Steven Henikoff1 и Mitchell Smith2

1 Howard Hughes Medical Institute, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle,

Washington 98169-1024 department of Microbiology, University of Virginia, Charlottesville, Virginia 22908

Содержание:

 

Общее резюме

Гистоны упаковывают ДНК, собираясь в коровые частицы нуклеосом, тогда как ДНК оборачивается вокруг них. На протяжении эволюционного времени белки с доменом «гистонового сворачивания» (histone fold domain proteins) диверсифицировались от своих предков, представленных у архей, в четыре различные субъединицы, которые составляют знакомый октамер эукариотической нуклеосомы. Результатом дальнейшей диверсификации гистонов в разные варианты оказывается дифференцировка хроматина, могущая иметь эпигенетические следствия. Исследования эволюции, структуры и метаболизма вариантов гистонов обеспечивают основу для понимания участия хроматина в важных клеточных процессах и эпигенетической памяти.

Большинство гистонов синтезируются в фазе S для быстрой откладки позади репликационных вилок, чтобы заполнить пробелы, образовавшиеся в результате распределения предсуществовавших гистонов. Кроме того, замещение канонических гистонов S-фазы вариантами, независимо от репликации, потенциально может дифференцировать хроматин.

Дифференцировка хроматина вариантами гистонов особенно заметна в центромерах, где вариант гистона H3, CENP-A, собирается в специализированные нуклеосомы, образующие фундамент для сборки кинетохора (см. левую часть рисунка в начале главы). Центромерный аналог CENP-A, CenH3, обнаруживается у всех эукариот. У растений и животных правильная сборка содержащих CenH3 нуклеосом в центромерах не требует, оказывается, центромерных нуклеотидных последовательностей ДНК, что является замечательным примером эпигенетической наследственности. Некоторые CenH3s развились адаптивно в участках, контактирующих с ДНК, что позволяет предполагать, что центромеры конкурируют друг с другом и что CenH3s и другие специфичные для центромеры белки, связывающиеся с ДНК, адаптировались в ответ на это. Этот процесс мог бы объяснить большие размеры и сложность центромер у растений и животных.

Хроматин может быть дифференцированным и вне центромер путем включения конститутивно экспрессируемой формы гистона H3, называемой H3.3, которая является субстратом для независимой от репликации сборки нуклеосом. Замещение вариантом H3.3 происходит в активных генах (см. правую часть рисунка в начале главы, где зеленым цветом изображен H3.3 на хромосоме плодовой мушки); это динамический процесс с потенциальными эпигенетическими следствиями. Различия между H3 и H3.3 по их наборам ковалентных модификаций могут лежать в основе изменений в свойствах хроматина в активно транскрибируемых локусах.

Несколько вариантов Н2А также могут дифференцировать или регулировать хроматин. Н2А.Х определяется как вариант по 4-аминокислотному карбокситерминальному мотиву, в котором остаток серина является сайтом для фосфорилирования в сайтах двухнитевых разрывов ДНК. Фосфорилирование Н2АХ является ранним событием в репарации двухнитевых разрывов, где, как считают, он концентрирует компоненты репарационной машины. Фосфорилирование Н2АХ также маркирует неактивный бивалент XY во время сперматогенеза млекопитающих и требуется для конденсации, спаривания и фертильности.

H2AZ — это структурно отклоняющийся вариант, который долгое время был загадкой. Исследования на дрожжах позволили считать, что H2AZ устанавливает транскрипционную компетентность и противодейству ет сайленсингу гетерохроматина. Биохимический комплекс, замещающий Н2А вариантом H2AZ в нуклеосомах, является АТФ-зависимым ремоделером нуклеосом, представляя первый пример специфической функции у члена этого многообразного класса ассоциированных с хроматином машин.

Два варианта, специфичных для позвоночных, macroН2А и H2ABbd, проявляют контрастирующие особенности, будучи упакованы в нуклеосомы in vitro: macroH2A препятствует, a H2ABbd облегчает транскрипцию. Эти особенности согласуются с паттернами их локализации на эпигенетически инактивированной Х-хромосоме млекопитающих, где macroH2A много, а Н2АBbd мало.

На основании результатов этих исследований складывается представление, что варианты гистонов и процессы, откладывающие их в нуклеосомы, обеспечивают первичную дифференцировку хроматина, которая может служить основой для эпигенетических процессов.

 

1. У всех организмов ДНК упаковывается архитектурными белками

Огромная длина двойной спирали ДНК по отношению к размерам содержащей ее органеллы требует плотной упаковки, и для этой цели развились архитектурные белки. Первый уровень упаковки укорачивает двойную спираль и защищает ее от повреждений, но все еще предоставляет ДНК-полимеразе полный доступ к каждой паре оснований в каждом клеточном цикле. Кроме того, эти архитектурные белки облегчают сворачивание более высокого порядка, чтобы еще больше сократить длину хромосомы. Возможно из-за жестких требований к упаковке ДНК почти у всех клеточных форм жизни обнаруживаются лишь два структурных класса архитектурных белков (Malik and Henikoff, 2003). Бактериальная ДНК упакована белками HU, эукариотическая ДНК — гистонами, а ДНК архей упакована либо белками HU, либо гистонами.

Гистоны упаковывают ДНК в нуклеосомные частицы, и эта архитектурная роль может объяснить тот факт, что гистоны составляют половину массы эукариотической хромосомы. Однако было также обнаружено, что гистоны играют многообразные роли в экспрессии генов, сегрегации хромосом, репарации ДНК и других базовых хромосомных процессах у эукариот. Специфические требования, предъявляемые этими хромосомными процессами, привели к развитию разных вариантов гистонов. Включение вариантного гистона в нуклеосому представляет потенциально глубокое изменение хроматина. Действительно, недавние работы показали, что некоторые варианты гистонов откладываются разными комплексами сборки нуклеосом, что позволяет предполагать, что хроматин диверсифицируется, по крайней мере частично, включением и замещением вариантов гистонов.

Четыре коровых гистона различаются в отношении их склонности диверсифицироваться в варианты. Например, у человека имеется только один изотип Н4, но несколько паралогов Н2А с разными свойствами и функциями. Очевидно, разное положение коровых гистонов в нуклеосомной частице подвергало их действию разных эволюционных сил, приводя к важным диверсификациям Н2А и H3, но не Н2В и Н4. Наличие геномных последовательностей от самых разнообразных эукариот позволяет нам сделать вывод, что эти диверсификации произошли в разное время в ходе эволюции эукариот. Однако явная диверсификация анцестрального белка «гистоновой свертки» (histone fold protein) в знакомые четыре коровых гистона должна была произойти на ранних этапах эволюции эукариотического ядра или даже, возможно, еще раньше. Рассматривая эти древние события, мы узнаем о тех силах, которые привели к последующей диверсификации в современные варианты.

 

2. Эукариотические коровые гистоны развились из гистонов архей

Эукариотическая нуклеосома представляет собой сложную структуру, состоящую из октамера четырех коровых гистонов, обернутого почти два раза ДНК; «хвосты» гистонов и линкерные гистоны опосредуют разнообразные упаковочные взаимодействия вне коровой частицы (Arents et al., 1991; Wolffe, 1992; Luger et al., 1997). Нуклеосомы архей гораздо проще, и очевидно, что они похожи на анцестральную частицу, из которой развились эукариотические нуклеосомы (Malik and Henikoff, 2003). Нуклеосома архей состоит из белков с доменом «гистонового сворачивания» (histone fold domain proteins), которые не имеют «хвостов» и образуют тетрамерную частицу, обернутую лишь одним витком ДНК. Родство между нуклеосомами архей и эукариот можно видеть, сравнивая их структуры: остов [backbone] тетрамера архей почти накладывается на остов тетрамера (H3•Н4)2 (рис. 13.1). Когда нуклеосомы архей реконструируются и формируют хроматин, получающаяся фибрилла ведет себя подобно «тетрасомам» (H3•Н4). Поэтому полагают, что эукариотические нуклеосомы развились из нуклеосом архей путем добавления димеров Н2А•Н2В с каждой стороны тетрасомы, чтобы сделать возможным второй виток ДНК, и путем приобретения гистоновых «хвостов». Кроме того, ДНК сворачивается в правую суперспираль вокруг коров архей, но в левую суперспираль вокруг эукариотических коров.

Дальнейшее проникновение в происхождение эукариотических нуклеосом становится возможным благодаря изучению субъединичных структур нуклеосом архей. В то время как большинство гистонов архей являются недиффернцированными мономерами или дифференцированы в структурно взаимозаменяемые варианты, которые сходятся вместе и формируют тетрамер, некоторые из них представляют собой димерные слияния типа «голова к хвосту», которые сходятся вместе и образуют димер из слившихся димеров (рис. 13.1). Когда два из этих слившихся димеров собираются в нуклеосомную частицу каждый член слившейся пары находится в структурно различимой позиции. Занимая различные позиции в частице, каждый член слившегося димера архей развивается независимо, давая ему возможность адаптироваться к одной позиции в нуклеосомной частице. Напротив, мономеры, занимающие взаимозаменяемые позиции, не обладают свободой для адаптации к определенным позициям. Действительно, два члена димеров архей дивергировали друг от друга в обеих независимых линиях, в которых они обнаруживаются. Этот процесс представляет возможный сценарий дифференцировки анцестрального белка с доменом «гистонового сворачивания» (histone fold domain protein) в четыре различные субъединицы, занимающие различные положения в эукариотической нуклеосоме. Подобно их предполагаемым предкам у архей эукариотические гистоны образуют димеры, где Н2А димеризуется с Н2В, а H3 — с Н4 (который также стабильно тетрамеризуется в растворе). При разрешении 2 Е структурный остов (backbone) гистонового димера у архей накладывается на остовы Н2А•Н2В и H3•Н4, причем первый член этого димерного повтора накладывается на Н2А или H3, а второй член — на Н2В или Н4. Поэтому, хотя у всех четырех эукариотических гистонов отсутствует сколько-нибудь существенное сходство по нуклеотидной последовательности друг с другом и с гистонами архей, это поразительное структурное наложение димерных единиц заставляет предполагать, что эукариотические гистоны развились и дифференцировались из более простых предков, бывших у архей.

Рис. 13.1. Модель эволюции эукариотической нуклеосомы из предкового дублетного гистона (doublet histone ancestor) архей

Тетрамер архей с взаимозаменяемыми субъединицами А и В (А/В) мог развиться в димер слившихся димеров («дублет»). За этим могло бы следовать расшепление [split] гена, чтобы дать начало эукариотическому тетрамеру H3 и Н4, формирующему «тетрасому» (H3•Н4), которая занимает один виток ДНК. Н2А и Н2В могли возникнуть в результате аналогичного события, собираясь над тетрамером и под ним, как предполагается на рисунке, в результате чего становятся возможными два витка ДНК (не изображено). Одиночные точки в верхней части диаграммы изображают контакты димеров, а двойные точки — четырехспиральные пучки между соседними димерами (Перепечатано из: Malik and Henikoff 2003)

Асимметрия димеров Н2А•Н2В и H3•Н4, происходящая. по-видимому, от тандемных димеров архей. могла проложить путь для последующей диверсификации вариантов эукариотических гистонов. И Н2А. и H3 соответствуют первому члену тандемных гистоновых димеров у архей, и оба впоследствии многократно диверсифицировались в эволюции эукариот. Напротив, Н2В и Н4 соответствуют второму члену и продемонстрировали очень незначительную функциональную диверсификацию (Н2В) или вовсе никакой (Н4). И H3, и Н2А образуют гомодимерные контакты в октамере (рис. 13.2), тогда как Н4 и Н2В контактируют лишь с другими гистонами. В результате изменения в остатках, вовлеченных в гомодимеризацию либо Н2А, либо H3, могут потенциально сопротивляться образованию смешанных октамеров, позволяя нуклеосомам, содержащим вариант Н2А или H3, развиваться независимо от родительских нуклеосом. Например, четырехспиральный пучок (four-helix bundle), охватывающий интерфейс между молекулами H3, определяет левостороннее суперскручивание ДНК вокруг нуклеосомы (Arents et al., 1991; Luger et al., 1997), тогда как в нуклеосомах архей супервитки ДНК являются правосторонними (Marc et al., 2002). Очевидно, мутация этого четырехспирального пучка у предка H3 была ответственна за эту реверсию. В целом структурные особенности, облегчавшие независимую эволюцию субъединиц, могли быть предпосылками для диверсификации нуклеосомных частиц.

Рис. 13.2. Локализация гистона Н3 (синий цвет) и Н2А (корич­ невый цвет) в коровой частице нуклеосомы

Четыре остатка, различающиеся у вариантов НЗ, показаны желтым цветом (перепечатано, с любезного разрешения, из: Henikoff and Ahmad 2005)

Хотя мы можем дать рациональное объяснение происхождению эукариотических коровых гистонов от тандемных димеров архей, остаются другие основные вопросы. Откуда появились «хвосты» гистонов? Когда вышли на сцену Н2А•Н2В? Произошли ли эти события до, во время или после возникновения эукариотического ядра? Почему все известные нуклеосомы архей состоят из тетрамеров с одним витком, тогда как эукариотические нуклеосомы состоят из октамеров с двумя витками? Почему поменялось направление суперспирали? Возможно, изучение большего числа архей и м примитивных эукариот позволит обнаружить промежуточные формы, которые смогут дать ответ на эти вопросы.

 

3. Основная масса гистонов откладывается после репликации ДНК

Для упаковки по существу всей ДНК эукариотической клетки в нуклеосомы необходимо, чтобы хроматин дуплицировался, когда реплицируется ДНК (рис. 13.3). Таким образом, канонические гистоны продуцируются в фазе синтеза ДНК клеточного цикла (фазе S). Сопряжение синтеза гистонов с синтезом ДНК в фазе S находится под строгим контролем клеточного цикла (Marzluff and Duronio, 2002). Это особенно очевидно у животных, где специальный процессинг гистоновых транскриптов малым ядерным рибонуклеопротеидным комплексом U7 и стабилизация иРНК белком SLBP (stem-loop-binding protein) вносят вклад в тесную координацию синтеза гистонов с репликацией ДНК. Весьма вероятно, что необходимость в быстром и массивном производстве гистонов в фазе S ответственна за тот факт, что сопряженные с репликацией (RC, replication-coupled) гистоны у животных закодированы в кластерах, содержащих много гистоновых генов.Например, в геноме человека имеется 14 генов Н4, большинство из которых находятся в двух главных кластерах, где эти гены Н4 чередуются с генами других гистонов RC (Marzluff et al., 2002). У животных гистоны RC узнаются по наличию 3’-последовательности длиной 26 п.о., которая образует структуру «стебель-петля (stem-loop)» для распознавания комплексом SLBP при транскрипции в гистоновую иРНК. Канонические гистоны растений тоже кодируются множественными генами и откладываются в фазе S, хотя транскрипты растительных гистонов полиаденилированы, а аналог SLBP, по-видимому, отсутствует.

В той мере, в какой эпигенетическая наследственность является результатом наследования «состояния» хроматина, процесс сборки нуклеосом RC представляет исключительный интерес. Биохимия этого процесса была выяснена, когда были разработаны системы in vitro, способные собирать нуклеосомы на реплицирующейся ДНК. Эти исследования показали, что трех-субъелиничный комплекс, фактор сборки хроматина I (CAF-I, chromatin assembly factor I) действует как гистоновый шаперон, облегчающий включение H3•Н4 в качестве первого этапа сборки нуклеосом (Loyola and Almouzni, 2004). Было показано, что CAF-1 взаимодействует с фиксатором репликационной процессивности (replication processivity clamp), PCNA, что означает, что репликация ДНК и сборка RC происходят в тесной близости. Работы на почкующихся дрожжах показали, что ни одна из субъединиц комплексов, участвующих в сборке RC in vitro, не является существенной для роста; это позволяет предполагать, что in vivo существуют избыточные механизмы для сборки RC. Тот факт, что большая часть хроматина дрожжей собирается независимым от репликации (RI, replication-independent) образом (Altheim and Schultz, 1999), дает разумное объяснение для этой явной избыточности. Как показано ниже, варианты гистонов, как правило, откладываются путем RI-сборки нуклеосом.

Рис. 13.3. Старые нуклеосомы (темные диски) случайно распределяются позади репликационной вилки, а новые нуклеосомы (светлые диски) откладываются в образующиеся бреши

Опосредованная CAF-1 сборка нуклеосом изображена, с увеличением, на ведущей и отстающей нитях. ДНК-полимераза ( зеленый цвет ); фиксатор поступательного хода репликации, PCNA (синее кольцо); тетрамеры гистонов H3•Н4 ( розовый цвет ); вновь синтезированная ДНК ( красный цвет )

У почкующихся дрожжей RC-сборка не является полностью избыточной. Интригующим оказалось открытие, что отсутствие большой субъединицы CAF-1 ведет к утрате эпигенетического сайленсинга в теломерах (Loyola and Almouzni, 2004). Эта связь между RC-сборкой и эпигенетическим сайленсингом была распространена и на Arabidopsis, где утрата субъединиц CAF-1 приводит к ряду дефектов, которые можно приписать утере эпигенетической памяти. Хотя механистическая основа этих наблюдений неизвестна, кажется очевидным, что правильная откладка новых нуклеосом позади репликационной вилки важна для поддержания эпигенетически сайленсированного состояния.

Предпосылкой эпигенетической наследственности нуклеосомного состояния является тот факт, что предсуществовавшие нуклеосомы после репликации должны быть распределены по дочерним хроматидам (рис. 13.3). Действительно, так оно и есть: детальные исследования показали, что старые нуклеосомы наследуются дочерними хроматидами интактными и очевидно случайным образом (рис. 13.3) (Annunziato, 2005). Однако этот процесс наследования плохо понят, как и процесс, посредством которого новые гистоны могли бы приобретать эпигенетическую информацию. Популярная модель состоит в том, что новые нуклеосомы модифицируются в результате того, что они находятся вблизи старых нуклеосом (Jenuwein, 2001), однако данные в пользу этого гипотетического процесса отсутствуют, и необходимо рассматривать альтернативные средства воспроизведения эпигенетического состояния (Henikoff and Ahmad, 2005). Каким образом эпигенетическая информация наследуется дочерними клетками, остается главным невыясненным вопросом биологии, и изучение вариантов гистонов и механизмов их откладки может дать ответ на этот вопрос

 

4. Варианты гистонов откладываются на протяжении всего клеточного цикла

Как мы видели, коровые гистоны можно классифицировать на основе их анцестральной последовательности и положения в нуклеосоме. Линкерные гистоны характеризуются доменом winged helix, а не доменом histone fold, и связываются с линкерной ДНК, разделяющей нуклеосомы (Wolffe, 1992). Хотя существуют минорные варианты этих канонических гистонов, они оказываются взаимозаменимыми с основной формой. Например, Н3.1 и Н3.2 различаются одной аминокислотой, и не известно, чтобы это придавало разные биологические свойства этим двум изоформам. Существование множественных генов, производящих большие количества канонических гистонов для откладки в фазе S, является типичным для эукариотических геномов. Почти повсеместная встречаемость и подавляющее изобилие канонических S-фазных гистонов привело к тому, что до последнего времени вариантам гистонов уделяли относительно мало внимания.

Возрождение интереса к вариантам гистонов явилось отчасти результатом осознания, что они отличаются от канонических S-фазных гистонов таким образом, что это может приводить к глубокой дифференцировке хроматина. Одно из различий между ними — различие в способе их включения в хроматин. RC-сборка вставляет новые нуклеосомы в бреши между старыми нуклеосомами по всему геному, тогда как RI-сборка связана с локальным замещением существующей нуклеосомы или субъединицы (Marzluff et al., 2002). Поэтому RI-сборка потенциально способна переключать состояние хроматина путем замещения канонического гистона его вариантом. Замещение одного гистона другим могло бы также стирать или изменять паттерн посттрансляционных модификаций. Следовательно, RI-сборка потенциально способна «перезагружать» эпигенетические состояния, которые, как полагают, опосредуются гистонами и их модификациями. Недавние успехи в изучении вариантов гистонов и процессов, с помощью которых они откладываются, привели к углублению наших представлений об основах эпигенетической наследственности и ремоделинга. Ниже мы обсудим особенности конкретных вариантов гистонов, обусловливающие их вклад в дифференцировку хроматина и, возможно, связанные с воспроизведением эпигенетической информации.

 

5. Центромеры идентифицируются специальным вариантом H3

Определяющей особенностью эукариотической хромосомы является центромера, которая служит местом прикрепления микротрубочек веретена во время митоза. Первыми центромерами, описанными на молекулярном уровне, были центромеры почкующихся дрожжей (Saccharomyces cerevisiae), где последовательность длиной 125 п.о. необходима и достаточна для формирования центромеры (Amor et al., 2004а). Однако центромеры растений и животных очень различаются, состоя, как правило, из мегабазных порядков коротких тандемных повторов. В отличие от ситуации с почкующимися дрожжами роль нуклеотидной последовательности ДНК в этих сложных центромерах неясна, поскольку известно, что полностью функциональные неоцентромеры образуются у человека спонтанно в эктопических сайтах, полностью лишенных последовательностей, похожих на центромерные повторы (рис. 13.4). Эти и другие наблюдения говорят против прямой роли последовательности ДНК в определении локализации центромер (глава 6)

Ключевое проникновение в идентичность и наследование центромер пришло в результате идентификации варианта гистона H3, CENP-A (рисунок в начале главы). который оказался специфически локализованным в центромерах и включенным в нуклеосомные частицы вместо самого H3 (Palmer et al., 1991). Замечательно, что CENP-A остается связанным с центромерами при переходе от гистонов к протаминам во время сперматогенеза, когда, в сущности, все другие гистоны утрачиваются (Palmer et al., 1990). Это раннее наблюдение в исследовании CENP-A позволяет предполагать, что CENP-A вносит вклад в центромерную идентичность мужского генома. Общее значение этого факта не было полностью оценено, пока не осознали, что CENP-A является гораздо более хорошим маркером для центромер, чем нуклеотидная последовательность ДНК (Armor et al., 2004а), и что аналоги CENP-A можно найти в геномах всех эукариот (рис. 13.5) (Malik and Henikoff, 2003). Таким образом, хотя центромеры почкующихся дрожжей определяются по консенсусной последовательности длиной 125 п.о., это также сайт центромерной нуклеосомы, который содержит вариант Cse4 центромерного H3 (CenH3). У дробянковых дрожжей (Schizosaccharomyces pombe) группа содержащих CenH3 нуклеосом занимает центральный коровый район центромеры, фланкированный содержащими H3 нуклеосомами, обнаруживающими характерные черты гетерохроматина (Armor et al., 2004а). У мух и позвоночных CenH3s присутствуют в виде порядков [arrays], чередующихся с содержащими H3 порядками, которые демонстрируют уникальный паттерн модификаций гистонов (Sullivan and Karpen, 2004). Чередование может объяснять тот факт, что центромеры занимают лишь внешний край центромерной перетяжки метафазных хромосом (рисунок в начале главы) Это согласуется с наблюдением, что у «голокинетических» хромосом червей микротрубочки прикрепляются по всей длине каждой анафазной хромосомы, а CenH3 занимает ведущий край по всей ее длине (рис. 13.5, справа) (Malik and Henikoff, 2003). Действительно, оказалось,что уникальный вариант CenH3 точно маркирует центромеру у всех изученных в этом отношении эукариот. Эта очевидная повсеместность и присутствие центромер для осуществления митоза у всех эукариот указывает на возможность происхождения первого канонического H3 из CenH3.

Рис. 13.4. Неоцентромеры человека (указаны стрелками) лишены центромерной ?-сателлитной ДНК, но имеют CENP-A и гетерохроматин

AHTH-CENP-A-окрашивание зеленым цветом и анти-CENP-B-окрашивание красным цветом (который маркирует ?-сателлитную ДНК) идентифицируют неоцентромеру хромосомы 4, которая лишена ?-сателлита ( основная часть рисунка ) Эта хромосома 4 в остальных отношениях нормальна и передавалась на протяжении, по крайней мере, трех мейотических поколений нормальных особей Врезка изображает анти-НР1-окрашивание, которое показывает, что несмотря на отсутствие сателлитной ДНК гетерохроматин формируются вокруг активных неоцентромер. (Перепечатано, с любезного разрешения, из: Armor et al., 2004b [©National Academy of Sciences])

Генетические эксперименты на разных эукариотах подтвердили существенное значение CenH3 для формирования кинетохора и для расхождения хромосом (Amor et al., 2004а). Поскольку CenH3-содержащие нуклеосомы остаются на месте на протяжении всего клеточного цикла, они образуют фундамент для сборки других кинетохорных белков во время митоза и мейоза (глава 6). Чрезвычайно важным вопросом в исследованиях хромосом является вопрос о том, каким именно образом эти белки взаимодействуют, с тем чтобы обеспечить сцепление между центромерой и микротрубочками веретена, которое может противостоять сильным тянущим силам, прилагаемым к кинетохорам в анафазе. У дрожжей были идентифицированы несколько десятков специфичных для кинетохора белков (дополнительные детали см. в главе 6), хотя то, каким образом они взаимодействуют с содержащими CenH3 нуклеосомами и другими базовыми белками, такими как CENP-C, в настоящее время неизвестно. Еще одним вызовом является расшифровка процесса сборки CenH3 в нуклеосомы Тот факт, что центромеры составляют такую маленькую долю всего хроматина, затруднило биохимические подходы к этой замечательной проблеме, но мы надеемся, что совершенствующиеся технологии приведут к лучшему пониманию структуры и динамики кинетохор.

Рис. 13.5. Центромерные варианты H3 у модельных эукариот

( Слева ) Хромосома человека, окрашенная антителами против специфичного для центромеры варианта гистона H3, CENP-A ( зеленый цвет ), и анти-CENP-B ( красный цвет ), маркирующий ?-сателлитную ДНК (любезно предоставлено Peter Warburton). (В центре) У Drosophila melanogaster анти-CenH3-антитела (красный цвет) окрашивают центромеры в метафазных хромосомах и на протяжении всей интерфазы (любезно предоставлено SusoPlatero). ( Справа ) У Caenorhabditis elegans анти-CenH3-антитела ( зеленый цвет ) окрашивают расположенные «конец в конец» голоцентромеры профазных хромосом ( красный цвет ) (любезно предоставлено Landon Moore)

Эволюция CenH3s не похожа на эволюцию гистонов любого другого класса. В то время как гистон H3 инвариантен по последовательности, что отражает действие чрезвычайно сильного очищающего отбора на каждый остаток, CenH3s эволюируют быстро, особенно в линиях растений и животных (Malik and Henikoff, 2003). Наиболее очевидным образом это демонстрируют аминотерминальные «хвосты», которые различаются по длине и последовательности до такой степени, что становится невозможным выравнивание CenH3s разных таксономических групп. Даже домен histone fold в CenH3 эволюирует на порядки быстрее, чем такой же домен H3. Какова же причина этого разительного эволюционного различия между H3, который функционирует в центромерах, и H3, который функционирует в других местах?

Быстро эволюирующие участки генов CenH3 Drosophila и Arabidopsis обнаруживают избыток нуклеотидных замен типа replacement nucleotide substitutions по сравнению с тем, что можно было бы ожидать исходя из скорости синонимических замен (Malik and Henikoff, 2003). Этот избыток — признак адаптивной эволюции. Адаптивная эволюция у растений и животных видна также по еще одному главному центромерному фундаментальному белку [major centromere foundation protein], CENP-C (Talbert et al., 2004). Хотя адаптивная эволюция хорошо документирована для генов, участвующих в генетических конфликтах (таких, как «гонка вооружений» между хозяином и паразитом), эти гены являются единственными известными существенными однокопийными генами, адаптивно эволюционирующими у любого организма. В случае CenH3 и CENP-C участки адаптивной эволюции соответствуют участкам связывания и «нацеливания» на ДНК Это позволяет предполагать, что главные связывающиеся с центромерой белки адаптируются к эволюирующей центромерной ДНК, давая, таким образом, центромерному хроматину возможность взаимодействовать с консервативной кинетохорной машинерией, связывающей центромеру с микротрубочками веретена. Было высказано предположение, что центромеры конкурируют в ходе женского мейоза за включение в ядро яйцеклетки, чтобы не быть утраченными в составе полярных телец (Talbert et al., 2004). Возникла бы «гонка вооружений», ведущая к экспансии центромер, вероятно путем неравного кроссинговера между сестринскими хроматидами. Подавление хозяином этого процесса мейотического драйва с помощью CenH3 и CENP-C приводило бы к избытку изменений типа замен в участках, взаимодействующих с ДНК. Организмы, для центромер которых нет возможности конкурировать, таких как почкующиеся дрожжи, не подвергались бы центромерному драйву, и это могло бы объяснить тот факт, что у них маленькие центромеры и их белки CenH3 и CENP-C находятся под действием сильного очищающего отбора

Таким образом, мы видим, что специальный район генома, центромера, отличается одним классом вариантов гистонов, последовательности которых обнаруживают остатки «гонки вооружений», которая могла привести к чрезвычайной сложности центромер. Процесс RI-сборки, в каждом клеточном цикле «нацеливающий» новые нуклеосомы, содержащие CenH3, на центромеры, остается неизвестным (Amor et al., 2004а). Центромерные нуклеосомы демонстрируют примечательное отсутствие специфичности по последовательности в том, что они не только могут надежно локализоваться на неоцентромерах, которые совершенно непохожи на нативные центромеры (рис. 13.4), но и в том, что дрожжевой гомолог Cse4 может функционально замещать CENP-A человека (Wieland et al., 2004) (ни один из них не является адаптивно эволюирующим;

Talbert et al., 2004). Удивительно, что наши центромеры оставались в тех же самых положениях десятки миллионов лет без каких-либо очевидных детерминантов в виде специфических последовательностей, участвующих в поддерживающем их процессе. В той мере, в какой шигенетика означает наследственность, не зависящую от нуклеотидных последовательностей ДНК, наследование центромер в масштабах геологического времени является наиболее крайней формой, какую только можно себе представить. Тем не менее, мы все еще ищем механизм, чтобы объяснить, каким образом они поддерживают себя на протяжении даже одного клеточного цикла (дальнейшее обсуждение этой темы см. в главе 14).

 

6. Замещение гистоновым вариантом H3.3 обнаруживается в активном хроматине

Полагают, что транскрипционно активный хроматин, подобно центромерам, поддерживается эпигенетически и, подобно центромерам, активный хроматин обогащен вариантом гистона H3, называемым H3.3 (Henikoff and Ahmad, 2005). H3.3 очень похож по последовательности на канонические формы H3, отличаясь лишь четырьмя аминокислотами. При таких маленьких различиях можно было бы предположить, что эти две формы взаимозаменяемы. Однако у Drosophila H3.3 откладывается путем либо RC-, либо RI-сборки, тогда как H3 откладывается толко в репликационных фокусах RC-способом. Это различие между двумя вариантами закодировано в самом белке, причем три из четырех различий между H3 и H3.3 явно участвуют в предотвращении откладки H3 по способу RI (в ?-спирали 2, рис. 13.2). Очистка растворимых комплексов сборки у человека подтвердила, что эти две формы участвуют в разных процессах сборки: Н3.1 выделялся совместно с CAF-1 для RC-сборки, а H3.3 выделялся вместе с другими компонентами, в том числе с HirA, и участвовал в RI-сборке.

Хотя различия по четырем аминокислотам могли бы показаться практически несущественными, но если учесть, что человек, мухи и двустворчатые моллюски обладают H3.3, имеющими в точности одинаковую последовательность. эти отличия от H3 становятся заметными. Филогенетический анализ показывает, что пара H3/H3.3 возникала в разное время в ходе эволюции эукариот по меньшей мере четыре раза: у растений, у животных/грибов, у инфузорий и у Apicomplexa (Malik and Henikoff, 2003). Несмотря на отдельное происхождение от животных и грибов, пара H3/H3.3 животных и пара от растений (называемая Н3.1 [RC] и Н3.2 [RI] — во избежание путаницы мы обозначаем все изоформы RC как H3. а все изоформы RI как H3.3) поразительно похожи друг на друга. Один и тот же кластер аминокислот (позиции 87—90, который препятствует отложению H3 по RI-типу у Drosophila, оказался отличающимся у растений, и другое различие у животных (в позиции 31 находится Аа у H3 и либо Ser, либо Thr у H3.3) также обнаруживается у растений. Грибы особенно интересны. Исходно [ancestrally] они имеют и H3, и H3.3; однако аскомицеты, к которым относятся дрожжи и плесневые грибы, утратили форму H3. Таким образом, облигатная RC-форма гистона H3, привлекшая наибольшее внимание у животных, даже не присутствует у дрожжей.

Исследования H3.3 в основной массе хроматина показали, что активные фракции обогащены им (Henikoff and Ahmad, 2005). Однако разнообразные факторы вносили свой вклад в ситуацию неопределенности с этой потенциальной «меткой» активного хроматина во времена великого возбуждения в хроматиновой области, когда осознали, что модификации гистонов могут отличать активный хроматин от «молчащего». Прежде всего, отсутствовали какие-либо антитела, которые могли бы эффективно отличать H3 от H3.3 в хроматине (позиции 87—90 блокированы спиралями ДНК в нуклеосоме), тогда как превосходные антитела против многих посттрансляционных модификаций были легко доступными. Кроме того, различия по последовательности между H3 и H3.3, казавшиеся незначительными, не предполагали каких-либо фундаментальных различий в хроматине, тогда как модификации гистонов были главным образом по лизинам «хвостов», о которых было известно, что они влияют на взаимодействия хроматина или связывают ассоциированные с хроматином белки. Ощущение, что эти две формы гистона 3 должны быть взаимозаменяемыми, получило подтверждение в открытой у Tetrahyтепа возможности замены S-фазной формой гистона ее замещающего аналога. Наконец, влиятельная гипотеза «гистонового кода» представляла нуклеосомы как фиксированные мишени модификационных ферментов во время дифференцировки хроматина (Jenuwein and Allis, 2001). Однако становилось все более и более очевидным, что хроматин является высокодинамичным, и даже ассоциированные с гетерохроматином белки связываются с местами своего нахождения на минуты или даже менее (Phair et al., 2004). Оказывается, хроматин активно транскрибируемых генов находится в состоянии постоянного изменения, характеризующемся непрерывным замещением гистонов (Henikoff and Ahmad, 2005). Три коровых различия, отличающие H3 от H3.3, делают димеры H3.3•Н4 субстратом для RI-сборки, и сама по себе RI-сборка глубоко изменяет хроматин. В результате этого процесса активно транскрибируемые участки становятся маркированными H3.3 (рис. 13.6), и доказательства в пользу этого процесса следуют из наблюдения RI-замещения H3, метилированного по лизину 9 (H3K9me) меченым H3.3 [with tagged H3.3] в транскрибируемых PH К-полимеразами I и II (pol I и II) локусах (Schwartz and Ahmad, 2005).

Результатом динамичной природы хроматина в активных локусах является стирание предсуществовавших модификаций гистонов. Этим обеспечивается потенциальное решение вопроса о том, каким образом «молчащий» хроматин может становиться активированным, когда он гиперметилирован по H3K9 и H3K27 (модификации гистонов, обычно ассоциированные с репрессивным хроматином). Исследования временной динамики показали, что метилы на гистонах столь же стабильны, как и сами гистоны (Waterborg, 1993), хотя недавнее открытие деметил азы, специфичной для моно- и диметилированного H3K4 (Shi et al., 2004), показывает, что некоторые метальные группы могут энзиматически удаляться с гистонов. В целом, паттерны ковалентных модификаций гистонов могли бы быть результатом модификаций, уже присутствующих на гистонах в то время, когда они откладываются. Таким путем модифицирующие ферменты шли бы по уже проложенному следу вместе с машиной сборки, возможно облегчая этот процесс (Henikoff and Ahmad, 2005).

Рис. 13.6. H3.3 предпочтительно локализуется в активно транскрибируемых участках политенных хромосом Drosophila

Окрашивание DAPI (красный цвет) показывает паттерн бэндинга ДНК (слева), и H3.3-GFR (зеленый цвет) локализуется в междисковых промежутках (средняя часть), которые являются сайтами локализации РНК-полимеразы II. Правая часть рисунка — совмещение (перепечатано из: Schwartz and Ahmad, 2005)

Эта модель динамической сборки предсказывает, что модификациями гистонов, которыми обогащен активный хроматин, должен быть обогащен и H3.3, и большинство измерений модификаций в H3 и H3.3 показали, что так оно и есть и у растений, и у животных. Более того, на основании этой модели ожидается, что активные модификации лизинов, такие как ацетилирование H3 и Н4 и метилирование H3K4 и H3K79, будут сильно коррелировать друг с другом, как наблюдалось в разных системах (O’Neill et al., 2003: Kurdistani et al., 2004; Schubeler et al., 2004). Наконец, динамическая RI-сборка в активных генах может объяснить, почему мутации CAF-1 вызывают утрату сайленсинга (Loyola and Almouzni, 2004): считается, что лишь около 10 % генома дрожжей находится в «молчащем» состоянии, и это, возможно, единственный хроматин, который не замещается динамически в геноме дрожжей. В отсутствие опосредуемой CAF-1 RC-сборки RI-сборка происходила бы по всему геному дрожжей, активируя прежде «молчащие» районы. Возможно, существование варианта H3, предназначенного для RC-сборки у многоклеточных эукариот, является адаптацией для удержания подавляющей части хроматина клетки в эпигенетически «молчащем» состоянии

Замещение дифференциально модифицированными димерами H3.3•Н4 позволяет предложить простую модель наследования активного хроматина у делящихся клеток (Henikoff and Ahmad, 2005). Активный хроматин оставался бы активным после разбавления обычными нуклеосомами после RC-сборки, если эта случайная смесь RI-отложенных и RC-отложенных нуклеосом не мешает таким активным процессам, как транскрипционная инициация и элонгация. Продолжение транскрипционной активности в результате восстанавливало бы хроматин в следующем клеточном цикле, приводя к постоянному поддержанию активного хроматина на протяжении всего развития. Возможность того, что вариант гистона постоянно поддерживается процессом RI-сборки, может относиться и к CenH3s, которые вставлялись бы в бреши, создаваемые «развертыванием» обычных нуклеосом в результате анафазного натяжения.

Когда клетки выходят из клеточного цикла и дифференцируются, они больше не продуцируют и не включают S-фазные гистоны, и в результате накапливается H3.3. Например, H3.3 накапливается в мозге крыс до уровня, составляющего 87 % от уровня гистона H3, ко времени достижения крысами 400-дневного возраста (Henikoff and Ahmad, 2005). Имеет ли это градуальное замещение хроматина какое-нибудь функциональное значение или не имеет — неизвестно. Неизвестно также, является ли активный процесс, делающий возможным замещение, тем же самым, что и процесс, наблюдаемый в транскрипционно активных локусах Одна из возможностей заключается в том, что разрушение хроматина проходящей РНК-полимеразой или машиной ремоделинга хроматина вызывает локальное развертывание нуклеосомы и случайную утрату димера H3.3•Н4 (рис. 13.7). Это сопровождалось бы воссозданием [reassembly] нуклеосомы вслед за полимеразой с замещением утраченного димера димером H3.3•Н4 с помощью комплекса HirA. Лишь тогда, когда полимеразы упакованы слишком плотно для осуществления сборки, нуклеосомы полностью развертываются [unravel].

 

7. Фосфорилирование Н2АХ функционирует в репарации двунитевых разрывов ДНК

Гистоны Н2А также образуют семейство разных вариантов, обнаруживаемых у всех эукариот. Вариант Н2АХ определяется по присутствию мотива карбокситерминальной аминокислотной последовательности, SQ(E или D)?, где ? означает гидрофобную аминокислоту. Серии в этой последовательности-мотиве является сайтом фосфорилирования, продуцируя модифицированный белок, обозначаемый «?-Н2АХ». Динамическая природа хроматина и фосфорилирование Н2АХ особенно очевидны, когда в ДНК возникают двунитевые (ds, double-stranded) разрывы (Morrison and Shen, 2005). Летальность даже одиночного двунитевого разрыва требует немедленных действий по репарации повреждения и восстановления непрерывности двойной спирали. Обнаружение ds-разрыва в норме происходит в пределах минуты или около того с момента его образования, и это, в свою очередь, включает быстрое фосфорилирование Н2АХ в непосредственной близости от сайта разрыва. Это фосфорилирование выполняется членами семейства фосфоинозитол 3-киназоподобных киназ. Вслед за этим первоначальным событием фосфорилирование Н2АХ быстро распространяется вдоль по хромосоме, маркируя относительно большой хроматиновый домен, окружающий этот разрыв. Наконец, этот ds-разрыв в конце концов репарируется либо путем гомологичной рекомбинации, либо негомологичным воссоединением концов [nonhomologous end-joining], и метка-фосфорилирование удаляется.

Рис. 13.7. Модель независимого от репликации замещения или обмена

Большая молекулярная машина (либо комплекс SWR1, либо РНК-полимераза II) частично или полностью расвертывает нуклеосому во время своего прохождения. Результатом этого оказывается либо сохранение гетеродимерных субъединиц, как, например, облегчаемый FACT перенос Н2А•Н2В из положения перед РНК-полимеразой в положение позади нее (Formosa et al. 2002; Belotserkovskaya et al. 2003), либо утрата гетеродимера. В последнем случае процесс репарации хроматина заменяет утраченный гетеродимер либо H2AZ•Н2В ( верхняя часть рисунка ), либо Н3.3•Н4 ( нижняя часть рисунка )

Фосфорилирование Н2АХ не является существенным для обнаружения или репарации ds-разрывов, потому что делеция гена или мутация «мишени» — серинового остатка не отменяет репарацию. Однако Н2АХ не просто маркер повреждения, поскольку такие мутанты уменьшили эффективность репарации и являются гиперчувствительными к радиационному повреждению и генотоксическим агентам. В настоящее время полагают, что Н2АХ функционирует в процессе репарации ds-разрывов по крайней мере двумя способами. Во-первых, он может помогать рекрутировать или сохранять белки, требующиеся для репарации в сайте разрыва (Morrison and Shen, 2005). Во-вторых, он может стабилизировать хромосому, окружая разорванные концы, путем рекрутирования когезина, белкового комплекса, ответственного за удерживание вместе сестринских хроматид (Lowndes and Toh, 2005).

Эволюция Н2АХ не похожа на эволюцию других вариантов гистонов. Хотя ген Н2АХ обнаружен почти у всех эукариот, он возникал неоднократно в относительно недавнее время (Malik and Henikoff, 2003). Например, версия Н2АХ, обнаруженная у Drosophila, отличается от версии, обнаруживаемой у другого двукрылого насекомого, Anopheles Предположительно, способность развивать новый Н2АХ из канонической формы Н2А является следствием простого мотива SQ(E или D)©. Ожидается, что развитие такого мотива на карбоксильном конце канонического Н2А происходило неоднократно в ходе эволюции. Случайная утрата существующего Н2АХ с вновь отчеканенной версией могла бы подпитываться необходимостью для Н2АХ быть очень однородно распределенным, потому что ds-разрывы могут происходить в любом месте генома. Если в существующем гене Н2АХ происходят мутации, уменьшающие его сходство с каноническим Н2А таким образом, что его сборка становится менее эффективной или однородной, возникнет сильное давление отбора, чтобы заместить его версией, которая более похожа на канонический Н2А. Эта логика могла бы помочь объяснить исключительный случай Н2Ах Drosophila, который, в отличие от других эукариот, происходит не от своего канонического Н2А, а, скорее, от удаленной линии H2AZ (описываемой ниже). Если все, что нужно, чтобы быть Н2АХ — это находиться в положении Н2А в нуклеосоме и иметь карбокситерминальный мотив для фосфорилирования, H2AZ может развить в себе эти способности.

Рис. 13.8. Стадия пахитены сперматогенеза, показывающая зависимость формирования полового тельца от Н2АХ

В нормальных сперматоцитах млекопитающих видно, что ядерная структура, называемая половым тельцем ( стрелка, помечено зеленым цветом на правых рисунках ), охватывает неспаренный бивалент XY ( помечен на левых рисунках ). Синаптонемный комплекс, выравнивающий спаренные хромосомы, окрашен в красный цвет. Половое тельце в норме обогащено Н2АХ (Н2АХ+/+). В сперматоцитах Н2АХ-/- половое тельце не образуется, и эпитоп полового тельца становится диспергированным по аутосомам ( нижний правый рисунок ). Масштабная линейка = 10 мкм. Фотографии любезно предоставлены Shantha Mahadevaiah и Paul Burgoyne (Fernandez-Capetillo et al., 2003)

Репарация ds-разрывов представляет собой несомненно универсальную функцию фосфорилирования Н2АХ, и, казалось бы, у этого процесса нет никакого стабильного эпигенетического аспекта. Однако мыши с нуль-мутацией по Н2АХ стерильны, и цитологическое изучение сперматогенеза млекопитающих выявило яркую эпигенетическую особенность — специфическое фосфорилирование Н2АХ на биваленте XY (рис. 13.8) (Femandez-Capetillo et al., 2003). Эта хромосомная пара занимает отдельное «половое тельце» во время мейотической профазы, предположительно участвующее в сайленсинге сцепленных с полом генов во время мужского мейоза. Фосфорилирование Н2АХ играет существенную роль в формировании нормального полового тельца, и дефектные по Н2АХ сперматоциты не способны спариваться или конденсироваться и не могут инактивировать гены X и Y во время мейоза. Фосфорилирование Н2АХ бивалента XY отличается от процесса, происходящего в ds-разрывах. Фосфорилирование XY в половом тельце не требует разрывов; скорее, оно происходит наиболее заметным образом в неспаренных участках хромосом. Механизмы, посредством которых фосфорилирование Н2АХ «нацеливается» на неспаренные хромосомы, и то, как это событие приводит к конденсации, спариванию и сайленсингу, в настоящее время неизвестны. Однако интересно пофантазировать, что эта роль может иметь отношение к способности взаимодействовать с когезином и рекрутировать его.

 

8. H2AZ играет роль в регулировании транскрипции

Возрождение интереса к вариантам гистонов оказалось особенно мощным в случае H2AZ (или H2A.Z) (Karnakaka and Biggins, 2005). H2AZ почти повсеместен; он дивергировал от анцестрального Н2А на ранних этапах эволюции эукариот. В соответствии с этим отдельным происхождением генетические эксперименты с почкующимися дрожжами и мухами показали, что гистоны Н2А и H2AZ возникли для выполнения отдельных, неперекрывающихся функций. H2AZ является необходимым гистоном у большинства организмов, от ресничных простейших до млекопитающих. Однако почкующихся и дробянковых дрожжей делеция гена H2AZ дает жизнеспособные клетки, хотя эти нуль-мутанты обладают разнообразными фенотипами. Эти свойства облегчили его генетическую и биохимическую характеристику у дрожжей.

У большинства протестированных на сегодня организмов H2AZ составляет приблизительно 10 % от общего белка Н2А. Он широко, но не однородно распределен по всем хромосомам. Это наиболее элегантно выглядит в случае политенных хромосом Drosophila, где он образует отчетливый паттерн бэндинга. Результаты опытов по иммунопреципитации хроматина с использованием дрожжевых и мышиных клеток согласуются с этим паттерном. Хотя H2AZ преимущественно локализуется в промоторных участках генов дрожжей, эта специфичность не соблюдается для всех сайтов его откладки. У Drosophila сколько-нибудь различимая связь между локализацией H2AZ и экспрессией генов отсутствует. Таким образом, хотя механизм откладки H2AZ известен (обсуждается ниже), правила, определяющие места его концентрации, в настоящее время неясны.

Ряд наблюдений указывают на важную роль в регулировании экспрессии генов (Kamakaka and Biggins, 2005). Мутационный анализ почкующихся дрожжей показал, что функция H2AZ частично является избыточной с двумя разными классами глобальных транскрипционных факторов, комплексом ремоделинга нуклеосом, Swi/Snf, и комплексом модификации гистонов, SAGA. Хотя утрата по отдельности функции H2AZ, Swi/Snf или SAGA не лишает клетку жизнеспособности, одновременная потеря любой комбинации двух путей детальна. Дополнительные генетические и биохимические эксперименты позволяют предположить, что эта роль включает и функции как в инициации, так и в элонгации транскрипции (дополнительные детали см. в главе 10). Более того, баланс откладки H2AZ причинно связан с эпигенетикой через его роль как фактора антисайленсинга Делеция гена H2AZ приводит к экстенсивному распространению «молчащего» хроматина внутрь от теломер, и этот дефект может быть подавлен дополнительной делецией генов, кодирующих сами факторы сайленсинга (рис. 4.7). Влияние делетирования H2AZ на глобальную экспрессию генов было протестировано с помощью микрочипов дрожжевых генов. Хотя большинство регулируемых генов обнаруживают пониженную экспрессию в нуль-мутантах по H2AZ, существенная доля их демонстрирует увеличение экспрессии. Поскольку все еще не ясно, какие изменения отражают прямую регуляцию, а какие — косвенную, возможно, что нуклеосомы H2AZ функционируют как позитивно, так и негативно в регулировании транскрипции генов. Более того, неизвестно, лежит ли в основе этих разнообразных ролей H2AZ в транскрипции и гетерохроматине один унифицирующий механизм или же более сложное сочетание разных путей.

В противоположность современной картине, полученной для почкующихся дрожжей, в клетках млекопитающих H2AZ предпочтительно локализуется в гетерохроматиновых участках. Действительно, было показано, что он физически взаимодействует с белком НР1 (Heterochromatin associated Protein 1) (Fan et al., 2004). Хотя это могло бы наводить на мысль о возможной роли H2AZ в сайленсинге у многоклеточных животных, следует отметить, что у Drosophila подгруппа экспрессируемых генов, локализованных в гетерохроматине, действительно нуждается в НР1 для экспрессии (Weiler and Wakimoto, 1995). Если локализация H2AZ в клетках млекопитающих отражает аналогичный процесс, тогда четко установленные роли этого варианта в облегчении транскрипции и противодействии сайленсингу у дрожжей вероятно отражали бы общие фундаментальные свойства этого варианта. H2AZ может играть еще одну роль в эпигенетике расхождения хромосом. Одним из первых фенотипов, обнаруженных у нуль-мутантов по H2AZ, был дефект расхождения хромосом в митозе, наблюдавшийся у дробянковых дрожжей. Последующие эксперименты сделали эту связь более очевидной. Экспериментальная делеция H2AZ в клетках млекопитающих с помощью РНК-интерференции (RNAi) вызывает дефекты в перицентрической ассоциации НР1, нестабильность генома и нарушения в сегрегации хромосом (Kamakaka and Briggins, 2005). Аналогичным образом, у почкующихся дрожжей нуль-мутанты по H2AZ обнаруживают повышенную частоту потери хромосом в митозе и существенные генетические взаимодействия с генами, кодирующими известные компоненты центромеры и митотического веретена (Krogan et al., 2004). Остается формально возможным, что влияние H2AZ на расхождение хромосом является косвенным следствием его роли в установке программы транскрипции генов. Однако интригующая гипотеза заключается в том, что механизмы расхождения хромосом эволюционировали таким образом, чтобы использовать не только вариант H3, но и вариант Н2А.

Каким образом H2AZ влияет на транскрипционную компетентность, сайленсинг, гетерохроматин и, возможно, сегрегацию хромосом? Структура содержащей H2AZ нуклеосомы, полученная с высоким разрешением, позволяет выявить несколько уникальных свойств этого варианта (Suto et al., 2000). По сравнению с нуклеосомами Н2А H2AZ обладает расширенным кислотным пэтч-доменом на поверхности нуклеосомы, и это отличие, вероятно, имеет функциональное значение. Например, у Drosophila именно часть «докинг-домена» («docking domain») (рис. 13.2) взаимодействует с гистоном Н4 и определяет сегмент, существенный для функции. Далее, результаты мутационных исследований и экспериментов по связыванию in vitro свидетельствуют о том, что этот расширенный кислотный пэтч вносит основной вклад во взаимодействие нуклеосомы с НР1 (Dryhurst et al., 2004). Интересно, что НР1 содержит хромодомен, белковый мотив, который может связываться с H3, метилированным по лизину 9 (главы 3 и 4). Таким образом, Н2А2может действовать совместно с метилированием гистона H3, обеспечивая ассоциированным с хроматином белкам платформу для связывания. В дополнение к своему расширенному кислотному пэтчу H2AZ имеет пару остатков гистидина, координирующих дополнительный ион металла в этой структуре, который, in vivo, мог бы обеспечивать уникальный физиологический ответ, недоступный нуклеосомам, содержащим Н2А. Наконец, кристаллическая структура позволяет предсказать, что асимметричный гистоновый октамер, состоящий из одного главного димера Н2А•Н2В плюс одного вариантного димера H2AZ•Н2В, создавал бы конфликт белковых структур в петле 1 (рис. 13.2) и, по-видимому, вряд ли происходит in vivo.

В совокупности эти новые особенности нуклеосом H2AZ свидетельствуют в пользу того, что этот вариант должен придавать хроматину уникальные физические свойства. Это предсказание подтверждается экспериментально. Например, H2AZ может стабилизировать димертетрамерные взаимодействия в нуклеосоме, и порядки нуклеосом, составленных из нуклеосом H2AZ, могут обнаруживать усиленное сворачивание более высокого порядка и уменьшенную межмолекулярную агрегацию (Dryhurst et al., 2004). Таким образом, H2AZ, вероятно, модулирует функцию хроматина по меньшей мере тремя различными способами. Во-первых, он несомненно изменяет физические свойства своего хроматинового окружения, влияя таким образом на доступность или активность trans-действующих факторов. Во-вторых, как и в случае с другими гистонами, посттрансляционные модификации в его аминотерминальном и карбокситерминальном доменах, вероятно, обеспечивают уникальные docking-сайты для ассоциированных с хроматином белков (так называемые эффекты, с которыми мы познакомились в главе 3), или регулируемые изменения в плотности заряда (cis-эффекты). В-третьих, его ограниченная и специфическая откладка в хроматине, вероятно, «нацеливает» уникальные функции на специфические локусы.

 

9. Белковые комплексы для откладки и замещения вариантов Н2А

Хотя все еще остаются важные вопросы относительно того, как варианты гистона Н2А функционируют, недавние исследования выяснили основу их включения в хроматин. Первый прорыв совершился, когда был биохимически очищен комплекс, катализирующий перенос димеров Н2А•Н2В в хроматин (Sarma and Reinberg, 2005). Этот мультисубъединичный комплекс, названный SWR1-C, содержит в качестве каталитической субъединицы белок Swrl, член семейства SWI/SNF FNA-зависимых ремоделеров хроматина. In vivo SWR1 -С, оказывается, предназначен для этой работы, потому что эффекты делетирования гена SWR1 сходны с эффектами делетирования гена, кодирующего сам H2AZ. Более того, у нуль-мутанта по swrl предпочтительная откладка H2AZ в специфических локусах полностью утрачена. In vitro, когда очищенный SWR1-C представлен с набором нуклеосом, он специфически замещает димеры Н2А•Н2В димерами H2AZ•Н2В в АТФ-зависимой реакции (рис. 11. Эволюция многих гистонов была направлена на более плотную упаковку ДНК

13.7). Интересный аспект этой реакции вытекает из предсказания кристаллической структуры, упомянутой выше: смешанные нуклеосомы, содержащие и Н2А, и H2AZ, не должны быть стабильными. Таким образом, замещение димера, опосредованное SWR1-C, может быть совместной реакцией, в которой замещение одного димера H2AZ•Н2В облегчает извлечение и замещение остающегося димера Н2А•Н2В.

Второй мультисубъединичный белковый комплекс выполняет у Drosophila замещение фосфорилированного Н2АХ нефосфорилированной молекулой (Morrison and Shen, 2005). Замечательно, что этот единственный у Drosophila комплекс, названный dTip60, состоит из белков, обычно обнаруживаемых в двух отдельных комплексах: SWR1-C, АТФ-зависимом комплексе ремоделирования хроматина, описанном выше, и NuA4/Tip60, комплексе модификации гистонов с ацетилтрансферазной активностью. In vitro эта реакция требует и АТФ. и ацетил-СоА. Таким образом, один этот комплекс интегрирует ацетилирование гистонов, ремоделинг нуклеосом и замещение гистонов их вариантами. Это сочетание вероятно отражает тот факт, что Н2АХ Drosophila является также ее H2AZ, тогда как у других эукариот Н2АХ эволюционировал из канонического Н2А. Несмотря на это различие, есть основания ожидать, что основной путь консервативен. У почкующихся дрожжей и в клетках млекопитающих SWR1-C, NuA4/ Tip60 и еще один АТФ-зависимый комплекс ремоделинга нуклеосом, INO80-C, имеют общие субъединицы. Одной из них является родственный актину белок Агр4. Интересно, что было показано, что у почкующихся дрожжей Агр4 взаимодействует с фосфорилированным Н2АХ, результатом чего является последовательное рекрутирование комплексов NuA4, SWR1 и INO80 (Downs et al., 2004). Это позволяет предполагать, что и у этих организмов эти комплексы катализируют замещение как Н2АХ, так и H2AZ. Остается продемонстрировать это предсказание непосредственно.

Открытие того, что комплексы ремоделинга хроматина предназначены для RI-сборки нуклеосом, важно не только для понимания того, как варианты гистонов включаются, но и для обеспечения первых специфических in vivo функций для машин ремоделинга хроматина. До этих открытий было неясно, почему клетки обычно имеют такое обилие крупных машин, облегчающих движение нуклеосом (Becker and Horz. 2002). Разнообразие АТФаз SWI/SNF представляло загадку, которую теперь, возможно, легче понять, если некоторые машины ремоделинга предназначены для сборки разных вариантов в нуклеосомы. Возможно, сборка нуклеосом является согласованным процессом, в котором ферменты, модифицирующие гистоны, действуют на свои субстраты, в то время как АТФ-зависимые ремоделеры обеспечивают рабочий ход и специфичность, необходимые для RI-замещения

 

10. Другие варианты Н2А дифференцируют хроматин, но их функции все еще неизвестны

Дальнейшая диверсификация Н2А произошла у позвоночных. У млекопитающих macroH2A и H2ABbd (Н2А Barr body deficient) представляют уникальные линии, которые, по-видимому, играют роль в эпигенетическом феномене компенсации дозы (детально обсуждается в главе 17). МасгоН2А называется так потому, что, кроме домена histone fold и карбокситерминальных «хвостов», он содержит большой карбокситерминальный глобулярный домен (Ladurner, 2003). С учетом того, что карбокситерминальный «хвост» Н2А выходит поблизости от линкерной ДНК, возможно, что этот глобулярный домен взаимодействует с линкерами, «хвостами» H3 или с такими линкерными белками, как Н1 и белки HMG (High Mobility Group). В чем именно заключается это взаимодействие — неизвестно, хотя интригующая возможность заключается в том, что оно обладает ферментативной активностью. В пользу этой возможности говорит сходство глобулярного домена (имеющего длину, 200 аминокислотных остатков) с белками, обладающими гидролитической активностью по отношению к полинуклеотидам и полипептидам. Другая возможность заключается в том. что глобулярный домен может просто действовать как препятствие для инициации транскрипции; на мысль о такой роли наводит его способность блокировать связывание транскрипционных факторов in vitro (Sarma and Reinberg, 2005). Домен histone fold macroH2A также обладает специфическими свойствами, поскольку он не действует на ремоделеры хроматина. Эти наблюдения позволяют предполагать, что нуклеосомы, содержащие macroH2A, менее мобильны и потому могут быть устойчивыми к активной транскрипции. Это могло бы объяснить обогащенность дискретных районов факультативно неактивной Х-хромосомы вариантом macroH2A у женщин — районов, которые чередуются с участками конститутивного гетерохроматина (рис. 13.9а) (Chadwick and Willard, 2004).

В противоположность macroH2A H2ABbd, по-видимому, не выявляется на тельце Бара, но в остальном наблюдается повсеместно в ядре (рис. 13.96) (Chadwick and Willard. 2001). Поведение in vitro нуклеосом, содержащих H2ABbd, согласуется с предположением, что он играет роль в облегчении транскрипции (Sarma and Reinberg, 2005). H2ABbd является быстро эволюционирующим белком по сравнению с другими известными изоформами Н2А, хотя причины этой ускоренной эволюции неясны.

 

11. Эволюция многих гистонов была направлена на более плотную упаковку ДНК

Когда больше нет необходимости получать доступ к ДНК для репликации и транскрипции, хроматин обычно становится еще более конденсированным, и это нередко связано с замещением канонических гистонов. Это очевидно для спермиев, и в некоторых линиях у паралогов гистонов выработалась специализированная роль упаковщиков. Например, сперии морского ежа содержат варианты Н1 и Н2В с повторяющимися «хвостовыми» мотивами, связывающимися с малой бороздкой ДНК (Malik and Henikoff, 2003), что предположительно является адаптацией к тому, чтобы более плотно упаковать хромосомы для включения в головки спермиев. Аналогичная адаптация обнаруживается у специфичных для пыльцы вариантов Н2А у цветковых растений, У позвоночных специфичные для спермиев специализированные варианты гистонов обнаруживаются в семенниках млекопитающих, в том числе паралог Н2В (SubH2Bv), локализующийся в акросоме, и специфичный для семенников вариант H3 (Witt et al., 1996).

Рис. 13.9. Варианты Н2A и неактивная Х-хромосома у женщин

( а ) macroH2A ( красный цвет) окрашивает дискретные районы неактивной Х-хромосомы, которые чередуются с маркером гетерохроматина (гистоном H3K9me3). ( б ) H2ABbd ( зеленый цвет ) исключается из неактивной Х-хромосомы ( красная точка с указывающей на нее стрелкой ), ( в ) То же самое ядро, что и на б , но окрашенное DAPI, чтобы показать хроматин (а — перепечатано, с любезного разрешения, из: Chadwick and Willard, 2004 [© National Academy of Sciences]; б, в — перепечатано, с любезного разрешения, из: Chadwick and Willard, 2001 [©The Rockefeller University Press])

Замещение гистонов во время созревания спермиев протаминами и другими белками обеспечивает потенциальные средства для стирания эпигенетической информации в мужской зародышевой линии. Однако данные о трансгенерационной наследственности (Rakyan and Wbitelaw, 2003), особенно у животных, у которых нет метилирования ДНК, указывают на то, что некоторая выборка нуклеосомных гистонов, возможно, сохраняется при этом переходе и передает эпигенетическую информацию Как уже указывалось, это именно то, что происходите CENP-А в центромерах (Palmer et al., 1990), и возможно, что небольшая фракция других вариантов, таких как H3.3, остается в спермиях для эпигенетического наследования информации об экспрессии генов. Хотя наше понимание о процессе замещения гистонов в ходе развития спермиев является рудиментарным, мы надеемся, что многое удастся узнать, когда мы поймем, каким образом CENP-A переживает этот переход.

Увеличенная компактизация происходит также в соматических клетках, прекративших деления и претерпевающих дифференцировку. В некоторых случаях компактизация включает количественные и качественные изменения в линкерных гистонах. Стоихиометрия гистона Н1 относительно нуклеосом определяет средний интервал в нуклеосомных порядках in vivo (Fan et al., 2003). Кроме того, присутствие HI в хроматине способствует формированию структуры более высокого порядка, которая обычно подавляет транскрипцию (Wblffe, 1992). Линкерные гистоны in vivo гораздо более мобильны, чем коровые гистоны. Время пребывания [residence times] для Н2А и Н2В — часы, а для H3 и Н4 оно даже не может быть измерено, тогда как время пребывания для Н1 — несколько минут (Phair et al., 2004). В результате крайне мало вероятно, что включение вариантных линкерных гистонов дифференцирует хроматин наследуемым образом. Скорее, роль вариантов Н1, как полагают, сводится к тому, чтобы изменять свойства основной массы хроматина, которые могут влиять на компактизацию (Wblffe, 1992).

Варианты Н1 разделяют с коровыми гистонами разграничение между RC- и RI-формами (Marzluff et al., 2002). RC-вариантные формы HI, по-видимому, взаимозаменяемы друг с другом — предположение, основывающееся на том факте, что нокаутные мыши, лишенные одного или двух из пяти RC-вариантов Н1, фенотипически нормальны (Fan et al., 2003). У птиц вариант линкерного гистона Н5 откладывается во время созревания эритроцитов, что сопровождает крайнюю степень компактизации ядра. Еще один вариант, который откладывается до высоких уровней в неделящихся клетках, — это Н10, сильно дивергировавший от канонических форм. Сверхэкспрессия Н10 делает хроматин менее доступным для нуклеаз, чем аналогичная сверхэкспрессия канонической формы. Обычное накопление Н10 в неделящихся клетках могло бы быть общим механизмом компактизации хроматина, по мере того как клетки переходят в состояние покоя.

 

12. Заключение и перспективы исследований

Варианты гистонов обеспечивают наиболее фундаментальный уровень дифференцировки хроматина, и альтернативные механизмы откладки различных вариантов потенциально могут устанавливать и поддерживать эпигенетические состояния. Гистоны Н2А, Н2В, H3 и Н4 занимают разные положения в коровой частице в результате эволюционного процесса, начавшегося до появления последнего общего предка эукариот. Ключевые эволюционные инновации остаются неопределенными, в том числе возникновение октамера из анйцестрального тетрамера типа H3•Н4, и мы ожидаем секвенирование большего числа геномов архей и примитивных эукариот, которые могли бы оказаться отсутствующими связующими звеньями. Последующее усложнение четырех коровых гистонов в разные варианты обеспечило основу для эпигенетических процессов, включая развитие и расхождение хромосом. Для полного понимания эпигенетической наследственности нам нужно лучше понимать процессы включения вариантов путем замещения канонических гистонов. Важным достижением последнего времени является характеристика независимых от репликации путей сборки, предназначенных для конкретных вариантов.

Центромеры представляют собой наиболее бросающиеся в глаза примеры очень разного хроматина, которые можно приписать особым свойствам того или иного варианта гистона. Хотя ясно, что нуклеосомы, содержащие CenH3, образуют фундамент центромеры, главным вызовом для будущих исследований остается вопрос о том, каким именно образом они откладываются в одно и то же место в каждом клеточном поколении в отсутствие даже намека на сиквенс-специфичность.

Становится очевидным, что с вариантами гистонов связаны также эпигенетические свойства активных генов. Транскрипиионно активные локусы обогащены и H3 3, и H2AZ, и расшифровка процессов сборки, ответственных за это обогащение, представляет собой важную область текущих исследований. Динамическое поведение хроматина ведет к пониманию того, что транскрипция, ремоделинг хроматина и модификация гистонов могли бы быть сопряжены со сборкой и разборкой нуклеосом. Изучение динамических процессов, связанных с обновлением гистонов, находится лишь на ранней стадии, и мы ожидаем технологических достижений в молекулярной биологии, цитогенетике, биохимии и структурной биологии, которые можно будет использовать для лучшего понимания динамической природы хроматина.

Помимо этих универсальных процессов варианты гистонов участвуют и в конкретных эпигенетических явлениях. В случае Х-хромосомы млекопитающих три разных варианта Н2А, фосфо-Н2АХ, macroH2A и H2ABbd, рекрутированы для участия в сайленсинге или активации генов в целях инактивации зародышевой линии или компенсации дозы. Понимание функции этих вариантов в эпигенетических процессах остается важным вызовом на будущее

Получение первой структуры коровой частицы нуклеосомы с высоким разрешением (Luger et al., 1997) стало плодотворным достижением в выяснении свойств хроматина. Путем такого усложнения этой базовой структуры, которое имело биологические последствия, варианты гистонов дают возможность углубить наше понимание того, каким образом эти удивительные [fascinating] архитектурные белки эволюционировали, чтобы играть разнообразные роли в эпигенетических процессах

 

Литература

Agalioti T., Lomvardas S., Parekh B., Yie J., Maniatis T., and Thanos D., 2000. Ordered recruitment of chromatin modifying and general transcription factors to the IFN-p promoter. Cell 103: 667-678.

Armstrong J.A., Papoulas O., Daubresse G., Sperling A.S., Lis J.T., Scott M.P., and Tamkun J.W., 2002. The Drosophila BRM complex facilitates global transcription by RNA polymerase II. EMBO J. 21: 5245-5254.

Bantignies R., Goodman R.H., and Smolik S.M., 2000. Functional interaction between the coactivator Drosophila CREB-binding protein and ASH 1, a member of the trithorax group of chromatin modifiers. Mol. Cell. Biol., 20: 9317-9330.

Beisel C., Imhof A.. Greene J.. Kremmer E., and Sauer F., 2002. Histone methylation by the Drosophila epigenetic transcriptional regulator Ash 1. Nature 419: 857-862.

Bultman S., Gebuhr T., Yee D., La Mantia C., Nicholson J., Gilliam A., Randazzo F., Metzger D., Chambon P., Crabtree G., and Magnuson T., 2000. A Brgl null mutation in the mouse reveals functional differences among mammalian SWI/SNF complexes. Mol. Cell 6: 1287-1295.

Byrd K.N. and Sheam A., 2003. ASH1, a Drosophila trithorax group protein, is required for methylation of lysine 4 residues on histone H3. Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 11535-11540.

Chaya D., Hayamizu T., Bustin M., and Zaret K.S., 2001. Transcription factor FoxA (HNF3) on a nucleosome at an enhancer complex in liver chromatin. J. Biol. Chem. 276: 44385-44389.

Cirillo L.A., Lin F.R., Cuesta I., Friedman D., Jamik M., and Zaret K.S., 2002. Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3 (FoxA) and GATA-4. Mol. Cell 9: 279-289.

Cote J., Quinn J., Workman J.L., and Peterson C.L., 1994. Stimulation of GAL4 derivative binding to nucleosomal DNA by the yeast SWI/SNF complex. Science 265: 53-60.

Daubresse G., Deuring R., Moore L., Papoulas O., Zakrajsek L, Waldrip W.R., Scott M.P., Kennison J.A., and Tamkun J.W., 1999. The Drosophila kismet gene is related to chromatin-remodeling factors and is required for both segmentation and segment identity. Development 126: 1175-1187.

Denis G.V. and Green M.R., 1996. A novel, mitogen-activated nuclear kinase is related to a Drosophila developmental regulator. Genes Dev. 10: 261 -271.

Dou Y., Milne T.A., Tackett A.J., Smith E.R., Fukuda A., Wysocka J., Allis C.D., Chait B.T., Hess J.L., and Roeder R.G., 2005. Physical association and coordinate function of the H3 K4 methyltransferase MLL1 and the H4 K16 acetyltransferase MOF. Cell 121: 873-885.

Dunaief J.L., Strober B.E., Guha S., KhavariP.A., Alin K., Luban J., Begemann M., Crabtree G.R., and Goff S.P., 1994. The retinoblastoma protein and BRG1 form a complex and cooperate to induce cell cycle arrest. Cell 79: 119-130.

Duncan I., 1987. The bithorax complex. Annu. Rev. Genet. 21: 285-319.

Fan H.Y., He X., Kingston R.E., and Narlikar G.J., 2003. Distinct strategies to make nucleosomal DNA accessible. Mol. Cell 11: 1311-1322.

Farkas G., Gausz J., Galloni M., Reuter G., Gyurkovics H., and Karch F., 1994. The Trithorax-like gene encodes the Drosophila GAGA factor. Nature 371: 806-808.

Francis N.J. and Kingston R.E., 2001. Mechanisms of transcriptional memory. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2: 409-421.

Francis N.J., Saurin A.J., Shao Z., and Kingston R.E., 2001. Reconstitution of a functional core polycomb repressive complex. Mol. Cell 8: 545-556.

Gellon G. and McGinnis W., 1998. Shaping animal body plans in development and evolution by modulation of Hox expression patterns. Bioessays, 20: 116-125.

Gutierrez L., Zurita M., Kennison J.A., and Vazquez M., 2003. The Drosophila trithorax group gene tonalli (tna) interacts genetically with the Brahma remodeling complex and encodes an SP-R1NG finger protein. Development 130: 343-354.

Hassan A.H., Neely K.E., and Workman J.L., 2001. Histone acetyltransferase complexes stabilize swi/snf binding to promoter nucleosomes. Cell 104: 817-827.

Holstege E.C., Jennings E.G., Wyrick J.J., Lee T.I., Hengartner 1998. Dissecting the regulatory circuitry of a eukaryotic genome. Cell 95: 717-728.

Hughes C.M., Rozenblatt-Rosen O., Milne T.A., Copeland T.D., Levine S.S., Lee J.C., Hayes D.N., Shanmugam K.S., Bhattachaqee A., Biondi C.A., et al., 2004. Memn associates with a trithorax family histone methyltransferase complex and with the hoxc8locus. Mol. Cell 13: 587-597.

Imbalzano A.N., Kwon H., Green M.R., and Kingston R.E., 1994. Facilitated binding of TATA-binding protein to nucleosomal DNA. Nature 370: 481-485.

Jacobs S.A. and Khorasanizadeh S., 2002. Structure of HP1 chromodomain bound to a lysine 9-methylated histone H3 tail. Science 295: 2080-2083.

Janody E., Martirosyan Z., Benlali A., and Treisman J.E., 2003. Two subunits of the Drosophila mediator complex act together to control cell affinity. Development 130: 3691-3701.

Kassabov S.R., Zhang B., Persinger J., and Bartholomew B., 2003. SWI/SNF unwraps, slides, and rewraps the nucleosome. Mol. Cell 11: 391-403.

Kaufman T.C., Seeger M.A., and Olsen G., 1990. Molecular and genetic organization of the antennapedia gene complex of Drosophila melanogaster. Adv. Genet. 27: 309-362.

Kennison J.A., 1995. The Polycomb and trithorax group proteins of Drosophila: Trans-regulators of homeotic gene function. Annu. Rev. Genet. 29: 289-303.

Kennison J. A., 2003. Introduction to Trx-G and Pc-G genes. Methods Enzymol. 377: 61-70.

Kennison J.A. and Tamkun J.W., 1988. Dosage-dependent modifiers of Polycomb and Antennapedia mutations in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8136-8140.

Khorasanizadeh S., 2004. The nucleosome: From genomic organization to genomic regulation. Cell 116: 259-272.

Klymenko T. and Muller J., 2004. The histone methyltransferases Trithorax and Ash1 prevent transcriptional silencing by Polycomb group proteins. EM BO Rep. 5: 373-377.

Kruger W., Peterson C.L., Sil A., Cobum C, Arents G., Moudrianakis E.N., and Herskowitz I., 1995. Amino acid substitutions in the structured domains of histories H3 and H4 partially relieve the requirement of the yeast SWI/SNF complex for transcription. Genes Dev. 9: 2770-2779.

Kwon H., Imbalzano A.N., Khavari P.A., Kingston R.E., and Green M.R., 1994. Nucleosome disruption and enhancement of activator binding by a human SWI/SNF complex. Nature 370: 477-481.

Levine S.S., King I.F., and Kingston R.E., 2004. Division of labor in Polycomb group repression. Trends Biochem. Sci. 29: 478-485.

Lewis B.A. and Reinberg D., 2003. The mediator reactivator complex: Functional and physical roles in transcriptional regulation. J. Cell Sci. 116: 3667-3675.

Logie C. and Peterson C.L., 1997. Catalytic activity of the yeast SWI/SNF complex on reconstituted nucleosome arrays. EMBO J. 16: 6772-6782.

Lorch Y., Zhang M., and Romberg R.D., 1999. Histone octamer transfer by a chromatin-remodeling complex. Cell 96: 389-392.

Machado C. and Andrew D.J., 2000. D-Titin: A giant protein with dual roles in chromosomes and muscles. J. Cell Biol. 151: 639-652.

Mahmoudi T. and Verrijzer C.P., 2001. Chromatin silencing and activation by Polycomb and trithorax group proteins. Oncogene, 20: 3055-3066.

Miller T., Krogan N.J., Dover J., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Johnston M., Greenblatt J.F., and Shilatifard A., 2001, COMPASS: A complex of proteins associated with a trithorax-related SET domain protein. Proc. Natl. Acad. Sci. 98: 12902-12907.

Min J., Zhang Y., and Xu R.M., 2003. Structural basis for specific binding of Polycomb chromodomain to histone H3 methylated at Lys 27. Genes Dev. 17: 1823-1828.

Mohrmann L. and Verrijzer C.P., 2005. Composition and functional specificity of SWI2/SNF2 class chromatin remodeling complexes. Biochim. Biophys. Acta 1681: 59-73.

Muyrers-Chen I., Rozovskaia T., Lee N., Kersey J.H., Nakamura T., Canaani E., and Paro R., 2004. Expression of leukemic MLL fusion proteins in Drosophila affects cell cycle control and chromosome morphology. Oncogene 23: 8639-8648.

Petruk S., Sedkov Y., Smith S., Tillib S., Kraevski V, Nakamura T., Canaani E., Croce C.M., and Mazo A., 2001. Trithorax and dCBP acting in a complex to maintain expression of a homeotic gene. Science 294: 1331-1334.

Phelan M.L., Sif S., Narlikar G.J., and Kingston R.E., 1999. Reconstitution of a core chromatin remodeling complex from SWI/SNF subunits. Mol. Cell 3: 247-253.

Pokholok D.K., Harbison C.T., Levine S., Cole M., Hannett N.M., Lee T.I., Bell G.W., Walker K., Rolfe P.A., Herbolsheimer E., et al., 2005. Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast. Cell 122: 517-527.

Polach K.J. and Widom J., 1995. Mechanism of protein access to specific DNA sequences in chromatin: A dynamic equilibrium model for gene regulation. J. Mol. Biol. 254: 130-149.

Rea S., Eisenhaber E, O’Carroll D., Strahl B.D., Sun Z.W, Schmid M., Opravil S., Mechtler K., Ponting C.P., Allis C.D., and Jenuwein T., 2000. Regulation of chromatin structure by site-specific histone H3 methyltransferases. Nature 406: 593-599.

Ringrose L. and Paro R., 2004. Epigenetic regulation of cellular memory by the polycomb and trithorax group proteins. Annu. Rev. Genet. 38: 413-443.

Roguev A.,. Schaft D., Shevchenko A., Pijnappel W.W., Wilm M., Aasland R., and Stewart A.F., 2001. The Saccharomyces cerevisiae Setl complex includes an Ash2 homologue and methylates histone 3 lysine 4. EMBO J., 20: 7137-7148.

Saha A., Wittmeyer J., and Cairns B.R., 2005. Chromatin remodeling through directional DNA translocation from an internal nucleosomal site. Nat. Struct. Mol. Biol. 12: 747-755.

Santos-Rosa H., Schneider R., Bannister A. J., Sherriff J., Bernstein B.E., Emre N.C., Schreiber S.L., Mellor J., and Kouzandes T., 2002. Active genes are tri-methylated at K4 of histone H3. Nature 419: 407-411.

Simon J., 1995. Locking in stable states of gene expression: Transcriptional control during Drosophila development. Curr. Opin. Cell Biol. 7: 376-385.

Simon J.A. and Tamkun J.W., 2002. Programming off and on states in chromatin: Mechanisms of Polycomb and trithorax group complexes. Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 210—218.

Srinivasan S., Armstrong J.A., Deuring R., Dahlsveen I.K., McNeill H., and Tamkun J.W., 2005. The Drosophila trithorax group protein Kismet facilitates an early step in transcriptional elongation by RNA Polymerase II. Development 132: 1623-1635.

Strober B.E., Dunaief J.L., Guha S., and Goff S.P., 1996. Functional interactions between the hBRM/hBRGl transcriptional activators and the pRB family of proteins. Mol. Cell. Biol 16: 1576-1583.

Sudarsanam P., Iyer V.R., Brown P.O., and Winston F., 2000. Whole-genome expression analysis of snf/swi mutants of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 3364-3369.

Tamkun J.W., Deuring R., Scott M.P., Kissinger M., Pattatucci A.M., Kaufman T.C., and Kennison J.A., 1992. brahma: A regulator of Drosophila homeotic genes structurally related to the yeast transcriptional activator SNF2/SWI2. Cell 68: 561-572.

Therrien M., Morrison D.K., Wong A.M., and Rubin G.M., 2000. A genetic screen for modifiers of a kinase suppressor of Ras-dependent rough eye phenotype in Drosophila. Genetics 156: 1231-1242.

Versteege I., Sevenet N., Lange J.. Rousseau-Merck M.F., Ambros P., Handgretinger R., Aurias A., and Delattre O., 1998. Truncating mutations of hSNF5/INIl in aggressive paediatric cancer. Nature 394: 203-206.

Vignali M., Hassan A.H., Neely K.E., and Workman J.L., 2000. ATP-dependent chromatin-remodeling complexes. Mol Cell Biol., 20: 1899-1910.

Wang W., Cote J., Xue Y., Zhou S., Khavari P.A., Biggar S.R., Muchardt C., Kalpana G.V., Goff S.P., Yaniv M., et al., 1996. Purification and biochemical heterogeneity of the mammalian SWI-SNF complex. EMBO J. 15: 5370-5382.

White house I., Stockdale G., Flaus A., Szczelkun M.D., and Owen-Hughes T., 2003. Evidence for DNA translocation by the ISWI chromatin-remodeling enzyme. Mol. Cell. Biol. 23: 1935-1945.

Wysocka J., Swigut T., Milne T.A., Dou Y., Zhang X., Burlingame A.L., RoederR.G., Brivanlou A.H., and Allis C.D., 2005. WDR5 associates with histone H3 methylated at K4 and is essential for H3 K4 methylation and vertebrate development. Cell 121: 859-872.

Yokoyama A., Wang Z., Wysocka J., Sanyal M., Aufiero D.J., Kitabayashi I., Herr W., and Cleary M.L., 2004. Leukemia protooncoprotein MLL forms a SET 1-like histone methyltransferase complex with menin to regulate Hox gene expression. Mol. Cell Biol. 24: 5639-5649.

Yu B.D., Hanson R.D., Hess J.L., Homing S.E., and Korsmeyer S.J., 1998. MLL, a mammalian trithorax-group gene, functions as a transcriptional maintenance factor in morphogenesis. Proc. Natl Acad. Sci. 95: 10632-10636.

Yu B.D., Hess J.L., Horning S.E., Brown G.A., and Korsmeyer S.J., 1995. Altered Hox expression and segmental identity in M/-mutant mice. Nature 378: 505-508.