В 2010 году Джон Крейг Вентер создал жизнь с нуля. Он и его группа синтезировали полный геном крошечной свободноживущей бактерии, которую они назвали Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0, и перенесли его в клетку-реципиент, из которой предварительно удалили ее собственный геном. Ученые не только соединили вместе все фрагменты, необходимые, чтобы геном функционировал (что он и делал), а клетка размножалась (что она и делала), но и внесли в него своеобразный «водяной знак» – переведенные в генетический код имена исследователей, участвовавших в проекте, чтобы этот синтетический геном можно было отличить от настоящего, на котором он был основан.

Процесс создания жизни Вентер и его группа начали с изучения полной геномной последовательности бактерии Mycoplasma mycoides. Этот оцифрованный геном, представляющий собой не более чем строчки текста, хранящиеся в файле на жестком диске компьютера, стал макетом созданной ими жизни. Они выбрали именно этот бактериальный геном из-за его небольшой длины – немногим более миллиона пар оснований, а также из-за быстрого роста бактерий, которое ускорило эксперимент.

Миллион спаренных оснований – это очень короткий геном, даже для бактерии. Однако недостаточно короткий, чтобы его можно было синтезировать целиком за один раз. При создании цепочек ДНК в лаборатории машины делают это, соединяя в определенном порядке отдельные азотистые основания – А, Г, Ц и Т, из которых образуются целые геномы. Чем длиннее фрагмент, тем больше ошибок будет сделано в процессе синтеза. Если ученые хотят, чтобы бактерия могла выживать и размножаться, искусственный геном должен соответствовать своему макету максимально близко.

Чтобы обойти проблему синтеза длинных фрагментов, группа Вентера разработала четырехэтапный процесс создания полного генома. Вначале они синтезировали, по одному спаренному основанию за раз, 1078 фрагментов ДНК, каждый из которых насчитывал 1080 пар оснований. Это достаточно короткие фрагменты, чтобы их гарантированно можно было синтезировать в лаборатории, но также достаточно длинные, чтобы каждый из них содержал уникальную идентифицирующую его информацию, – это позволяло собрать конечную версию генома в правильном порядке. Затем ученые стали брать по 10 фрагментов, расположенных рядом в шаблонном геноме, за раз и помещать эти небольшие участки в дрожжевые клетки, позволяя внутренним механизмам клеток сшить фрагменты вместе. В результате у них получилось 100 фрагментов бактериальной ДНК, каждый из которых имел около 10 тысяч пар оснований в длину. Затем они склеили эти куски по 10 штук, получив 11 фрагментов, около 100 тысяч пар оснований в длину каждый. Наконец, они сшили вместе и эти 11 фрагментов и получили в результате один бактериальный геном длиной в миллион спаренных оснований. Они изъяли этот геном из дрожжевой клетки и перенесли в бактериальную, где он начал вырабатывать все белки, необходимые ей для жизни. Весь процесс занял 15 лет и обошелся более чем в 40 миллионов долларов.

Создание первой искусственной жизни – поразительное достижение. Однако оно ничуть не приближает нас к возможности создания мамонтов или странствующих голубей. Во-первых, бактерии – прокариоты, то есть у них нет ядра. Поэтому Вентер и его группа смогли пропустить важный этап создания жизни, который никому пока не удалось преодолеть, – им не пришлось собирать геном, состоящий из множества различных хромосом, внутри ядерной мембраны, что пришлось бы сделать при создании эукариотической клетки. Пока кто-нибудь не справится с этой задачей (пристальный взгляд в сторону Института Крейга Вентера), нам не увидеть резвящихся в округе мамонтов или странствующих голубей с полностью синтезированными геномами. Во-вторых, бактериальные геномы имеют небольшую длину. Геном мамонта содержит более 4 миллиардов спаренных оснований. Геномы птиц, как правило, короче, чем у млекопитающих, но все равно обычно включают в себя не меньше миллиарда пар оснований. Не все эти пары содержат гены, отвечающие за синтез белков, но мы до сих пор по-настоящему не знаем, какая часть остального содержимого генома имеет жизненную важность. Еще важнее то, что мы не знаем и, вероятно, так и не сможем узнать полную геномную последовательность какого-либо вымершего вида. Даже если ученые откроют способ синтезировать полную геномную последовательность эукариотического генома внутри клеточного ядра, вполне возможно, что нам никогда не найти шаблон для синтеза.

Давайте поближе присмотримся к мамонту. За прошедшие годы ученые, работающие с древней ДНК, секвенировали миллиарды пар оснований мамонтовой ДНК, выделенной из тысяч костей и других останков этого животного. Фрагменты ДНК, полученные из этих источников, как правило, повреждены и имеют небольшую длину (примерно от 30 до 90 пар оснований), чего и следует ожидать от очень старой ДНК. Возвращаясь к аналогии с пазлом из главы 2, представим, что фрагменты ДНК мамонта – это кусочки пазла, а на крышке коробки нарисован африканский слон. Хотя благодаря сравнению последовательностей митохондриальной ДНК мы знаем, что индийский слон приходится мамонту более близким родственником, чем африканский (рис. 9), на сегодня мы имеем реконструкцию ядерного генома только африканского слона, так что в качестве шаблона можно использовать только его. Кроме того, геном африканского слона известен нам лишь на 80 % или около того, так что картинка на крышке коробки не совсем верна. В сущности, у нас есть миллиарды микроскопических, слегка деформированных кусочков пазла и немного смазанная фотография-подсказка от другой головоломки.

Рис. 9. Эволюционные связи между мамонтами, мастодонтами, а также индийскими и африканскими слонами, основанные на изучении ископаемых останков и последовательностей митохондриальной ДНК этих животных

Проще всего будет соединить те кусочки пазла, которые относятся к наиболее сохранившимся участкам генома. Это части генома, общие или почти общие для мамонтов и современных слонов, да и всех видов млекопитающих. Мы наверняка справимся и с кусочками, относящимися к тем частям генома, в которых мамонты и африканские слоны похожи, хотя и не полностью идентичны. Сложнее всего будет собрать фрагменты, принадлежащие областям генома, в которых различия между мамонтами и африканскими слонами очень велики. Такие расхождения могут быть следствием перестановки или даже удвоения или исчезновения генов.

В книге «Парк юрского периода» ученые заполнили пробелы в геноме динозавра – на месте фрагментов, которые они не смогли секвенировать, – с помощью ДНК лягушки. Точно так же мы можем решить эту проблему, просто заполнив недостающие участки при помощи ДНК слона. Но вряд ли это хорошая идея. Общий предок мамонтов, индийских слонов и африканских слонов жил на Земле около 4 миллионов лет назад. Это значит, что мамонта отделяет от индийского и африканского слонов более 8 миллионов лет эволюционных изменений – достаточно длинный промежуток, чтобы успели накопиться эволюционные различия. Одними из самых трудных в сборке будут те области генома мамонта, которые подверглись изменениям после точки расхождения мамонтов и других видов слонов. Вероятно, эти участки будут относиться к наиболее важным областям генома, которые потребуется изменить, чтобы получить слона, выглядящего и ведущего себя как мамонт, а не как слон. С точки зрения возрождения вымершего вида узнать правильную последовательность нуклеотидов в этих областях генома будет важнее всего.

В случае геномов живых видов лучший способ собрать эти наиболее каверзные участки заключается в том, чтобы секвенировать очень длинные фрагменты ДНК. Под «длинными» я имею в виду участки длиной в тысячи и сотни тысяч спаренных оснований. Сделать это сложно, и на попытки каждый год уходят огромные деньги. К сожалению, длинные цепочки древней ДНК не сохраняются: большинство наших фрагментов содержат менее сотни спаренных оснований, а зачастую и намного меньше. Так что даже если в ближайшие несколько лет у нас произойдет технологический прорыв, позволяющий секвенировать очень длинные участки ДНК, это не принесет особой пользы для возрождения вымерших видов.

Хорошая новость заключается в том, что стоимость секвенирования ДНК продолжает снижаться, а значит, мы можем создавать все больше и больше цепочек ДНК каждого нашего древнего образца, не разоряясь при этом до основания. Кроме того, мы совершенствуем способы выделения ДНК из окаменелостей. Несмотря на то что эти фрагменты будут короткими, их количество может увеличиться. Кроме того, если нам повезет, мы найдем древние образцы (к примеру, сохранившиеся в замерзшей арктической почве), содержащие много сотен спаренных оснований, – хотя крайне маловероятно, чтобы нам удалось обнаружить фрагменты длиной в тысячи или сотни тысяч спаренных оснований. Наконец, совершенствуются вычислительные методы, используемые для соединения фрагментов ДНК при отсутствии близкородственного шаблонного генома, что позволит нам получить более качественные сборки древних геномов все более разнообразных видов.

Правда, однако, заключается в том, что ни один геном млекопитающего еще не был секвенирован полностью. Это касается и человеческого генома, хотя появившиеся более 10 лет назад восторженные заявления определенно указывают на обратное. Правда заключается в том, что отдельные участки человеческого генома до сих пор не были секвенированы, и их нельзя секвенировать ни одним из существующих способов.

Геном состоит из двух компонентов: эухроматина – компонента, содержащего гены, и гетерохроматина – очень плотного компонента, состоящего из повторяющихся фрагментов. В эухроматической части человеческого генома все еще присутствует несколько очень маленьких несеквенированных промежутков, но на них приходится менее 1 % генома. Вторая, более крупная недостающая часть относится к гетерохроматическим участкам. Гетерохроматин составляет около 20 % человеческого генома, и поскольку он содержит множество повторяющихся фрагментов, это наиболее сложная для секвенирования часть человеческого (и вообще любого) генома. Гетерохроматин, вероятно, играет важную роль в регуляции экспрессии генов, направляя сегрегацию хромосом во время деления клетки и определяя, где разные хромосомы должны находиться в ядре. Но поскольку с помощью существующих технологий секвенировать его очень трудно, мы знаем о гетерохроматине намного меньше, чем о эухроматической части генома.

Секвенировать гетерохроматин из древнего образца будет не легче, чем в случае живого человека. На самом деле секвенировать гетерохроматин из образца, находящегося в плохом состоянии, скорее всего, окажется намного сложнее, чем из образцов тканей живых организмов, вследствие фрагментации древней ДНК. Станет ли это серьезным препятствием на пути к возрождению вымерших видов, еще предстоит выяснить.

Поскольку нам не удастся узнать полную геномную последовательность вымершего вида, синтезировать геном целиком с нуля при возрождении вымершего вида не получится, даже если у нас появится возможность воссоздать искусственную эукариотическую жизнь. Но я совершенно уверена, что синтетическая биология – это действительно способ возродить вымершие виды и исчезнувшие признаки. Пусть нам не удастся создать целый геном, но ведь мы можем синтезировать фрагменты ДНК. Что, если мы используем эти фрагменты, чтобы вернуть вымершие виды к жизни путем редактирования генома?

 

Вырезать и вставить мамонта

Джордж Чёрч – преподаватель генетики в Гарвардской медицинской школе и ведущий участник еще одного проекта по возрождению мамонта. Этот проект заметно отличается от тех, организаторы которых рассчитывают обнаружить нетронутые клетки в вечной мерзлоте Сибири. Для воскрешения мамонта Джордж использует редактирование генома, которое, как я уже говорила, представляет собой один из двух доступных нам способов восстановления исчезнувших признаков.

Я познакомилась с Джорджем в 2012 году в Институте Висса в Кембридже, штат Массачусетс. Он принимал у себя мини-конференцию, организованную Райаном Феланом и Стюартом Брандом из фонда Long Now в рамках их некоммерческой инициативы Revive & Restore. Формально конференция была посвящена проекту по возрождению странствующего голубя, и, как ученый, чья лаборатория исследования древней ДНК содержит наиболее обширную коллекцию останков странствующих голубей, я тоже получила приглашение. Кроме того, на конференции присутствовали специалисты в области природоохранной биологии, в том числе Ноэль Снайдер из Службы охраны рыбных ресурсов и диких животных США, который посвятил много лет проекту по охране калифорнийского кондора, а также ученые, работающие в сфере биоэтики, к примеру Хэнк Грили, преподаватель права в Стэнфордском университете, специализирующийся на социальных и этических последствиях применения биотехнологий. Обсуждение было напряженным и временами велось на повышенных тонах, но оно принесло огромную пользу: именно на этой мини-конференции я поняла, как именно должно свершиться восстановление вымерших видов.

Джордж Чёрч – один из моих любимых ученых. В мире не так уж много людей, успешно балансирующих на грани гениальности и безумия, и он относится к их числу – возможно, потому, что в его случае первое намного превосходит второе. Джордж Чёрч – один из самых изобретательных умов в области геномики, этот факт лучше всего иллюстрируется исключительно длинными списками проектов в сфере биотехнологий, в которых он участвовал, приводимыми в конце его научных статей и презентаций.

На той встрече в 2012 году Джордж представил свой план возрождения мамонта в качестве примера того, что можно и нужно сделать для возрождения странствующего голубя. План включал использование новой (и совершенно потрясающей) технологии пошагового превращения слоновьего генома в мамонтовый. Этот план в общем виде проще всего представить как вырезание и вставку отдельных фрагментов. Позже я опишу его намного более детально, с техническими подробностями, но пока что изложу основной смысл.

Во-первых, мы берем несколько (или множество) хорошо сохранившихся образцов останков мамонта, выделяем из них ДНК и собираем геном. Затем мы сравниваем этот геном с геномной последовательностью индийского слона и определяем те участки, в которых есть существенные различия. Теперь мы можем построить план дальнейших действий: мы собираемся отредактировать геном слона так, чтобы на этих отдельных участках он стал похож на геном мамонта.

Во-вторых, мы синтезируем цепочки ДНК мамонта, соответствующие тем фрагментам генома, которые хотим изменить. Для этого мы соединяем вместе азотистые основания А, Г, Ц и Т, в качестве образца используя собранную часть генома мамонта. В результате мы получим фрагменты ДНК, которые в дальнейшем нужно будет вставить в геном слона. Эти синтезированные участки могут быть очень короткими (всего несколько пар оснований) или немного длиннее (несколько сотен или даже несколько тысяч пар оснований), но их длина будет существенно меньше длины хромосомы и определенно окажется в пределах наших текущих возможностей в области синтеза ДНК.

В-третьих, мы создаем инструмент (назовем его «молекулярными ножницами»), чтобы находить в точности тот фрагмент генома слона, который мы хотим изменить, и связаться с ним. Существует несколько таких инструментов, ниже я опишу их все.

В-четвертых, мы переносим в ядро слоновьей клетки молекулярные ножницы и синтезированные фрагменты ДНК мамонта. Молекулярные ножницы точно определяют участок генома слона, подлежащий редактированию, связываются с ним и разрезают нить ДНК надвое. Поскольку разрыв ДНК пагубно влияет на клетку, в ходе эволюции появился клеточный механизм, предназначенный специально для починки таких повреждений. Он приходит в действие и ремонтирует поврежденный участок, вставляя на место фрагмента ДНК слона фрагмент ДНК мамонта.

В-пятых, мы оцениваем успешность процедуры с помощью эксперимента, который показывает, происходит ли теперь в клетке экспрессия гена мамонта вместо гена слона. На этом шаге мы можем определить, какие клетки были отредактированы, и затем оценить, как эти изменения повлияли на фенотип клетки (если вообще повлияли).

Наконец, клетки, в которых успешно удалось вырезать и вставить участки генома, используются для создания методом ядерного переноса живых организмов с избирательно отредактированными геномами.

Думаю, можно с уверенностью сказать от лица всех, посетивших конференцию, что нас ошеломило то, насколько реальным и достижимым сделал возрождение вымерших видов Джордж в своей презентации. Его подход показался простым, даже элегантным. Неужели появление живых, дышащих мамонтов и правда возможно в сроки, предложенные профессором Иритани (пусть и другим путем)?

В то время Джордж еще даже не начал работать с ДНК слона. Геном мамонта все еще находился на очень ранней стадии сборки, и, по существу, было не до конца понятно, какие участки слоновьего генома следует редактировать. Геном странствующего голубя также находился в процессе секвенирования, как и геном его ближайшего живого родственника, полосатохвостого голубя, поэтому наши представления о том, что именно мы должны изменить, тоже оставались очень смутными. Но благодаря этой презентации наша цель обрела четкие очертания. Что еще важнее, она оказалась достижимой. Нам не нужно секвенировать полный геном. Нам просто нужно каким-то образом выяснить, какие части генома имеют значение, и секвенировать их.

 

Молекулярные ножницы и ферментный клей

Хотя редактирование генома в описании Джорджа Чёрча выглядит довольно просто, сам процесс (что неудивительно) сопровождается серьезными техническими трудностями. Чтобы добиться успеха, редактирование генома должно быть избирательным. Никому не нужно, чтобы молекулярные ножницы беспорядочно кромсали геном и вставляли в него случайные участки ДНК. Это не только не повлияет желаемым образом на фенотип клетки (или животного, которое получится в результате) – неизбирательный разрыв нитей ДНК пагубно воздействует на клетку. Он вызывает нестабильность генома и зачастую приводит к раку.

Ключом к успешному редактированию генома стало открытие и усовершенствование различных типов программируемых молекулярных ножниц. Этот инструмент позволяет достичь избирательности, то есть возможности резать в тех местах, где нам нужно, и избежать разрезов, приводящих к гибели клетки.

Последние десять лет или около того преимущественно использовались два типа программируемых молекулярных ножниц (рис. 10): нуклеазы «цинковые пальцы», или ZFN (zinc finger nucleases), и нуклеазы TALEN (transcription activator-like effector nucleases – эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции). Нуклеазы ZFN и TALEN похожи в том отношении, что они обе являются гибридными молекулами, состоящими из двух отдельных частей. Первая часть (иногда ее называют «плечом») представлена белком, который опознает часть генома, требующую редактуры, и связывается с ней. Это программируемая часть: каждый «цинковый палец» распознает специфическую последовательность из трех нуклеотидов, а каждый эффектор, подобный активатору транскрипции (TALE), узнает отдельный нуклеотид. «Цинковые пальцы» или TALE объединяются в цепочки синтетическим путем, так что каждое звено опознает специфическую последовательность ДНК. Второй компонент гибридной молекулы – нуклеаза. Именно нуклеаза разрезает нить ДНК. Она присоединяется к одному из концов цепочки из «цинковых пальцев» или TALE. Для того чтобы внести одно изменение, синтезируются две гибридные молекулы: одна находит последовательность ДНК, расположенную перед целевым фрагментом, и связывается с ней, вторая делает то же самое с участком ДНК, расположенным после целевого фрагмента. После того как обе молекулы обнаруживают нужные места в геноме и связываются с ними, нуклеаза делает разрез.

Рис. 10. Нуклеазы «цинковые пальцы» (ZFN) и эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN). Каждый палец в ZFN распознает специфическую последовательность из трех нуклеотидов, в то время как каждый эффектор, подобный активатору транскрипции (TALE), узнает отдельный нуклеотид. Плечи образуются при связывании нуклеаз с распознающими специфическую последовательность «цинковыми пальцами» или TALE, так что их последовательность соответствует геномной последовательности, к которой они должны присоединиться

Сделать разрез в нужном месте – это только первая половина работы. Вторая половина заключается в том, чтобы убедить клетку заменить в процессе починки только что поврежденного фрагмента ДНК слоновью версию участка геномной последовательности на мамонтовую.

В норме обрыв обеих нитей ДНК приводит к гибели клетки. Если же оборвалась только одна, ремонтные механизмы клетки могут восстановить любой недостающий участок, используя в качестве шаблона вторую нить. Если оборвались обе цепочки, не так очевидно, откуда клетка узнает, чем ей заменить утраченную последовательность.

Для решения этой проблемы в процессе эволюции возникло два механизма клеточной репарации. Первый называется гомологической рекомбинацией. Поскольку у каждой хромосомы в клетке существует гомологичная копия (одна хромосома от отца, другая – от матери), одну из них можно использовать в качестве шаблона для исправления ошибок в другой. При гомологической рекомбинации две гомологичные хромосомы выстраиваются друг напротив друга, позволяя механизмам клеточной репарации использовать генетическую последовательность неповрежденной хромосомы как образец для ремонта поврежденного участка. При вырезке и вставке мы пытаемся использовать этот механизм в своих целях. Одновременно мы хотим обмануть клетку, заставив ее вместо гомологичной хромосомы использовать в качестве шаблона синтезированный фрагмент ДНК (в нашем случае участок ДНК мамонта, доставленный в клетку вместе с молекулярными ножницами).

Второй механизм репарации двунитевых разрывов называется негомологичным соединением концов. Для работы этого механизма не требуется наличия гомологичной последовательности в качестве шаблона для репарации участка ДНК, вместо этого оборванные концы просто склеиваются между собой. Это не тот путь, по которому клетка должна пойти, если мы хотим изменить последовательность ДНК, но клетки часто используют такой механизм. Следовательно, одна из оставшихся трудностей заключается в том, чтобы разработать способ контролировать то, какой из механизмов будет задействован для репарации ДНК. Но пока что только часть отредактированных клеток получит новую версию гена, помещенную в нужное место в процессе репарации.

Нуклеазы ZFN и TALEN заслужили право считаться невероятно мощными молекулярными инструментами. Нуклеазы ZFN используются для исправления мутаций, вызывающих генетически обусловленные заболевания у людей, путем прямого редактирования геномной последовательности в стволовых клетках пациента. Эти модифицированные стволовые клетки затем можно пересадить пациенту, и они будут действовать как лекарство. Нуклеазы ZFN используются даже в разработке средства от ВИЧ/СПИД, при этом ген CCR5, кодирующий белок, с помощью которого ВИЧ проникает в Т-лимфоциты, редактируют таким образом, что вирус больше не может его использовать. Редактирование генома также используется для вставки генов устойчивости к гербицидам в геномы кукурузы и табака, а также для изменения коровьего генома таким образом, чтобы у коров вырабатывались человеческие версии различных белков крови и молока.

Применение ZFN и TALEN для редактирования геномов ограничено в основном необходимостью определять для них специфическую цель в геномной последовательности, что оказалось довольно сложно контролировать. При использовании более длинных зондов, созданных путем соединения большего количества «цинковых пальцев» или TALE, увеличивается специфичность, но более длинные белковые молекулы сложнее доставлять в клетку. Кроме того, создание зондов – это сложный процесс, требующий кропотливой работы, и на нее зачастую уходят месяцы и годы проб и ошибок. Со всеми этими проблемами мы уже сталкиваемся при работе с организмами, эксперименты с которыми давно ведутся в лабораториях молекулярной биологии. Если мы решим применить эти методы для восстановления вымерших видов, в экспериментах будут участвовать организмы, геномные последовательности которых нам неизвестны, на которых никогда не проводились исследования в области молекулярной биологии, что дополнительно увеличит сложность работы. Разумеется, эти инструменты для редактирования генома потенциально можно использовать для возрождения вымерших видов. Однако, глубже разобравшись в механизме их работы, мы вынуждены будем спуститься с небес на землю.

 

Возрождение вымерших видов с точки зрения CRISPR

Почти одновременно с нашей встречей в Гарварде появился новый экземпляр в наборе инструментов для редактирования генома. Этот новый инструмент, называемый системой CRISPR-Cas9, был открыт, когда ученые обнаружили его роль в формировании иммунитета у бактерий: вначале система считывает последовательность ДНК патогенного организма, а затем обнаруживает эту последовательность и уничтожает ее. Использование той же системы для редактирования генома имеет два ключевых преимущества по сравнению с ZFN и TALEN. Во-первых, программирование механизма происходит намного быстрее – у нас больше нет нужды соединять в цепочки «цинковые пальцы» и TALE методом проб и ошибок. Во-вторых, можно использовать намного более длинные последовательности, что существенным образом повышает их специфичность. Относительная простота, с которой можно редактировать геном при помощи этой системы, позволяет предположить, что в скором будущем биологию ожидает еще одна революция, подобная той, которая разразилась после изобретения ПЦР.

Вот как это работает. Когда болезнетворный микроорганизм проникает в клетку бактерии или простейшего, его геном опознается клеткой и разрезается на мелкие кусочки. Некоторые из них захватываются в качестве «спейсеров» молекулой, называемой CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats – короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами). Таким образом эти фрагменты патогенных микроорганизмов встраиваются в бактериальный геном и сохраняются для использования в будущем. Чтобы защитить себя от проникающих в нее патогенов, клетка транскрибирует CRISPR и разрезает ее в местах повторов, высвобождая спейсеры, которые, как мы помним, представляют собой участки ДНК болезнетворного микроорганизма. Транскрибированные спейсеры захватываются белками Cas9, которые затем ищут внутри клетки фрагменты ДНК, соответствующие спейсерам, чтобы обнаружить и уничтожить проникшие в клетку патогены.

Чтобы понять, как систему CRISPR-Cas9 можно использовать для редактирования генома, представьте, что, вместо того чтобы захватывать кусочки ДНК патогена и искать с их помощью болезнетворные микроорганизмы, которые могли проникнуть в клетку, молекулы Cas9 связываются с созданным нами участком ДНК и ищут с его помощью ту часть генома, которую мы хотим отредактировать (рис. 11). Этот способ определения специфических участков генома становится все более эффективным и точным. Мы проектируем и синтезируем молекулы CRISPR РНК (или cгРНК), которые представляют собой аналоги соединенных вместе «цинковых пальцев» или TALE, для поиска нужного нам участка генома. Когда cгРНК находит этот участок, Cas9, аналог молекулярных ножниц в ZFN и TALEN, разрезает нить ДНК. После этого начинаются стандартные процессы репарации ДНК и (мы надеемся) наши правки встраиваются в геномную последовательность.

Помимо выигрыша в скорости и специфичности, система CRISPR-Cas9 также позволяет увеличить эффективность процесса, если мы хотим внести множество изменений за один раз. Белок Cas9 и синтезированные cгРНК не связаны между собой физически, и это означает, что в клетку можно доставить сразу много различных cгРНК. Каждая из них будет захвачена белком Cas9 и использована для обнаружения (и разрыва) разных участков генома.

Группа Джорджа Чёрча из Института Висса – одна из лидирующих исследовательских групп, занимающихся усовершенствованием системы CRISPR-Cas9 для использования в геномной инженерии. Большинство людей в его лаборатории обдумывают применение CRISPR в персонализированной медицине или работают над усовершенствованием технологии таким образом, чтобы можно было как вводить в клетку более длинные фрагменты ДНК, так и производить множественные изменения в различных участках генома за один раз.

Рис. 11. CRISPR-Cas9. Ученые синтезируют длинные нити ДНК, соответствующие участку генома, который нужно отредактировать, и с их помощью создают cгРНК (темные цепочки ДНК). Затем их доставляют в клетку вместе с белком Cas9. Попав внутрь клетки, Cas9 захватывает cгРНК, которая направляет весь комплекс к нужному участку генома (светлые цепочки ДНК), а затем Cas9 вырезает его

Но в дальнем темном углу его лаборатории (так это представляется моему воображению) сидит маленькая группа постдоков, чья цель по размеру не уступает мамонту: сами они называют себя воскресителями мамонта. Каждый месяц лаборатории, сотрудничающие с организацией Revive & Restore, проводят телеконференции, чтобы поделиться достижениями активных проектов в области возрождения вымерших видов. Воскресители мамонта с завидным постоянством укладывают всех остальных на обе лопатки. Мы все еще занимаемся сборкой генома странствующего голубя и пытаемся определить, что нам может понадобиться изменить в нем. Они же решили не ждать, когда будет собран геном мамонта, и сразу дали себе команду «полный вперед». Начав с нескольких мутаций, о которых нам уже было известно (а именно с различий в гемоглобине мамонта и слона), и нескольких хороших предположений, они начали прокладывать свой путь к мамонту, орудуя «ножницами» и «клеем».

Текущие планы воскресителей мамонта сравнительно скромны. Когда они начинали работу, у них не было клеток индийского слона, так что они взялись редактировать геном африканского слона внутри клеток африканского слона. Кроме того, пока что они работают с разновидностью клеток кожи (фибробластами), а не со стволовыми клетками, снова же из-за того, что только эти клетки были им доступны. Отдельное направление их исследований посвящено созданию стволовых клеток из фибробластов слона, пока что оно увенчались ограниченным успехом. Из полученных стволовых клеток они собираются создавать клетки различных типов, а затем с их помощью проверять, удалось ли отредактировать геном. Никто еще не обсуждает всерьез возможность на самом деле превратить эти клетки в живого мамонта. Пока что цель заключается в том, чтобы отредактировать геном слона и вырастить клетки, содержащие его измененную версию, в крошечных пластиковых лабораторных планшетах.

Ученые из группы Джорджа Чёрча надеются отредактировать геном африканского слона таким образом, чтобы получить два специфических изменения фенотипа. Во-первых, они внесут все четыре изменения, касающиеся известных нам генов, кодирующих гемоглобин, которые отличаются у мамонта и слона. В результате должны получиться клетки, способные вырабатывать гемоглобин, подобный тому, который содержался в крови мамонта. Если им удастся произвести эти изменения в кроветворных стволовых клетках (тех, которые дифференцируются в различные типы клеток крови), они смогут напрямую измерить способность получившихся эритроцитов к переносу кислорода и выяснить, удалось ли добиться успеха. Они также надеются создать клетки, из которых сможет вырасти «самая густая и роскошная мамонтовая шерсть», как выражается Джордж. Но это более трудная задача, поскольку никто не знает наверняка, какие гены ответственны за густую и роскошную шерсть мамонта и сколько их было. Пока что Джордж довольствуется догадками, основанными на том, какие гены отвечают за шерстяной покров у других видов.

Разумеется, это только начало. Теперь, когда мы выяснили, что исчезнувшие фенотипы можно восстановить путем редактирования генома, используя клетки живущих видов, процесс возрождения вымерших видов начнет набирать обороты. Но какое именно животное получится у нас в результате? Сколько изменений нам придется внести, чтобы мы смогли назвать слона мамонтом? Возможно ли устранить все различия между их геномами? А если нет, то какие изменения нам следует внести?