной водой, по вскрытии гонады тщательно отмывались морской водой, взятой из чистого места, отфильтрованной, нагретой до 70° и снова охлажденной до температуры морской воды, и помещались в сосуды с морской водой. Для опытов использовались яйца, сами собой выходившие из гонад. Mytilus выбирались лишь со. зрелой спермой и притом хорошоподвижной. Оказалось полезным перед опытами держать сперму на воздухе 1/2—1 час без воды или с небольшим количеством ее — это способствует оживлению спермы.

Для опытов яйца раскладывались порциями в сосуды с 50 см3 воды, и прибавлялась сперма, предварительно разбавленная вдвое, в разные сосуды в таком количестве: 0 (контроль); 0,2; 0,4 … 2 см3. Пребывание яиц вместе со спермой («экспозиция») ограничивалось 3 часами, после чего яйца переносились в свежую воду.

Оказалось однако, что-эта техника, пригодная для St. purpuratus, недостаточна для St. lividus и для Echinus. Яйца последнего покрыты студенистой оболочкой, абсолютно непроходимой для спермы молюсков, к которой они только густо прилипают. Оболочка может быть; уничтожена кратким содержанием в подогретой воде или 1–11/2-минутной обработкой раствором 0,5 см3 n/10 HCl в 50 см3, морской воды. Наилучшим способом является однако механический, путем сильного потряхивания. Часть яиц при этом разрушается, но часть утрачивает лишь оболочку.

К освобожденным от оболочки яйцам Echinus прибавлялось 5—10 капель полуразбавленной спермы и 50 см3 воды, экспозиция здесь продолжалась не более 1 часа. Более длительная экспозиция оказывалась вредной, так как после проникновения спермы Mytilus в яйцо Echinus последнее не образовывало оболочки, предохраняющей от — внедрения других сперматозоидов, и в большинстве случаев это приводило к полиспермии (наблюдалось внедрение до 17 сперматозоидов). Между тем дальнейшее правильное дробление возможно лишь при моноспермии. Именно полиспермией и объясняется низкий процент нормального развития яиц Echinus × Mytilus, в среднем равнявшийся у Купельвизера 3,7 % до бластулы и 1 % до гаструлы.

Леб применил несколько иную методику, работая с яйцами St. franciscanus и спермой молюска Chlorostomi funabrale. Яйца одной самки раскладывались равными порциями в сосуды с 50 см3 морской воды и к ней прибавлялось n/10 NaOH в различном количестве: 0,0; 0,2; 0,4; 0,6;0,8; 1,0. Оплодотворение наступало очень быстро. В сосуде с 0,8 NaOH до 80 % яиц почти тотчас образовывали мембрану, в 0,6 NaOH — меньше, а 1,0 NaOH вызывало уже аглютинацню спермы. Рядом опытов Леб доказал, что здесь происходил не искусственный партеногенез химическим раздражением, а действительно процесс гетерогенного оплодотворения (Леб, 1908). Повторные опыты дали столь же прекрасные результаты, и Леб получил тысячи нормально развитых плютеусов. Плютеусы эти все без исключения были типичными для St. franciscanus (рис. 41).

Рис. 41.Псевдогибридные плютеусы Strongylocentrotus franciscanus при оплодотворении спермой молюска Chlorostoma (по Лебу). (Ср. рис. 87 и 88).

Яйца Echinus значительно прозрачнее яиц крупного St. franciscanus, что позволило Купельвизеру дать подробное описание явления оплодотворения in vivo. Если студенистая оболочка яйца не была удалена совершенно, сперматозоиды прилипали к ней хвостами, Впрочем и Леб и Купельвизер отмечают, что у довольно значительного числа самок опыт не удается вовсе — очевидно в связи с какими-то индивидуальными свойствами их яйцеклеток, оставаясь на ее поверхности, пока все яйцо не обволакивалось ими. Внутрь оболочки ни разу сперматозоиды не попадали. При удалении оболочки сперматозоиды упираются в яйцо и пытаются внедриться в него. В большинстве случаев однако им удается воткнуть лишь острие головки, и они затем либо снова отрываются либо остаются длительно в таком положении. Изредка удается однако увидеть проникновение головки, после чего в течение четверти часа при помощи оживленных движений хвостика сперматозоид погружается в яйцо целиком. Никакого воспринимающего бугорка яйцо навстречу этому чужому сперматозоиду не образует, и проникновение происходит в любом месте, что доказывается уже одновременным прониканием многих сперматозоидов в различных местах. После проникновения, как упомянуто, не происходит образования мембраны, почему проникновение сперматозоидов продолжается, и моноспермия является исключением.

Приблизительно через полчаса от начала опыта можно видеть проникшие сперматозоиды в виде больших, сильно преломляющих свет телец в протоплазме яйца. Через 10–20 минут возле такого тельца возникает отчетливое сияние, лучистая сфера. Лучистая сфера сперматозоида, проникшего первым (часто также и второго и третьего), начинает правильно, хотя и медленно, двигаться к ядру яйца, ведя за собой и ядро (пронуклеус) спермия. (Сперматозоиды, проникшие позднее, также образуют сферы, но остаются на периферии и могут не поворачиваться сферой к ядру яйца.) Далее образуется уже центральное слияние, и оболочка ядра яйца исчезает, начинается первое дробление. Нередко это центральное слияние захватывает и другие сперматозоиды, — образуется многополюсный митоз, и яйцо гибнет.

Темп развития идет нормально. По данным, полученным на фиксированном материале, сроки наступления стадий таковы:

Центральное сияние — 1 час 13 мин.

Веретено — 2 часа 5 мин.

Два бластомера — 3 часа 0 мин.

Бластула — 17 часов 15 мин.

На фиксированном материале Купельвизер изучил и более детальные процессы, происходящие при этом. Они дополняются следующими существенными деталями: ядро сперматозоида, проникнув в яйцо, несколько изменяется, разбухает, что впрочем свойственно сперматозоидам Mytilus и при нормальном оплодотворении. Направляясь вслед за, своей центросомой к ядру яйца, ядро сперматозоида однако дальше не обнаруживает никакой активности. В то время как ядро яйца теряет оболочку и распадается на свои нормальные 9 хромосом (рис. 42), ядро сперматозоида остается округлым, достаточно плотным тельцем и лишь изредка образует нечто вроде хромосом. Во всяком случае уже в первом делении оно не принимает участия, и лишь в виде исключения оказывается в веретене, но попрежнему в виде цельного тельца. В результате при первом же делении ядро сперматозоида оказывается в одном из бластомеров, а при втором дроблении Купельвизером уже не было найдено. Общий итог своих наблюдений Купельвизер выражает следующей схемой (рис. 43).

Рис. 42. Поведение ядер при оплодотворении спермой молюска яйца морского ежа (по Купельвизеру).

На левом рисунке маленький пронуклеус сперматозоида виден при правой центросоме; на правом рисунке — при верхней центросоме. На правом и среднем рисунке видно гаплоидное число хромосом.

Обсуждая эти выводы, Купельвизер отмечает их полнейшее, до мельчайших подробностей совпадение с аномальным процессом оплодотворения яиц Echinus его же спермой, но обработанной едким кали (см. Boveri, 1888; Teihmann, 1909). Ядро сперматозоида в обоих случаях оказывается убитым, и яйцо и дальнейший организм получают от сперматозоида лишь центросому, нормальный характер которой описывает детально Купельвизер.

Гибель хромосом, показанная Купельвизером, объяснила, почему полученные им и Лебом плютеусы оказываются чисто матроклинными. Вместе с тем она лишила обоснования и вывод Леба, сделанный им в 1908 г. что «чисто материнский характер гибридов еж × молюск указывает на то, что не хромосомы являются носителями наследственности, а что передача наследственных особенностей есть проблема чисто химическая, но не гистологическая».

Рис. 43. Схема оплодотворения яйца морского ежа спермой молюска (по Купельвизеру).

Пронуклеус яйца изображен кружком или рядом хромосом на веретене (4); пронуклеус сперматозоида — точкой при луче сияния.

Гибридизация морских ежей с морскими лилиями осуществленная в 1904–1906 гг. Годлевским (Godlewsky Е. jun., 1906), представляет. как несколько более близкая, межклассовая, ряд интересных моментов для сравнения с данными Купельвизера. Годлевским была произведена гибридизация по методу Леба яиц морских ежей Sphaerechmus granularis, Echinus microtuberculatus u Strongylocentrotus lividus спермой лилии Antedon rosacea. Так же, как и в скрещивании еж × молюск, полученные плютеусы оказались чисто материнскими, и ни в темпе деления, ни в образовании мезенхимы, ни в самом плютеусе не было обнаружено никаких изменений, которые можно было бы приписать влиянию отцовского вида. Однако в гистологическом отношении имеются интересные отличия от картины, полученной — Купельвизером в скрещивании еж × молюск.

Рис. 44. Процесс оплодотворения яиц морского ежа спермой морской лилии (по Годлевскому).

Морские лилии и морские ежи представляют собой две чрезвычайно древние ветви иглокожих, разделившиеся еще до палеозоя, сотни миллионов лет назад. Тем замечательнее факт, что оплодотворение яиц морских ежей спермой лилии происходит совершенно нормальным образом. Если исключить то, что для оплодотворения необходимо некоторое повышение концентрации ОН-ионов, то во всем остальном процессе нельзя заметить никаких уклонений от нормального процесса оплодотворения.

Проникнув в яйцо, сперматозоид образует лучистую сферу, поворачивается ею по направлению к ядру яйца, начинает двигаться к атому ядру, очевидным образом оба ядра сливаются в одно, В этом последнем пункте у еж × молюск было отличие, так как картины слияния ядер с полной убедительностью установить было невозможно, и даже в тех случаях, когда ядро молюска оказывалось в тесном контакте с ядром ежа, первое имело все же характер некоторого инородного тела. Рис. 44 показывает картину типичного слияния ядер и совместное участие обоих уже в первом веретене. Точный анализ хромосом здесь проделан не был, и так как хромосомы Antedon были не учтены, а для ежей оставалось невыясненным, не существует ли двух рас, с 9—18 и 18–36 хромосомами, то по полученной пластинке метафазы, на которой можно насчитать несколько более 20 хромосом, установить уверенно судьбу хромосом лилии невозможно. Однако каких-либо признаков элиминации хромосом в первом делении Годлевский не видел.

Полученные от Echinus × Antedon и Strongylocentrotus × Antedon плютеусы ничем не отличимы от контрольных чистых видов, и можно думать, что рано или поздно эта элиминация произошла. Однако вопрос этот не вполне ясен (о нем см. ниже — в главах VII и IX).

Наконец при гибридизации, еще более — близкой, ежей Strongylocentrotus lividus с ежом Arbacia Бальцер (Baltzer, 1909) хотя и получил тоже матроклинных личинок, отцовские хромосомы элиминировались уже лишь на стадии бластулы (см. главу VII).

Заканчивая краткий обзор фактов, относящихся к гетерогенному оплодотворению, необходимо отметить несмотря на их огромный интерес и значение для гибридагогии их крайнюю неполноту и односторонность. Неполнота состоит в том, что ни на один вопрос, нас интересующий, мы не имеем еще ответов, настолько глубоко проработанных, чтобы они могли служить путеводителем в работе гибридизатора. На основной вопрос — почему в одних случаях при гибридизации мы получаем оплодотворение, а в других нет — мы удовлетворяющего ответа не имеем кроме ответа общего, что чем дальше отстоят друг от друга скрещиваемые формы, тем меньше шансов на успех. Также и на второй основной для нас вопрос — что нужно делать для того, чтобы заставить произойти оплодотворение там, где оно не идет, — мы также почти не имеем ответа кроме отдельных указаний эмпирического характера, касающихся некоторых иглокожих. Очевидно здесь предстоит еще огромная исследовательская работа со всевозможными объектами.

До сих пор мы говорили о гетерогенном оплодотворении как о методике получения F1 гибридов. Не менее интересна теоретически и важна практически и проблема гибридного оплодотворения, т. е. оплодотворения гибридных яиц и оплодотворения гибридной спермой. Здесь вопрос стоит так: какая сперма должна лучше всего оплодотворять гибридное яйцо (яйцо гибрида) и какие яйца должны — лучше всего оплодотворяться гибридной спермой? Этот вопрос имеет ту же самую формулировку, как и соответствующий вопрос в главе об осеменении.

В самом деле в пределах вида А. свойства яйца и свойство сперматозоида так взаимно согласованы, что обычно яйцо оплодотворяется легче всего спермой, того же вида и обратно — свойства спермы приспособлены к свойствам яйца того же вида. Но у гибрида свойства его яиц и спермы очевидно уже не те, что у чистых видов. Специальному приспособлению друг к другу яйца и сперма этих гибридов не подвергались. Значит ли это, что все-таки яйца гибрида будут легче всего оплодотворяться спермой подобного же гибрида или нет, или может быть более подходящей будет сперма родительских видов и т. д.? Для размножения гибридов эти вопросы их оплодотворения будут иметь конечно большое значение. Тем печальнее, что мы не располагаем по этому поводу нужными фактами.

 

Гетерогенное оплодотворение теплокровных in vitro

Если прямые попытки получения таких гибридов, как овца × коза, корова × буйвол, заяц × кролик, не приводят к результатам, то это может происходить либо от того, что сперматозоид не достигает яйца или достигает его в поврежденном состоянии, или от того, что оказывается невозможным само гетерогенное оплодотворение, или же от того, что гибридный эмбрион погибает на самых ранних стадиях развития. Преодоление этих препятствий возможно будет конечно лишь тогда, когда для каждой гибридной комбинации будет выяснено, где именно это препятствие лежит. В частности необходимо выяснить, в каких случаях оказывается невозможным или затрудненным сам процесс гетерогенного оплодотворения.

У млекопитающих и птиц с их внутренним оплодотворением выяснение этого вопроса связано с большими трудностями и даже почти невозможно in situ. Отсюда, возникает необходимость разработать такую методику, при которой можно было бы непосредственно наблюдать оплодотворение яйца млекопитающего и птицы in vitro. Разработка этой методики в настоящее время уже началась и идет с серьезными успехами.

Помимо очевидного значения для изучения процесса гетерогенного оплодотворения методика оплодотворения in vitro, имеет и другое неменьшее значение для гибридизации, так как она позволяет получать гибридную зиготу, минуя все те трудности, которые связаны с естественным прохождением сперматозоида до яйца. Однако оплодотворение in vitro получит полное значение только в том случае, если мы разрешим вопрос о дальнейшем выращивании полученной in vitro зиготы. Так как выращивание до взрослого состояния эмбрионов млекопитающих и птиц in vitro пока совершенно невозможно, то нами намечена такая схема использования для гибридизации методики оплодотворения in vitro:

1) изъятие яиц из самки;

2) оплодотворение in vitro изъятых яиц спермой другого вида;

3) имплантация полученной зиготы, обратно в фаллопиевы трубы оперированной или другой самки.

Для судьбы метода решающее значение имеет разрешение третьего пункта схемы. В настоящее время однако Можно считать перспективы этого разрешения вполне благополучными.

Еще в 1890 г. Хипе (Неаре М.) удалось трансплантировать оплодотворенные яйца кроликов ангорской породы в трубы самкам-фландрам. Из трех опытов один дал отличные результаты, и приемная мать, будучи затем покрыта самцом-фландром, дала помет, состоявший как из крольчат-фландров, так и из двух типичных белых ангорских кроликов. Эти замечательные опыты остались если не забытыми, то неповторенными до 1930 г. Пинкус (Pincus, 1930) из трех опытов в одном получил положительный результат — самка принесла помет из трех крольчат на 31-й день. Асдель и Хэммонд поставили 21 опыт трансплантации и получили результат у трех самок, В общей сложности в этих опытах на 27 трансплантаций получено 5 удач, т. е. 18,5 %, Эти результаты приходится признать безусловно чрезвычайно интересными и обнадеживающими, учитывая неразработанность ряда вопросов, связанных, с этой операцией. Таковы например опасность ввести яйца слишком рано в матку, еще не подготовленную к восприятию яйца, опасность температурных и кислородных шоков и пр. Пинкусом было поставлено несколько опытов имплантаций яиц, оплодотворенных in vitro, с отрицательными результатами, но в силу неразработанности этой методики подобная неудача не имеет серьезного значения и требует лишь дальнейшей работы в том же направлении. Техника трансплантации описана в работе Хипе 1897 г.

Таким образом уже сейчас можно считать третье звено указанной выше схемы принципиально разрешенным, и вопрос должен итти лишь о дальнейшем. усовершенствовании гибридагогами техники трансплантации, с применением ее к яйцам, оплодотворенным in vitro, может быть о пересадках яиц одного вида в самок другого, более удобного для: работы вида, применении методики к другим видам млекопитающих и т. д. В свете задач, стоящих перед гибридизацией, разработка этой проблемы приобретает исключительный интерес.

Само оплодотворение яиц млекопитающих, in vitro в настоящее время тоже принципиально разрешено. Впервые опыты подобного рода были поставлены Шенком (Schenk, Вена) и Груздевым (Петербург, 1896), но эти опыты в настоящее время имеют лишь исторический интерес. Шенк производил оплодотворение на нагревательном столике Под микроскопом, а Груздев смешивал яйца и сперму в особой пипетке, после чего они вдувались в трубы самки кролика. Однако правильного дальнейшего развития зигот Груздев не получил, и возможно думать в свете работ Пинкуса, что наблюдавшееся Груздевым неправильное дробление носило партеногенетический характер или касалось одной лишь цитоплазмы.

В новейшее время. опыты оплодотворения яиц кроликов in vitro были поставлены Пинкусом (Pincus, 1930), Ямане (Jamane), Красовской и Диомидовой (1934), Диомидовой и Кузнецовой, и техника его разработана уже на достаточно высоком уровне, будучи заимствованной из техники культур тканей (эксплантации). Объектом этих опытов явились яйца кроликов благодаря тому, что провоцированный характер овуляции у этого животного позволяет более или менее безошибочно определять необходимый момент операции для получения годных для опытов яиц.

Это обстоятельство важно потому, что яйца кролика пригодны для: оплодотворения лишь в течение короткого срока по выходе из яичника. В это время они одеты тонкой белковой оболочкой, которая быстро утолщается по мере продвижения яйца вниз по фаллопиевой трубе; и уже через 18 часов после коитуса яйцо становится недоступным для оплодотворения. Для получения годных к оплодотворению яиц самка покрывается вазэктомированным самцом, который, — не эякулируя в самку семени, провоцирует овуляцию. Овуляция наступает примерно через. 10 часов после коитуса, когда и производится операция, В это время яйца находятся уже в трубе. Труба осторожно вырезается, и яйца вымываются из нее раствором Паннета-Комптона или Рингера тонкой пипеткой, вводимой либо с маточного либо с фимбриального конца в зависимости от ожидаемого по времени местоположения яиц. Капли вытекающего раствора принимаются на стерилизованные слюдинки и просматриваются под микроскопом для отыскания яиц.

Когда яйцо найдено, к промывной капле прибавляются капля спермы, капля куриной или кроличьей плазмы и эмбриональный экстракт. Когда прибавленная плазма образует сгусток, фиксирующий яйцо, культура заделывается по методу висячей капли и сохраняется в термостате при 37°. Все манипуляции, начиная с промывания труб, проводятся стерильно в стерильной комнате (боксе).

Через 40–50 минут после прибавления спермы сперматозоиды проникают в яйцо. Яйца млекопитающих входят в трубу с выделившимся первым направительным тельцем. Второе деление созревания наступает естественно лишь в результате оплодотворения. В культурах in vitro это второе деление созревания наступает через 1–2 часа после прибавления спермы. Часов через 8 наступает первое дробление. Удавалось довести in vitro до третьего деления дробления, до стадии 8 бластомеров, на что требуется до 46 часов, — значительно больше, чем при развитии in situ, при котором стадия 8 бластомеров достигается уже через 24 часа.

Для интересующих нас целей — дальнейшей имплантации зиготы в трубу — достаточно убедиться лишь в наступлении гетерогенного оплодотворения, т. е. продержать яйцо in vitro лишь 1–2 часа. Дальнейшее культивирование может понадобиться лишь для того, чтобы вообще можно, было убедиться в удаче гетерогенного оплодотворения, и для цитологической проверки. Опытами Пинкуса было установлено, что в нынешних условиях культуры in vitro неоплодотворенные яйца с некоторым запозданием, но все же начинают обнаруживать признаки как бы партеногенетического дробления. Хотя деление ядра при этом еще не доказано, но по внешнему виду, принимаемому яйцом, его оказывается почти невозможно отличить от нормально дробящегося яйца. Правда, в большинстве случаев, но не всегда, образующиеся шары дробления оказываются при таком «партеногенезе» неодинаковой величины. Так как не вполне равномерное дробление происходит и при нормальном развитии яиц кролика и тем большей неравномерности возможно ожидать при гетерогенном оплодотворении, — то наступление оплодотворения для каждой гибридной комбинации должно быть проверено на окрашенных и нарезанных препаратах.

Для оплодотворения in vitro, особенно для длительных опытов, сперма должна быть получена стерильно из эпидидимиса или из vas defferens в стерильный капиляр.

Гибридизация млекопитающих in vitro в настоящее время произведена Ямане и Диомидовой и Кузнецовой (1933, неопубл.) и Красовской (1934, неопубл.). Ямане оплодотворял яйца кролика спермой крысы и даже лошади. В обоих опытах получено в надлежащем виде выделение второго полярных телец, что Ямане и считает доказательством произошедшего оплодотворения.

Целью его работы была однако не сама гибридизация, но выяснение того, является ли стимул, вызывающий второе деление созревания, специфическим, видовым, или он может быть привнесен и сперматозоидом другого вида млекопитающего. Цитологического исследования судьбы проникшего сперматозоида и участия его ядра в дальнейшем дроблении Ямане произведено не был».

Диомидова и Кузнецова оплодотворяли яйца кролика спермой морской свинки (другой подотряд грызунов) и наблюдали несколько раз правильное дробление, в отдельных случаях до 8 бластомеров. Цитологического подтверждения наступившего оплодотворения произведено еще тоже не было, но правильность и своевременность стадий дробления делают вероятным, что гетерогенное оплодотворение действительно имело место. Наконец в только что законченных опытах Красовской цитологически показано, что при оплодотворении яиц кролика спермой крысы (другой подотряд!) в 75 % происходит настоящее дробление и образующиеся бластомеры имеют ядра. Происходит также выделение и второго направительного тельца. При оплодотворении спермой морской свинки картина оказывается уже существенно иной, — отшнуровываются лишь участки дейтоплазмы, без участия ядра, и не достаточно еще ясно-, происходит ли действительное оплодотворение. Наконец сперматозоиды собаки повидимому вовсе не проникают в яйцо кролика.

Оплодотворение in vitro является делом очень кропотливым, требующим большой тщательности и большого материала. Тем по менее тот свет, который эти работы проливают, на проблему гетерогенного оплодотворения млекопитающих, с лихвой окупает затраченный труд. Если, как и можно было ожидать (см. выше стр. 134), даже столь гетерогенное оплодотворение, как кролик × крыса (разные подотряды), протекает легко, то проблема помощи ему оказывается снятой и все внимание гибридизатора при работе с млекопитающими придется сосредоточить на проблеме осеменения, в общем гораздо более легкой и перспективной. Необходимо произвести подобные же исследования с другими видами млекопитающих и с птицами.