Tony Kouzarides1 и Shelley L. Berger2

1 The Gurdon Institute, University of Cambridge, United Kingdom

2 The Wistar Institute, Philadelphia, Pensylvania 19104

 

Общее резюме

Гистоны являются строительными блоками нуклеосом, образуя октамерную структуру, которая упаковывает ДНК у эукариот и формирует структуру, известную как хроматин Хроматин, однако, не является однородной структурой, и в последние годы произошел взрыв в наших знаниях о вариациях в структуре хроматина. Это, в свою очередь, углубило наше понимание механизмов, регулирующих геномные матричные процессы, в частности посттрансляционных модификаций гистоновых белков (центральная характеристика этого геномного регулирования). Действительно, существует большое число посттрансляционных модификаций гистонов (HPTMs, histone posttranslational modifications). Они разделяются на две группы. Во-первых, существуют малые химические группы, в том числе ацетилирование, фосфорилирование и метилирование. Во-вторых, имеются гораздо более крупные пептиды, в том числе убиквитинирование и сумоилирование.

Как представляют себе влияние HPTMs на регуляцию и функционирование генома? Обычно рассматриваются три механизма, и полезно держать эти механизмы в голове, поскольку в этой главе представлены обширная информация и данные по истории HPTMs. Во-первых, HPTMs могут каким-то образом влиять на структуру хроматина —например, предотвращая ключевые контакты, облегчающие образование определенных конформаций хроматина или структур более высокого порядка (что может рассматриваться как cw-модифицирующие эффекты). Напротив, два других механизма считаются действующими в trans-конфигурации. HPTMs могут разрушать связывание белков, которые ассоциируются с хроматином или гистонами. Или же HPTMs могут создавать измененные связывающие поверхности, которые притягивают определенные эффекторные белки. Этот третий механизм был охарактеризован наиболее детально, и такое рекрутирование белков определяется по отношению к его функциональным последствиям: так, оно может иметь активирующее или же репрессивное влияние на транскрипцию. Большое число обнаруженных HPTMs и их разнообразные комбинации привели к мысли, что HPTMs осуществляют регуляцию посредством комбинаторных паттернов, во временных последовательностях, и могут устанавливаться на коротких и длинных расстояниях. Эти разнообразные механизмы определяют разные функциональные результаты — одни из них временные, преходящие, другие стабильные и эпигенетически наследуемые.

В 1960-е годы Винсент Олфри (Vincent Allfrey) идентифицировал ацетилирование, метилирование и фосфорилирование гистонов, выделенных из многих эукариот. Гистоны были также первыми распознанными убиквитилированными белковыми субстратами. Тем не менее, хотя Олфри и наблюдал определенные корреляции между модификациями и источником транс-крипционно активного хроматина, генетические и функциональные доказательства в пользу роли HPTMs в регуляции генов были получены значительно позже. Действительно, многие исследователи, изучавшие биохимию и генетику регуляции генов в 1980-е и 1990-е годы, скептически относились к мысли, что HPTMs играют причинную роль в регуляции генов

 

1. Гистоны и ацетилирование играют регуляторную роль в транскрипции

Как показано в этой главе, гистоны подвержены многим разным посттрансляционным модификациям (PTMs), и со временем несомненно будут обнаружены новые, пока еще не известные HPTMs. Известные модификации можно классифицировать либо как малые химические группы, обсуждаемые в разделах 2—4 этой главы, либо как более крупные пептидные изменения в гистонах, что обсуждается в разделе 5 (табл. 10.1). Механизм, посредством которого HPTMs влияют на хроматиновую матрицу и родственные процессы, такие как транскрипция или репрессия генов, рассматриваются в контексте трех концептуальных моделей, изображенных на рис. 10.1. Модель 1 предполагает, что посттрансляционно модифицированные гистоны могут каким-то образом изменять струкутру хроматина. В модели 2 НРТМ может подавлять связывание некоего фактора с хроматиновой матрицей, тогда как модель 3 предполагает, что НРТМ создает сайт связывания для определенного белка (см. также раздел 5 главы 3).

Что, в историческом плане, изменило главенствующий взгляд, согласно которому хроматин является, в основном, материалом упаковки ДНК? Самые ранние

Таблица 10.1. Типы ковалентных посттрансляционных модификаций гистонов

HPTMs разбиваются на две группы: группа 1 представляет модификации малыми химическими группами, а группа 2 включает более крупные химические модификации данные о том, что HPTMs регулируют активацию транскрипции и сайленсинг, были получены в экспериментах на Saccharomyces cerevisiae в конце 1980-х годов. Эти почкующиеся дрожжи являются весьма эффективной моделью для проведения генетических экспериментов (в области как прямой, так и обратной генетики) по выяснению значения гистонов. Причина этого в том, что, в отличие от высших эукариот, где имеются множественные копии каждого гистонового гена, с однокопийными гистоновыми генами дрожжей можно легко проводить генетические манипуляции. Например, на фоне удаления с помощью делеций всех гистоновых генов можно ввести копию каждого гена, закодированную в эписоме, несущей такой селективный маркер, как ген URA3, для сохранения этой эписомы. Вторую копию гистонов можно ввести на второй эписоме, несущей другой селективный маркер. В этой второй копии можно вызвать мутацию с помощью сайт-направленного мутагенеза, а затем можно вызвать утерю первой копии, копии дикого типа, из клетки, используя 5-FOA (5-фтороротовая кислота), делающую продукт гена URA3 токсичным для клетки. Конечным результатом будет присутствие в клетке единственной копии — измененной копии на второй эписоме, которая содержит любое число мутаций, подлежащих тестированию. У S. cerevisiae гистоновые гены расположены парами H3/ Н4 и Н2А/Н2В, и их транскрипция в большой степени скоординирована таким образом, что совпадает с фазой S. Каждая нуклеосома собирается из тетрамера H3/Н4 и двух димеров Н2А/Н2В; когда одна пара любой двойки оказывается недо- или сверхтранскрибированной, нуклеосомы оказываются обедненными. Это изменение дозы гистонов генетическими средствами явилось одним из первоначальных доказательств того, что структура хроматина играет ключевую роль в регулировании экспрессии. Один такой подход использовал «прямую» генетику, когда были отселектированы случайные мутации, которые приводили к инактивации гена-маркера (Clark-Adams et al., 1988). Оказалось, что эти мутации изменяют количество пар гистонов. При втором подходе использовали «обратную» генетику, когда направленное «истощение» гистоновых генов давало четкое доказательство того, что гистоны регулируют транскрипцию генов (Han and Grunstein, 1988). Следующий этап заключался в том, чтобы провести делецию только аминотерминальных «хвостов» гистонов (сайты локализации многих НРТМ) или выполнить мутации-замены сайтов ацетилирования в гистонах. Эти более тонкие «хирургические» изменения также вызывали уменьшение активации генов, позволяя предполагать, что ацетилирование необходимо для транскрипции генов (Durrin et al., 1991).

Рис. 10.1. Модели, показывающие, каким образом посттрансляционные модификации гистонов влияют на хроматиновую матрицу

Модель 1 предполагает, что изменения в структуре хроматина опосредуются cis-эффектами ковалентных модификаций гистонов, таких как ацетилирование или фосфорилирование гистонов. Модель 2 иллюстрирует подавляющее влияние НРТМ на связывание ассоциированного с хроматином фактора (CF) на примере фосфорилирования по H3S10, блокирующего связывание НР1 в метилированном H3K9. В модели 3 НР1М может обеспечивать специфичность связывания для ассоциированного с хроматином фактора Классическим примером является связывание НР1 через посредство его хромодомена с метилированным H3K9

При других подходах исследовали, изменяются ли нуклеосомы естественным образом в ходе активации генов. Биохимические эксперименты показали, что нуклеосомы играют репрессивную роль в транскрипции на матрицах ДНК in vitro (Workman and Roeder, 1987), но вопрос о том, происходит ли то же самое in vivo, является спорным. Некоторые промоторы обладают нуклеосомами, расположенными естественным образом «вверх по течению» от сайтов начала транскрипции, и эти позиционированные нуклеосомы становятся измененными, когда ген активируется (Svaren et al., 1994; Shim et al., 1998). В случае PH05 изменение нуклеосом требовало активатора, показывая тем самым, что без транскрипции нуклеосомы не были изменены. Однако было неясно, является ли это изменение причиной или же следствием транскрипции. Чтобы выяснить это, делетировали ТАТА-бокс, отменяющий транскрипцию у дрожжей. Положение нуклеосом, тем не менее, изменилось, заставляя предположить, что это изменение нуклеосом предшествует транскрипции.

В совокупности подобные эксперименты убедительно свидетельствовали о том, что для активации транскрипции могут быть необходимы и репозиционирование нуклеосом, и ацетилирование специфических остатков в гистоновых «хвостах»

 

2. Ацетилирование и деацетилирование

Дополнительные экспериментальные подходы продолжали поставлять данные о том, что ацетилирование (versus отсутствие ацетилирования) коррелирует с транскрипцией. Районы, транскрипционно активные или готовые к транскрипции, склонны иметь «открытую» конфигурацию хроматина и поэтому доступны для таких ферментов, как ДНКаза и MN-ase, которые при добавлении к изолированным, но интактным ядрам могут переваривать ДНК. В начале 1990-х годов исследователи начали использовать иммунопреципитацию хроматина (ChIP, chromatin immunoprecipitation) — мощный метод для анализа того, какие белки связываются с определенными нуклеотидными последовательностями ДНК in vivo. Этот метод включает создание поперечных сшивок в белках, связанных с ДНК, с помощью таких проникающих в клетку химических реагентов, как формальдегид, и последующую обработку ультразвуком для разрушения комплексов ДНК:белок до более мелких фрагментов. Интересующие исследователя комплексы ДНК:белок затем подвергаются иммунопреципитации с использованием специфических антител в качестве зонда. Затем поперечные сшивки ликвидируются, чтобы изолировать и идентифицировать нуклеотидные последовательности ДНК, ассоциированные с белком, который связался с антителом; при этом для анализа используется либо радиоактивно меченые ДНК-зонды, либо ПЦР Одна группа использовала этот метод, чтобы исследовать корреляцию между сайтами в ДНК вокруг активных глобиновых генов, которые гиперчувствительны к перевариванию ДНКазой и ассоциируются с ацетилированными гистонами в эритроцитах курицы; корреляция оказалась очень тесной (Hebbes et al., 1994). У S. cerevisiae аналогичные подходы были применены в транскрипционно «молчащих» районах генома, и были показаны очень низкие уровни ацетилирования гистонов (Braunstein et al., 1993). Наоборот, генетическое нарушение сайленсинга коррелировало с увеличенным ацетилированием.

Все эти эксперименты постепенно обнаруживали, что гистоны и, в частности, сайты обратимого ацетилирования играют роль в регуляции генов. Однако первые ферменты ацетилирования и деацетилирования ядерных гистонов не были идентифицированы вплоть до середины 1990-х годов, и они явились наиболее прямым доказательством того, что эти ферменты играют роль в ходе транскрипции. Первая ядерная ацетилтрансфераза гистонов (HAT) была выделена из так называемого макронуклеуса (очень крупного транскрипционно активного ядра в отличие от мейотического микронуклеуса) инфузории Tetrahymena, который характеризуется высокими скоростями транскрипции (Brownell et al., 1996). Ключевым подходом для выявления активности HAT оказался анализ «в геле» («in-gel»): сложная смесь белков из клеточных экстрактов была разделена на пропитанном гистонами SDS-геле, затем пептиды были подвергнуты ренатурации, и белки с активностью фермента HAT метили этот гель путем переноса радиактивно меченного кофактора, ацетилкоэнзима А, на локализованные гистоны. Это делало возможным последующее биохимическое фракционирование и очистку этого полипептида. Идентифицированный энзим HAT был гомологичен ранее изолированному у S. cerevisiae коактиватору, называемому Gcn5, о котором было известно, что он взаимодействует с транскрипционными активаторами. Одновременно первая деацетилаза гистонов (HDAC) была выделена посредством биохимической очистки (Taunton et al., 1996). В этом случае фермент был очищен из клеточных экстрактов с помощью ингибитора, связанного с нерастворимым матриксом, который физически связывался с каталитическим сайтом фермента. Энзим оказался гомологичным ранее выделенному гену, игравшему роль кофактора в репрессии генов. Эти замечательные параллельные открытия первых ферментов, которые, как оказалось, метаболизируют ацетильные группы на гистонах, привели к модели, которая в настоящее время стала парадигмой для ген-специфичных гистоновых PTMs: связанные с ДНК активаторы рекрутируют HATs для того, чтобы ацетилировать нуклеосомные гистоны, тогда как репрессоры рекрутируют YDACs для того, чтобы деацетилировать гистоны. Эти изменения ведут к изменениям нуклеосомы и, соответственно, к ап- или даун-регуляции гена (рис. 10.2).

Было показано, что многие другие хорошо известные коактиваторы и корепрессоры обладают активностью HAT или HDAC или ассоциируются с такими энзимами (Sterner and Berger, 2000; Roth et al., 2001). Более того, ферментативные активности HATs и HDACs являются критическими для их роли в активации и репрессии генов. Эти энзимы часто являются компонентами крупных комплексов, модулярных по структуре и функции; модифицирующая гистоны ферментативная активность — это только одна функция, и в числе других, например, рекрутирование связывающегося с ТАТА белка (TBR TATA-binding protein) (Grant et al., 1998). Интересно, что некоторые ядерные рецепторы гормонов функционируют и как связывающиеся с ДНК репрессоры транскрипции (когда они не связаны с гормонами-лигандами), и как активаторы транскрипции (когда связаны с гормонами-лигандами); эти рецепторы осуществляют эти функции отчасти через посредство РТМ хроматиновых участков-мишеней, рекрутируя HDACs, когда они не связаны с лигандами, и HATs, когда связаны (Baek and Rosenfeld, 2004).

Рис. 10.2. Энзимы , модифицирующие гистоны, рекрутируются к промоторам связывающимися с ДНК транскрипционными факторами

Ацетилтрансферазы гистонов (HAT) рекрутируются активаторами, которые связываются с активирующими нуклеотидными последовательностями «вверх по течению» (UAS, upstream activating sequences). Этот фермент катализирует ацетилирование локальных гистонов, которые, как известно, вносят вклад в активацию транскрипции. Деацетилазы гистонов (HDAC) рекрутируются репрессорами транскрипции, которые связываются с репрессивными нуклеотидными последовательностями «вверх по течению» (URS) и деацетилируют локальные гистоны Это вносит вклад в репрессию транскрипции

Белки HAT могут ацетилировать остатки лизина на всех четырех коровых гистонах, но разные энзимы обладают разной специфичностью в отношении предпочтительного субстрата (рис. 10.3; табл. 10.1), хотя каждый энзим редко «нацелен» только на один сайт. Одно главное семейство HAT — GNAT (сокращение для Gcn5 related acetyltransferase) «нацелено» на гистон H3 как на свой основной субстрат. Второе главное семейство, семейство MYST, в качестве своего основного субстрата«нацелено» на гистон Н4. Третье главное семейство — СВР/р300 — «нацелено» и на H3, и на Н4 и является самым неразборчивым. Был выполнен структурный анализ для каталитических доменов первых двух главных семейств (GNAT и MYST), и они оказались различающимися; структура семейства СВР/р300 пока еще не раскрыта. Между прочим, каждое из этих семейств ацетилтрансфераз способно также ацетилировать негистоновые субстраты (Glozak et al., 2005).

Как обсуждалось выше, существуют три модели, описывающие роль HPTMs в регулирование структуры хроматина (рис. 10.1). Первая модель рассматривает структурные изменения в хроматине, индуцируемые прямыми влияниями HPTMs, такие как изменения заряда. В этом случае нейтрализация ацетилированием положительно заряженного лизина уменьшает силу связывания сильно основных гистонов или гистоновых «хвостов» с отрицательно заряженной ДНК и таким образом открывает сайты связывания с ДНК (Vettese-Dadey et al., 1996). Имеются также данные, все еще в пользу первой модели, что ацетилирование может декомпактизировать нуклеосомные порядки, что согласуется с ролью в открывании хроматина для активации генов (Shorgen-Knaak et al., 2006). Третья модель предполагает, что HPTMs обеспечивают поверхность связывания, чтобы белки ассоциировались с хроматином и регулировали ДНК-матричные процессы; впервые это было показано для ацетилирования. Специализированный белковый домен, названный бромодоменом и обычно обнаруживаемый в ассоциированных с хроматином белках, специфически связывается с ацетилированными лизинами (рис. 10.3) (Dhalluinet al., 1999). Бромодомены присутствуют во многих HATs, таких как Gcn5 и СВР/рЗОО. Белки с этим мотивом, когда они являются частью крупных комплексов, ассоциированных с хроматином или изменяющих его, — например, таких как зависимый от АТФ ремоделирующий комплекс, Swi/ Snf — стимулируют его связывание с хроматином (Hassan et al., 2002). Другими примерами белков, которые содержат бромодомены, обладающие специфичностью связывания с ацетилированными гистонами, являются Tafl и Bdfl в комплексе TFIID, Rsc4 в ремоделирующем комплексе Rsc и Brd2 в большом семействе бромодоменных белков.

Рис. 10.3. Охарактеризованные сайты ацетилирования гистонов

Гистоны ацетилируются главным образом по лизиновым остаткам, локализованным в аминоконцах H3 и Н4, за исключением H3K56, локализованного в глобулярном домене. Показаны белки, проявляющие специфичность связывания с ацетилированными гистонами

Существуют многочисленные ферменты HDAC, удаляющие ацетильные группы (Kurdistani and Grunstein, 2003; Yang and Seto, 2003). Они распадаются на три каталитические группы, консервативные в эволюции от S. cerevisiae до млекопитающих, которые обозначаются как энзимы типа I, типа II и типа III, или родственные Sir2. Ферменты типа I и типа II обладают близким механизмом деацетилирования, который не связан с кофактором, тогда как ферменты, родственные Sir2, требуют кофактор NAD в качестве компонента их каталитического механизма. Структура представителей всех этих трех семейств выяснена. Многие HDACs обнаруживаются в крупных мультисубъединичных комплексах, компоненты которых служат для «нацеливания» этих энзимов на гены, что ведет к репрессии транскрипции. Например, Rpd3 является частью крупного комплекса, включающего HDAC Sin3, которая взаимодействует с репрессорами, связанными с ДНК (Kurdistani and Grunstein, 2003; Yang and Seto, 2003). Rpd3 является также частью малого комплекса, «нацеленного» на открытые «рамки считывания» генов (ORFs) через ассоциацию хромодомена с H3KЗбше (дальнейшее обсуждение хромодоменов см. в разделе 4). Результатом этого оказывается деацетилирование гистонов, частично подавляющее инициацию внутренней РНК-полимеразы II (pol II), а также регулирующее различные этапы цикла транскрипции (Carrozza et al., 2005; Joshi and Struhl, 2005).

 

3. Фосфорилирование

Фосфорилирование — лучше всего известная РТМ, поскольку уже давно поняли, что киназы регулируют проведение сигнала с клеточной поверхности через цитоплазму и в ядро, приводя к изменениям в экспрессии генов. Гистоны были одними из первых белков, фосфорилирование которых было обнаружено. К 1991 году открыли, что когда клетки стимулировали к пролиферации, происходила индукция так называемых «немедленных-ранних» [«immediate-early»] генов, и они становились транскрипционно активными и функционировали, стимулируя клеточный цикл. Эта повышенная экспрессия генов коррелирует с фосфорилированием гистона H3 (Mahadevan et al., 1991). Остаток серина 10 гистона H3 (H3S10) оказался важным сайтом фосфорилирования для транскрипции от дрожжей до человека и, по-видимому, особенно важен у Drosophila (Nowak and Corces, 2004). Были идентифицированы многие киназы, имеющие «мишенью» этот сайт, в том числе Msk1/2 и родственная ей Rsk2 у млекопитающих и SNF1 у S. cerevisiae (Sassone-Corsietal., 1999; Loetal., 2001; Soloagaetal., 2003). Исследования линкерного гистона Н1 у Tetrahymena показали, что фосфорилирование этого гистона также может влиять на контроль транскрипции.

Возможно, наперекор интуиции фосфорилирование некоторых остатков коррелирует с конденсацией хромосом в митозе и мейозе. Неясно, каким образом фосфорилирование участвует в этом процессе, но недавно было показано, что фосфорилирование H3S10 действует как временной [temporal] переключатель, извлекающий НР1, связанный с метилированным по соседству остатком H3K9, и называемый «бинарным переключателем methyl-phos» (Fischle et al., 2005; Hirota et al., 2005). Остается посмотреть, может ли это, возможно совместно с фосфорилированием H3S28 и H3Т11, влиять на конденсацию хроматина посредством рекрутирования конденсинового комплекса и митотического веретена (Nowak and Corces, 2004).

Меньше известно о точной роли фосфорилирования гистонов в механистических терминах. Имеются данные в пользу всех трех моделей, касающихся роли HPTMs. Во-первых, фосфорилирование гистонов изменяет степень компактности хроматина in vivo (модель 1) Действительно, работы на Tetrahymena показали, что коллективный «пэтч отрицательных зарядов», образующийся в результате фосфорилирования кластеров, находящихся по соседству с остатками в линкерном гистоне Н1, влияет на сродство его связывания с ДНК. явно увеличивая транскрипционный потенциал локального хроматинового окружения (Dou and Gorovsky, 2002). В поддержку модели 2 говорят данные о том, что белки, связанные с хроматином, могут быть смещены фосфорилированием. Недавно это было продемонстрировано пониженной афинностью связывания НР1 во время митоза после митоз-специфичного фосфорилирования H3S10 (Fischle et al., 2005; Hirota et al., 2005). В поддержку Модели 3 свидетельствуют данные о том, что адапторный белок 14-3-3 (известный белок, связывающий фосфатную группу) распознает H3S10ph в промоторах индуцибельных генов (Macdonald et al., 2005).

 

4. Метилирование

 

Метилирование как ковалентная модификация гистонов является более сложной, чем любая другая, поскольку оно может происходить как по лизинам, так и по аргининам. Кроме того, в отличие от любой другой модификации в группе 1, последствия метилирования могут быть как позитивными, так и негативными по отношению к транскрипционной экспрессии в зависимости от положения остатка в гистоне (табл. 10.1). Еще один уровень сложности связан с тем фактом, что по каждому остатку могут быть множественные метилированные состояния. Лизины могут быть моно- (me1), ди- (me2) или три- (me3) метилированными, тогда как аргинины могут быть моно- (me1) или ди- (me2) метилированными. Поскольку на H3, Н4, Н2А и Н2В имеются по меньшей мере 24 идентифицированных сайта метилирования лизинов и аргининов, число различающихся метилированных состояний нуклеосом невообразимо велико. Такой комбинаторный потенциал метилированных нуклеосом может быть необходим, по крайней мере отчасти, чтобы сделать возможным регулирование таких сложных и динамических процессов, как транскрипция, которая требует последовательных и точно размещенных во времени событий (Jenuwein and Allis, 2001; Y. Zhang and Reinberg, 2001; Lee et al., 2005; Martin and Zhang, 2005; Wysocka et al., 2006a).

 

4.1. Метилирование лизинов

Тот факт, что лизиновые остатки в гистонах метилированы, был известен многие десятилетия. Однако биологическое значение этой модификации стало высвечиваться лишь недавно, после идентификации первой метилтрансферазы лизинов, использующей гистоны в качестве своего субстрата (Rea et al., 2000). В настоящее время идентифицировано большее количество лизиновых метилтрансфераз (HKMTs), и определены сайты, модифицируемые ими на гистонах (Martin and Zhang, 2005). Все эти ферменты, за исключением Dot 1, имеют общий домен SET, который содержит каталитически активный сайт и делает возможным связывание с S-аденозил-L-метиониновым кофактором.

Из большого числа известных метилированных сайтов к сегодняшнему дню хорошо охарактеризованы шесть; пять на H3 (К4, К9, К27, К36, К79) и один на Н4 (К20). Метилирование по H3K4, H3K36 и H3K79 в целом было связано с активацией транскрипции, а остальные варианты — с репрессией (табл. 10.1). Кроме того, два из этих сайтов — H3K79me и H4K20me — участвуют, как считается, в процессе репарации ДНК. Были идентифицированы специфические белки-связки, распознающие каждый из шести охарактеризованных сайтов метилирования (рис. 10.4). Эти белки имеют домен узнавания лизина, относящийся к одному из трех разных типов: хромо, тюдор и PHD-повтор. Ниже каждая из этих охарактеризованных модификаций обсуждается более детально.

Метилирование H3K4

Метилирование H3K4 связано с эухроматином, а именно с генами, которые активны или должны стать активными. Демонстрация того, что метилирование H3K4 коррелирует с активным хроматином, была получена при анализе локуса куриного β-глобина и локусов типа спаривания почкующихся дрожжей (Litt et al., 2001; Noma et al., 2001). ChlPs с использованием антител, специфичных к метилированным H3K4, показали, что островки модифицированных гистонов метят активные гены. Последующая работа на дрожжах показала, что в процессе активной транскрипции появляется триметильное состояние (H3K4me3) (Santos-Rosa etal., 2002).

У дрожжей во время активации транскрипции модификация H3K4me3 наблюдается на 5’-концах генов.

Рис. 10.4. Сайты метилирования гистонов, их белковые связки и функциональная роль в геномных процессах

Метилирование гистонов происходит по лизиновым остаткам в гистонах НЗ и Н4. Некоторые метилированные остатки лизина ассоциированы с активацией транскрипции ( зеленый флажок Me ), тогда как другие участвуют в репрессивных процессах ( красный флажок Me ). Показаны белки, связывающиеся с определенными метилированными остатками лизина

Полагают, что за эту метку отвечают три компонента транскрипционной машины. Во-первых, RNA pol II, фосфорилированная по Ser-5 карбокситерминального домена (CTD), может рекрутировать Setl HKMT, которая метилирует H3K4 поблизости от промоторов (рис. 10.5). Такое фосфорилирование в норме высвобождает RNApol II из комлекса инициации транскрипции в комплекс ранней элонгации (часто называемый promoter clearance или escape). Второй компонент, рекрутирующий H3K4me3, это комплекс RAF, который регулирует различные этапы метаболизма РНК и также взаимодействует с Setl. Третьим компонентом, важным для установления H3K4me3, является моноубиквитилирование Н2В по Lys-123 (H2BK123ub1 или H2BK120ub1 у человека; обсуждается ниже, в разделе 6). Что остается неясным, так это вопрос о том, какие процессы транскрипционной элонгации контролирует H3K4me3 (Hampsey and Reiberg, 2003); однако факторы, специфически связывающиеся с метилированными H3K4me3, начинают выявлять его роль.

В механистическом плане метилирование H3K4 может приводить к рекрутированию таких специфических факторов, как белок CHD1, который, как было показано, связывается с H3K4me2 и me3 (рис. 10.4), и комплекс NURF, который, как известно, мобилизует нуклеосомы в активных генах у Drosophila. Домены, опосредующие связь с метилированными H3K4, являются тандемным набором хромодоменов в Chdl (Sims et al., 2006) и «пальцем» PHD в NURF (Li et al., 2006). Среди других белков, рекрутируемых метилированием H3K4, — АТФ-аза ISWI, которая связывается непрямым образом, через посредство другого белка (белков). Напротив, имеются данные, что репрессорный комплекс NuRD у млекопитающих больше не связывается с метилированными «хвостами» H3K4 (D.Y. Lee et al., 2005; Martin and Zhang, 2005).

Метилирование по H3K4, по-видимому, взаимодействует с другими модификациями. Например, метилирование H3K9 HKMT SUV39H in vitro предотвращается, если H3K4 метилирован и H3S10 фосфорилирован. Это вполне может быть способом закрытия репрессивной модификации H3K9 на активно транскрибируемых генах. При более сложной форме взаимодействия типа «trans-tail» моноубиквитинилирование H2BK123 влияет на уровни H3K4me3. Как это происходит — неясно, но одно из предположений заключается в том, что комплекс Setl не может триметилировать H3K4, если нуклеосома (нуклеосомы) не находится в определенном конформационном состоянии, которое определяется убиквитилированием Н2В (Zhang and Reinberg, 2001; D.Y. Lee et al., 2005).

Белок Setl/MLL/ALLl/HRX, который является гомологом Setl у человека, может рекрутироваться к промоторам гена НОХ. Другая H3K4 HKMT, SMYD3, оказалась сцепленной с транскрипционной активацией. Метилирование с помощью SMYD3 также было связано с индукцией клеточной пролиферации. В самом деле, ограниченный анализ человеческих энзимов, метилирующих H3K4, позволяет предполагать их участие в генезе рака (D.Y. Lee et al., 2005).

Метилирование H3K36

Полученные данные привели к предположению, что метилирование H3K36 необходимо для эффективной элонгации RNA pol II через колирующий участок. Кодирующий район активных генов очень обогащен этой модификацией в противоположность 5’-локализации метилирования H3K4. Белок Set2 является HKMT, способной метилировать H3K36 Фермент Set2 связывается предпочтительно с RNA pol II, которая была фосфорилирована по Ser-2 в пределах его CTD (рис. 10.5). Эта форма RNA pol II, которая, между прочим, отличается от фосфорилированного состояния, связанного с очисткой промотора, имеет тенденцию аккумулироваться в транскрибируемых районах так же, как на 3’-концах генов. Это согласуется с тем, что H3KЗбme3 достигает пика на 3’-концах генов, которые активно транскрибируются. Рекрутирование Set2 к активным генам требует также компонентов комплекса РАЕ, как в случае рекрутирования Setl. Однако моноубиквитилирование Н2В играет негативную репрессивную роль в метилировании H3K36 (Zhang and Reinberg, 2001; Martin and Zhang, 2005). Действительно, комплекс SAGA, рекрутируемый к транскрибируемым генам у дрожжей, содержит Ubp8, деубиквиназу, которая специфична к H2BK123. Дальнейшие исследования позволили предположить, что убиквитилирование и деубиквитилирование H2BK123 являются активным процессом в ходе транскрипционной элонгации.

Продвижение RNA pol II через кодирующие участки требует ацетилирования нуклеосом. Транскрипционное регулирование также нужно для подавления неправильной внутренней инициации транскрипции с криптических стартовых сайтов, которые встречаются внутри кодирующих районов. Чтобы подавить этот процесс, метилирование по H3K36 с помощью Set2 создает сайт узнавания для белка EAF3 через его хромодомен, который в свою очередь опосредует рекрутирование комплекса Rpd3S HDAC. Деацетилазная активность Rpd3S удаляет затем ацетилирование гистонов, связанное с элонгацией, супрессируя таким образом внутреннюю инициацию (Carrozza et al., 2005; Joshi and Struhl, 2005; Keogh et al., 2005). Метилирование H3K36 также оказалось на гораздо более низком уровне в промоторах индуцибельных генов, но в этом случае его влияние оказывается репрессивным (Zhang and Reinberg, 2001).

Рис. 10.5. Роль метилирования лизинов гистонов в транскрипционной элонгации

РНК-полимераза II рекрутирует разные типы HKMTs в зависимости от состояния фосфорилирования его карбокситерминального домена (CTD) РНК-полимераза II активируется для инициации транскрипции поблизости от промотора, когда Ser-5 фосфорилирован. Это рекрутирует Setl HKMT для метилирования H3K4. Фосфорилирование Ser-2 происходит в ходе транскрипционной элонгации, побуждая к метилированию H3K36 в результате рекрутирования Set2 HKMT к хроматиновой матрице

Метилирование по H3K79 является необычным, потому что эта модификация лежит в коре нуклеосомы, а не в «хвосте», где находится большинство других охарактеризованных сайтов метилирования Глобальный анализ показал, что H3K79 метилируется в эухроматиновых районах дрожжей и ассоциируется главным образом с кодирующим участком активных генов. Ограниченный анализ у высших эукариот демонстрирует такой же профиль.

Энзим млекопитающих, метилирующий H3K79, hDOTIL, как было показано, опосредует лейкемогенные функции белка слияния MLL-AF10. Однако до сего дня не обнаружен белок, который связывается с H3K79me и связывает его с транскрипционными событиями. Единственные данные механистического плана о том. как метилирование H3K79 функционирует в активации транскрипции, были получены в работе с почкующимися дрожжами. Эта работа показывает, что данная модификация каким-то образом лимитирует такие репрессивные белки, как Sir2 и Sir3, в эухроматине, внося таким образом свой вклад в регулирование и поддержание «молчащего» гетерохроматина за счет усиления их концентрации в репрессивных участках хроматина. Другой функцией, приписываемой H3K79 HKMT Dotl у дрожжей, является опосредование «контрольной точки» репарации ДНК. В соответствии с этим последним фактом в клетках человека был идентифицирован белок Р53ВР1, который может связываться с метилированным H3K79 и играет роль в функции «контрольной точки» в репарации ДНК (Martin and Zhang, 2005).

Метилирование H3K9

Этот тип метилирования является сегодня наиболее изученной модификацией гистонов, главным образом

потому, что энзим, метилирующий H3K9, — SUV39H1 — был первой идентифицированной HKMT (Rea et al., 2000). Ее гомологу Drosophila, Su(var)3-9, первоначально был идентифицирован как супрессор мозаичности, что указывало на то, что он участвует в механизме сайленсинга эффекта положения мозаичного типа (PEV), который связан с распространением гетерохроматина в соседние эухроматиновые гены (дополнительные детали см. в главе 5). Осознание того, что SUV39H1 по нуклеотидной последовательности сходен с метилтрансферазой растений, субстратом для которой является Rubisco, привело к идентификации домена Suv39 SET как каталитического домена, способного метилировать H3K9.

Был достигнут прогресс в определении функции метилирования H3K9 в формировании перицентромерного гетерохроматина, что широко обсуждается также и в других главах (об исследованиях на Drosophila см. главу 5, об исследованиях на S. pombe см. главу 6 и об исследованиях по опосредованному RNAi формированию гетерохроматина см. главу 8). Эти результаты получены в основном в исследованиях на дробянковых дрожжах и млекопитающих, где гетерохроматиновые структуры, как полагают, достаточно консервативны (но обратите внимание на то, что у почкующихся дрожжей метилирование H3K9 не было обнаружено). Суммируя, можно сказать, что первый этап нашего понимания возник на основе исследований факторов, участвующих в установлении гетерохроматина. В их число входит кооперация двух белков: SUV39H (или Clr4 у дробянковых дрожжей) и его партнер по связыванию НР1 (или Swi6 у дробянковых дрожжей [Nakayamaet al., 2001; Nomaet al., 2001]). Была предложена модель, в которой SUV39H метилирует H3K9, создавая платформу для связывания НР1 через его хромодомен (Bannister et al., 2001; Lach-ner et al., 2001). Коль скоро HP1 связался, он может распространяться на соседние нуклеосомы за счет его ассоциации с SUV39Y. который далее катализирует метилирование соседних гистонов (Nakayama et al., 2001). Кроме того, НР1 ассоциируется сам с собой через домен «chromoshadow», облегчая распространение гетерохроматина. Однако каким образом распространение НР1 диктует формирование плотно упакованных гетерохроматиновых структур остается неизвестным.

Вышеуказанная модель предсказывает, что должен быть специальный механизм основанного на гетерохроматине рекрутирования для фермента SUV39H HKMT. прежде чем станет возможным распространение НР1. Ключ к разгадкё того, что бы это могло быть, был получен в серии экспериментов на дробянковых дрожжах, которые продемонстрировали связь между формированием гетерохроматина и образованием коротких интерферирующих РНК (siRNAs) (Hall et al., 2002; Volpe et al., 2002). Эти РНК возникают в результате двунаправленной транскрипции центромерных повторов, которые пропессируются в siRNAs ферментом dicer. Эти siRNAs упаковываются затем в комплекс RITS, который содержит обладающий хромодоменом белок, Chp1, который связывается с метилированным H3K9. Таким образом, «нацеливание» комплекса RITS на хроматин образует начальную стадию формирования гетерохроматина.

Распространение и поддержание гетерохроматина на участке, 20 т.п.н., как описано выше, требует метилирования H3K9 гистона Clr4 HKMT и связывания Swi6 с метилированным по H3K9 хроматином (Martin and Zhang, 2005; дополнительные детали см. в главе 8).

Представление о взаимозависимости разных репрессивных эпигенетических механизмов возникло из исследований, проводившихся вначале на Neurospora crassa. но также и на растениях, особенно заметно продемонстрировавших связь между метилированием H3K9 и процессом метилирования ДНК (главы 6 и 8). Метилирование H3K9 необходимо для того, чтобы имело место метилирование ДНК; по-видимому, действует и реципрокная связь, когда метилирование H3K9 зависит от метилирования ДНК. Более того, недавние исследования на раковых клетках млекопитающих, у которых нет ДНК-метилтрансферазных ферментов (Dnmts), показывают сниженные уровни метилирования H3K9, и это можно приписать тому, что связывющийся с метил-CpG белок 1 (MBD1, methyl-CpG-binding protein 1) ассоциируется с H3K9 HKMT SETDB1 (Zhang and Reinberg, 2001; Martin and Zhang, 2005; дополнительные детали см. в главе 18).

Метилирование по H3K9 функционирует также в репрессии эухроматиновых генов ChlPs выявляют это метилирование в промоторе генов млекопитающих, когда эти гены «молчат». Механизм этой репрессии в эухроматиновых сайтах, по-видимому, слегка отличается от механизмов, встречающихся в гетерохроматиновых районах. Репрессорный белок RB предъявляет SU-V39H1 HKMT и НР1 таким эухроматиновым генам, как ген регулируемого E2F циклина Е. Однако, в отличие от гетерохроматина, заполнение НР1, по-видимому, ограничено одной или немногими нуклеосомами вокруг сайта инициации, даже несмотря на то, что метилирование H3K9 происходит и в других местах на промоторе. В другом примере репрессор КАР1 приносит ESET/SET-DB1 HKMT к промотору генов, регулируемых КАР1, и сайленсирует транскрипцию метилированием H3K9 и рекрутированием НР1. То, что НР1 специфически ограничены этими эухроматиновыми промоторами, и предотвращение распространения позволяют предполагать для НР1 наличие отдельного механизма действия по отношению к его гетерохроматиновой роли. Один возможный способ действия НР1, получивший некоторую поддержку, заключается в том, что он действует как якорь, закрепленный в богатых гетерохроматином ядерных компартментах. В ходе репрессии эухроматиновых генов наблюдали движения, показывающие, что «молчащий» ген смешается в гетерохроматиновый район, и это перемещение зависит от гамма-изоформы НР1 (Martin and Zhang, 2005).

Формирование гетерохроматина в теломерах, хотя и связано с НР1 и метилированием H3K9, отличается от вышеупомянутых перицентромерных и «молчащих» эухроматиновых районов. У Drosophila НР1 не рекрутируется к теломерным концам через его хромо- и «chromoshadow»-домен, и метилирование H3K9 катализируется неизвестной HKMT. У млекопитающих другие гомологи НР1, СВХ1, СВХЗ и СВХ5 участвуют в связывании с метилированным H3K9, преобразованным белками SUV39H1 и SUV39H2 для формирования репрессивных хроматиновых доменов на хромосомных концах (дополнительные детали см. в главе 14).

Метилирование H3K27

Метилирование H3K27 является репрессивной модификацией, обнаруживаемой в клетке в трех разных местах:

(1) в эухроматиновых генных локусах, преимущественно там, где имеются реагирующие элементы Polycomb (PREs, Polycomb Response Elements) в случае Drosophila,

(2) в перицентромерном гетерохроматине и (3) в неактивной Х-хромосоме у млекопитающих.

В клетках человека ферментом, опосредующим метилирование H3K27, является EZH2 — гомолог белка ENHANCER OF ZESTE [E(Z)] у Drosophila. Этот энзим EZH2 обнаруживается в ряде отдельных репрессивных комплексов Polycomb (PRCs), которые ассоциируются со специфичными репрессивными элементами Polycomb-ДНК в промоторах у Drosophila (глава 11). Что «нацеливает» содержащие EZH2 комплексы на специфические гены у млекопитающих — неизвестно, поскольку репрессивные элементы Polycomb не были идентифицированы. Однако «нацеливание» этих EZI-12-комплексов может быть опосредовано рядом транскрипционных факторов, в том числе GAGA и MYC. Механизмы репрессии, осуществляемой EZH2, включают метилирование H3K27 и рекрутирование белка Polycomb (Рс) к этому модифицированному сайту (как в модели 3 на рис. 10.1). Важным аспектом пути, ведущего к метилированию H3K27, является предположение о его роли в раковых заболеваниях. В ряде раковых тканей, в том числе при раке груди и простаты, обнаружена сверхэкспрессия H3K27 HKMT EZH2 (Martin and Zhang, 2005).

Метилирование H4K20

Очень мало что известно, в механистическом плане, о роли этой модификации в контроле транскрипции. Что очевидно, так это то, что в перицентромерном гетерохроматине присутствуют H4K20me2 и H4K20me3 и что ферментами HKMT, опосредующими эти модификации, являются SUV4-20H1 и SUV4-20H2. Для метилирования H4K20, по-видимому, требуется метилирование H3K9.

Еще одним ферментом, который может монометилировать H4K20 у высших эукариот, является PR-Set7, для которого предполагается участие в митотических событиях. Наконец, имеются функциональные доказательства того, что у почкующихся дрожжей метилирование H4K20 сцеплено с репарацией ДНК через связывание белка «контрольной точки» повреждений ДНК, CrB2 (Martin and Zhang).

 

4.2. Деметилирование лизинов

До недавнего времени было неясно, происходит ли в клетке деметилирование лизинов в гистонах. Поиски таких ферментов оказались бесплодными, и имелись данные о том, что метильные группы в гетерохроматиновых районах могут быть весьма стабильными. Открытие LSD1 все это изменило (Shi et al., 2004). Было показано, что этот белок является энзимом, который специфически удаляет метальные группы с H3K4 и участвует в репрессии. LSD1 присутствует в ряде различных репрессорных комплексов, и некоторые из них позволяют ему более эффективно деметилировать лизиновые остатки из нуклеосомного гистона H3 (M.G. Lee et al., 2005; Shi et al., 2005). Специфичность LSD1 может изменяться, если он связывается с таким партнером, как рецептор андрогена (AR). Комплекс LSD 1-AR деметилирует H3K9 вместо H3K4 и в этих условиях активирует, а не репрессирует транскрипцию (Metzger et al., 2005).

Недавно ]были идентифицированы пять новых деметил аз, которые обладают общей каталитической структурой, отличной от LSD1 и названной JmjC-доменом (рис. 10.6). Ранее было предсказано, что этот домен обладает ферментативной активностью (Trewick et al., 2005). Было обнаружено, что эти новые деметилазы деметилируют разные метальные состояния H3K9 и H3K36. JHDM1 деметилирует H3K36me1 и me2, а JHDM2A деметилирует H3K9me1 и me2 (Tsukada et al., 2006; Yamane et al., 2006). Триметильное состояние этих двух модифицированных остатков удаляется отдельным набором энзимов. JHDM3A и JHDM2A могут действовать как на H3KЗбme3, так и на H3K9me3 (Cloos et al., 2006; Fodor et al., 2006; Klose et al., 2006; Tsukada et al., 2006; Whetstine et al., 2006). Возможно, вызывает удивление, что существуют ферменты, которые могут одновременно деметилировать активную (например, H3KЗбте) и репрессивную (например, H3K9me) метку. Это можно объяснить с помощью недавно обнаруженных данных о том, что метилирование H3K9 ассоциируется также с активно транскрибируемыми генами (Vakoc et al., 2005). В более классическом механизме энзим JHDM2A рекрутируется с помощью AR к промоторам, где он участвует в активировании транскрипции через деметилирование H3K9 (Yamane et al., 2006). Структурный анализ JHDM2A показал, что четыре разных домена (JmjN, JmjC, необычный «цинковый палец» и карбокситерминальный домен), объединяясь, образуют каталитический кор. Этими объединившимися доменами формируется глубокая щель, которая требует конформационного изменения в энзиме или субстрате, чтобы приспособить метальную группу для деметилирования. Такой конформационный сдвиг может объяснить специфичность деметилирования (Chen et al., 2006).

И нтересно отметить, что од на из вновь открытых деметилаз, JMJD2C, была прежде известна как GASCI — ген, амплифицированный в чешуйчатой карциноме. В соответствии с каузативной ролью этого энзима в развитии рака было показано, что сверхэкспрессия GASCI индуцирует клеточную пролиферацию (Cloos et al., 2006). Эти результаты в совокупности означают, чта деметилазы, как и HKMTs, могут быть «мишенями» для разработки противораковых лекарств (глава 24).

Рис. 10.6. Деметилазы лизинов гистонов и сайты деметилирования на гистоне H3

Сайты метилирования лизинов гистонов могут быть моно-, ди- или триметилированными. Известные деметилазы лизинов гистонов обладают различной специфичностью при деметилировании остатков гистонов или метилированных состояний, как это изображено на рисунке

 

4.3. Метилирование аргининов

Гистон H3К4

Понимание важной роли метилирования аргининов гистонов в контроле транскрипции пришло после идентификации CARM1, фермента, который может метилировать аргинины в H3 in vitro (Chen et al., 1999). In vivo метилирование аргининов было впоследствии продемонстрировано в экспериментах с использованием антител, специфичных к сайтам метилированных аргининов (Strahl et al., 2001; Wang et al., 2001; Bauer et al, 2002).

Участие метилирования аргининов предполагают как в позитивной, так и в негативной регуляции транскрипции. Две метилтрансферазы, PRMT1 (protein arginine methyl-transferse) и PRMT4/CARM1, были связаны с активацией транскрипции. PRMT1 обладает способностью метилировать H4R3 (Strahl et al., 2001; Wang et al., 2001), тогда как PRMT4/CARM1 может катализировать метилирование H3R2, H3R17 и H3R26 (Schurter et al., 2001; Bauer et al., 2002). Специфические транскрипционные факторы (NR, p53, YY1, NFKB) рекрутируют эти ферменты к специфическим промоторам, где они активируют транскрипцию. Напротив, PRMT5 (которая может метилировать H3R8 и H4R3) действует как репрессор многочисленных генов, в том числе некоторых генов, регулируемых МУС (Fabbrizio et al., 2002; Pal et al., 2003).

Большинство наших сведений о метилировании аргининов мы получаем при анализе эстрогенного сигнального пути, регулирующего ген pS2. ChlPs показали, что вслед за стимуляцией этого гена эстрогеном происходит сложная и цикличная последовательность событий.Сначала, в течение ближайших после стимула минут, рецептор эстрогена рекрутируется к промотору pS2 и приносит с собой много белковых комплексов и энзимов, которые модифицируют гистоны (Metivier et al., 2003). Важным здесь оказывается рекрутирование CARM1 и PRMT1, которые могут метилировать аргининовые остатки гистонов H3 и Н4 (Ма et al., 2001; Bauer et al., 2002). Это метилирование выявляется очень скоро после прибытия энзимов и совпадает с появлением активной RNA pol II на промоторе. Удивительно однако, что уже спустя минуты после этих событий метилирование по аргининам больше не обнаруживается специфическими антителами, a RNA pol II исчезает. Вскоре после этого метилирование аргининов и RNA pol II появляются вновь (Metivier et al., 2003; Cuthbert et al., 2004; Wang et al., 2004). Причины этих циклических событий неизвестны. Одна из возможностей заключается в том, что они представляют собой механизм быстрого отключения транскрипции, если эстрогеновый сигнал исчезает.

Эксперименты, проделанные на реконструированных хроматиновых матрицах, помогли установить прямую роль метилирования аргининов в экспрессии генов. Анализ опосредованной р53 активации транскрипции in vitro показал, что имеет место синергизм между метилированием, обусловленным PRMT1 и CARM1, и ацетилированием с помощью СВР/р300 (An et al., 2004). Более того, эти тесты подтвердили наблюдения, сделанные in vitro на гене pS2, согласно которым во время активации имеет место специфический порядок событий, в ходе которых необходима последовательная активность PRMT1, СВР/р300 и С ARM! (Metivier et al., 2003).

С учетом того, что метилирование аргининов представляет собой такой динамический процесс, были описаны несколько способов, которыми контролируется эффективность метилтрансферазы аргининов. Во-первых, взаимодействие этого фермента с другим белком может контролировать его субстратную специфичность. Во-вторых, имеется возможность конкуренции между энзимами за данный аргининовый субстрат. И PRMT1, и PRMT5 могут метилировать H4R3, но первый фермент является активатором, а второй — репрессором транскрипции. Третий уровень регулирования метального состояния может осуществляться деметилированием аргининов. Такая активность все еще не была выделена, но имеются четкие свидетельства быстрого исчезновения метальных групп из аргининов, что делает такую активность весьма привлекательной возможностью (Zhang and Reinberg, 2001; D.Y. Lee et al., 2005; Wysocka et al., 2006a).

 

5. Деиминирование

Отсутствие деметилазы аргининов навело на мысль, что в качестве антагонистов метилирования аргининов могут выступать другие типы ферментативных реакций (Bannister et al., 2002). Одну из таких реакций представляет деиминирование — процесс, посредством которого аргинин может быть превращен в цитруллин за счет удаления иминогруппы. Если данный аргинин моно-метилирован, удаление метиламина эффективно приводило бы к удалению метильной группы из аргинина. В настоящее время показано присутствие цитруллина в гистонах, и идентифицирован фермент, PADI4, который может превращать аргинины в составе гистонов в цитруллины (Cuthbert et al., 2004; Wang et al., 2004). Более того, появление цитруллина в гистонах H3 и Н4 коррелирует с исчезновением метилирования аргинина in vivo. Кроме того, анализ регулируемых эстрогеном промоторов, где метилирование аргининов совпадает с активным состоянием транскрипции, показал, что цитруллин появляется, когда промотор выключен. Многие вопросы относительно этой модификации остаются без ответа. Действует ли цитруллин таким образом, что подавляет активное метилирование по аргининам, или же он репрессирует транскрипцию путем активного рекрутирования белков? Как обстоит дело с обратимостью вставки цитруллина? Это несомненно происходит на промоторах с очень высокой скоростью, но есть ли это ферментативно катализируемая реакция или же это просто обусловлено замещением нуклеосомных гистонов гистоновыми вариантами, которые содержат аргинин на месте цитруллина?

 

6. Убиквитилирование/ деубиквитилирование и сумоилирование

Убиквитин и SUMO — совершенно иные PTMs по сравнению с ацетилированием, фосфорилированием и метилированием. В то время как эти последние PTMs представляют собою малые химические группы, Ub и SUMO — это крупные полипептиды, которые увеличивают размеры гистона приблизительно на две трети. Ub и SUMO на 18 % идентичны по нуклеотидной последовательности и имеют общую трехмерную структуру, но различаются по поверхностному заряду.

Гистоны были первыми белками, для которых было показано, что они моноубиквитилированы, хотя точное положение Ub не было идентифицировано до сравнительно недавнего времени (Robzyk et al., 2000; Wang et al., 2004). Подобно метилированию и в отличие от ацетилирования и фосфорилирования (и, возможно, сумоилирования) убиквитилирование может быть либо репрессивным, либо активирующим в зависимости от специфических сайтов. Н2А и Н2В моноубиквитилированы, что контрастирует с полиубиквитилированием, ассоциированным с протеолизом. Влияние моноубиквитилирования на каждый коровый гистон противоположно (рис. 10.7). Моноубиквитилирование Н2В является активирующим для транскрипции, преобразованной RNF20/RNF40 + UbcH6) (Wood et al., 2003; Kim et al., 2005; Zhu et al., 2005), и ведет к метилированию H3K4, как описано в предыдущем разделе и в следующем разделе (Henry et al., 2003; Као et al., 2004). Эта последовательность событий, хотя пока еще непонятная в механистическом плане, консервативна от дрожжей до человека (Kim et al., 2005; Zhu et al., 2005). С другой стороны, у млекопитающих H2AK119ubl является репрессивным для транскрипции и катализируется белком В mi 1/Ring 1 из группы Polycomb (Wang et al., 2004). Нет никаких данных в пользу эволюционного консерватизма репрессивного H2Aub у дрожжей.

До сих пор не идентифицирован ни один специфичный для гистонов белок, связывающий убиквитин. Однако поскольку было документировано, что многочисленные домены взаимодействия с убиквитином связываются с негистоновыми убиквитилированными субстратами, кажется весьма вероятным, что будут обнаружены эффекторы для убиквитилированных гистонов. Однако они могут взаимодействовать иным образом, чем взаимодействующие с хроматином домены для ацетилирования и метилирования; т.е., вероятно, имеются два типа одновременных связывающих взаимодействий; одно с поверхностью на убиквитине и другое взаимодействие внутри гистоновых последовательностей для обеспечения специфичности взаимодействия.

Деубиквитилирование сайта H2BK123 участвует и в активации, и в поддержании гетерохроматинового сайленсинга через действие двух различных протеаз, Ubp8 и UbplO. Ubp8 является субъединицей комплекса ацетилирования гистонов, SAGA (Sanders et al., 2002), и действует вслед за убиквитилированием, производимым Rad6 (Henry et al., 2003; Daniel et al., 2004). Эта последовательность убиквитилирования H2B, за которым следует деубиквитилирование, необходима для установления соответствующих уровней метилирования H3K4 (требуется H2Bub) и H3K36 (H2Bub не требуется) (Henry et al., 2003). UbplO функционирует в «молчащих» районах, поддерживая низкие уровни H3K4me и ацетилирования лизинов H3/Н4, и таким образом помогает предотвращать транскрипцию (Emre et al., 2005; Gardner et al., 2005).

Рис. 10.7. Сайты убиквитилирования гистонов и его последствия для регулирования транскрипции

Убиквитилирование Н2А по Lys-119 коррелирует с репрессией транскрипции. Убиквитилирование H2BK123, наоборот, связано с активацией транскрипции

Сумоилирование является единственной НРТМ, описанной у дрожжей в качестве репрессивной, и оно консервативно у млекопитающих (Shiio and Eisenman, 2003). Его роль может сводиться, в целом, к негативному действию по предотвращению действия активирующих HPTMs. Это подавление активных HPTMs может осуществляться двумя механизмами. Во-первых, SUMO-гистон может прямо блокировать лизиновые сайты-субстраты, которые могут ацетилироваться или же сумоилироваться (как в модели 2 на рис. 10.1). Во-вторых, сумоилированные гистоны могут рекрутировать HDACs как к хроматину (модель 3), так и через группу SUMO, которая оказывается на связанных с ДНК репрессорах.

 

7. Темы в модификациях

 

Предшествовавшее обсуждение многочисленных типов и сайтов гистоновых РТМ, происходящих в транскрипции, могло бы привести к выводу, что всеохватывающих руководящих принципов или идей здесь немного. Тем не менее, по-видимому, действительно есть некоторое число широких тем, которые повторяются, хотя специфика может меняться в зависимости от гистона, сайтов НРТМ и связывающихся белков. Действительно, регулирование хроматина может варьировать в разных промоторах и отдельных путях.

 

7.1. Гистоновый код

После этого затянувшегося обсуждения сложностей HPTMs возникает один ключевой вопрос: почему существует так много модификаций? Несомненно, что многие из них коррелируют с транскрипцией, а другие происходят во время различных матрицируемых ДНК процессов. Таким образом, одна гипотеза заключается в том, что существует гистоновый «код», сопрягающий специфические модификации с индивидуальными процессами (Strahl and Allis, 2000; Turner, 2000). Простейшим кодом могло бы быть бинарное отношение между HPTMs и активацией либо репрессией генов и отдельные HPTMs для других процессов. Данными в пользу такого кода является, как описано выше, наблюдаемая тенденция для одних HPTMs быть позитивно действующими, а для других — негативно действующими. Однако имеются наблюдения, которые не согласуются с простым бинарным кодом. Например, фосфорилирование H3S10 является как активирующим транскрипцию, что предположительно связано с раскрытием хроматина, так и участвующим в конденсации хромосом, делая хроматин еще более недоступным (Nowak and Corces, 2004). Аналогично этому недавно было показано, что уровень H3K9me возрастает во время индукции генов (Vakoc et al., 2005) в дополнение к его хорошо охарактеризованной роли в гетерохроматиновом сайленсинге. Наконец, многие из одних и тех же HPTMs возникают как в транскрипции, так и в репарации ДНК, которые в механистическом плане являются разными процессами.

На основе некоторых из этих соображений была предложена более общая гипотеза, где HPTMs служат в качестве ядерного ассоциированного с ДНК пути проведения сигнала, подобного цитоплазматическому проведению сигнала, которое генерируется и воспроизводится в основном через фосфорилирование Ser/Thr (Schreiber and Bernstein, 2002). В этой модели имеет место не строгий гистоновый код, а скорее узнавание и связывание НРТМ благодаря изобилию связывающих белок мотивов. Эта модель объясняет, каким образом любой сайт мог бы быть и активирующим, и репрессирующим и участвовать в более чем одном процессе, потому что различные связывающиеся эффекторные белки имеют сродство к одной и той же НРТМ для разных процессов.

 

7.2. Паттерны модификаций

Некоторые экспериментальные данные указывают на структурное изменение хроматина определенными HPTMs (модель 1). Это может быть результатом изменения заряда одного гистонового остатка или кластера таких остатков. Это особенно верно в тех случаях, когда остатки ацетилированы или фосфорилированы, что уменьшает положительный заряд участков гистона (см. раздел 5 главы 3). Такие c/s-изменения могут менять межнуклеосомные интервалы и снижать сродство гистонов к отрицательно заряженной ДНК, примером чего являются отрицательно заряженные пэтчи, встречающиеся на линкерном гистоне (Dou and Gorovsky, 2002). Эти типы HPTMs могут быт кумулятивными по своему влиянию, например, на транскрипционную активацию или для создания хроматиновых структур более высокого порядка, а не для производства двоичного эффекта «включено/ выключено» (Kurdistani et al., 2004; Henikoff, 2005).

Еще одна модель для «конечного результата» [«output»] мириад HPTMs сводится к тому, что код является сложным и считывается паттернами, а нередко и в форме временных последовательностей. Согласно этим взглядам, сложность паттернов в трехмерном пространстве и на протяжении какого-либо процесса, требующего многих связанных с хроматином этапов, таких, например, как транскрипция, дает осмысленный механистический результат. Были идентифицированы два типа паттернов НРТМ. Во-первых, имеются паттерны на одном и том же гистоновом «хвосте», или в «cis»-конфигурации, и, во-вторых, паттерны на разных гистоновых «хвостах», или в «trans»-конфигурации. Лучше всего охарактеризованный cis-паттерн находится между H3S10ph и H3K14ас на аминотерминальном «хвосте» (Cheung et al., 2000; Lo et al., 2000), где H3S10ph ведет к H3K14ac. Механизм, лежащий в основе установления этого паттерна, выяснен в структурных деталях: ацетилируюший фермент связывается с предварительно фосфорилированным «хвостом» H3, проявляя повышенное сродство благодаря большему числу контактных точек аминокислотной боковой цепи (Clements et al., 2003). Другими c/s-паттернам и являются ацетилирование H3K23 и метилирование H3R17 (Daujat et al., 2002) и метилирование H3R3 и ацетилирование H4K8 (Wang et al., 2001).

Как описано выше, был идентифицирован один trans-«хвостовой» паттерн, где первоначальное убиквитилирование H2BK123 ведет к метилированию H3K4 (Bnggs et al., 2002; Dover et al., 2002; Sun and Allis, 2002). Механизм, связывающий эти HPTMs, не выяснен, хотя существуют несколько возможных гипотез. Поскольку это связь от одной большой модификации (убиквитин) к несоседней НТРМ, одна из моделей предполагает, что убиквитин, как перемычка, закрепляет хроматин в открытом состоянии [ubiquitin wedges the chromatin open, like a crowbar] и делает возможным доступ метилирующего энзима к его сайту. Вторая общая модель сводится к тому, что H2BK123ub1 функционирует таким образом, что рекрутирует эффекторные белки, аналогично роли других HPTMs. Некаталитическая часть протеасомы требует для ассоциации хроматина убиквитилирования Н2В (Ezhkova and Tansey, 2004), и функционирование элонгационного комплекса FACT стимулируется убиквитилированием Н2В (Pavriet al., 2006), хотя еще не было показано, чтобы какой-либо комплекс непосредственно связывался бы с убиквитилированием Н2В.

 

7.3. Изменения в структуре хроматина, связанные с активацией транскрипции и элонгацией

Транскрипционно активные эухроматиновые районы содержат нуклеосомы, но в «развернутом» состоянии, обозначаемом как «бусинки на нити», или 11-нанометровая фибрилла. Нуклеосомы в этом состоянии все еще оказывают присущее им подавляющее влияние на транскрипционную машину. Некоторые транскрипционные факторы, будь то активаторы или репрессоры, могут получать доступ к своим сайтам, когда они содержатся в нуклеосомах, но другие этого не могут. Более того, аппарат, рекрутируемый связанными с ДНК регуляторами и ответственный за доставку RNA pol II к промоторам, ограничен присутствием нуклеосом. Ряд различных механизмов служит для реконфигурирования хроматина, приведения генов в готовность для последующей транскрипции или стимулирования инициации или элонгации. Некоторые из этих механизмов изображены на рис. 10.8.

Проблема с нуклеосомами во время транскрипции отчасти решается рекрутированием белковых комплексов для мобилизации и (или) изменения структуры нуклеосом. Эти комплексы делятся на два разных семейства: одно представлено SNF2H (или ISW1 и ISW2 у дрожжей), а другое — семейством Brahma-Swi/Snf (Narlikar et al., 2002; Peterson, 2002; Flaus and Owen-Hughes, 2004) Первое семейство мобилизует нуклеосомы, тогла как Swi/Snf также временно изменяет структуру нуклеосом. Ацетилированные нуклеосомы распознаются комплексом Swi/Snf через взаимодействие с бромодоменом (модель 1 на рис. 10.8).

Вторым механизмом, участвующим в активации генов, является избирательная утеря октамеров в промоторах. Например, у S. cerevisiae октамеры гистонов вытесняются в промоторе гена РН05 во время индукции транскрипции (модель 2 на рис. 10.8) (Boeger et al., 2003; Reinke and Horz, 2003) Кроме того, промоторы S. cerevisiae обладают конститутивно низкой плотностью нуклеосом, что делает возможным доступ для транскрипционных факторов (Sekinger et al., 2005). Все еще неизвестно, способствуют ли комплексы АТФ-зависимош ремоделинга генерированию и поддержанию этого редкого размещения, и если способствуют, то как они это делают.

Третий главный механизм, участвующий в установлении транскрипционных состояний, — это наличие вариантов гистонов. Имеются два типа вариантов гистонов, ассоциирующихся с активностью генов. Во-первых, вариант Н2А, называемый H2AZ, обнаруживается в нуклеосомах вокруг вокруг свободного от нуклеосом участка промотора [the promoter gap] и подготавливает ген к активации (Santisteban et al., 2000; Raisner et al., 2005; Zhang et al., 2005); специфичный комплекс АТФ-зависимого ремоделинга, называемый Swrl, замещает Н2А вариантом H2AZ (модель 3 на рис. 10.8) (Mizuguchi et al., 2004; дополнительные детали см. в главе 13). Во-вторых, одна из изоформ H3, называемая Н3.1, во время репликации инкорпорируется в хроматин, тогда как изоформа H3.З инкорпорируется не зависящим от репликации образом (Ahmad and Henikoff, 2002), с помощью шаперона HIRA (histone regulator А). Этот вариант преимущественно обнаруживается внутри ORFs генов (Mito et al., 2005), заставляя полагать, что его размещение является процессом, сочетанным с транскрипцией.

Для преодоления нуклеосомного барьера для элонгации RNA pol II (и RNA pol I) существуют дополнительные механизмы. Было изолировано большое число факторов, влияющих на транскрипционную элонгацию (Sims et al., 2004). Обнаружили, что один из этих факторов позволяет RNA pol II преодолевать нуклеосомы. Этот фактор известен как FACT (аббревиатура от Facilitate Chromatin Transcription). Важно, что FACT функционирует исключительно через посредство нуклеосом, связывается с ними и затем стимулирует смещение одного димера Н2А/Н2В (модель 4 на рис. 10.8) (Belotserkovskaya et al., 2003). Коль скоро транскрипция прекращается, FACT также стимулирует реконституцию нуклеосомы. Интересно, что FACT осуществляет свои функции в отсутствие энергии, но физически взаимодействует с CHD1, белком, который гидролизует АТФ для мобилизации нуклеосом и связывания с активной меткой H3K4те. Более того, FACT также взаимодействует с NuA4 — комплексом, содержащим активность HAT. Хотя FACT может способствовать смещению димера Н2А/Н2В in vitro независимым от АТФ образом, возможно, что это стимулируется его взаимодействием с такими факторами, как CHD1, которые мобилизуют или изменяют структуру нуклеосом in vivo, а также взаимодействие с HPTMs (Reinberg and Sims, 2006).

Рис. 10.8. Модели участия ремоделинга хроматина и обмена гистонов в процессах транскрипции

В модели 1 семейство АТФаз Swi/Snf связывается с хроматином посредством узнавания ацетилированных гистонов с помощью бромодомена и действует таким образом, чтобы изменить локальную структуру хроматина. Модель 2 изображает замещение октамера [the reported octamer eviction], происходящее в некоторых локусах, таких как РН05, с помощью неизвестного механизма. В модели 3 АТФаза SWR1 катализирует замещение гистона Н2А вариантом H2AZ. который подготавливает хроматин к транскрипции. В модели 4 делается акцент на участии FACT в транскрипционной элонгации, что способствует развертыванию [unraveling] за счет смещения димера Н2А/Н2В. Это может сопровождаться обменом гистона H3 на H3.З в ходе этого процесса

 

8. Заключительные замечания

Мы прошли долгий путь в эту «современную эпоху» модификаций гистонов, охватывающую последние 10 лет. В это время были охарактеризованы шесть разных типов путей модификации гистонов и идентифицированы многочисленные сайты модификаций. Тем не менее очевидно, что это все еще лишь начало нашего понимания проблемы. В механистическом плане нам известно, что модификации влияют на связывание белков, но мы все еще не знаем, как именно эти белки приводят к реорганизации структуры хроматина. Мы все еще не знаем, существует ли код или же модификации являются просто частью сигнального пути. Кроме того, у нас недостает знаний о многих клеточных процессах помимо транскрипции, в которых могут участвовать модификации. Таким образом, говоря коротко, мы узнали о сложности этой системы, но мы все еще далеки от понимания смысла этой сложности. Одно можно сказать наверняка: усилия оправданны, ибо модификации гистонов играют фундаментальную роль и в нормальных процессах, и в процессах, связанных с заболеваниями.

 

Литература

Ahmad K. and HenikoffS., 2002. The histone variant H3.3 marks active chromatin by replication-independent nucleosome assembly. Mot Cell 9: 1191-1200.

An W., Kim J., and Roeder R.G., 2004. Ordered cooperative functions of PRMT1, p300, and CARM1 in transcriptional activation by p53. Cell 117: 735-748.

Baek S.H. and Rosenfeld M.G., 2004. Nuclear receptor coregulators: Their modification codes and regulatory mechanism by translocation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319: 707-714.

Bannister A.J., Schneider R., and Kouzarides T., 2002. Histone modification: Dynamic or static? Cell 109: 801-806.

Bannister A.J., Zegerman R, Partridge J.F., Miska E.A., Thomas J.O., Allshire R.C., and Kouzarides T., 2001. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature 410: 120-124.

Bauer U.M., Daujat S., Nielsen S.J., Nightingale K., and Kouzarides T., 2002. Methylation at arginine 17 of histone H3 is linked to gene activation. EMBO Rep. 3: 39-44.

Belotserkovskaya R., Oh S., Bondarenko V.A., Orphanides G., Studitsky V.M., and Reinberg D., 2003. FACT facilitates transcription-dependent nucleosome alteration. Science 301: 1090-1093.

Boeger H., Griesenbeck J., Strattan J.S., and Komberg R.D., 2003. Nucleosomes unfold completely at a transcriptionally active promoter. Mol. Cell 11: 1587-1598.

Braunstein M., Rose A.B., Holmes S.G., Allis C.D., and Broach J.R. 1993. Transcriptional silencing in yeast is associated with reduced nucleosome acetylation. Genes Dev. 1: 592-604.

Briggs S.D., XiaoT., SunZ.W., Caldwell J.A., Shabanowitz J., Hunt D.F., Allis C.D., and Strahl B.D., 2002. Gene silencing: Trans-histone regulatory pathway in chromatin. Nature 418: 498.

Brownell J.E., Zhou J., RanalliT., Kobayashi R., Edmondson D.G., Roth S.Y., and Allis C.D. 1996. Tetrahymena histone acetyltrans-ferase A: A homolog to yeast Gcn5p linking histone acetylation to gene activation. Cell 84: 843-851.

Carrozza M.J., Li B., Florens L., Suganuma T., Swanson S.K., Lee K.K., Shia W.J., Anderson S., Yates J., Washburn M.P., and Workman J.L., 2005. Histone H3 methylation by Set2 directs deacetylation of coding regions by Rpd3S to suppress spurious intragenic transcription. Cell 123: 581-592.

Chen D., Ma H., Hong H., Koh S.S.. Huang S.M., Schurter B.T., Aswad D.W, and Stallcup M.R. 1999. Regulation of transcription by a protein methyltransferase. Science 284: 2174-2177.

Chen Z., Zang J., Whetstine J., HongX., Davrazou F, Kutateladze T.G., Simpson M., Mao Q., Pan C.H., Dai S., et al., 2006. Structural insights into histone demethylation by JM JD2 family members. Cell 125: 691-702.

Cheung P., Tanner K.G., Cheung W.L., Sassone-Corsi P., Denu J.M., and Allis CD., 2000. Synergistic coupling of histone H3 phosphorylation and acetylation in response to epidermal growth factor stimulation. Mol. Cell 5: 905-915.

Clark-Adams C.D., Norris D., Osley M.A., Fassler J.S., and Winston F. 1988. Changes in histone gene dosage alter transcription in yeast. Genes Dev. 2: 150-159.

Clements A., Poux A.N., Lo W.S., Pillus L., Berger S.L., and Mar-morstein R., 2003. Structural basis for histone and phosphohis-tone binding by the GCN5 histone acetyltransferase. Mol. Cell 12: 461-473.

Cloos PA., Christensen J.. Agger K., Maiolica A., Rappsilber J., Antal T., Hansen K.H., and Helin K., 2006. The putative oncogene GASC1 demethylates tri- and dimethylated lysine 9 on histone H3. Nature 442: 307-311.

Cuthbert G.L., Daujat S., Snowden A.W., Erdjument-Bromage H., Hagiwara T., Yamada M., Schneider R., Gregory P.D., Tempst P., Bannister A.J., and Kouzarides T., 2004. Histone deimination antagonizes arginine methylation. Cell 118: 545-553

Daniel J.A., Torok M.S., Sun Z.W., Schieltz D., Allis C.D., Yates J.R., III, and Grant PA., 2004. Deubiquitination of histone H2B by a yeast acetyltransferase complex regulates transcription. J. Biol. Chem. 279: 1867-1871.

Daujat S., Bauer U.M., Shah V., Turner B., Berger S., and Kouzarides T., 2002. Crosstalk between CARM1 methylation and CBP acetylation on histone H3. Curr. Biol. 12: 2090-2097.

Dhalluin C., Carlson J.E., Zeng L., He C, Aggarwal A.K., and Zhou M.M. 1999. Structure and ligand of a histone acetyltransferase bromodomain. Nature 399: 491-496.

Dou Y. and Gorovsky M.A., 2002. Regulation of transcription by H1 phosphorylation in Tetrahymena is position independent and requires clustered sites. Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 6142-6146.

Dover J., Schneider J., Tawiah-Boateng M.A., Wood A., Dean K, Johnston M., and Shilatifard A., 2002. Methylation ofhistone H3 by COMPASS requires ubiquitination ofhistone H2B by Rad6 J. Biol. Chem. 277: 28368-28371.

Durrin L.K., Mann R.K., Kayne PS., and Grunstein M. 1991. Yeast histone H4 N-terminal sequence is required for promoter activation in vivo. Cell 65: 1023-1031.

Emre N.C., Ingvarsdottir K., Wyce A., Wbod A., Krogan N. J., Henry K.W., Li K., Marmorstein R., Greenblatt J.F, Shilatifard A., and Berger S.L., 2005. Maintenance of low histone ubiquitylationby UbplO correlates with telomere-proximal Sir2 association and gene silencing. Mol. Cell 17: 585-594.

Ezhkova E. and Tansey W.P., 2004. Proteasomal ATPases link ubiq-uitylation of histone H2B to methylation of histone H3. Mol. Cell 13: 435-442.

Fabbrizio E., El Messaoudi S., Polanowska J., Paul C., Cook J.R., Lee J.H., Negre V., Rousset M., Pestka S., Le Cam A., and Sardet C., 2002. Negative regulation of transcription by the type II ai’ginine methyltransferase PRMT5. EMBO Rep. 3: 641-645.

Fischle W., Tseng B.S., Dormann H.L., Ueberheide B.M., Garcia B.A., Shabanowitz J., Hunt D.F., Funabiki H., and Allis C.D., 2005. Regulation of HP I-chromatin binding by histone H3 methylation and phosphorylation. Nature 438: 1116-1122.

Flaus A. and Owen-Hughes T., 2004. Mechanisms for ATP-depen-dent chromatin remodelling: Farewell to the tunacan octamer? Curr. Opin. Genet Dev. 14: 165-173.

Fodor B.D., Kubicek S., Yonezawa M., O’Sullivan R.J., Sengupta R., Perez-Burgos L., Opravil S., Mechtler K., Schotta G., and Jenuwein T., 2006. Jmjd2b antagonizes H3K9 tnmethylation at pericentric heterochromatin in mammalian cells. Genes Dev., 20: 1557-1562.

Gardner R.G., Nelson Z.W., and Gottschling D.E., 2005. UbplO/ Dot4p regulates the persistence of ubiquitinated histone H2B: Distinct roles in telomeric silencing and general chromatin. Mol. Cell. Biol. 25: 6123-6139.

Glozak M.A., Sengupta N., Zhang X., and Seto E., 2005. Acetylation and deacetylation of non-histone proteins. Gene 363: 15-23.

Grant P.A., Sterner D.E., Duggan L.J., Workman J.L., and Berger S.L. 1998. The SAGA unfolds: Convergence of transcription regulators in chromatin-modifying complexes. Trends Cell Biol. 8: 193-197.

Hall I.M., Shankaranarayana C.D., Noma K., Ayoub N., Cohen A., and Grewal S.L, 2002. Establishment and maintenance of a heterochromatin domain. Science 297: 2232-2237.

Hampsey M. and Reinberg D., 2003. Tails of intrigue: Phosphorylation of RNA polymerase II mediates histone methylation. Cell 113: 429-432.

Han M. and Grunstein M. 1988. Nucleosome loss activates yeast downstream promoters in vivo. Cell 55: 1137-1145.

Hassan A.H., Prochasson P., Neely K.E., Galasinski S.C, Chandy M., Carrozza M.J., and Workman J.L., 2002. Function and selectivity of bromodomains in anchoring chromatin-modifying complexes to promoter nucleosomes. Cell 111: 369-379.

Hebbes T.R., Clayton A.L., Thome A.W., and Crane-Robinson C. 1994. Core histone hyperacetylation co-maps with generalized DNase I sensitivity in the chicken beta-globin chromosomal domain. EMBO J. 13: 1823-1830.

Henikoff S., 2005. Histone modifications: Combinatorial complexity or cumulative simplicity? Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 5308-5309.

Henry K.W., Wyce A., Lo W.S., Duggan L.J., Emre N.C., Kao C.F., Pillus L., Shilatifard A., Osley M.A., and Berger S.L., 2003. Transcriptional activation via sequential histone H2B ubiquitylation and deubiquitylation, mediated by SAGA-associated Ubp8. Genes Dev. 17: 2648-2663.

Hirota T., Lipp J.J., Toh B.H., and Peters J.M., 2005. Histone H3 serine 10 phosphorylation by Aurora B causes HP1 dissociation from heterochromatin. Nature 438: 1176-1180.

JenuweinT. and Allis C.D., 2001. Translating the histone code. Science 293: 1074-1080.

Joshi A.A. and Struhl K., 2005. Eaf3 chromodomain interaction with methylated H3-K36 links histone deacetylation to Pol II elongation. Mol. Cell, 20: 971-978.

Kao C.F., Hillyer C., Tsukuda T, Henry K., Berger S., and Osley M A, 2004. Rad6 plays a role in transcriptional activation through ubiquitylation ofhistone H2B. Genes Dev. 18: 184-195.

Keogh M.C., Kurdistani S.K., Morris S.A., Ahn S.H., Podolny V., Collins S.R., Schuldiner M.. Chin K., Punna T., Thompson N.J., et al., 2005. Cotranscriptional set2 methylation ofhistone H3 lysine 36 recruits a repressive Rpd3 complex. Cell 123: 593-605.

Kim J., Hake S.B., and Roeder R.G., 2005. The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions. Mol. Cell, 20: 759-770.

Klose R.J., Yamane K., Bae Y., Zhang D., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Wong J., and Zhang Y., 2006. The transcriptional repressor JHDM3A demethylates trimethyl histone H3 lysine 9 and lysine 36. Nature 442: 312-316.

Kurdistani S.K. and Grunstein M., 2003. Histone acetylation and deacetylation in yeast. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 4: 276-284.

Kurdistani S.K., Tavazoie S., and Grunstein M., 2004. Mapping global histone acetylation patterns to gene expression. Cell 117: 721-733.

Lachner M., O’Carroll D., Rea S., Mechtler K., and Jenuwein T., 2001. Methylation ofhistone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature 410: 116-120.

Lee D.Y., Teyssier C, Strahl B.D., and Stallcup M.R., 2005. Role of protein methylation in regulation of transcription. Endocr, Rev. 26: 147-170.

Lee M.G., Wynder C., Cooch N., and Shiekhattar R., 2005. An essential role for CoREST in nucleosomal histone 3 lysine 4 demethylation. Nature 437: 432-435.

Li H., Ilin S., Wang W., Duncan E.M., Wysocka J., Allis C.D., and Patel D.J., 2006. Molecular basis for site-specific read-out of histone H3K4me3 by the BPTF PHD finger of NURF. Nature 442: 91-95.

Litt M.D., Simpson M., Gaszner M., Allis C.D., and Felsenfeld G., 2001. Correlation between histone lysine methylation and developmental changes at the chicken beta-globin locus. Science 293: 2453-2455.

Lo W.S., Duggan L., Emre N.C, Belotserkovskya R., Lane W.S., Shiekhattar R., and Berger S.L., 2001. Snfl — A histone kinase that works in concert with the histone acetyltransferase Gcn5 to regulate transcription. Science 293: 1142-1146.

Lo W.S., Trievel R.C, Rojas J.R., Duggan L., Hsu J.Y., Allis C.D., Marmorstein R., and Berger S.L., 2000. Phosphorylation of serine 10 in histone H3 is functionally linked in vitro and in vivo to Gcn5-mediated acetylation at lysine 14. Mol. Cell 5: 917-926.

Ma H., Baumann C.T., Li H., Strahl B.D., Rice R., Jelinek M.A., Aswad D.W., Allis C.D., Hager G.L., and Stallcup M.R., 2001. Hormone-dependent, CARM1-directed, arginine-specific methylation ofhistone H3 on a steroid-regulated promoter. Curr. Biol. 11: 1981-1985.

Macdonald N., Welbum J.P., Noble M.E., Nguyen A., Yaffe M.B., Clynes D., Moggs J.G., Orphanides G., Thomson S., Edmunds J.W., et al., 2005. Molecular basis for the recognition of phos-phorylated and phosphoacetylated histone H3 by 14-3-3. Mol. Cell 20: 199-211.

Mahadevan L.C., Willis A.C., and Barratt M.J. 1991. Rapid histone H3 phosphorylation in response to growth factors, phorbol esters, okadaic acid, and protein synthesis inhibitors. Cell 65: 775-783.

Martin C. and Zhang Y., 2005. The diverse functions ofhistone lysine methylation. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6: 838-849.

Metivier R., Penot C., Hubner M.R., ReidC., Brand H., Kos M., and Gannon F., 2003. Estrogen receptor directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter. Cell 115: 751-763.

Metzger E., Wissmann M., Yin N., Muller J.M., Schneider R., Peters A. H., Gunther T., Buettner R., and Schule R., 2005. LSD1 demethylates repressive histone marks to promote androgen-receptor-dependent transcription. Nature 437: 436-439.

Mito Y., Henikoff J.G., and Henikoff S., 2005. Genome-scale profiling ofhistone H3.3 replacement patterns. Nat. Genet. 37: 1090-1097.

Mizuguchi C., Shen X., Landry J., Wu W.H., Sen S., and Wu C., 2004. ATP-driven exchange of histone H2AZ variant catalyzed by SWR1 chromatin remodeling complex. Science 303: 343-348.

Nakayama J., Rice J.C., Strahl B.D., Allis C.D., and Grewal S.L, 2001. Role ofhistone H3 lysine 9 methylation in epigenetic control of heterochromatin assembly. Science 292: 110-113.

Narlikar G.J., Fan H.Y., and Kingston R.E., 2002. Cooperation between complexes that regulate chromatin structure and transcription. Cell 108: 475-487.

Noma K., Allis C.D., and Grewal S.L, 2001. Transitions in distinct histone H3 methylation patterns at the heterochromatin domain boundaries. Science 293: 1150-1155.

Nowak S.J. and Corces V.G., 2004. Phosphorylation ofhistone H3: A balancing act between chromosome condensation and transcriptional activation. Trends Genet., 20: 214-220.

Pal S., Yun R., Datta A., Lacomis L., Erdjument-Bromage H., Kumar J., Tempst P., and Sif S., 2003. mSin3A/histone deacetylase 2- and PRMT5-containing Brgl complex is involved in transcriptional repression of the Myc target gene cad. Mol. Cell. Biol. 21: 7475-7487.

Pavri R., Zhu B., Li G., Trojer P., Mandal S., Shiiatifard A., and Reinberg D., 2006. Histone H2B monoubiquitination functions cooperatively with FACT to regulate elongation by RNA polymerase II. Cell 125: 703-717.

Peterson C.L., 2002. Chromatin remodeling: Nucleosomes bulging at the seams. Curr. Biol. 12: R245-R247.

Raisner R.M., Hartley P.D., Meneghini M.D., Bao M.Z., Liu C.L., Schreiber S.L., Rando O.J., and Madhani H.D., 2005. Histone variant H2A.Z marks the 5’ ends of both active and inactive genes in euchromatin. Cell 123: 233-248.

Rea S., Eisenhaber E, O’Carroll D., Strahl B.D., Sun Z.W., Schmid M., Opravil S., Mechtler K., Pontmg C.P., Allis C.D., and Jenu-wein T., 2000. Regulation of chromatin structure by site-specific histone H3 methyltransferases. Nature 406: 593-599.

Reinberg D. and Sims R.J., III., 2006. de FACTo nucleosome dynamics. J. Biol. Chem.(in press).

Reinke H. and Horz W., 2003. Histones are first hyperacetylated and then lose contact with the activated PH05 promoter. Mol. Cell 11: 1599-1607.

Robzyk K., Recht J., and Osley M.A., 2000. Rad6-dependent ubiq-uitination ofhistone H2B in yeast. Science 287: 501-504.

Roth S.Y., Demi J.M., and Allis C.D., 2001. Histone acetyltrans-ferases. Annu. Rev. Biochem. 70: 81-120.

Sanders S.L., Jennings J., Canutescu A., Link A.J., and Weil P.A., 2002. Proteomics of the eukaryotic transcription machinery: Identification of proteins associated with components of yeast TEIID by multidimensional mass spectrometry. Mol. Cell. Biol. 22: 4723-4738.

Santisteban M.S., Kalashnikova T., and Smith M.M., 2000. Histone H2A.Z regulates transcription and is partially redundant with nucleosome remodeling complexes. Cell 103: 411-422.

Santos-Rosa H., Schneider R., Bannister A. J., Sherriff J., Bernstein B.E., Emre N.C., Schreiber S.L., Mellor J., and Kouzarides T., 2002. Active genes are tri-methylated at K4 ofhistone H3. Nature 419: 407-411.

Sassone-Corsi P., Mizzen C.A., Cheung P., Crosio C, Monaco L., Jacquot S., Hanauer A., and Allis C.D. 1999. Requirement of Rsk-2 for epidermal growth factor-activated phosphorylation of histone H3. Science 285: 886-891.

Schreiber S.L. and Bernstein B.E., 2002. Signaling network model of chromatin. Cell 111: 771-778.

Schurter B.T., Koh S.S., Chen D., Bunick G.J., Harp J.M., Hanson B.L, Henschen-Edman A., Mackay D.R., Stallcup M.R., and Aswad D.W., 2001. Methylation ofhistone H3bycoactivator-asso-ciated arginine methyltransferase 1. Biochemistry 40: 5747-5756.

Sekinger E.A., Moqtaderi Z., and Struhl K., 2005. Intrinsic histone-DNA interactions and low nucleosome density are important for preferential accessibility of promoter regions in yeast. Mol. Cell 18: 735-748.

Shi Y., Lan E., Matson C., Mulligan P., Whetstine J.R., Cole P.A., Casero R.A., and Shi Y., 2004. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell 119: 941-953.

Shi Y.J., Matson C., Lan E., Iwase S., Baba T., and Shi Y., 2005. Regulation of LSD 1 histone demethylase activity by its associated factors. Mol. Cell. 19: 857-864.

Shiio Y. and Eisenman R.N., 2003. Histone sumoylation is associated with transcriptional repression. Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 13225-13230.

Shim E.Y., Woodcock C., and Zaret K.S. 1998. Nucleosome positioning by the winged helix transcription factor HNF3. Genes Dev. 12: 5-10.

Shogren-Knaak M., Ishii H., Sun J.M., Pazin M.J., Davie J.R., and Peterson C.L., 2006. Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions. Science 311: 844-847.

Sims. R.J.. Belotserkovskaya R., and Reinberg D., 2004. Elongation by RNA polymerase II: The short and long of it. Genes Dev. 18: 2437-2468.

Sims R.J., Chen C.F., Santos-Rosa H., Kouzarides T., Patel S.S., and Reinberg D., 2006. Human but not yeast CHD1 binds directly and selectively to histone H3 methylated at lysine 4 via its tandem chromodomains. J. Biol. Chem. 51: 41789-41792.

Soloaga A., Thomson S., Wiggin G.R., Rampersaud N., Dyson M.H., Hazzalin C.A., Mahadevan L.C., and Arthur J.S., 2003. MSK2 and MSK1 mediate the mitogen- and stress-induced phosphorylation ofhistone H3 and HMG-14. EMBO J. 22: 2788-2797.

Sterner D.E. and Berger S.L., 2000. Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64: 435-459.

Strahl B.D. and Allis C.D., 2000. The language of covalent histone modifications. Nature 403: 41-45.

Strahl B.D., Briggs S.D., Brame C.J., Caldwell J.A., Koh S.S., Ma H., Cook R.G., Shabanowitz J., Hunt D.E., Stallcup M.R., and Allis C.D., 2001. Methylation ofhistone H4 at arginine 3 occurs in vivo and is mediated by the nuclear receptor coactivator PRMT1. Curr. Biol. 26: 996-1000.

Sun Z.W. and Allis C.D., 2002. Ubiquitination ofhistone H2B regulates H3 methylation and gene silencing in yeast. Nature 418: 104-108.

Svaren J., Schmitz J., and Horz W. 1994. The transactivation domain of Pho4 is required for nucleosome disruption at the PH05 promoter. EMBO J. 13: 4856-4862.

Taunton J., Hassig C.A., and Schreiber S.L. 1996. A mammalian histone deacetylase related to the yeast transcriptional regulator Rpd3p. Science 111: 408-411.

Trewick S.C., McLaughlin P.J., and Allshire R.C., 2005. Methylation: Lost in hydroxylation? EMBO Rep. 6: 315-320.

Tsukada Y., Fang J., Erdjument-Bromage H., Warren M.E., Borch-ers C.H., Tempst P., and Zhang Y., 2006. Histone demethylation by a family of JmjC domain-containing proteins. Nature 439: 811-816.

Turner B.M., 2000. Histone acetylation and an epigenetic code. Bioessays 22: 836-45.

Vakoc C.R., Mandat S.A., Olenchock B.A., and Blobel G.A., 2005. Histone H3 lysine 9 methylation and HP1* are associated with transcription elongation through mammalian chromatin. Mol. Cell 19: 381-391.

Vettese-Dadey M., Grant P.A., Hebbes T.R., Crane-Robinson C, Allis C.D., and Workman J.L. 1996. Acetylation ofhistone H4 plays a primary role in enhancing transcription factor binding to nucleosomal DNA in vitro. EMBO J. 15: 2508-2518.

Volpe T.A., Kidner C., Hall I.M., Teng G., Grewal S.L, and Mar-tienssen R.A., 2002. Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi. Science 297: 1833-1837.

Wang H., Wang L., Erdjument-Bromage H., Vidal M., Tempst P., Jones R.S., and Zhang Y., 2004. Role ofhistone H2Aubiquitination in Polycomb silencing. Nature 431: 873-878.

Wang H., Huang Z.Q., Xia L., Feng Q., Erdjument-Bromage H., Strahl B.D., Briggs S.D., Allis C.D., Wfong J., Tempst P., and Zhang Y., 2001. Methylation ofhistone H4 at arginine 3 facilitating transcriptional activation by nuclear hormone receptor. Science 293: 853-857.

Wang Y., Wysocka J., Sayegh J., Lee Y.H., Perlin J.R., Leonelli L., Sonbuchner L.S., McDonald C.H., Cook R.G., Dou Y., et al., 2004. Human PAD4 regulates histone arginine methylation levels via demethylimination. Science 306: 279-283.

Whetstine J.R., Noffice A., Lan F., Huarte M., Smolikov S., Chen Z., Spooner E., Li E., Zhang G., Colaiacovo M., and Shi Y., 2006. Reversal of histone lysine trimethylation by the JMJD2 family ofhistone demethylases. Cell 125: 467-481.

Wood A., Krogan N.J., Dover J., Schneider J., Heidt J., Boateng M.A., Dean K., Golshani A., Zhang Y., Greenblatt J.F., et al., 2003. Brel, an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter. Mol Cell 11: 267-274.

Workman J.L. and Roeder R.G. 1987. Binding of transcription factor TFIID to the major late promoter during in vitro nucleosome assembly potentiates subsequent initiation by RNA polymerase II. Cell 51: 613-622.

Wysocka J., Allis C.D., and Coonrod S., 2006a. Histone arginine methylation and its dynamic regulation. Front. Biosci. 11: 344-355.

Yamane K., Toumazou C., Tsukada Y., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Wong J., and Zhang Y., 2006. JHDM2A, a JmjC-contaimng H3K9 demethylase, facilitates transcription activation by androgen receptor. Cell 125: 483-495.

Yang X.J. and Seto E., 2003. Collaborative spirit ofhistone deacety-lases in regulating chromatin structure and gene expression. Curr. Opin. Genet. Dev. 13: 143-153.

Zhang H., Roberts D.N., and Cairns B.R., 2005. Genome-wide dynamics of Htz1, a histone H2A variant that poises repressed/ basal promoters for activation through histone loss. Cell 123: 219-231.

Zhang Y. and Reinberg D., 2001. Transcription regulation by histone methylation: Interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15: 2343-2360.

Zhu B., Zheng Y., Pham A.D., Mandal S.S., Erdjument-Bromage H., Tempst P., and Reinberg D., 2005. Monoubiquitination of human histone H2B: The factors involved and their roles in HOX gene regulation. Mol. Cell, 20: 601-611.