Важнейшие открытия и достижения молекулярной генетики

• 1952г. Показано, что материалом наследственности у бактериофагов является ДНК, а не белок (А. Херши и М. Чейз).

• 1953г. Открыта структура (двойная спираль) ДНК (Дж. Уотсон и Ф. Крик). П. Медавар с коллегами выявили факт приобретенной иммунологической толерантности у новорожденных мышей

• 1957-59гг. Сформулирована клонально-селекционная теория приобретенного иммунитета, предсказывающая «дарвиновский» отбор антигенами клеток, продуцирующих специфические антитела. (М. Бернет, Д. Талмейдж, Н. Ерне)

• 1957-59 гг. Доказан предсказанный Уотсоном и Криком механизм репликации двойной спирали ДНК и обнаружен фермент ДНК-полимераза (ДНК -> ДНК копирование; М. Мезельсон, Ф. Сталь, А. Корнберг)

• 1959г. Предсказано существование обратной транскриптазы (РНК -> ДНК копирование) (Г. Темин)

• 1961 г. Обнаружена информационная РНК. Это молекула-посредник между геном и белком. Установлен факт копирования ДНК -> РНК с помощью фермента РНК-полимеразы. (С. Бреннер, Ф. Жакоб, М. Мезельсон, Б. Ход, С. Спигельман)

• 1961-66 гг. Расшифрован генетический код. При синтезе последовательности аминокислот, или белка, последовательность оснований информационной РНК считывается по три (ко-дон) (М. Ниренберг, Г. Г. Корана, Ф. Крик, С. Бреннер)

• 1965г. Предложена модель генов антител, предсказывающая V —> С-перестройку (В. Дрейер, Дж. Беннет)

• 1970г. Предложена двусигнальная модель индукции иммунного ответа, усовершенствовавшая представления о различении своего и не-своего (П. Бречер, М. Кон)

• 1970г. Обнаружена обратная транскриптаза опухолевых РНК-вирусов (ретровирусов), т. е. копирование РНК->ДНК (Г.Темин, Д. Балтимор)

• 1968-74 гг. Предложено рациональное объяснение соматических мутаций генов антител. Установлена «зависимость Ву-Кэбота» для V-областей антител (Т. By, Е. Кэбот). Предсказано существование определяемого антигеном соматического гипермугирования вариабельных генов антител (А. Каннингам).

• 1974-77 гг. Установлена уникальная организация генов антител и доказана V -> С-модель Дрейе-ра-Беннета. Опубликованы первые данные по последовательностям ДНК, подтверждающие, что вариабельные гены антител подвергаются соматическому мутированию В. Тонегава)

• 1977гг. Открыты интроны, или некодирующие встроенные последовательности, в генах эука-риот (Р. Роберте, П. Шарп)

• 1979г. Сформулирована теория соматического отбора, предсказывающая движение наследственной информации от сомы к зародышевой линии для вариабельных генов антител в иммунной системе (Э. Стил)

• 1981 г. Широко признаны доказательства того, что определяемое антигеном соматическое гипермутирование генов антител в иммунной системе действительно происходит.

• 1982г. Широко признаны доказательства существования не-вирусной «общей» обратной транскрипции (РНК -» ДНК)

• 1982-83гг. Открыты рибозимы, или ферменты, основанные на РНК (Т. Кеч, С. Альтман)

• 1985г. Предложен метод ПЦР (К. Маллис)

• 1987г. Предложена модель обратной транскрипции для объяснения определяемого антигеном соматического гипермутирования вариабельных генов антител (Э. Стил, Дж. Поллард)

• 1987г. Предложены общая теория эволюции иммунной системы, «концепция протектона» (Р. Лангман,. М. Кон)

• 1992г. Опубликованы данные, согласующиеся с моделью соматического гипермутирования, основанной на обратной транскрипции. Накапливаются сведения, подтверждающие теорию соматического отбора (Г. Ротенфлу, Р. Бландэн, Э. Стил)

• 1996г. Обнаружений рекомбинационный след в V-генах зародышевой линии, что подтверждает схему интеграции, предсказанную теорией соматического отбора (Г. Вейлер, Р. Бландэн, Г. Ротенфлу, П. Зилстра, Э. Стил).

Таким образом, «генетический чертеж», определяющий большое разнообразие живых форм, обусловлен сложной живой информационной системой клетки. Эта система аналогична компьютерным кодам, хранящимся в маленьких полупроводниковых микросхемах, из которых состоит часть центрального обрабатывающего блока компьютера; Законы генетического кода и его перевода в биологические продукты живого организма открывались учеными параллельно с развитием компьютерных технологий. Однако природа создала удивительно совершенные системы хранения и поиска информации задолго до того, как люди придумали силиконовые компьютерные микросхемы. Силиконовые микросхемы для массового производства только лишь сейчас достигли размеров в 1 микрон. Всем известно, что новые поколения компьютеров и компьютерных программ появляются примерно каждые пять лет. Подобные перемены системы понятий и взглядов происходят и в современной молекулярной и клеточной биологии. Благодаря им мы перешли на новый уровень знаний генетических функций, которые рассматриваются в этой главе.

 

Живые системы функционируют в окруженной мембраной контролируемой микросреде

Началом молекулярной генетики можно считать открытие строения и роли отдельной клетки. Несколько миллиардов лет назад на Земле начала распространяться клеточная форма жизни. Неотъемлемой чертой живых клеток является репли-кация и передача от материнских клеток к дочерним информационных молекул, сначала РНК, а затем ДНК.

Избирательно проницаемая мембрана, окружающая клетку, обеспечивает контролируемую внутреннюю среду (раствор солей и других молекул в воде), внутри которой реплицируется геном, синтезируются и работают все ферменты и мультимолекулярные машины (органеллы). В результате сложного транспортного процесса молекулы (например, белки, углеводы и жиры) постоянно проникают в клетку и пополняют запас молекулярных строительных блоков. Липидная (жировая) водонерастворимая мембрана предотвращает растворение клеточного содержимого в окружающей среде. На мембране располагается множество специализированных молекул, осуществляющих взаимодействие клетки с внешней средой. Некоторые клетки имеют десятки, если не сотни, различных специфических поверхностных рецепторов, которые позволяют им распознавать внешние стимулы и отвечать на них. Некоторые из этих рецепторов действуют и как транспортные каналы, обеспечивающие движение определенных молекул через клеточную мембрану. В клетке непрерывно протекает несметное число химических реакций, которые координируются и совмещаются во времени и пространстве подобно сложным компьютерным программам. Каждая реакция достигает своей определенной цели, важной для роста и выживания клетки.

Рис. 2.1. Высшие и бактериальные клетки, вирусы. Высшие (эукариотические) клетки в 10-100 раз крупнее, чем бактериальные (прокариотические). Избирательно проницаемая мембрана (состоящая из множества липидных молекул), регулирует перемещение различных веществ, включая воду, в клетку и из клетки. Мембрану бактериальной клетки окружает довольно жесткая клеточная стенка. Растительные клетки также имеют внешнюю грубую клеточную стенку (на рисунке не показана). В состав высших клеток входит окруженное мембраной ядро, содержащее несколько хромосом (длинных линейных молекул ДНК). Бактериальные клетки имеют только одну кольцевую хромосому. В высших клетках РНК-копии генов производятся в ядре (процесс транскрипции) и перемещаются в цитоплазму после преобразования (процессинга). (См. рис. 4.4 и 4.5). Затем в цитоплазме эти молекулы информационной мРНК транслируются в белок с помощью специальной молекулярной машины, или органеллы, которая называется рибосомой. В бактериальной клетке РНК и белки производятся в цитоплазме, так как у бактерий нет мембраны, окружающей единственную хромосому. Вирусы — паразиты, которые внедряются в клетку и используют ее молекулярный аппарат для собственного размножения. Они очень мелкие, приблизительно в 10-15 раз меньше, чем клетки, и состоят только из белковой оболочки и генома, представленного ДНК- или РНК-молекулой. Вирусы имеют разные формы и размеры, а молекулы нуклеиновых кислот в их геноме могут быть и двухцепочечными, и одноцепочечными, и линейными, и кольцевыми. Вирусам, которые размножаются в бактериальных клетках, дано специальное название — бактериофаги. Некоторые вирусы безвредны, например, эндогенные РНК-ретровирусы, которые закодированы в геноме нормальных клеток (в виде ДНК) и продуцируются (в виде РНК-транскриптов) нормальной клеткой, например, стимулированным антигеном В-лимфоцитом (см. рис. 1.2).

 

Что происходит, когда мы съедаем кусочек шоколада и усваиваем сахар? Биохимики установили, что типичная клетка для выделения энергии из молекулы глюкозы использует 30 или более специфических ферментативных реакций. Каждый шаг в этой цепи реакций нужен для отрыва от молекулы глюкозы энергии, заключенной в химических связях, удерживающих атомы в молекулах. Эти химические реакции являются частью процесса «молекулярного питания» клетки, который создавался в ходе эволюции для извлечения максимального количества полезной энергии.

Бактериальные клетки по своим основным функциям несколько отличаются от более специализированных (дифференцированных) клеток многоклеточного организма. Они меньше, их геном состоит из небольшого числа генов. Поскольку требуется координация меньшего числа реакций, бактериальные клетки способны расти и делиться очень быстро. В благоприятных условиях среды на это уходит от 20 до 30 минут. Эта способность к быстрому делению делает бактерии при попадании в организм многоклеточного хозяина опасными болезнетворными агентами. Это же свойство делает бактерии и мельчайшие вирусы, которые в них размножаются (фаги), чрезвычайно полезным инструментом современных исследований в молекулярной генетике.

На рис. 2.1 показаны вирусы в сравнении с бактериальной клеткой и клеткой высших организмов. Вирус представляет собой цепочку генов (вирусный геном может состоять и из ДНК, и из РНК в зависимости от типа вируса), упакованную в белковый чехол или мембранную оболочку. Вирусы сами по себе не растут и не делятся. Все вирусы — паразиты; для того, чтобы приобрести способность размножаться, они должны проникнуть внутрь клетки-хозяина. Это позволило Херши (Hershey) и Чейзу (Chase) в 1952 г. доказать, что генетическим материалом вирусов является нуклеиновая кислота, а не белок (табл. 2.1). Одни вирусы заражают бактериальные клетки, другие — клетки высших многоклеточных организмов, растений и животных. Некоторые вирусы, например, вирусы гриппа и иммунодефицита человека (ВИЧ), вызывающий СПИД, способны быстро изменяться. И это позволяет им ускользать от иммунной системы.

Проникнув в клетку, вирус освобождает свой геном от оболочки и приступает к захвату клеточных метаболических путей для своих собственных целей. (Компьютерный вирус, внедряясь в определенную часть компьютера- «хозяина» достигает подобных же целей.) Внутри клетки ДНК- и РНК-содержащие вирусы размножаются и производят свои белки. Затем происходит сборка зрелых вирусных частиц, которые покидают приютившую их клетку и начинают заражать другие клетки. Одни вирусы убивают клетку при размножении. К ним относится, например, вирус гриппа. Другие мирно сосуществуют с живой клеткой, которую они инфицировали, а вирусное потомство постоянно выходит через клеточную мембрану. Третьи, например, вирус герпеса, могут до начала репликации много лет находиться внутри живой клетки в скрытом (латентном) состоянии. Однако самая крайняя степень паразитизма проявляется у ретровирусов. Некоторые из них, например, ВИЧ, создают ДНК-копию своего РНК-генома, встраивают ее в хромосому(ы) клеточного ядра и реплицируются вместе с хромосомами в ходе нормальных клеточных делений.

Молекулярно-генетические процессы основываются на трех основных принципах

• каждую отдельную химическую реакцию осуществляет специфический катализатор;

• ДНК состоит из двух цепочек нуклеотидов, основания которых связаны парами;

• генетическая информация передается от генов к белкам.

Эти принципы лежат в основе механизма наследственности.

 

Каждую отдельную химическую реакцию осуществляет специфический катализатор

Открытие этого важнейшего правила молекулярной генетики заняло много лет. Сейчас это аксиома: для протекания каждой отдельной химической реакции в живой клетке необходим специфический белковый фермент (или молекула РНК с ферментными функциями). Ферменты — это биологические катализаторы, они изменяют субстрат, сами оставаясь неизменными. Это очень важная концепция. Из нее следует, что ни один многоступенчатый биологический процесс не может происходить случайно. Все они регулируются рядом координированных взаимодействий между молекулами, которые по форме подходят друг к другу как два кусочка трехмерной мозаики.

Под действием катализатора химическая реакция идет быстрее и эффективнее. Так, в отсутствие фермента молекула А не могла бы немедленно вступить в реакцию с молекулой В и образовать продукт АВ (рис. 2.2). Это могло бы произойти случайно, но ждать этого пришлось бы миллионы лет, если бы вообще удалось дождаться. Специфический фермент, который имеет места «стыковки» для А и В, связывается с ними и держит обе молекулы так тесно, что у них нет другого выбора, как только образовать химические связи друг с другом. Ферменты, таким образом, можно назвать генетически закодированными инструментами, созданными природой для осуществления химических реакций, отобранных входе эволюции. Для проведения сложного набора реакций работа нескольких ферментов синхронизируется и координируется. Таким образом, ферменты способны к коллективному выполнению сложных задач, например таких, как выделение энергии из съеденного кусочка шоколада. Другими словами, каждый фермент можно сравнить с отдельной инструкцией, которая является частью большой компьютерной программы. Однако есть одно фундаментальное отличие. Компьютерный набор инструкций создается человеком для достижения поставленной им цели. Специфическое Действие ферментов регулировалось миллионами (а может быть и миллиардами) лет эволюции путем естественного отбора. Компьютерная программа — результат работы человеческого мозга, а молекулярные процессы, направляющие биологическую эволюцию, происходят через взаимодействие молекул.

Рис. 2.2. ферменты (белки или РНК) - «молекулярные машины», или катализаторы. Изображен белковый фермент, осуществляющий химическую связь между двумя разными молекулами, А и В, с образованием сложной молекулы АВ. Некоторые ферменты состоят из РНК, их называют рибозимами. 1. фермент имеет два связывающих центра, с которыми стыкуются соответствующие им субстраты А и В. 2. Фермент изменяет форму и создает соответствующие молекулярные взаимодействия и силы, облегчая образование химической связи между А и В. 3. Продукт АВ высвобождается. 4. Свободный фермент может использоваться снова.

В клетке работают тысячи ферментов. Одни из них создают строительные блоки для генов; другие распознают пищевые молекулы и обеспечивают их попадание из окружающей среды; наконец, третьи перестраивают различные молекулы внутри клеток. Большинство биологических катализаторов, так же как и многие структурные компоненты клетки, — белки, но есть и катализаторы, представленные РНК.

В конце 1950-х годов Г. Темин предсказал существование обратной транскрипции. Он обнаружил, что опухолевые РНК-содержащие вирусы исчезают при добавлении их к клеткам в культуре ткани. Для объяснения этого он предположил, что вирус создает ДНК-копию своего РНК-генома, затем встраивает эту ДНК-копию в хромосомы клетки (причем исходный вирусный РНК-геном, в конце концов, разрушается). Следовательно, он предсказал существование фермента, который, используя в качестве матрицы молекулу РНК, создает молекулу ДНК. После десятилетних поисков, в конце 1960-х годов, сам Говард Темин обнаружил этот фермент. За эту работу он был удостоен Нобелевской премии (в 1975 году), разделив ее с Давидом Балтимором, который подтвердил существование фермента, названного обратной транскриптазой. Это открытие изменило первоначальные представления о переносе генетической информации. В последние годы стало также известно, что молекулы РНК могут играть роль катализаторов. Они могут сами себя разрезать и сшивать («редактировать») и потенциально способны к саморепликации.

Для каждой из известных биологических реакций существует специфический катализатор. Мы уверены, что катализатор (обычно белок, иногда РНК) должен существовать для любой гипотетической реакции. Все известные данные подтверждают это.

 

В основе механизма наследственности лежит простое правило спаривания оснований

Другой важный принцип, управляющий механизмом наследственности, это правило спаривания оснований (нуклеотидов), входящих в состав ДНК: всегда А соединяется с Т; a G — с С.

Во всех живых клетках генетическая информация зашифрована в последовательности оснований ДНК. Длинная линейная цепь ДНК представляет собой ряд нуклеотидов, различающихся по азотистым основаниям, входящим в их состав. Основания принято обозначать буквами A, G, С и Т (табл. 1.2). Порядок нуклеотидов в гене определяет последовательность аминокислот в белке. Поясним это.

Трехмерная структура ДНК была открыта в 1953 г. Джеймсом Уотсоном (Watson) и Фрэнсисом Криком (Crick). За это открытие, послужившее началом новой эпохи в биологии, в 1962г. ученые получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине. Оказалось, что структура ДНК чрезвычайно проста и придает этой молекуле такие свойства, которые делают ее главным кандидатом на роль носителя наследственной информации. ДНК состоит из двух комплементарных цепей, закрученных друг относительно друга так, что образуется знаменитая «двойная спираль» (рис. 2.3). Каждая цепь представлена последовательностью повторяющихся нуклеотидов, включающих азотистые основания А (аденин), G (гуанин), С (цитозин) и Т (тимин).

Две цепочки ДНК идут антипараллельно по отношению друг к другу и спарены основаниями. Спаривание оснований определяет стабильность и высокую точность копирования генома. Двухцепочечная ДНК более стабильна и труднее разрушается, чем одноцепочечные ДНК или РНК. Правило спаривания оснований гласит: если в одной цепочке находится А то, в другой в том же положении будет находиться Т; если в одной цепочке находится G, то в другой будет С. Например, если порядок оснований в одной цепочке 5'—AGCTAT—3', то в другой, комплементарной, порядок будет 3'—TCGATA—5'. To есть, цепочки антипараллельны и комплементарны друг другу. Символы концов цепочек 5' и 3' (произносится «пять штрих» и «три штрих») объяснены в таблице 1.2.

Рис. 2.3. Два способа изображения двухцепочечной ДНК. Слева показана двойная спираль, имеющая две спаренные основаниями комплементарные цепи. Цепи в правозакрученной спирали антипараллельны, т.е. направление одной — от 5' к 3', другой — от 3' к 5'. Обратите внимание, что там, где в одной цепи находится основание аденин (А), в комплементарной цепи в той же позиции находится тимин (Т); там где в одной цепи находится основание гуанин (G), в комплементарной цепи в той же позиции присутствует цитозин (С). Основания являются частью нуклеотида, содержащего углевод рибозу. Нуклеотиды соединены друг с другом фосфодиэфирной связью, образующей остов каждой цепи Для удобства молекулу ДНК (всегда подразумевается, что она двухцепочечная, если не сказано иначе) изображают в упрощенной двумерной форме (справа). При репликации цепи раскручиваются, освобождая матричную последовательность свободных (неспаренных) оснований, по которой ДНК-полимераза строит комплементарную цепь (рис. 2.4, Б).

 

Именно в этом заключается чрезвычайно простой закон, определяющий структуру ДНК. Открытию правила спаривания оснований способствовали эмпирические данные Эрвина Чаргаффа (Chargaff), полученные в 1940-х годах. Анализируя химический состав ДНК, он показал, что во всех препаратах ДНК, выделенных из разных организмов, число молекул А всегда равно числу молекул Т; и точно также, число молекул С всегда равно числу молекул G. Эта закономерность была названа «правилом Чаргаффа». Чаргаффу, однако, не удалось связать полученные данные со структурой ДНК и механизмом наследственности. В полной мере оценить результаты Чаргаффа стало возможным лишь после открытия двойной спирали. В истории науки немало других примеров, когда важная информация не оказывает никакого влияния и «скрыто» лежит до тех пор, пока где-то вдохновенная созидательная интуиция не откроет ее истинную цену.

Правило спаривания оснований и антипараллельное расположение комплементарных цепочек объясняют, как создается дочерняя молекула с идентичной родительской последовательностью оснований (и, следовательно, содержащейся в ней информацией). Если цепочки разделить, можно предположить, что последовательность 3'—TCGATA—5' может служить матрицей для выстраивания в линию сначала А, затем G, затем С, затем Т и так далее до образования комплементарной последовательности 5'—AGCTAT—3' (рис. 2.3). Обьга-но копирование ДНК происходит с чрезвычайно большой скоростью и точностью. Однако в некоторых случаях имеют место ошибки, изменяющие последовательность оснований. Такие ошибки называются мутациями. Они создают наследственную изменчивость, на которую действует естественный отбор.

Итак, если линейную информационную макромолекулу ДНК сравнить с длинными полосами лент, которые использовали в первых компьютерах, то ДНК хромосом можно представить как последовательность миллионов букв (оснований). В этих последовательностях закодирован весь набор инструкций, представляющих генетический материал всех живых клеток на Земле. Проект «Геном человека» поставил целью определить порядок этих букв во всех 22 парах аутосом и в двух половых хромосомах человека. Этой работой занимается целый ряд специализированных лабораторий мира, владеющих методами клонирования и секвенирования генов. В общедоступных базах j данных и в персональных компьютерах молекулярных биологов хранятся сотни файлов, содержащих информацию о тысячах (может быть, миллионах) последовательностей ДНК. Достижения компьютерных технологий дают возможность биологам манипулировать последовательностями (например, искать определенную последовательность, разрезать ее или вставлять дополнительную информацию). Можно смело утверждать, что для появления ряда новых открытий молекулярной биологии р было необходимо развитие современных компьютерных технологий (табл. 2.1).

 

Генетическая информация передается от генов (нуклеиновых кислот) к белкам -центральная догма молекулярной биологии

До сих пор мы рассказывали о том, как организован геном человека, тот наследственный чертеж, по которому «строится» наш организм; упомянули мы и о том, что большинство химических реакций происходит с участием специфических белков — ферментов. Возникает вопрос, как информация, записанная в ДНК, превращается в тысячи различных белков, необходимых для функционирования и роста клеток? Как из одной клетки развиваются мириады разных клеток, из которых состоят ткани высокоорганизованных животных?

На эти ключевые вопросы ученые начали искать ответы только после открытия структуры ДНК. В начале 1960-х годов Фрэн-сис Крик, Сидней Бреннер (Brenner) и их коллеги совместно с Гобиндом Кораной (Khorana) и Маршаллом Ниренбергом (Nirenberg) выяснили, как информация, записанная в молекуле ДНК, может быть переведена с языка линейной последовательности оснований (GCTGGACTAATC) на язык соответствующей последовательности аминокислот (Ala, Gly, Leu, lieu). Эта грандиозная задача по дешифровке была решена к 1966 г., когда были окончательно установлены правила генетического кода. Определенный набор из трех оснований, расположенных в определенном порядке, соответствует определенной аминокислоте в белковой цепи. Так, в нашем примере GCT кодирует Ala (ала-нин), GGA кодирует Gly (глицин) и так далее (табл. 1.2 и приложение).

Экспериментально было показано, что существует информационная молекула — посредник между ДНК и белком. Этим посредником оказалась РНК, которая, в отличие от ДНК, состоит только из одной цепи. Однако ее химический состав оказался очень похожим на ДНК. И РНК, и ДНК построены из одинаковых основных строительных блоков. РНК содержит основания А (аденин), G (гуанин), С (цитозин) и U (урацил). Соотношение между двумя нуклеиновыми кислотами следующее. Если порядок оснований в ДНК 3'-TCGAATA-5', то порядок оснований в РНК (копия которой синтезируется по ДНК-матрице) будет 5'—AGCUUAU—3', где вместо Т (тимин) теперь стоит U (урацил). Мы уже упоминали это правило в гл. 1, табл. 1.2.

Рис. 2.4. Поток генетической информации - центральная догма молекулярной биологии.

А. Поток генетической информации направлен от нуклеиновых кислот (ДНК/РНК) к белкам и никогда в обратном направлении.Это означает, что последовательности оснований ДНК и РНК могут служить матрицами для синтеза других ДНК- или РНК-последовательностей, а аминокислотные последовательности в белках никогда не служат матрицей для синтеза РНК (или ДНК) последовательности оснований. Основные процессы копирования нуклеиновых кислот — это ДНК-> ДНК (репликация ДНК), ДНК->РНК (транскрипция), РНК->РНК (репликация РНК) и РНК->ДНК (обратная транскрипция). Аминокислотные последовательности, составляющие белки, определяются последовательностью оснований в. молекуле мРНК. Этот сложный процесс, называемый трансляцией, проходит в рибосомах на цитоплазме.

Б. Первый этап репликации ДНК заключается в локальном раскручивании двойной спирали, в результате которого матричные последовательности становятся доступными для копирования (этот участок называется вилкой репликации). Затем сложный набор белковых ферментов, включая ДНК-полимеразу, копирует каждую цепь, синтезируя комплементарную цепь (скорость копирования примерно 1000 оснований в секунду). Синтез всегда идет в направлении от 5'- к 3'-концу. Когда процесс достигает конца матричной молекулы, каждая из двух дочерних нитей состоит из одной новой цепи и одной родительской.

В. Отдельные участки ДНК-последовательности копируются или в мРНК, которая кодирует специфическую последовательность аминокислот (см. приложение), или в рибосомную РНК (рРНК), или в транспортную РНК (тРНК), которые являются частью молекулярного механизма, необходимого для трансляции мРНК в белок (см. приложение). РНК-по-лимераза копирует матричную цепь ДНК (чтобы это могло произойти, необходимо локальное раскручивание спирали ДНК). Синтез РНК также идет в направлении от 5'- к 3'-концу, так что матричная цепь ДНК имеет антипараллельную ориентацию от 3' к 5'. Последовательность оснований за кодирующим участком гена определяет терминацию (конец) синтеза РНК.

 

Самое важное — это то, что последовательность оснований ДНК определяет комплементарную последовательность РНК. Процесс синтеза на ДНК-последовательности соответствующей РНК-последовательности называется транскрипцией. На рис. 2.4 обратите внимание, что движение генетической информации происходит в направлениях ДНК -> РНК -> белок.

Также обратите внимание на то, что РНК-последовательность может служить матрицей для синтеза ДНК-последовательности (обратная транскрипция), а последовательность аминокислот в белке никогда не служит матрицей для обратного потока информации от белковой последовательности к РНК.

Все это еще не дает ответа на поставленные в начале вопросы. Как последовательность ДНК, переписанная в последовательность РНК (которая называется информационной РНК, или мРНК), переводится в белок? Большая часть данных, отвечающих на этот вопрос, получена М. Ниренбергом и Г. Кора-ной в начале 1960-х годов. По мере накопления информации становилось ясным, что процесс синтеза аминокислотной последовательности по триплетному коду мРНК чрезвычайно сложен. Этот процесс назвали трансляцией (от англ. translation — перевод). В общем виде он описан в приложении. Информационная РНК выходит из ядра в цитоплазму, где она транслируется в соответствующую последовательность аминокислот (белок). Она напоминает компьютерную ленту, подающуюся через устройство, которое считывает по три основания одновременно. Каждый триплет оснований определяет одну аминокислоту. «Читающее устройство» клетки называется рибосомой — это молекулярная органелла, состоящая из РНК и белков. Рибосома транслирует (переводит) мРНК в белковую последовательность — линейную цепочку аминокислот. Функциональным белком эта цепочка становится только после того, как примет определенную трехмерную устойчивую форму.

Рис. 2.5. ДНК, РНК и белки имеют трехмерную структуру. На уровне генетической (нуклеотидной) и белковой (аминокислотной) информации часто удобно рассматривать линейные последовательности (слева); на уровне функции в клетке все эти молекулы имеют сложную трехмерную структуру.

А. Двухцепочечная ДНК — это правозакрученная спираль. Однако существует и более сложная укладка, особенно в высших клетках, позволяющая компактно упаковывать хромосомы внутри ядра. В зависимости от стадии клеточного цикла, спирали образуют комплексы с разнообразными белками, многие из которых определяют, какие гены будут транскрибироваться в мРНК.

Б. Одноцепочечные молекулы РНК могут складываться в сложные структуры с локальными спариваниями оснований комплементарных последовательностей. Эта вторичная структура особенно важна для функционирования транспортных и рибосомных РНК.

В. Аминокислотные последовательности белка принимают сложную пространственную структуру.

 

Генетический код, насколько известно до сих пор, универсален для всех живьк организмов на Земле: от мельчайших вирусов и бактерий до растений и животных. В ходе эволюции жизни на Земле около 3—4 млрд. лет назад этот код был отобран как оптимальный механизм переноса информации, приводящий к образованию белка, и с тех пор ни разу не был ни изменен, ни заменен. В противоположность этому современные компьютерные программы постоянно обновляются и заменяются. Очень интересны рассуждения Лесли Оргела (Orgel) и Фрэн-сиса Крика о возникновении генетического кода, опубликованные примерно 25 лет назад. Они полагают, что сложный молекулярный аппарат, требующийся для транслирования РНК в белок, мог быть занесен на Землю живыми организмами (бактериями) откуда-то из Вселенной — или кометами, или космическим кораблем из сверхразумной цивилизации. Варианты этой идеи отстаивают и астрофизики Фред Хойли (Hoyle) и Чандра Викрамасинг (Wickramasihghe) в книгах Life Cloud (Облако жизни) и Our Place in the Cosmos (Наше место во Вселенной) (рис. 1.4).

Рис. 2.6. Наследование изменении в последовательности оснований ДНК. Репликация ДНК — это процесс копирования. Несмотря на высокую точность этого процесса иногда все-таки происходят замены, вставки или потери оснований. Такие ошибки, например замена одного основания, редкие события. Их частота составляет примерно 1 на миллиард реплицированных оснований (см. рис. 5.2). Традиционно последовательность оснований ДНК представляют цепью 5'-3' (она имеет ту же ориентацию, что и мРНК, которая никогда не служит матрицей для синтеза мРНК).

А. В верхнем примере восьмое основание G заменено на А в этом же положении. Если эта замена происходит в участке гена, кодирующем аминокислоты, это может привести к появлению в ходе трансляции другой аминокислоты в белке или к преждевременному окончанию (терминации) синтеза белка (т. е., эта замена может привести к появлению стоп-кодона ТАА, TAG или TGA).

Б. Замена одного основания — простейший тип мутации; более сложные мутации могут приводить к потере или вставке одного или нескольких оснований. Если вставки или потери происходят в нетрэчскри-бируемых или фланкирующих участках, это может не привести к серьезным генетическим последствиям. Однако если они происходят в участке, кодирующем аминокислоты, последствия обычно летальны, так как последовательность аминокислот в белке будет совершенно другой, покольку вставка или потеря оснований изменяют рамку считывания кодонов. Чаще всего, изменение рамки считывания кодонов (этот тип мутаций называется «сдвиг рамки») приводит к появлению стоп-кодона, а именно ТАА, TAG или TGA, которые преждевременно останавливают синтез белка.

 

Где бы ни возник генетический код, он стал основным кодом жизни на Земле. Он привел к развитию чрезвычайно сложных и разнообразных биологических форм, оставаясь неизменным для всех организмов.

Когда мы клонируем какой-нибудь ген (скажем, ген инсулина человека), мы реплицируем (размножаем) его в бактериальных клетках и, таким образом, производим большое количество инсулин-специфической ДНК. Это говорит о том, что аппарат репликации ДНК бактерий обрабатывает ДНК-последовательность человека так же, как и бактериальную. Если мы хотим получить большое количество белка инсулина для лечения диабета, мы «экспрессируем» клонированный ген человека в бактерии. То есть, мы заставляем бактерию производить человеческий инсулин. И бактерия создает тот же самый инсулин, с той же последовательностью аминокислот, что и клетка человека. Это означает, что генетический код прочитывается одинаково и в бактериальной, и в человеческой клетках, а разошлись они в ходе эволюции, возможно, 3,6 млрд. лет назад.

Итак, гены в хромосомах представлены двухцепочечной ДНК. По мере роста клетка производит копию каждой цепи ДНК, и образуются две двухцепочечные спирали. В каждую из двух новых дочерних клеток, образующихся в результате деления, попадает по одной новой молекуле ДНК. Для роста и выполнения своих функций в дифференцированных тканях многоклеточного организма клетки нуждаются в тысячах различных белков, которые объединяются в структуры, которые мы называем «мультимолекулярными машинами». Такие объединения белков (и РНК) координируют и проводят все химические реакции в клетке, которые необходимы ей для поддержания жизни, роста и развития. Генетическая информация, зашифрованная в линейной последовательности оснований ДНК, определяет (через РНК) весь набор белков, в которых нуждаются различные клетки. Информационные молекулы продуцируют практически бесконечное разнообразие белков — с разными последовательностями аминокислот, структурой и функциями, — которое дало начало удивительному разнообразию и великолепию форм жизни на Земле.

Хотя мы говорим о линейных последовательностях ДНК, РНК и белка, надо помнить, что все эти информационные и функциональные полимеры имеют трехмерную структуру. Так, двухцепочечная ДНК — это правозакрученная спираль (рис. 2.5, А). Одноцепочечная РНК способна формировать сложную структуру за счет спаривания соседних комплементарных последовательностей (рис. 2.5, Б). Цепочка аминокислот в белке также складывается в характерную трехмерную форму (рис 2.5, В). Следовательно, на уровне генетической информации нам достаточно думать в терминах линейных последовательностей, но на функциональном уровне жизнь протекает в трехмерном пространстве.

Таким образом, во многих отношениях клетки и многоклеточные организмы могут рассматриваться как самопрограмми-руюшиеся многоцелевые информационные системы, способные изменяться во времени. Допустим, что в ДНК-последовательности 5'—AGCTAT—3' третье основание С заменено на Т; тогда последовательность станет другой, и все ее потомки также будут другими. Иными словами, мутантная (измененная) последовательность передается по наследству всем дочерним молекулам (рис. 2.6). Поэтому на молекулярном уровне дарвиновский отбор можно представить как отбор наиболее приспособленных последовательностей. Самые убедительные доказательства естественного отбора были получены в молекулярно-генетических исследованиях.

 

Обратная транскрипция — создание ДНК-копии по матрице РНК

За десять лет после открытия структуры ДНК и расшифровки генетического кода сформулированная Джеймсом Уотсоном в 1952 г. гипотеза об однонаправленном переносе генетической информации (от нуклеиновых кислот к белку и никогда наоборот) превратилась в общепризнанную «центральную догму молекулярной биологии». Эта аксиома, как мы уже сказали, остается в силе для всех биологических систем.

Это правило переноса генетической информации составляет суть молекулярной биологии. Только один раз, в 1970 г., оно было модифицировано, когда признали существование обратной транскрипции. Впервые обратная транскрипция была обнаружена у опухолевых вирусов мышей и кур. Сейчас эти РНК-сод ержашие вирусы называют ретровирусами. Их инфекционный цикл хорошо изучен. Вирус проникает в клетку-мишень, и на основе своей РНК создает копию ДНК, которая встраивается в хромосому хозяина. При делении клетки встроенная копия ДНК вирусного генома удваивается и передается дочерним клеткам. Таким образом, наследственный материал вируса оказывается включенным в геном клетки. Вирусная РНК может образоваться позже путем копирования встроенной ДНК. Это приведет к образованию новых инфекционных вирусов.

Именно таким образом вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) встраивается в ядерную ДНК и размножается вместе с клеточным геномом. Вот почему от этого вируса трудно избавиться, ведь каждая встроенная (интегрированная) ДНК-копия вируса может использоваться для образования множества копий РНК в результате нормального процесса транскрипции, а это в свою очередь приводит к появлению новых инфекционных ВИЧ-частиц. Еще один пример ретровирусов — это вирусы, вызывающие рак легких и лейкоз у человека и животных.

В конце 1997 г. в журнале «Nature» была опубликована работа группы Ролфа Цинкернагеля (Zinkemagel) из Цюриха, в которой показано, что в некоторых клетках животных, содержащих обратную транскриптазу ретровирусов, могут образовываться ДНК-копии других РНК-содержащих вирусов. Это захватывающее открытие означает, что обратная транскрипта-за, кодируемая ретровирусами, потенциально способна делать копии ДНК с других молекул РНК, присутствующих в клетке. Значит, возможно образование свободных ДНК-копий (их называют кДНК, или ретротранскрипты) собственных генов по матрице мРНК. Эта идея, допускающая теоретическую возможность передачи генетической информации от сомы к зародышевой плазме (о чем и говорил Тед Стил еще в 1979 г.), приблизила нашу теорию об эволюции иммунной системы позвоночных к реальности. В следующих главах мы детально опишем молекулярные данные, поддерживающие эту теорию.

 

Мир РНК — передача функции генетического чертежа от РНК к ДНК

Есть еще один вопрос, который биологи продолжают себе задавать, несмотря на то, что мы все больше и больше узнаем о молекулярно-генетических процессах. Что появилось раньше: ДНК, РНК или белок? Этому вопросу посвящено много исследований. Здесь мы остановимся на основных моментах.

В начале 1980-х годов Томас Кеч (Cech), Сидней Алтман (Altman) и их коллеги открыли ферментативные свойства молекул РНК, которые были названы «рибозимами»[6]. С этого времени появилось много концепций, касающихся «мира РНК». Предполагается, что первой живой молекулой был полимер РНК. Белков, какими мы их знаем теперь, и содержащих ДНК хромосом еще не существовало. В мире РНК микроскопические живые формы были самореплицирующимися молекулами РНК разной длины, от сотен до тысяч оснований. Репликация линейной цепочки РНК контролировалась самой молекулой (рибозимом), определенным образом сложенной. Итак, согласно этой гипотезе, первыми молекулами, способными к само-репликации и, следовательно, к дарвиновской эволюции, были не двойные спирали ДНК, как теперь, а РНК. Репликация же ДНК требует сложного набора специфических ферментов, составляющих «машину репликации ДНК».

Открытие ферментативных функций РНК и ее способности к саморепликации завершило 30—40-летний период попыток рационально объяснить первые шаги молекулярной эволюции жизни. Тот факт, что одноцепочечные молекулы РНК способны сами себя реплицировать и изменять, представлялся с функциональной точки зрения существенным. Сейчас известно, что все матричные процессы копирования, затрагивающие РНК (транскрипция, репликация и обратная транскрипция — рис. 2.4 А, В), склонны к ошибкам.

Это важно для нас, потому что все гены клеточных организмов представлены двухцепочечными молекулами ДНК, чрезвычайно точную репликацию которых осуществляет сложный аппарат (включающий от 30 до 40 разных белков). Высокая точность копирования достигается за счет того, что несколько белков, участвующих в репликации ДНК, занимаются исключительно редактированием и исправлением вновь образуемой копии ДНК. Например, если во время репликации вместо С встанет А, фермент- «редактор» заметит это, так как будет нарушен нормальный процесс спаривания оснований, и вставит на нужное место правильное основание. Если химическое повреждение основания происходит после того, как вновь синтезированная цепочка соединяется с родительской (матрицей), образуется «изгиб» двойной спирали, который запускает редакторские функции ферментного комплекса, вырезающего поврежденную последовательность и синтезирующего заново правильную копию (рис. 2.7). Это сродни процессу, который происходит при проверке полноты данных в ходе передачи электронного сообщения. Вот почему генные мутации, возникающие исключительно на уровне ДНК, — чрезвычайно редкие события. Мутации, которые мы видим, это те мутации, которым удалось пройти сквозь все нормальные редакторские и корректорские кордоны репликационной машины. Репликация ДНК — это процесс копирования очень высокой точности. В самом деле, на каждые миллиард реплицированных оснований остается нераспознанной только одна ошибка.

Таким образом, древний мир РНК представляется «эволюционирующим хаосом», в котором выживали наиболее приспособленные самореплицирующие молекулы. Манфред Эйген (Eigen) с коллегами провели поучительное исследование, которое показало, каким образом склонное к ошибкам копирование РНК и отбор могут давать квази-оптимальную популяцию молекул РНК. Эта популяция молекул РНК способна быстро эволюционировать при изменении окружающей среды.

Одноцепочечная РНК химически менее устойчива, нежели двухцепочечная ДНК. Очевидно, что в какой-то момент далекого эволюционного прошлого ранним формам жизни стало выгодно стабилизировать свой наследственный чертеж. Это послужило началом перехода от мира РНК к миру ДНК. Первый необходимый шаг на пути к миру ДНК — это передача информационной функции от РНК-последовательности к ДНК-последовательности, т. е. появление обратной транскрипции.

Рис. 2.7. Репарация ДНК. Ошибки в ДНК-последовательности оснований, которые передаются по наследству, вносят вклад в генетическую изменчивость популяций и, таким образом, в эволюцию путем естественного отбора. Ошибки, или мутации, редки, потому что аппарат репликации ДНК осуществляет несколько последовательных редакций и проверок молекулярной целостности двойной спирали. На рисунке схематично показан один из типов исправления ошибок, включающий удаление химически измененного или неправильного основания, которое не может спариваться с комплементарным основанием в другой цепи. Короткий участок вокруг неспаренного (или поврежденного) основания удаляется специальными разрезающими ферментами (эндонуклеазами). Образовавшийся пробел заполняется в результате репаративного синтеза ДНК в направлении от 5' к 3'. В качестве матрицы для этого синтеза служит другая цепь.

 

Наиболее вероятно, что древняя обратная транскриптаза была РНК-ферментом (рибозимом). Появление более сложных белковых обратных транскриптаз произошло позже.

Тем не менее для некоторых РНК-содержащих вирусов, таких как вирус гриппа и ретровирусы, высокий уровень ошибок, свойственный процессу образования РНК, в сочетании с некоторыми другими особенностями генома дает селективные преимущества. Высокий уровень мутирования (примерно одно ошибочное основание на каждую тысячу реплицированных оснований) делает их неуязвимыми перед иммунной системой инфицированного хозяина. Это привело к тому, что даже после появления в ходе эволюции белковых ферментов, РНК сохранилась в качестве вирусного генома. Совсем недавно, в конце 1980-х гг., Элизабет Блакберн (Blackburn) показала, что ферменты, которые строят ДНК-последовательности по РНК матрице на концах хромосом позвоночных (теломерах) путем обратной транскрипции, имеют явную эволюционную связь с вирусными ферментами, копирующими вирусные РНК. Это еще один пример эволюционной значимости РНК.

Почему мы придаем такое огромное значение этому шагу молекулярной эволюции? Потому что далее мы покажем насколько важна обратная транскрипция для всех современных ламарковских идей о существовании обратной связи генов, которая делает возможным наследование приобретенных соматических мутаций.