Наследование соматических мутаций

Итак, мы можем спросить, есть ли польза от антигензависимых соматических событий (мутаций и отбора) для ДНК-последовательностей V-генов зародышевой линии следующих поколений? В предьщущей главе мы уже рассказали, как много появляется новых мутантных ДНК-последовательностей в В-лимфоцитах и как они проходят отбор на успешность связывания антигена. Сейчас мы спросим, могут ли эти новые последовательности вливаться в ДНК зародышевой линии — в ДНК половых клеток, яйцеклеток и сперматозоидов?

Теория соматического отбора предполагает передачу приобретенных соматических мутаций V-генов антител половым клеткам. Эта передача может осуществляться при участии обратной транскриптазы (копирование соматической РНК в ДНК) и эндогенных РНК-ретровирусов (продуцируемых лимфоцитами), действующих как «генные челноки», перевозящие мутантные последовательности V-генов в половые клетки. После этого должна происходить интеграция возникшей в соматических клетках генетической информации в ДНК зародышевой линии и замещение ею ранее существовавшей ДНК-последовательности (рис. 1.2). Когда мы формулировали свою гипотезу, мы подчеркивали, что она — «полезный эвристический инструмент», подобный использованным в теоретической физике. Наша теория обращает внимание исследователя на возможность наследования приобретенных признаков. Она убедительно показывает, что теоретически барьер Вейсмана легко преодолим, а, следовательно, он может быть преодолимым и в реальности.

Книга Somatic Selection and Adaptive Evolution вызвала полярные реакции: от резкой критики до щедрой похвалы. Некоторые сочли ее просто фантастической, так как она требовала принятия ламаркистской «ереси», другие приняли ее. Философ Карл Поппер посчитал нашу книгу самой захватывающей из всех, что он читал в том году, а Питер Медавар выразил надежду, что Стил в конце концов окажется прав. Ричард Докинз в своей книге The Extended Phenotype назвал все происходящее тогда «ламаркистским психозом». Позже мы вернемся к критике гипотезы соматического отбора, которую дал Докинз.

Некоторые критики считают идею соматического отбора слишком сложной, так как она требует последовательного наступления слишком многих независимых, если не невероятных, событий. Это — появление мутации в соматических ДНК/РНК, клеточный отбор антигеном, доставка в половые клетки, копирование РНК в ДНК и, наконец, генетическая рекомбинация, приводящая к интеграции мутантной соматической копии кДНК в ДНК зародышевой линии (рис. 1.2). Однако ко времени создания этой теории было хорошо известно, что В-лимфоциты, стимулированные антигеном, продуцируют большое количество эндогенных ретровирусов (предположительно безвредных), несущих обратную транскриптазу. И мы утверждаем, что теория соматического отбора имеет один положительный момент — эволюционное преимущество возвращения мутантных V-последовательностей назад в зародышевую линию. Эндогенные ретровирусы могут рассматриваться в качестве векторов, обеспечивающих генетическую связь между генами соматических и половых клеток.

Тем не менее, главное оправдание теории соматического отбора — в том, что она позволяет критически оценить и интерпретировать весь набор молекулярных фактов, которые иначе бы остались невостребованными. Это то же самое, что аргументы в пользу эволюционной концепции «прерывистого равновесия», использованные недавно С. Дж. Гулдом. Идея обратной связи сомы и зародышевой линии в не меньшей степени полезна, потому что она отвергает непроницаемость барьера Вейсмана на основе научных данных.

В 1994 г. в престижном американском журнале Proceedings of the National Academy of Sciences Симона Бард (Bard), Дэвид Балтимор и Ирвин Вейсман (Weismann) высказали предположение о том, что гены могут перемещаться от вида к виду в результате вирусной инфекции и что этот процесс вносит вклад в эволюцию иммунной системы позвоночных. Эта идея подразумевает, что барьер Августа Вейсмана проницаем, и значит — еще более ответственна, чем идея Тэда Стила, которая не привлекает гипотезу вирусного переноса генов от одного животного к другому. Примечательно, что на эти рассуждения не было столь сильной реакции научной общественности и неодарвинистов, как на теорию соматического отбора. Возможно, потому что Ламарк не был упомянут. А, возможно, еще и потому что Дэвид Балтимор — Нобелевский лауреат, и он, и Ирвин Вейсман — члены Академии. Какими бы ни были причины, это интересный пример из жизни научного сообщества.

 

Опыты по передаче с отцовской стороны

Первые и очень спорные эксперименты по этому вопросу были проведены в конце 1970-х годов не на уровне генов, но на уровне функциональных характеристик иммунного ответа. Тэд Стил задал вопрос, приводят ли изменения иммунологических функций родителя (отца), вызванные активной обработкой антигеном, к каким-либо изменениям специфической или неспецифической иммунной реактивности у потомства, появившегося от скрещивания таких обработанных антигеном отцов с нормальными самками. Эти эксперименты были проведены на инбредных линиях мышей. Результаты оказались невоспроизводимыми — некоторые лаборатории смогли продемонстрировать отцовскую передачу специфических приобретенных иммунологических функций (или неспецифических нарушений), а другие не смогли. Первый положительный результат был получен Тэдом Стилом в соавторстве с Регом Гор-жински (Gorczynsky). Они использовали систему Медавара приобретенной неонатальной толерантности к чужим антигенам гистосовместимости (рис. 4.3). Эти эксперименты проводились в течение двух лет (1978—1979) в Онкологическом институте Онтарио (Торонто). Мы показали, что, если новорожденных самцов линии А повторно подвергать воздействию большого числа лимфоцитов линии В, то «толерантные» самцы могут передавать некоторые черты специфической толерантности к антигенам В-ткани своему потомству, полученному от , их скрещивания с нормальными самками линии А (рис. 6.1). , Иммунными эффекторными клетками в этом эксперименте почти несомненно были Т-лимфоциты, так как именно они вовлечены в реакцию отторжения. В более поздних экспериментах был проверен ответ В-лимфоцитов, причем была показана отцовская передача изменения силы ответа у потомков иммунизированных самцов.

Рис. 6.1. Передача приобретенной иммунолологической толерантности от отца. Эксперименты Горжински-Стила (Gorczynski-Steele). Мыши линии А приобрели толерантность к антигенам гистосовместимости линии В при инъекции новорожденным лимфоидных клеток линии В. (Это метод Медавара, см. рис. 4.3.) Эти мыши скрещиваются с нормальными самками линии А. У потомства проверяют образец киллерных Т-клеток на толерантность к антигенам гистосовместимости линии В. Согласно традиционной неодарвинистской теории потомство не должно быть толерантным, но в опыте было обнаружено много толерантных мышей. В контроле необработанных самцов линии А скрещивали с нормальными самками линии А. Родителей (контрольных и экспериментальных) и потомков содержали в одинаковых условиях в виварии. (По Steele E. J., Gorczynski R. M., Pollard J. W. In: Evolutionary Theory Path into the Future. Ed. J. W. Pollard. John Wiley, London, pp 217-237, 1984. Перепечатано с разрешения издателя).

В этих экспериментах мы столкнулись с материальными и техническими проблемами. В таких опытах необходимо долговременное разведение 10-20 обработанных и необработанных самцов и учет изменений ответа или на пересадку кожи, или на иммунизацию, или на стимулированный антигеном ответ лимфоцитов одновременно у 50—100 потомков. Правильная интерпретация результатов возможна только при большом числе контрольных животных и проверок реакций на каждом этапе. Положительная передача была непостоянной, появляясь с большой частотой у одного-двух из десяти самцов (среди самцов наблюдалась изменчивость по признаку «частоты передачи потомству»). Эти данные подтверждали прямую проницаемость барьера Вейсмана при активной иммунизации, так как предполагается, что следующему поколению самцы передают только спермий. С иммунизированными матерями экспериментов не проводили, так как на плод и новорожденного прямо воздействуют антитела и лимфоциты, проникающие от матери или в матке, или после рождения с молозивом.

Неудивительно, что эти эксперименты вызвали серьезные возражения и стали отчасти причиной эмоционального приема идей, упомянутых ранее, а невоспроизводимость результатов вызвала скептицизм у некоторых исследователей. Биологические тесты, использованные в некоторых из этих работ, очень изменчивы [10]. Сейчас технически возможны более точные эксперименты, так как новые молекулярные методы позволяют создать линии мышей, на которых можно обнаружить передачу информации от сомы к зародышевой линии. Однако частота такого события все еще неизвестна.

 

«Печать» соматических мутаций и отбора стоит на всех V-генах зародышевой линии

Наш интерес к анализу ДНК-последовательностей V-генов зародышевой линии начался с наблюдений нашего коллеги Гарри Ротенфлу. В 1992 г, выполняя свою диссертационную работу, он изолировал и секвенировал V-элементы зародышевой линии из Ig-локуса тяжелой цепи мыши (различие между «конфигурацией зародышевой линии» и «соматической конфигурацией» V-генов описано в гл. 4). Напомним, что перестроенные V(D)J-гены вариабельной области появляются только в зрелых В-клетках, и эти гены являются непосредственными мишенями антигензависимых процессов — соматического мутирова-ния и отбора в центре размножения. Данные Гарри Ротенфлу показали, что особенности ДНК-последовательностей соматической конфигурации свойственны и конфигурации зародышевой линии!

Такое строение ДНК-последовательностей V-генов в зародышевой линии трудно объяснить в рамках любой теории, опирающейся на полное запрещение переноса генетической информации от сомы к зародышевой линии. Во-первьгх, V-элементы половых клеток никогда не могли быть прямой мишенью для естественного отбора (т. е. связывания антигена). Отбору подвергается только полностью собранный белок антитела (H+L гетеродимер) на поверхности В-лимфоцита, и только он проходит проверку на антигенсвязывающую функцию. Сами по себе V-элементы клеток зародышевой линии никогда не превращаются в РНК (не транскрибируются) или в белок (не транслируются). Они экспрессируются в зрелом В-лимфоците только после перемещения ДНК в хромосоме соматической клетки, приводящего к созданию типичного перестроенного V(D)J-участка (рис. 4.5). Функциональные исследования обнаружили, что только половина репертуара V-генов зародышевой линии появляется в V(D)J-последовательностях. Многие, возможно, никогда не использовались в зрелых V(D)J-перестройках и, по-видимому, никогда не подвергались отбору.

Во-вторых, геном мыши и человека содержит много V-генов зародышевой линии (примерно по 100 для Н- и L-цепей). И хотя их последовательности в каждой из групп (Н или L) высоко гомологичны, но есть и довольно заметные различия. Изменчивость V-элементов зародышевой линии и для Н-, и для L-цепей характеризуется кривой Ву—Кэбота, т. е. высоко неслучайна (рис. 5.3). В предыдущей главе мы уже рассказали, что такая картина неслучайной изменчивости создается только прямым антигенсвязывающим отбором, действующим на молекулу антитела, расположенную на поверхности В-лимфоцита. Этот вопрос обсуждался в предыдущей главе.

В-третьих, V-гены зародышевой линии мыши и человека «не затронуты» стоп-кодонами. Другими словами, многие V-гены зародышевой линии являются «открытыми рамками считывания». Обнаруживается статистически значимое снижение наблюдаемой частоты стоп-кодонов внутри кодирующих участков V-генов по сравнению с ожидаемой на основании процесса случайных мутаций. Это относится и к так называемым V-псевдогенам — нефункциональным V-генам, которые не могут экспрессироваться как мРНК и белок вследствие мутационных повреждений, нарушивших рамку считывания кодирующего участка или изменивших регуляторную последовательность. Считается, что такие поврежденные гены накапливают мутации, так как они не могут подвергаться действию отбора. Итак, низкая встречаемость точковых мутаций (или мутаций «сдвига рамки» из-за вставок или потерь оснований), приводящих к появлению стоп-кодона и в функциональных генах, и в псевдогенах предполагает существование механизма, который направлен на поддержание «открытой рамки считывания» V-генов зародышевой линии. Однако открытая рамка считывания может подвергаться отбору только на уровне связывания антигеном, связывания интактного гетеродимера, расположенного на поверхности клетки, и антигена.

Таким образом, структура ДНК-последовательности V-генов зародышевой линии млекопитающих предлагает нам сложную загадку. Согласно модели случайного дрейфа, эти гены должны накапливать довольно большое число фоновьк мутаций. Поскольку этого не происходит, то следовательно, эти последовательности несут следы отбора на уровне белка. Указанные особенности последовательностей V-генов наблюдаются у всех изученных до сих пор позвоночных, от хрящевых рыб, амфибий (лягушки) до кроликов, овец, мышей и человека.

Противоречия станут еще глубже, если рассмотреть ДНК-последовательности V-генов зародышевой линии у кур, изученные французскими и американскими исследователями под руководством Жан-Клода Вейля (Weill) и Крейга Томпсона (Thompson) в течение последних 10 лет. У кур процесс образования антител несколько отличается от такового у мышей и человека. Первое отличие заключается в том, что локусы тяжелой и легкой цепей содержат только по одному функциональному V-элементу, включающему сигнальную последовательность для активирующего рекомбинацию генов фермента (RAG), который обеспечивает перестройку ДНК. Вверх (к 5' концу) от этого функционального V-гена находится 20—100 псевдогенов. Они в основном нефункциональны из-за того, что у них укорочен участок, контролирующий транскрипцию (промотор), который может тянуться до последовательности, кодирующей лидерньш пептид (L). У них также отсутствует и сигнальная последовательность для RAG-фермента. Эти псевдогены тесно упакованы в ДНК зародышевой линии, по краям каждого кодирующего участка расположено всего несколько сот (самое большое) оснований. В отличие от них V-элементы генов зародышевой линии у человека и мыши отделены друг от друга 10—20 килобазами ДНК. Таким образом, размер IgV локусов курицы составляет примерно 1/20 размера этих локусов мыши и человека.

В развивающихся куриных В-лимфоцитах происходит перестройка единственного интактного V-гена и образование функционального вариабельного V(D)J-гена. Затем к нему добавляются фрагменты разной длины (5—100 оснований) расположенных выше V-псевдогенов. Этот процесс называют генной конверсией. Разные результаты генной конверсии в разных В-клетках приводят к образованию большого репертуара V(D)J-последовательностей. Такой источник разнообразия функциональных антител так же эффективен, как у мышей и человека, но требует гораздо меньшего (1/20) количества ДНК зародышевой линии.

Но самое поразительное в строении V-псевдогенов это то, что если сравнить их ДНК-последовательности с помощью компьютерных программ, то обнаруживается структура By— Кэбота»! (рис. 6.2). Более того, если различия между псевдогенами обусловлены вставкой и потерей нуклеотидов в кодирующих участках, они всегда кратны трем (т. е. триплету); таким образом, сохраняется правильная трансляционная рамка считывания! Это показано на рис. 6.2. Напомним, что триплетный ко-дон определяет аминокислоту в цепочке белка (см. приложение). Вдобавок у кур псевдогены тяжелой цепи на 3'-(правом) конце несут короткую D-последовательность (и все они находятся в предпочтительной рамке считывания, наблюдаемой только в соматически экспрессирующихся V(D)J-последовательностях). Псевдогены как тяжелых, так и легких цепей отличают вставки или потери нуклеотидов, которые, как известно, происходят в В-лимфоцитах при образовании V(D)J-пepeстройки. Эти вставки и потери создают третий гипервариабельный участок! Такие действительно поразительные и необычные свойства обнаружены в ДНК зародышевой линии, кодирующей псевдогены. Она несет «печать» соматических событий.

Рис. 6.2. Вариабельность ДНК и аминокислот (Ву-Кэбот) V-псевдогенов зародышевой линии у кур. Графики Ву—Кэбота для вариабельных областей псевдогенов 18 тяжелых {А) и 25 легких (Б) цепей генома кур. И для тяжелых, и для легких цепей наблюдаются неслучайные структуры Ву—Кэбота, свидетельствующие об антигенсвязывающем отборе В-клеток на уровне белка Ig. Этот результат противоречит структуре их последовательностей, которая гарантирует, что сами по себе эти гены никогда не экспрессируются как белковая последовательность. Верхние графики показывают вариабельность нуклеотидов в ДНК-последовательностях по длине участка, а нижние — вариабельность аминокислот (после трансляции успешной ДНК-последовательности триплетных кодонов в аминокислотную последовательность, см. приложение). Первое основание или аминокислота предполагаемого кодирующего участка обозначено как положение 0. Обратите внимание, что гипервариабельные последовательности совпадают с антигенсвязывающим центром (CDR), такая картина графика Ву—Кэбота ожидается для функционального белка вариабельной области (рис. 5.3). Положения, в которых произошли вставки (+) или потери (-) триплетов оснований обозначены светлыми стрелками. Относительные положения CDR1, CDR2 и CDR3 показаны на диаграммах под графиками. Появление вставок или потерь оснований наборами триплетных кодонов в правильной рамке считывания (см. приложение) снова свидетельствует об антигензависимом отборе, действующем на уровне белка — что невозможно, так как эти гены — псевдогены! Разумное объяснение таково, что эти последовательности оснований в V-псевдогенах зародышевой линии поддерживаются как открытые рамки считывания обратной связью сомы и зародышевой линии функциональных V(D)J-последовательностей после направляемого антигеном соматического отбора. (По Rothenfluh H. S., Blanden R. V., Steele E. J. Immuno-genetics, vol. 42: 159-171, 1995 с разрешения издателя, Springer-Verlag Gmbh &Co. Kg.)

Следовательно, куриные псевдогены — это чудовищный вызов традиционной молекулярной генетике, основанной на строгой неодарвинистской парадигме. Парадоксально, у них проявляются все черты прямого антигенсвязывающего отбора на уровне антитела, хотя ДНК-последовательности, характерные для зародышевой линии, транскрибируются (в мРНК) и транслируются (мРНК в белок) только по частям, после процесса соматической генной конверсии. Такая структура ДНК-последовательностей разумно объясняется только генетической моделью отбора антигеном соматического V(D)J-гена и последующей обратной связи генов вариабельной области сомы и зародышевой линии (наиболее вероятно, через РНК-> ДНК-копирование, или обратную транскрипцию). См. рис. 6.3 и рис. 1.2.

Структура Ву—Кэбота и другие соматические черты V-генов и псевдогенов зародышевой линии позвоночных (особенно поразительные свойства псевдогенов кур, описанные выше) указывают на действие процесса обратной связи генов сомы и зародышевой линии, активного в течение 400—500 миллионов лет эволюции V-генов. Следовательно, сейчас у нас есть причины для введения в современную эволюционную теорию третьей неоламарковской концепции: прямое проникновение через барьер Вейсмана некоторых семейств генов, например, V-генов иммуноглобулинов.

Рис. 6.3. Обратная связь сомы и зародышевой линии (тяжелая цепь). В гл. 5 говорилось, что соматические мутации накапливаются в вариа-6enbHbixV(D)J-reHax В-лимфоцитов (рис. 5.5 и 5.6). Мутантные обратные транскрипты (кДНК), доставленные в половые клетки подвижными В-клетками и/или ретровирусами, встраиваются в ДНК зародышевой линии в результате гомологичной рекомбинации. Картина рекомбинации V-генов зародышевой линии установлена с помощью алгоритма генетической рекомбинации, разработанного Джорджем Уайлером (см. текст и Weiller et al., 1998). Главные точки рекомбинации в зародышевой линии обнаружены в точке начала транскрипции, на границе между L-V интроном и концом кодирующего V-участка. Этот результат согласуется с предположением о следах интеграции, которые обсуждаются в этой главе. Этот процесс показан и на рис 1.2, но не так подробно. См. также подписи к рис. 4.5, 5.5 и 5.6.

Простейшие модели этого процесса включают создание кДНК по матрице про-мРНК с помощью обратной транскрипции и последующую доставку этой копии в репродуктивные ткани мобильными клетками (например, лимфоцитами) или эндогенными ретровирусами, действующими как «генные челноки». (Напомним, что предполагаемый механизм соматического гипермутирования, обсуждаемый в предыдущей главе, также включает создание кДНК.) Последнее — это гомологич-ная рекомбинация, причем созданная кДНК замещает исходную последовательность зародышевой линии. У нас нет способа оценки частоты возникновения таких событий в ходе эволюции, хотя сила «соматической печати», которую мы видим на ДНК зародышевой линии, заставляет считать их довольно частым эволюционным событием.

 

«Следы интеграции» сомы в зародышевую линию

Модель соматического отбора, объясняющая эволюционный цикл V-генов антител, приведена на рис. 1.2 и 6.3. Мы предполагаем, что новый варианту-последовательности зародышевой линии «рождается» в соме в результате гипермутирования «выбранного» антигеном перестроенного V(D)J-гена вариабельной области, экспрессирующегося в В-лимфоците. Интенсивные циклы соматического гипермутирования и отбора антигеном в центре размножения приводят к появлению новых, успешных V(D)J-последовательностей с мутациями в определяющих ком-плементарность участках (CDR, от англ complementarity-determining regions), или гипервариабельных участках, которые вступают в контакт с антигеном. Затем эти новые последовательности ДНК доставляются в репродуктивные ткани, где они совмещаются с существующим V-геном, имеющим очень похожую последовательность. После этого происходит процесс, который называется гомологичной рекомбинацией. Он включает разрыв хромосомной ДНК и ее воссоединение с концами нового гена, который, таким образом, интегрируется (встраивается) в хромосому (этот процесс обозначен перекрещивающимися линиями на рис. 6.3).

Все свойства V-генов зародышевой линии, описанные в этой книге, согласуются с этим «жизненным циклом» от сомы к зародышевой линии. Но мы нашли еще одно свидетельство, согласующееся с гипотезой движения информации от сомы к половым клеткам. А именно, если соматическая генная последовательность встраивается в зародышевую линию в результате рекомбинации, то мы должны увидеть свидетельства процесса рекомбинации самого по себе (рис. 6.3). Одним из таких свидетельств может быть распределение событий «вставка/потеря» нуклеотидов. Когда две гомологичные двухцепочечные спирали ДНК рекомбинируют, они должны разрушаться (разрезаться ферментом нуклеазой) и затем воссоединяться (с помощью фермента лигазы). Этот процесс может быть неточным и приводить к потере или вставке нуклеотидов на концах цепочек ДНК. Соответственно, появляются или потери, или вставки нуклеотидов в месте соединения. Поэтому среди последовательностей V-генов зародышевой линии должны быть вставки и потери разной длины по границам генов. В том же смысле, в каком структура Ву—Кэбота служит показателем антигенсвязывающего отбора, неслучайное распределение событий вставка/делеция должно свидетельствовать о существовании обратной связи генов сомы и зародышевой линии. И мы нашли это свидетельство не только в своих данных, полученных на мышах, но и во всех других семействах V-генов зародышевой линии позвоночных. Такое неслучайное распределение рекомбинационных ошибок точно соответствует предсказаниям модели «от сомы к зародышевой линии». На этом уровне наших знаний, по крайней мере для эволюционной генетики V-элементов зародышевой линии, мы не знаем иного объяснения наблюдаемой картине (кроме обращения к разумному манипулятору генами, или божественному вмешательству, а для этого нет оснований!).

Недавно мы начали разрабатывать другой подход к более точной идентификации рекомбинационных сайтов в V-генах зародышевой линии и, таким образом, к «более аккуратному» изучению следов интеграции сомы в зародышевую линию. Мы объединились с Джоржем Уайлером (Weiller) из Школы биологических исследований при Австралийском национальном университете. Джордж разработал новый способ определения сайтов рекомбинации в генных последовательностях, эффективность которого доказана на известных бактериальных ДНК-последовательностях. Поэтому мы могли точно локализовать сайты рекомбинации в коллекции последовательностей V-генов зародышевой линии. Результаты этой работы четко показывают, что рекомбинация в V-генах зародышевой линии происходит в местах, предсказанных теорией встраивания кДНК (обратных транскриптов), возникающей из несплайсированных или сплайсированных про-мРНК соматических L-V(D)J-генов. Таким образом, в зародышевой ДНК мы находим следы интеграции, которые согласуются с «печатью процессинга» соматической РНК. Этот потрясающий результат невозможно логично интерпретировать с позиций традиционных неодарвини-стских взглядов, но они полностью согласуются с предсказаниями теории соматического отбора.

 

Отступление: Комета Шумейкер Леви 9

Полезной аналогией, которая поможет нам пояснить идею следов интеграции, могут служить размер и форма кратеров на поверхности Луны и других тел Солнечной системы (включая и поверхность Земли), которые считаются результатом падения метеоритов и астероидов. У нас нет сомнений в том, что они были вызваны падениями метеоритов, астероидов или комет в прошлом. Мы даже можем по размерам кратера оценить массу и размеры этих болидов. Для земных и лунных кратеров геологи и астрономы могут также оценить время, когда произошло столкновение. Мы не сомневаемся в причинах, хотя сами редко бываем свидетелями подобных столкновений. Однако в июле 1994 г. мы получили драматические доказательства силы таких вторжений. Мы видели по телевидению (благодаря космическому кораблю «Галилей») падение 21 фрагмента кометы Шумейкер Леви 9 на поверхность Юпитера. Следовательно, с помощью видеозаписи человечество стало свидетелем события, которое может приводить к образованию кратеров на поверхности планет солнечной системы и их спутников. Шестьдесят пять миллионов лет назад болид диаметром примерно 10 километров образовал огромный кратер диаметром примерно 330 километров недалеко от полуострова Юкатан в Мексике.

Однако эта аналогия с кратерами, вызванными падением метеоритов или комет, неполная. Мы не можем точно оценить, как часто и когда происходили «генетические столкновения сомы и зародышевой линии». Данные о современных ДНК-последовательностях V-генов иммуноглобулинов свидетельствуют о том, что они происходили со значительной частотой в эволюционном прошлом, так как оставили отчетливый след в виде неслучайного распределения последовательностей, которое отличается от случайного фонового мутационного «шума». Более того, у разных видов позвоночных наблюдаются разные картины неслучайных последовательностей, а это означает, что столкновения сомы и зародышевой линии происходили много раз после дивергенции этих видов от общего предка.

 

Эволюционная значимость обратной связи сомы и зародышевой линии

Сейчас мы попытаемся ответить на вопрос, поставленный в конце главы 4. Поскольку иммунная система ныне живущих позвоночных, по-видимому, хорошо приспособлена к ответу на неожиданные антигены, есть ли сейчас нужда в обратной связи сомы и зародышевой линии? Для ответа на этот вопрос рассмотрим вероятные события в эволюции позвоночных, которые привели к появлению генов антител. Мы считаем, что, рассмотрев все известные генетические данные, можно дать следующее простейшее объяснение эволюции V-генов антител.

• Первым шагом было появление в зародышевой линии позвоночных небольшого числа вариабельных генов. Это произошло во время Кембрийского «взрыва» примерно 550-500 миллионов лет назад. Набор тесно сцепленных, хотя и различных генов мог возникнуть только в результате удвоения одного исходного гена и последующих мутационных изменений в образовавшихся дупликациях. Считается, что дуп-ликации генов появляются вследствие неравного кроссин-говера. Он происходит у организмов, размножающихся половым путем, в ходе мейоза, приводящего к образованию гамет (яйцеклеток и сперматозоидов) с гаплоидньш набором хромосом. Повторные дупликации и последующие мутации приводят к образованию рядов тесно сцепленных генов (тандемов) [15].-

• Затем, должен был существовать интенсивный отбор в пользу тех организмов, которые способны к соматическому ги-пермутированию V-генов. Это позволяло создавать большой репертуар антител для борьбы с инфекционными заболеваниями быстрее, чем медленно мутирующий небольшой набор генов зародышевой линии.

• Кроме того, должно было существовать давление отбора на увеличение репертуара V-генов зародышевой линии. Случайные мутации в половых клетках и последующий естественный отбор были бы чрезвычайно медленным способом построения такого репертуара. Кроме того, как мы уже обсуждали, эволюция гетеродимерных антигенсвязывающих центров антител и сегментация генов зародышевой линии, требующая соматической перестройки последовательностей ДНК, заметно ослабляют скорость отбора V-генов зародышевой линии. Каждое изменение структуры V-гена зародышевой линии требовало бы также образования нового репертуара генов. В этих условиях обратная связь успешных функциональных му-тантных последовательностей V-генов сомы и зародышевой линии давала бы большие селективные преимущества.

Нужно ли соматическое мутирование современным позвоночным? Конечно, соматическое гипермутирование можно продемонстрировать экспериментально. Однако в некоторых экспериментах с инбредными мышами и патогенными вирусами (гл. 3) показано, что в ходе антивирусного ответа соматические мутации или не происходят, или, если происходят, ничего не добавляют к иммунному ответу. В самом деле, в настоящее время соматическое гипермутирование само по себе кажется почти неуместным. Существующее в зародышевой линии разнообразие генетических элементов, кодирующих тяжелые и легкие цепи антител, и комбинаторные возможности соматических клеток, которые обеспечивают быстрое образование большого репертуара антител, достаточны для ответа на неожиданности. Поэтому у ныне живущих позвоночных соматическое гипермутирование, должно быть, излишне. Тем не менее, возможно, оно до сих пор дает селективное преимущество как источник новых успешных открытых рамок считывания, возвращающихся в зародышевую линию. Его действие может уменьшать вредный эффект случайного генетического дрейфа, который потенциально направлен на уменьшение репертуара V-генов зародышевой линии в результате появления стоп-кодонов в кодирующих участках из-за точковых мутаций или вставок/потерь нуклеотидов. Короче, роль обратной связи сомы и зародышевой линии у современных позвоночных, возможно, состоит в «генетическом домашнем хозяйстве»: она поддерживает открытые рамки считывания в тандемном наборе V-генов зародышевой линии.

 

Проницаемость барьера Вейсмана

Можно предположить несколько путей, какими соматическая генетическая информация могла бы попасть в зародышевую линию. Один — с помощью прототипных эндогенных ретровирус-ных векторов. Другой путь, предложенный Гарри Ротенфлу, состоит в том, что долгоживущие В-лимфоциты памяти проникают в репродуктивные ткани и иногда передают новые последовательности V-генов прямо в сперматозоиды и яйцеклетки. Но оба способа должны включать этап обратной транскрипции. Эта проблема является предметом исследований в наших лабораториях. Они включают комплекс экспериментов, в которых надо собрать и проанализировать огромную информацию о последовательностях ДНК. При современных возможностях результатов может не быть много лет. Однако прогресс все-таки есть, особенно за последние десять лет, и нет никаких причин считать, что дальнейшие исследования не будут плодотворными. Мы собираемся действовать на два фронта одновременно. Первый — это выяснение механизма соматического гипермути-рования, так как этот процесс может быть логически связан с обратной связью сомы и зародышевой линии. Вторая наша задача — сконструировать генетически модифицированных мышей, с помощью которых можно будет продемонстрировать генетическое столкновение сомы и зародышевой линии в настоящее время. Уже существуют линии трансгенных мышей, у которых экспрессируется небольшой набор V-, D-, J-, и С-элементов тяжелых и легких цепей человека; генетическая «операция» у таких мышей (удаление существенных ДНК-последовательностей) приведет к тому, что «свои» гены Ig-локуса не смогут экспрессироваться. У этих мышей при иммунизации антигеном будут синтезироваться и подвергаться соматическому гипермутированию только человеческие антитела. Проверка тандемного набора мышиных V-генов зародышевой линии у потомков иммунизированных родителей могла бы обнаружить свидетельства интеграции человеческих последовательностей V-генов.