Искусство различать мелкие объекты в сплошной массе фрагментов ДНК-последовательностей развивается сейчас очень быстро. В июле 2014 года о новом исследовании массива данных, полученных при анализе образцов человеческого микробиома, стало известно всему миру; оно позволило обнаружить в экскрементах человека неведомый нам прежде бактериальный вирус.

В чем же тут сенсация? Главным образом в том, насколько распространенным он оказался. Его выявили в трех четвертях исследованных проб – из Европы, Кореи и Японии. Выяснилось, что именно ему принадлежит примерно четвертая часть всех вирусных ДНК в микробиомах некоторых людей.

Статья об этом исследовании, проведенном научной группой из Университета Сан-Диего, лишний раз напомнила, как мало мы знаем о нашем микробиоме. Мы неплохо представляем себе, какие грибы живут на человеке и сколько на нем обитает эукариот. За последнее десятилетие мы разгадали много загадок нашей бактериальной популяции. Но сейчас мы лишь начинаем по-настоящему оценивать то, что может оказаться столь же важной, как и бактерии, частью общей картины, – вирусы.

 

Наша собственная темная материя

Джонатан Свифт, этот великий сатирик, кое-что знал о биологии уже в XVIII столетии. В его стихотворном сатирическом трактате «О поэзии. Рапсодия» имеется обаятельный отрывок, даже ставший популярным детским стишком:

На клеточном уровне эти «более мелкие блохи» – кусочки жизни, которые мы именуем вирусами. У бактерий тоже есть вирусы. Наряду с потоком новой информации о бактериях в научный оборот поступает и более скромный ручеек результатов, которые позволяют нам постепенно осознавать новый сложный слой микробиоты (а значит, и нашего суперорганизма), внося коррективы в наши представления о том, как она себя ведет и как эволюционировала.

Вирусы – скорее паразиты, чем симбионты. Они состоят из маленьких геномов в простенькой оболочке, и для размножения им требуются живые клетки. Вирусы, которые используют для этого бактерии, называются бактериофагами (или просто фагами). Название происходит от греческого phagein («пожирать»), но если вы посмотрите на них под микроскопом, то увидите, что они не едят путем окутывания собой: нет, они внедряются в бактериальные клетки, а потом заставляют их лопаться, едва те наполнятся новыми вирусными частицами.

Подобно клеточной жизни, вирусы присутствуют повсюду и в гораздо большем количестве, чем нам казалось раньше. Недавние открытия, касающиеся числа морских вирусов, заставили пересмотреть оценку их количества в сторону резкого увеличения. Вплоть до конца XX века считалось, что вирусы попадают в море из рек и канализационных стоков. Теперь мы знаем, что в каждом литре океанской воды содержится 100 миллиардов вирусов. А значит, общее число вирусов в биосфере в 10 миллионов раз больше, чем количество звезд в наблюдаемой части Вселенной. Неплохой объем биомассы! Если собрать вирусы из всех океанов, в совокупности они будут весить столько же, сколько 75 миллионов синих китов.

В биологии можно применять приблизительное правило: бактериофагов в каждой данной среде обитания примерно в десять раз больше, чем бактериальных клеток. Похоже, это относится и к человеческому кишечнику. Если учесть, скольким бактериям мы даем приют, нетрудно понять, что речь идет, мягко говоря, об очень большом количестве вирусов. Один из первых намеков на их разнообразие появился в 2003 году: в одном-единственном образце человеческого кала выявили более 1300 вирусных генотипов. Большинство из них принадлежало бактериофагам, которых никто никогда раньше не видел.

Сегодня известно, что один грамм фекалий содержит от 10 до 100 миллиардов бактериофагов. Это очередная новая оценка, вынуждающая меня задуматься над тем, каково было ученым в те времена, когда наука стала утверждать, что мир простирается дальше, чем людям казалось прежде. Взять хотя бы открытие геологического «глубокого времени», когда перед жителями Викторианской эпохи, заглянувшими в прошлое, вдруг разверзлась неведомая прежде хронологическая бездна в сотни миллионов лет. Теперь же мы можем после опорожнения кишечника заглянуть в унитаз и подумать о том, что в нем, вероятно, присутствуют миллиарды бактериофагов, которые совсем недавно, всего несколько наших мышечных сокращений назад, поджидали случая размножиться внутри бактерий, обитающих у нас в толстой кишке.

Вирусы перехватывают управление вырабатывающей белки аппаратурой клетки-хозяина, так что рибосомы им не требуются. А значит, не существует вирусной 16S РНК и соответствующего быстрого метода идентификации типов вирусов, имеющихся в образце. Исследователи вынуждены прибегать к более сложным, масштабным и утомительным процедурам, секвенируя миллионы кусков ДНК и пытаясь выяснить, какие из них вирусного происхождения. Поскольку большинство выявляемых сегодня вирусов ученые никогда не наблюдали раньше, работа во многом идет наугад. В ходе некоторых исследований образцы предварительно очищают от бактериальных и человеческих клеток, а также от того, что похоже на невирусные ДНК-цепочки. Затем секвенируют то, что осталось. Вероятно, при этом теряется порядочная часть вирусной ДНК. Как всегда, есть альтернативный путь: запустить умные машины и секвенировать вообще всю ДНК, содержащуюся в образце. Так мы избежим потерь материала, зато доведем до максимума количество последовательностей, соответствия которым неизвестны.

Наши знания о мириадах вирусов (разделяющих с микробами все уголки тела, где те обитают) остаются отрывочными, но они быстро пополняются и расширяются. Простой отбор проб и простое секвенирование дают массу результатов, которые трудно интерпретировать без общего представления об изучаемой популяции. Такое представление должно быть динамическим, поскольку вирусные популяции (так же, как и гены индивидуальных видов вирусов) способны быстро меняться. Сейчас, в начале пути, уже есть указания на то, что наши индивидуальные виромы отличаются даже сильнее, чем бактериальные популяции, которые мы несем в себе и на себе. Пробы, взятые у разных людей, могут давать почти не перекрывающиеся вирусные профили. Может оказаться, что не существует никакого «постоянного вирома» – иными словами, набора вирусов или вирусных генов, которые обычно всегда находятся где-то в нашем организме, какие бы дополнительные формирования ни укрепляли эту армию. Генетические подробности вирусов известны так мало, что некоторые ученые даже заговорили о «биологической темной материи». Концепцию темной, невидимой, необнаруживаемой материи космологи придумали, чтобы как-то объяснить некоторые наблюдаемые во Вселенной гравитационные взаимодействия. Впрочем, вирусная темная материя не является невидимой или необнаруживаемой, просто ее необычайно трудно заметить. Еще одну метафору предложила в 2013 году группа ученых из Брайтонского университета: существует множество «подсознательных» вирусных последовательностей. Обычно они проявляют себя очень слабо и почти не различимы, но при помощи подходящих инструментов их все же можно анализировать. Кроме того, более ранние исследования позволили вывести о таких вирусах несколько общих умозаключений, в которых ученые более или менее уверены. Некоторой ясности удалось добиться при подробнейшем изучении отдельных бактериофагов, особенно тех, что заражают собой все ту же бактерию E. coli – известную любимицу генетиков. Малый размер генома и стремительное размножение вирусов позволяют проводить на них быстрые и иногда сравнительно простые эксперименты. Самая первая полная геномная последовательность, опубликованная еще в 1977 году, представляла собой маленькое замкнутое кольцо ДНК бактериофага phiX174. В нем содержится 5300 нуклеотидных оснований, кодирующих всего 11 белков. Между прочим, в 2003 году тот же крошечный геном удалось соорудить искусственным путем в лаборатории Крейга Вентера. Так что phiX174 уж точно обеспечено место в истории.

Однако нам нужно знать, как и что работает в безбрежном океане вирусов. А для этого мало собрать один-единственный бактериофаг. Незаменимую помощь оказывает здесь современная молекулярная генетика, недавно показавшая, как вирусы, в том числе обитающие в нас постоянно, взаимодействуют с другими организмами.

 

Вирусы делают гены подвижными

Бактерии и их многочисленные вирусы совместно эволюционируют вот уже миллиарды лет. Каждый бактериофаг умеет распознавать специфическую для себя цель на поверхности бактерии. Обычно он нацелен лишь на один вид бактерий. В бактериальных видах и их вирусах постоянно происходят небольшие изменения, которые влияют на это взаимодействие. Бактериофаг меняется быстрее, чем бактерия, поскольку у него выше скорость размножения, а зачастую и скорость мутации. И в самом деле, вирусы, судя по всему, очень глубоко вовлечены в эволюцию не только бактерий, но и других организмов.

У бактериофагов есть два основных пути использования бактерий. Они могут вторгнуться в клетку, переключить механизмы, которые в ней уже имеются, на производство миллионов своих копий, а когда клетка под их напором лопнет, найти себе другую мишень-жертву. Или же они могут действовать в скрытом режиме: вирусный геном копируется в ДНК клетки-хозяина и проходит репликацию вместе с бактериальной хромосомой каждый раз, когда микроб делится. К плану А вирус возвращается, лишь когда для бактерии наступают тяжелые времена и ее размножение оказывается под угрозой. Тогда происходит массовое размножение вируса, клетка гибнет, и фаг отправляется искать новое временное пристанище. До этого бактерия и бактериофаг мирно сосуществуют. Иными словами, у наших бактериальных симбионтов есть собственные симбионты.

Эта несколько пугающая способность вирусов встраивать свою ДНК в клетку-хозяина оставила следы в геномах всех организмов, которые мы изучили, – не только бактерий, но и эукариот. Ретровирусы (немаловажный класс вирусов, куда входит и ВИЧ) получили такое название, поскольку сохраняют в себе генетическую информацию РНК – молекулярной кузины ДНК, а эту информацию можно копировать на ДНК при помощи фермента, именуемого обратной транскриптазой («ретро» в нашем сознании соотносится с прошлым, с движением вспять, с чем-то «обратным»). Так называемые эндогенные ретровирусы представляют собой фрагменты хромосомной ДНК, скопированные из вирусов, которые обычно несут свои гены на РНК. Подобные фрагменты рассеяны по всему человеческому геному и составляют примерно 8 % общего количества нашей ДНК. Впрочем, некоторые могут иметь не вирусное, а иное происхождение, ибо существует еще один принципиально важный эволюционный механизм, вызывающий появление сходного фрагмента генома.

Как выясняется, многие гены содержат последовательности, которые позволяют им полностью или частично копироваться и затем встраиваться в какой-то другой участок. Эти прыгающие гены, или транспозоны, естественным путем проделывают то, что генные инженеры делают в лаборатории, – перемещают ДНК из одного места в другое, в некоторых случаях при посредничестве РНК, которая затем копируется обратно в ДНК при помощи обратной транскриптазы, прославившейся в истории молекулярной биологии благодаря тому, что в свое время позволила разрушить устоявшуюся «центральную догму», утверждавшую, что генетическая информация всегда движется лишь в одном направлении – от ДНК к РНК и затем к белку. Мы не можем воспроизвести эволюционную историю фрагментов ДНК, однако вполне вероятно, что некоторые ретровирусы появились именно так: фрагмент ДНК копировался в РНК, отделялся и затем оказывался в биосферном генетическом супе в качестве свободно плавающего репликатора.

Все эти передвижения генов и фрагменты, которые в результате образуются, коренным образом изменили представления о биологических видах и их эволюции. Оказалось, что гены перемещаются между организмами с гораздо большей легкостью и гораздо чаще, чем нам казалось.

Подобные генетические обмены начались еще на заре эволюции у бактерий и их многочисленных вирусов. Эти процессы (обмены между бактериями, между вирусами, между бактериями и вирусами) происходят до сих пор. Вот почему вполне обоснованно считать содержимое толстой кишки единым генетическим варевом. При столь бурном обмене генами уже не так важно, какие конкретные объекты (бактерии или вирусы) присутствуют в смеси.

 

Ищите и обрящете

Сегодня мы обнаруживаем вирусы (свободные или находящиеся внутри генетических наборов других клеток) повсюду, куда ни взглянем. Из вирома наверняка удастся извлечь гораздо больше информации, чем из микробиома. Уже сейчас понятно, что эти примитивнейшие участники экосистемы поддерживают немаловажные взаимодействия с остальными ее компонентами. Это не значит, что нет вирусов, которые просто проникали бы в нам в организм и проходили сквозь его системы, ничего особенного не совершив. Одно из первых исследований в этой области, проведенное в 2006 году, показало, что в каждом грамме проанализированных человеческих фекалий содержится миллиард РНК-вирусов. Впрочем, большинство из них принадлежало не к числу долговременных жильцов кишечника, а к числу вирусов растительного происхождения, лишь проходящих через организм. Обильнее всего в этой пробе оказался представлен так называемый «вирус слабой крапчатости перца», причем он сохранил инфекционные свойства. Представьте: вы съедаете салат, ваша пищеварительная система обрабатывает поступившую в нее растительность, и на выходе обнаруживается целехонький вирус, по-прежнему способный вызывать болезнь (в данном случае – у растений). Невинный вирус? Не обязательно. Дальнейшие исследования заставляют предположить, что этот вирус вызывает лихорадку и боли в брюшной полости, так что реакция на острое мясо может на самом деле быть реакцией на вирус растительного происхождения.

Если данный растительный вирус действительно вызывает у едока дискомфорт, то это, по-видимому, проявление простого иммунного отклика. Долговременные обитатели нашей микробиоты постоянно вовлечены в гораздо более изощренную систему биокомпромиссов. Подобное можно выявить и на других биологических уровнях.

Как вирусы, так и бактерии пытаются блюсти собственные интересы, в самом узком смысле меняясь так, чтобы максимизировать свои шансы на выживание и успешное размножение. Иногда это приводит к конкуренции, иногда к кооперации. В особых случаях могут затрагиваться наши собственные интересы, принося нам пользу или вред.

К примеру, вирусы часто перемещают гены от одной бактерии к другой. Есть убедительные доказательства того, что так переносятся между различными штаммами гены устойчивости к антибиотикам.

Дэвид Прайд из Стэнфордского университета, одним из первых исследовавший на данный предмет человеческую слюну (в одном миллилитре нередко содержится около 100 миллионов вирусных частиц), показал, что бактериофаги здесь обладают необычно высокой долей генов невосприимчивости к антибиотикам. Как он предполагает, эти фаги служат своего рода хранилищем для таких генов, поскольку полдюжины добровольцев, предоставивших ему образцы собственной слюны, в последнее время не принимали никаких антибиотиков.

Связь между бактериофагами и устойчивостью к антибиотикам подтверждается опытами на мышах. Соберите мышиный помет до и после введения грызунам антибиотиков. Затем секвенируйте все бактериофаговые ДНК, какие сумеете найти. Оказывается, антибиотики вызывают формирование бактериофаговых геномов, обогащенных генами устойчивости к антибиотикам. Способность мельчайших организмов, находящихся под давлением жесткого отбора, обмениваться генами напоминает проявление разума. Есть в этом что-то жутковатое и сверхъестественное. Геномы бактериофагов после лечения обогащены генами, которые помогают бактериям сопротивляться воздействию введенных лекарств. Что еще удивительнее – в таких геномах обнаруживаются гены, способствующие устойчивости к воздействию антибиотиков, с которыми эти мыши (и их кишечные микробиомы) на самом деле никогда не сталкивались.

Похоже, теперь мы можем по-новому отнестись к изощренным реакциям микробиоты на наши собственные простенькие антибактериальные средства. Это подтверждается еще одной недавней находкой. Обнаружилось, что прием лекарственных препаратов может укреплять сети обмена генами между бактериями и фагами, затрагивая целый ряд других генов, влияющих на рост бактерий и колонизацию ими организма-хозяина. Складывается впечатление, что бактерия, подвергшаяся атаке антибиотика, устраивает набеги на геномы бактериофагов в поисках средств защиты. Иными словами, она использует фаги как своего рода хранилища генов, откуда черпает материал, чтобы ее питание и метаболизм становились эффективнее.

С другой стороны, некоторые бактериофаги сами могут являться сложнейшими орудиями для нападения на бактерий. С самого открытия бактериофагов ученые время от времени предпринимают попытки использовать их как антибактериальных агентов. С приходом антибиотиков эти усилия постепенно сошли на нет, но интерес к таким исследованиям вновь разгорается в наши дни, когда невосприимчивость бактерий к антибиотикам стала распространенным явлением.

Между тем бактерии всю свою эволюционную историю подвергались воздействию бактериофагов. Наши собственные внутренние договоры с бактериями используют этот факт. Самое любопытное на данный момент открытие, касающееся фагов в нашем кишечнике, дает представление о том, где они стремятся концентрироваться. Оказывается, их гораздо больше в слизи, покрывающей эпителий кишечника, чем где-либо еще. Подробные исследования вирусных геномов объясняют причину. Дело в том, что бактериофаги способны связываться с компонентами слизи.

Обитающие здесь фаги мирно сосуществуют с бактериальным штаммом-хозяином. Они размножаются вместе с бактерией, встраиваясь в ее геном, при этом атакуют те бактерии, которые конкурируют с хозяином. Это выглядит как ингибирование бактериальной колонизации поверхности, покрытой слизью. Простые эксперименты с единичным штаммом бактериофага подтверждают эту идею. Возможно, данный эффект удастся применить для изменения состава бактериальных популяций. В белках бактериофагов имеются участки, постоянно меняющиеся из-за мутаций бактериофаговых генов, и состав слизи быстро обновляется. Так конкуренция между фагами и бактериальными штаммами привела к возникновению (в ходе их совместной эволюции) ниши, помогающей усиливать способность организма-хозяина (то есть, в данном случае, человека) держать свои бактерии в узде.

Ученые получают все больше данных, свидетельствующих о том, что фаги могут вовлекаться в соперничество между бактериями. Вот один пример. Enterococcus faecalis – широко распространенная кишечная бактерия с весьма многообразными штаммами. Подобно другим бактериям, она может встраивать фаги в свой геном. Штаммы, населенные фагами, выбрасывают их наружу, чтобы сокращать численность конкурентов (при колонизации безмикробных мышей). Совместная работа с фагами дает бактериям конкурентное преимущество при монополизировании богатой питательными веществами среды, где они внезапно оказались.

Подобного рода взаимодействия между популяциями и субпопуляциями бактерий и бактериофагов, по-видимому, постоянно происходят в кишечнике, особенно в толстой кишке, где плотность населения особенно высока. Большинство таких взаимодействий до самого последнего времени оставалось непостижимым. Как показывает открытие одного совершенно нового для нас, но вездесущего бактериофага, мы пока не знаем всех фагов, которые могут находиться в микробиоме, не говоря уж об их функциях.

Этот свежеоткрытый бактериофаг, привлекший внимание ученых всего мира в 2014 году, удалось идентифицировать, прочесывая ДНК-последовательности в поисках вирусов при помощи новой компьютерной методики. Эта хитроумная программа отмечала ДНК-фрагменты с высокой вероятностью того, что они имеют вирусное происхождение, а затем объединяла их при помощи перекрывающихся участков последовательности. Так удалось собрать новый, неизвестный прежде бактериофаговый геном. Однако бактериофаг без бактерии – лишь бездомный кусок ДНК, прячущийся в белковой оболочке. Данный анализ показал также, с какими типами бактериальной ДНК обычно появляются эти фрагменты бактериофага.

Это позволило исследователям предположить, что их новый фаг (названный crAssphage, от cross-assembly – «перекрестная сборка»; так именуется компьютерная методика, позволившая выявить его геном) инфицирует собой какой-то из видов Bacteroides – одного из бактериальных родов, обычно в изобилии представленных среди кишечной микрофлоры и играющих немалую роль при исследовании ожирения. Таким путем можно было бы показать, что какой-то фаг, воздействующий на целый ряд Bacteroides или даже позволяющий им приобретать новые гены, непременно должен участвовать во всевозможных метаболических и иммунных процессах, имеющих стратегическое значение для человеческого организма.

 

Эволюция продолжается – в вашем собственном кишечнике

Четко вписать вирусы (в том числе и бактериофаги) в общую картину человеческого микробиома – задача для ученых будущего. Предварительные изыскания показывают, какая огромная работа им предстоит.

Однако если даровать вирусам статус живых существ, то можно считать, что виромные исследования уже сейчас выявили еще одну удивительную вещь: в нашем кишечнике идет эволюция и возникают новые виды. Пионерские исследования в этой области, проводимые под руководством Сэмюэла Майнора – постдока из лаборатории Фредерика Бушмана (Пенсильванский университет), включали в себя и некоторые попытки оценить, насколько стабильным может быть виром отдельного человека. Для этого в течение 2,5 лет исследовали состав кала одного добровольца.

Регулярный ДНК-анализ вирусных генов показал, что большинство типов вирусов, населявших кишечник испытуемого в начале эксперимента, пребывало там и 30 месяцев спустя. И хотя вирусы стремительно размножаются и быстро мутируют, большинство из них остались в общем-то примерно такими же. Большинство, но не все. Одно семейство вирусов, Microviridae, представители которого используют короткий однонитевой фрагмент ДНК для передачи своих генов, мутировало чаще других, и его ДНК-последовательность за эти 2,5 года изменилась на целых 4 %. Некоторые из уже известных нам видов Microviridae отличаются по своим генам на 3 %, так что можно предположить, что здесь имеет место процесс, аналогичный видообразованию. Интересующимся биологией есть над чем поразмыслить. Возникновение новых видов, великий феномен, над которым столько лет бился Дарвин, идет у нас внутри! Новые виды, пусть и мельчайшие из возможных, все время появляются в вашем кишечнике, а возможно, и на других микробиомных участках.

Стремительная эволюция на этом уровне идет на протяжении всего существования человечества, а началась она гораздо раньше, чем появился человек. Темпы нашей собственной эволюции куда скромнее. Порой высказывают мнение, что она и вовсе остановилась. Но человек – единственное существо, которое использует культурную эволюцию как силу, меняющую и природный, и социальный мир. Как мы уже видели, она вносит существенные (и незапланированные) изменения в наш микробиом. А если мы начнем намеренно его менять? Удастся ли нам его усовершенствовать? Пора подумать над тем, куда культурно-цивилизационная эволюция заведет наш суперорганизм в будущем.