1.1. Преимущества полового воспроизведения

Половое воспроизведение обычно у эукариот. Даже растения, которые вполне могут размножаться отводками или побегами, часто обладают альтернативным половым способом воспроизведения. Как нередко бывает, эволюция дает возможное объяснение этого, показывая, что половое воспроизведение дает огромное увеличение генетической изменчивости, с которой может работать естественный отбор, создавая эволюционные изменения. Перетасовка аллелей, происходящая в каждом половом поколении, могла бы таким образом создавать популяцию, способную справляться со сдвигами во внешней среде более эффективно, чем относительно гомогенная популяция, возникающая в результате бесполых способов воспроизедения. Однако у высших эукариот пол усложнен, поскольку нуждается в развитии, ведущем к образованию мужских и женских половых органов, а также физиологического и биохимического аппарата, необходимого для мейоза, созревания зародышевых клеток, привлечения партнеров и спаривания (дальнейшее обсуждение этих тем см.: Marshall Graves and Shetty, 2001 и помещенные там ссылки). Критический момент и определенная мера эволюционного успеха заключаются в том, что изменчивые популяции способны лучше избегать конечной катастрофы, связанной с вымиранием.

1.2. Способы определения пола

Генетические механизмы определения пола варьируют в значительной степени от одного организма к другому. Простейшая система включает один локус, который гомозиготен у одного пола (гомогаметныи пол) и гетерозиготен у другого (гетерогаметный пол) (рис. 17.1). Эта простая система развивалась различными путями, достигнув разной степени сложности у разных организмов. У некоторых из них возникли механизмы, подавляющие мейотическую рекомбинацию (кроссинговер) определяющих пол аллелей у гетерогаметного пола (рис. 17.1) — шаг, помогающий предотвратить возникновение смесей аллелей, ведущих к интерсексуальным состояниям. Во многих случаях неспособность к рекомбинации распространилась на часть или даже на всю хромосому, что сопровождалось утратой генетической информации. Эволюционное давление, обусловившее эту дегенерацию хромосомы, все еще остается непонятным, но конечный результат у многих видов заключается в том, что два пола обнаруживают различия не просто по аллелям в одном или нескольких локусов, но по целым хромосомам. Это изображено в виде простой диаграммы на рис. 17.1. У большинства видов, включая наш собственный, такую дегенерировавшую хромосому несут самцы, хотя бывают и исключения.

Рис. 17.1. Эволюция Y-хромосомы

На ранних этапах эволюции два пола могли различаться лишь по одному, аутосомному локусу, когда один пол (обозначаемый как протомужской) гетерозиготен по этому локусу, а другой пол (протоженский) гомозиготен. «Аллель, детерминирующая мужской пол», показана желтым цветом. Если для спаривания необходима одна особь каждого пола, тогда особи, гомозиготные по аллели, детерминирующей мужской пол, не могут возникать. На этой ранней стадии физиологические различия между полами будут еще слабыми, сравнимыми с различиями между двумя типами спаривания у дрожжей. Для предотвращения образования интерсексуальных состояний кроссинговер в локусе, определяющем мужской пол, и вокруг него будет подавлен (эти подавленные области показаны темным цветом) В пределах этого района будут накапливаться мутации, потому что подавление кроссинговера уменьшит их способность распространяться по популяции и, отсюда, давление отбора против них. Район дегенерации, в котором кроссинговер подавлен, будет постепенно расширяться («храповик Меллера»), пока эта хромосома не утратит большую часть своих активных, функциональных генов. Должен остаться небольшой, активный участок, гомологичный Х-хромосоме, для того, чтобы разрешить спаривание и кроссинговер при мейозе. Это псевдоаутосомный район (PAR, pseudoautosomal region). Аутосома, первоначально гомологичная будущей Y («А» на диаграмме), будет сама эволюировать в основном путем транслокаций с других аутосом. в конечном счете формируя отличающуюся Х-хромосому. Эта Х-хромосома, подобно другим хромосомам, представляет собой мозаику из фрагментов ДНК, помещенных на место в разные периоды на протяжении эволюции; некоторые из них являются древними, а некоторые относительно недавние. Это иллюстрируется по-разному расположенными пэтчами на прото-Х- и Х-хромосомах На Х-хромосоме человека более недавние участки обогащены генами, избежавшими инактивации X

Половая дифференцировка обычно запускается включением или выключением одного или небольшого числа генов в ходе развития. Продукты этих генов инициируют каскад регуляторных событий, опосредующих дальнейшее продвижение по тому или иному пути детерминации пола (см. детали для Caenorhabditis elegans в главе 15 и для Drosophila в главе 16). У человека существует белковый продукт гена SRYна Y-хромосоме, который запускает ранний зародыш по мужскому пути полового развития (обзор см.: McElrevey et al., 1995). Механизм такого типа не нуждается в крупных хромосомных различиях для того чтобы успешно работать; почему же тогда такие различия возникали так часто? Возможно, что они произошли как побочный продукт супрессии кроссинговера, необходимой для предотвращения интерсексуальных состояний (рис. 17.1). Математический анализ факторов, влияющих на распротстранение аллелей в популяциях, показывает, что супрессия кроссинговера неизбежно приведет к постепенному накоплению вредных мутаций (возможно даже, мутаций, вызывающих дальнейшее подавление кроссинговера). Это приведет к прогрессивной дегенерации одной из двух исходно гомологичных хромосом (рис

17.1). Этот процесс был назван «"храповиком" Меллера» в память генетика, впервые предложившего этот механизм. Для этого случая не существует отбора, он просто происходит как следствие начального принятия стратегии двух полов для воспроизведения (обсуждение см.: Charlesworth, 1996 и помещенные там ссылки). Какая бы эволюционная тенденция ни стояла за дегенерацией хромосомы, тот факт, что она произошла (и, возможно, еще продолжается), требует коэволюции механизмов, чтобы справиться с крупными хромосомными различиями между членами одного и того же вида. Для этого предназначены механизмы дозовой компенсации.

1.3 Хромосомные способы детерминации пола создают необходимость в компенсации дозы

И у млекопитающих, и у Drosophila самцы имеют одну копию каждой половой хромосомы, X и Y, тогда как самки обладают двумя копиями X. В обеих группах организмов Y бедна генами и в основном гетерохроматична. Она содержит всего несколько генов, необходимых для мужского развития или фертильности. Напротив, X является крупной, богатой генами хромосомой. Двукратная разница в числе копий, если ее не скорректировать, привела бы к двукратному различию во внутриклеточных концентрациях продуктов нескольких тысяч генов между полами. Поэтому не удивительно, что эволюция не может терпеть такое крупное различие между членами одного и того же вида. Вместо этого она выработала способы устранения этого различия с помощью механизмов компенсации дозы.

Говоря в общих словах, существуют только три способа уравнивания количеств транскриптов генов, сцепленных с Х-хромосомой, между гетерогаметным и гомогаметным полами. Это (1) выключение генов на одной из двух женских Х-хромосом, (2) удвоение скорости транскрипции генов на единственной мужской Х-хромосоме и (3) снижение наполовину скорости транскрипции на каждой из двух женских Х-хромосом. Конечный результат как (2), так и (3) один и тот же в том отношении, что гены на единственной мужской Х-хромосоме транскрибируются вдвое быстрее, чем эквивалентные гены на двух женских Х-хромосомах, но пути для достижения этого состояния фундаментально различны. Были найдены примеры всех трех механизмов. Млекопитающие используют первый способ, Drosophila — второй (глава 16), а червь-нематода С. elegans — третий (глава 15). Тот факт, что получили развитие — и по-видимому, независимо — три очень разных механизма компенсации дозы, подтверждает важность конечной цели, а именно, уравнивания между полами уровней продуктов генов, сцепленных с X (обзор см.: Marin et al., 2000). Как следствие этого, мутации, нарушающие компенсацию дозы у любого из этих трех организмов, летальны у затронутого такой мутацией пола.

1.4. Идентификация неактивной Х-хромосомы у самок млекопитающих

В 1949 году Барр и Бертрам описали тельце полового хроматина — структуру, видную в световой микроскоп в ядрах клеток самки (но не самца) разных видов млекопитающих (см. рисунок на титульной странице главы). Эта структура оказалась полезной в исследованиях половых аномалий, но лишь в 1959 году Оно и коллеги (см. Ohno, 1967) показали, что эта структура происходит из одной из двух Х-хромосом самки. В 1961 году Мэри Лайон описала генетические эксперименты по экспрессии сцепленных с X генов окраски меха у самок мышей. Чтобы объяснить паттерны наследования этой изменчивой пятнистости (мозаичности) окраски меха у индивидуальной самки мыши, Лайон высказала гипотезу, что в каждой женской клетке одна из двух женских Х-хромосом стабильно инактивируется на ранних стадиях развития (Lyon, 1961). Тельце полового хроматина, известное теперь как тельце Барра, является, таким образом, цитологическим проявлением неактивной Х-хромосомы. Элегантные эксперименты с использованием фибробластов кожи от самок, гетерозиготных по полиморфизму сцепленному с X ферменту глюкоза-6-фосфатдегидрогеназе (G6PD), показали, что только одна из двух возможных аллелей экспрессировалась в колониях, выращенных из индивидуальных клеток (клонах), демонстрируя тем самым наследуемость неактивного состояния от одного клеточного поколения следующему (Davidson et al., 1963) и подтверждая инактивацию Х-хромосомы у женщин (Beutler et al., 1962). Дальнейшие исследования инактивации Х-хромосомы у женщин с множественными копиями X (с такими кариотипами, как 47ХХХ или 48ХХХХ) показали, что все Х-хромосомы сверх одной были инактивированы. Это было обобщено в виде «правила «—1», гласящего, что если особь имеет п Х-хромосом, тогда п— 1 из них будут инактивированы (Ohno et al., 1967). Это правило объясняет замечательно легкие клинические симптомы, связанные с анеуплоидиями по Х-хромосоме. Гипотеза инактивации Х-хромосомы продолжала служить объяснением особенностей экспрессии генов, сцепленных с X в клетках самок, и оставалась практически без изменений с тех пор, как она была впервые предложена. Последние 40 лет или около того прошли в попытках разработать молекулярные механизмы, лежащие в основе этого явления.

2.1. Инактивация X регулируется в ходе развития

Инактивация Х-хромосомы у самок млекопитающих регулируется в ходе развития. В ранней зиготе активны обе Х-хромосомы (Epstein et al, 1978), а затем инактивация протекает согласованно с клеточной дифференцировкой В норме существует равная вероятность того, что клетки инактивируют Х-хромосому, полученную ими от матери либо от отца (Xm и Хр, соответственно). Исключением из этого является инактивация импринтированной Х-хромосомы, которая происходит у всех сумчатых и в ранних предимплантационных эмбрионах мышей, где всегда инактивируется Хр. В последнем случае инактивация импринтированной Хр поддерживается в первых клеточных линиях, подлежащих дифференцировке, а именно в клетках экстраэмбриональной троходермы (ТЕ) и примитивной эндодермы (РЕ), но в клетках внутренней клеточной массы (ICM), дающей начало эмбриону, эта неактивная Х-хромосома реактивируется. Реверсия инактивации X происходит также в развивающихся примордиальных зародышевых клетках (PGCs), что обеспечивает вновь активность этой Х-хромосомы в гамете. Рис. 17.2 иллюстрирует цикл инактивации и реактивации X у самок мышей.

2.2. Сайленсинг хромосомы включает множественные уровни эпигенетической модификации

На уровне структуры хроматина сайленсинг Х-хромосомы достигается путем модификации гистоновых «хвостов», включения или исключения вариантных гистонов и метилирования ДНК в богатых CpG «островках»; все это вносит вклад в стабильную структуру гетерохроматина. Слои эпигенетической модификации устанавливаются прогрессивно в ходе онтогенеза, что в деталях описано в разделе 4.4. Все вместе они обеспечивают стабильное воспроизведение неактивной Х-хромосомы в ходе многочисленных раундов клеточных делений.

Вклад отдельных модификаций варьирует как во времени, так и в разных линиях клеток. Например, в соматических клетках высокие уровни H3K27me3 (три-метилирования гистона H3 по лизину 27) требуются на Xi во время раннего развития, но не позже. Напротив, метилирование «островков» CpG необходимо лишь в позднем развитии или не требуется вовсе в клетках трофэктод ермы.

2.3. Некоторые гены избегают Х-инактивации

Х-инактивация затрагивает большую часть Х-хромосомы, но некоторые гены ускользают от сайленсинга. К ним относятся гены в небольшом районе Х-хромосомы, который спаривается с Y-хромосомой в ходе мейоза у самцов и известен как псевдоаутосомный район (PAR), или район спаривания XY (рис. 17.1). Гены, локализованные в этом районе, не требуют компенсации дозы, потому что и у самцов, и у самок присутствуют две копии.

Были охарактеризованы и другие гены-«беглецы» [«дезертиры»], как имеющие сцепленных с Y гомологов, так и не имеющие их. Недавнее исследование показало, что приблизительно 15 % генов на Х-хромосоме человека избегают Х-инактивации (Carrel and Willard, 2005). Интересно, что многие из этих генов лежат в коротком плече хромосомы (обозначаемом как Хр), который относительно недавно приобретен Х-хромосомой в ходе эволюции. Исследования на мышах показывают, что «беглецы» могут быть в раннем онтогенезе инактивированы, а в ходе дальнейшего развития прогрессивно реактивируются (раздел 4.6). У сумчатых большинство изученных генов оказалось в той или иной степени избегающими Х-инактивацию. Это может быть отражением неспособности поддерживать сайленсинг в ходе онтогенеза, которая, возможно, связана с утратой метилирования «островков»

CpG на Xi у этих видов (дополнительные детали см. в Разделе 4.7).

2.4. Х-инактивация регулируется главным локусом-переключателем — центром Х-инактивации

Классические генетические исследования продемонстрировали, что Х-инактивация опосредуется одним cis-действуюшим главным локусом-переключателем [master switch locus], называемым «центр Х-инактивации (Xic)». Было показано, что Xic требуется для сайленсинга Х-хромосомы в cis-конфигурации и для обеспечения корректной и надлежащей инициации случайной Х-инактивации. В более поздних исследованиях Xic был охарактеризован на молекулярном уровне. Этот локус производит большую некодирующую РНК, называемую Xist (Xznactive specific transcript), которая обладает уникальным свойством связываться в cis-конфигурации и накапливаться по всей длине хромосомы, с которой она транскрибируется (см. рис. 17.3) (Brown et al., 1991, 1992; Brockdorff et al., 1992). Покрытие этой хромосомы Xist-PHK создает переключатель для сайленсинга Х-хромосомы (Lee et al., 1996; Penny et al., 1996; Wutz and Jaenisch, 2000). Проведенные до сегодняшнего дня исследования показывают, что это происходит, по крайней мере отчасти, благодаря опосредованному Xist рекрутированию комплексов, модифицирующих хроматин (рис. 17.3).

Вторая некодирующая РНК, Tsix y также локализуется в участке Xic (Lee et al., 1999) и играет ключевую роль в регуляции экспрессии Xist Tsix перекрывается с геном Xist, но транскрибируется в антисмысловом направлении — отсюда его название, соответствующее Xist f прочтенному наоборот!

3.1. Импринтированная versus случайная Х-инактивация

Решение инактивировать Х-хромосому должно жестко регулироваться. Мужские клетки должны избежать сайленсинга своей единственной Х-хромосомы, а женские клетки должны избежать сайленсинга обеих Х-хромосом или сохранения обеих Х-хромосом в активном состоянии. Было показано, что здесь используются два разных способа регуляции. Импринтированный способ Х-инактивации обеспечивает сайленсинг Х-хромосомы, полученной от отца. При случайном способе каждая клетка имеет равную вероятность инактивации либо материнской, либо отцовской Х-хромосомы. Млекопитающие-метатерии (сумчатые) используют только импринтированный способ. Млекопитающие-эутерии (плацентарные), по крайней мере в некоторых случаях, используют импринтированный способ в экстраэмбриональных клеточных линиях, но случайный способ в собственно эмбрионе (рис. 17.2). Имеются некоторые указания на то, что у человека используется только случайная Х-инактивация, но это остается не выясненным окончательно.

Рис. 17.2. Цикл Х-инактивации и Х-реактивации

Х-хромосома в ходе развития проходит цикл Х-инактивации и Х-реактивации. Красные стрелки указывают на этапы Х-инактивации, а зеленые — на этапы Х-реактивации. Инактивация вначале происходит в ранних предимплантационных эмбрионах (импринтированная Х-инактивация), а впоследствии — в клетках эпибласта во время гаструляции (случайная Х-инактивация). Неактивная Х-хромосома реактивируется в клетках внутренней клеточной массы (ICM). когда они впервые обособляются на стадии бластоцисты, а также в развивающихся зародышевых клетках

3.2. Регуляция импринтированной Х-инактивации

Отцовски импринтированную Х-инактивацию впервые наблюдали у сумчатого (Sharman, 1971). Впоследствии Такаги и Сасаки (Takagi and Sasaki, 1975) продемонстрировали импринтированную Х-инактивацию в экстра-эмбриональных клеточных линиях ТЕ и РЕ мышиных эмбрионов. Именно происхождение Х-хромосомы от того или другого родителя управляет ее статусом; другими словами, инактивируются отцовские, но не материнские Х-хромосомы, независимо оттого, сколько Х-хромосом или хромосомных наборов присутствуют в клетке. Обратите внимание на то, что единственная Х-хромосома у самцов XYвсегда происходит от матери и, следовательно, не инактивируется в импринтированных тканях.

Какова же тогда природа импринта? Исследования экспрессии Xist, регулирующего Х-инактивацию в cis-конфигурации, показывают, что у мышиных эмбрионов имеется репрессивный импринт на аллели, локализованной в Xm (рис. 17.4). Этот импринт препятствует экспрессии Xist, удерживая Х-хромосому в активном состоянии. Опыты с пересадкой ядер показали, что этот репрессивный А75/-импринт устанавливается во время созревания ооцитов (Tada et al., 2000). Молекулярная основа этого импринта неизвестна, но метилирования ДНК не требуется, в отличие от многих других импринтированных генов (см. детали геномного импринтинга в главе 19).

Одна из теорий предпочтительной инактивации Хр в зиготе заключается в том, что имеет место перенос сайленсинга бивалента XY, который устанавливается на стадии пахитены мейоза у самцов (meiotic sex chromosome /motivation, MSCI) (Huynh and Lee, 2003). Недавние исследования говорят против этого. Во-первых, было показано, что MSCI — отдельный и не зависимый от Xist механизм, включаемый в пахитене присутствием неспаренных участков хромосом, как на половых хромосомах, так и на аутосомах (Turner et al., 2005 и помещенные там ссылки). Во-вторых, анализ экспрессии ряда сцепленных с X генов в ранних зиготах показал, что сайленсинг Хр возникает de novo в ответ на экспрессию Xist зиготической Хр (Okamoto et al., 2005 и помещенные там ссылки).

Экспрессия отцовского Xist (и получающийся в результате этого сайленсинг Хр), начинающаяся в начале зиготической активации гена (на 2—4-клеточной стадии), показывает, что аллель Xist хромосомы Хр готова к экспрессии (рис. 17.4). Однако в мужских соматических тканях Xist всегда репрессирована, откуда следует, что мужские зародышевые клетки должны каким-то образом ремоделировать локус Xist. В соответствии с этим, имеет место специфичное в отношении района деметилирование сайтов CpG в промоторе Xist во время сперматогенеза (Norris et al., 1994).

Рис. 17.3. Прогрессивная гетерохроматинизация всей хромосомы, индуцируемая Xist-РНК

(а) Когда ген Xist экспрессируется, синтезируемая РНК связывается с Х-хромосомой, с которой она транскрибируется, и покрывает ее ( зеленая прерывистая линия). Считается, что Xist -РНК включает сайленсинг этой хромосомы, рекрутируя активности, модифицирующие хроматин (красные и желтые кружки). Эта первоначальная волна сайленсинга, в свою очередь, приводит к рекрутированию дополнительных слоев эпигенетической модификации ( серые кружки ), еще более стабилизируя структуру гетерохроматина. Установление этих различных уровней эпигенетического сайленсинга достигается поэтапно в ходе всего развития и онтогенеза. (б) Локализацию Xist-PHК по всем Х-хромосомам показывает гибридизация in situ как в интерфазе, так и в метафазе

У эмбрионов с анеуплоидией по Х-хромосоме результатом родительских импринтов, управляющих экспрессией Xist, оказываются неправильные паттерны Х-инактивации на ранних этапах развития. Так же обстоит дело у андрогенетических и гиногенетических (или партеногенетических) эмбрионов, у которых оба хромосомных набора происходят, соответственно, либо от отца, либо от матери. Хотя это обычно снижает жизнеспособность эмбриона, некоторые эмбрионы выживают, очевидно исправляя несоответствующие паттерны Х-инактивации, чтобы обеспечить наличие одной активной Х-хромосомы во всех клетках. Полагают, что это связано с преодолением импринта с помощью механизма, в норме регулирующего случайную Х-инактивацию (см. ниже).

Ген Tsix, антисмысловой регулятор Xist, необходим для импринтированной Х-инактивации, поскольку делеция главного промотора приводит к ранней эмбриональной летальности, когда передается материнской, но не отцовской гаметой (Lee, 2000). Летальность, по-видимому, можно приписать несоответствующей экспрессии Xist хромосомы Xm, т. е. неспособности сохранить активную Х-хромосому у эмбрионов как XmY, так и ХгпХр. В настоящее время неясно, является ли экспрессия Tsix-РНК первичным импринтом или же функционирует позже для поддержания импринта.

3.3. Регуляция случайной Х-инактивации — счет

При случайном способе Х-инактивации клетки пользуются правилом п— 1, при котором на каждый диплоидный! хромосомный набор инактивируются все Х-хромосомы кроме одной. Выбор X, которая будет сайленсирована (или сохранится активной) по существу является случайным, хотя некоторые факторы могут влиять на него (см. раздел 3.4). Регуляция Xist при случайной инактивации строго контролируется Исследования показали, что одиночные эмбриональные стволовые (ES) клетки XX при дифференцировке экспрессируют только лишь одну аллель Xist, тогда как клетки XY никогда не инициируют экспрессию.

Рис. 17.4. Регуляция гена Xist в раннем развитии

Рисунок иллюстрирует современные знания и модели импринтированной и случайной регуляции Xist у ранних мышиных эмбрионов XX. Аллель Xm гена Xist приходит в зиготу с репрессивным импринтом, возможно опосредованным антисмысловым локусом Tsix (черный квадратик). Аллель Хр готова к тому, чтобы быть активной, и экспрессируется как только на 2-клеточной стадии происходит активация эмбрионального гена. Со стадии 2 клеток до стадии морулы Хр Xist экспрессируется во всех клетках (экспрессия показана открытым прямоугольником и стрелкой на 5’-конце). Этот паттерн поддерживается на стадии ранней бластоцисты и впоследствии в клетках ТЕ и РЕ и производных от них полностью дифференцированных тканей. В ICM поздней бластоцисты экспрессия Xist прекращается, возможно с помощью ICM-специфичного репрессорного фактора (голубой треугольник). Впоследствии экспрессия Xist начинается во время гаструляции. Здесь блокирующий фактор (черный ромб) гарантирует, чтобы экспрессия Xist не могла происходить на одной из двух аллелей (счет)

У анеуплоидных или полиплоидных по Х-хромосоме мышиных эмбрионов результат случайной и импринтированной Х-инактивации различен. Простую иллюстрацию этого дают эмбрионы ХО. При импринтированной Х-инактивации эмбрионы XmО являются нормальными, но развитие эмбрионов ХрО замедлено, поскольку клетки пытаются инактивировать свою единственную Х-хромосому, нарушая тем самым развитие экстраэмбриональных тканей. При случайной Х-инактивации клетки считают число своих Х-хромосом (подчиняясь правилу п—1) и таким образом поддерживают единственную Х-хромосому активной, независимо от того, является ли она Xm или Хр. и поэтому не страдают.

Случайный способ Х-инактивации требует, чтобы клетки обладали средствами для определения числа присутствующих Х-хромосом, нередко называемого «счетом» Популярной моделью для объяснения счета является модель блокирующего фактора, предложенная Растаном (Rastan, 1983). Она предполагает, что единственный Xic (аллель Xist) блокирован во всех клетках, обозначая тем самым активную Х-хромосому. Дополнительные Xic (аллели Xist), там где они имеются, экспрессируются, индуцируя таким образом Х-инактивацию (рис. 17.5). Модель Растана предполагает, что Х-инактивация есть состояние «по умолчанию», заключающееся в том, чтобы сохранять одну Х-хромосому активной. Хотя может показаться, что модель противоречит интуиции, она обладает важным достоинством, объясняя большинство сделанных до сегодняшнего времени экспериментальных наблюдений. Природа блокирующего фактора остается, однако, неизвестной.

Наше понимание механизмов, регулирующих экспрессию Xist и инициацию Х-инактивации, очень выиграло от использования клеток ES, культивируемых in vitro. Клетки ES получаются из мышиных эмбрионов на стадии бластоцисты, говоря конкретнее, из ICM (рис. 17.4). Они остаются недифференцированными при культивировании в сыворотке с добавкой лейкемического ингибиторного фактора (LIF, leukemia inhibitory factor). Дифференцировку in vitro можно включить удалением LIF из культуральной среды и пересевом клеток на чашки, изготовленные из неадгезивного пластика. В этих условиях они округляются, агрегируют и формируют эмбриоидные тела, внутри которых они дифференцируются, на протяжении всего нескольких дней, во много разных соматических клеточных типов В недифференцированном состоянии ES-клетки XX обладают двумя активными Х-хромосомами. Когда индуцируют дифференцировку этих клеток, большинство клеток эмбриоидного тела претерпевают случайную Х-инактивацию. Напротив, в дифференцированных ES-клетках XY экспрессия Xist и Х-инактивация не происходят Таким образом, ES-клетки представляют собой ценную модельную систему, потому что они поддаются генетическому манипулированию с использованием «нацеливания» на гены, и, таким образом, на них можно изучать различные этапы процесса Х-инактивации. Ключевым экспериментом явилась демонстрация того, что делеция участка длиной 65 т. п.н., локализованного непосредственно «вниз по течению» от Xist, приводит к экспрессии Xist этой аллелью (и, как следствие, к инактивации) даже в дифференцирующихся ES-клетках XY (Clerc and Avner, 1998). Это означает, что делетированные последовательности необходимы для связывания предполагаемого блокирующего фактора. Дальнейшая характеристика участка, ответственного за это, была достигнута с помошью стратегий «замещения — нацеливания», позволяющих получать делеции более мелких участков в пределах этих 65 т. п.н. (рис. 17.6). Определение ключевых элементов и идентификация связывающихся с ними факторов являются главными целями будущих исследований.

Рис. 17.5. Модель блокирующего фактора для случайной инактивации Х-хромосомы

Модель блокирующего фактора предполагает, что имеется некий фактор (желтый кружок), который во всех клетках блокирует единственную аллель Xist (зеленый прямоугольник ), так что в начале Х-инактивации эта хромосома защищена от идущей Х-инактивации. В мужских клетках (а) присутствует только одна аллель, и блокирующий фактор всегда связывается с нею. В женских клетках (б) существует равная вероятность, что блокирующий фактор свяжется либо с аллелью Xm Xist (красный цвет), либо с аллелью Хр Xist (синий цвет). В начале Х-инактивации только незаблокированная аллель будет экспрессировать Xist — РНК (зеленая прерывистая линия). Разные алели цетра Х-инактивации могут иметь большее или меньшее сродство к блокирующему фактору, так что у гетерозиготных самок этот фактор предпочтительно связывается с одной Х-хромосомой. В некоторых случаях это может лежать в основе отклонений от первичной неслучайной X-инактивации (рис. 17.7)

3.4. Регуляция случайной Х-инактивации — выбор

При некоторых обстоятельствах могут иметь место отклонения от случайной Х-инактивации. Это происходит либо в результате нарушений в первоначальном выборе

Х-хромосомы для инактивации («первичная неслучайная инактивация), либо в результате отбора против клеток, поддерживающих конкретную Х-хромосому в активном состоянии («вторичная» неслучайная Х-инактивация) (рис. 17.7). При первичной неслучайной Х-инактивации на выбор влияют вариации cis-действующих последовательностей или мутации, влияющие на вероятность того, что данная Х-хромосома будет выбрана у гетерозиготных животных как активная или неактивная X. Согласно предложенной Растаном модели блокирующего фактора, эти вариации могут проявлять свое влияние, изменяя вероятность связывания блокирующего фактора с данной аллелью.

Примером первичной неслучайной Х-инактивации является контролирующий Х-хромосому элемент (Хее, X controlling element) у мышей. Хее — классическим образом определенный локус, где разные аллели оказались влияющими на вероятность того, что несущая этот локус Х-хромосома будет активной X у гетерозигот XX (Cattanach and Isaacson, 1967). Опыты по генетическому картированию помещают Хее непосредственно «вниз по течению» от Xist (рис. 17.6) и, следовательно, в правильном положении для того, чтобы влиять на связывание блокирующего фактора, как определяется делецией 65 т. п.н. Лежащую в основе этого изменчивость последовательностей остается идентифицировать.

Второй элемент, который у мышей может влиять на выбор, — это антисмысловой регулятор Tsix (Lee and Lu, 1999). Полагают, что он опосредуется антисмысловой РНК Tsix, которая транскрибируется через локус Xist перед инициацией случайной Х-инактивации (рис. 17.6). Хромосома, несущая делецию промотора Tsix, в клетках XX, претерпевающих случайную Х-инактивацию, инактивируется предпочтительно. Более слабые отклонения наблюдаются у клеток с мутациями в энхансерных элементах (Xite-элементах), которые могут управлять уровнями экспрессии Tsix. Хотя промотор Tsix лежит в пределах района, определяющего предполагаемый сайт связывания блокирующего фактора, опыты с «прицельными» делециями не активируют Xist «по умолчанию» в ES-клетках XY. Это позволяет предположить, что эти локусы не синонимичны, но что делеция промотора Tsix оставляет интактными сайты связывания для блокирующего фактора.

Транскрипция Tsix сопровождается транскрипцией Xist, идущей на низком уровне, перед инициацией случайной Х-инактивации, позволяя предполагать, что влияние на выбор может быть опосредовано двунитевой РНК (т. е. гибридными нитями Tsix: Xist). В согласии с этим повышение уровня смысловой транскрипции через промоторы Xist находится в противоречии с репрессивным эффектом Tsix и дает в результате аллель с меньшей вероятностью стать активной X в гетерозиготной клетке XX (Nesterova et al., 2003). Подытоживая этот материал, можно сказать, что на рис. 17.6 показаны все различные Xic-элементы, о которых известно, что они влияют на инициацию случайной и импринтированной Х-инактивации, и которые часто описываются с точки зрения их способности влиять на функции счета и (или) выбора.

Рис. 17.6. Гены и регуляторные элементы в районе центра Х-инактивации

Ключевой район, регулирующим Х-инактивацию, изображен зеленым цветом. Фланкирующие гены показаны серым цветом Стрелки указывают на промоторы генов Xist (смысловой) и Tsix (антисмысловой). Протяженность соответствующих некодируюших РНК изображена прерывистыми зелеными линиями. Регуляторные элементы, контролирующие экспрессию Tsix , Xite и DXPas34, показаны черным. Районы и локусы, участвующие в выборе Х-хромосомы и счете Х-хромосом, показаны в верхней части рисунка

3.5. Способы переключения инактивации в раннем эмбриогенезе

Каким образом ранние эмбрионы мыши осуществляют переключение с импринтированного на случайный способ регуляции? До недавнего времени думали, что в обоих случаях инициация Х-инактивации сцеплена с клеточной дифференцировкой (Monk and Harper, 1979). Так, полагали, что линии трофэктодермы и примитивной эндодермы инактивируют Хр в ответ на родительские импринты на Xist, когда они впервые дифференцируются на стадии бластоцисты, в то время как клетки ICM, дающие начало собственно эмбриону, сначала, как думали, стирают импринт Xist, а потом претерпевают случайную Х-инактивацию, когда они дифференцируются в три зародышевые линии на стадии гаструляции. Однако более свежие данные показывают, что инактивация ХР происходит до начала клеточной дифференцировки на стадии дробления зародышей и что она происходит во всех клетках, включая предшественников ICM (Мак et al., 2004; Okamoto et al., 2004). Таким образом, импринтированная Х-инактивация в трофэктодерме и примитивной эндодерме представляет собой реликт паттерна Х-инактивации, устанавливаемого у эмбрионов на стадии раннего дробления. Клетки ICM должны, таким образом, запускать программу для реверсии этой начальной волны импринтированной Х-инактивации (см. рис. 17.4). База для реверсии инактивации Хр неизвестна, но может включать в себя специфичную для ICM программу, которая репрессирует экспрессию Xist на Хр (см. раздел 5).

4.1. Xist-PHK, сайленсинг генов и сборка гетерохроматина

Так что же делает ген Xist? Имеются убедительные данные, что ген Xist и его продукт, РНК, обеспечивают как переключатель, инициирующий Х-инактивацию в cis-конфигурации, так и средство распространения сайленсинга по хромосоме. Данные показывают, что (1) Xist уникален в том отношении, что он экспрессируется только с Xi, (2) уровни Xist-РНК резко возрастают у предимплантационных эмбрионов во время Х-инактивации, (3) ап-регуляция Xist предшествует Х-инактивации и, по-видимому, является абсолютно необходимой для нее, (4) Xist-РНК колокализуется с Xi в интерфазных ядрах и распределяется по одной из двух метафазных Х-хромосом (см. рис. 17.3) и (5) содержащие Xist трансгены, будучи вставлены в аутосомы, могут индуцировать по крайней мере некоторые свойства неактивного хроматина. В результате (сверх)экспрессии аутосома в cis-конфигуpaции покрывается продуктом, и параллельно возникает подобная гетерохроматину, транскрипционно «молчащая» структура хроматина (Heard et al., 1999 и помещенные там ссылки). Эти открытия заставляют предположить, что Xist-РНК и необходима, и достаточна для включения формирования гетерохроматина и транскрипционного сайленсинга. Однако продолжающаяся экспрессия Xist не требуется для поддержания Х-инактивации. Например, у гибридов соматических клеток человека и грызуна, где экспрессия Xist утрачена на Xi-хромосоме человека, которая сохраняется на фоне хромосом грызуна, поддерживается сайленсинг генов, сцепленных с Х-хромосомой (Brown and Willard, 1994). Эта тема обсуждается далее, в разделе 5.

Важно отметить, что ассоциация Xist-PHK с Xi избирательна. Она не обнаруживается вдоль PAR (которое остается активным и эухроматиновым) или в конститутивном (центрическом) гетерохроматине. Более того, анализ метафазных хромосом демонстрирует локализацию в виде бэндов, которая, по-видимому, коррелируете G-светлыми полосами (бэндами), обогащенными генами (см. рис. 17.3) (Duthie et al., 1999). Эти наблюдения показывают, что Xist-РНК покрывает лишь определенные районы хроматина (обсуждается далее в разделе 4.5)

Механизм (механизмы), посредством которого Xist-PHK осуществляет изменения в структуре хроматина и связанный с ним сайленсинг генов в деталях остаются все еще непонятными. Мы знаем, что разные участки молекулы Xist-PHК ответственны за сайленсинг генов и распространение вдоль Х-хромосомы. Эксперименты с системой индуцибельной экспрессии Xist в мышиных ES-клетках, в которой можно было протестировать функции молекул Xist, несущих определенные делеции, показали, что сайленсинг можно приписать консервативной повторяющейся последовательности на 5’-конце этой молекулы, тогда как покрытие Х-хромосомы опосредуется последовательностями, разбросанными по всей остальной части молекулы (Wutz et al., 2002).

4.2. Гетерохроматиновая структура неактивной Х-хромосомы

Со времени самых ранних светомикроскопических исследований вполне осознавали, что Xi обладает свойствами, общими с гетерохроматином. Подобно конститутивному гетерохроматину, обнаруживаемому в центромерах и вокруг них, Xi остается видимой и, вероятно, конденсированной на протяжении всей интерфазы (в виде тельца Барра), и ее ДНК обычно реплицируется в поздней фазе S. Говорится, что Xi состоит из факультативного гетерохроматина. Однако важно помнить, что ДНК конститутивного гетерохроматина обычно обогащена специфическими, повторяющимися сателлитными последовательностями, которые ответственны, по крайней мере частично, за его характерные свойства. ДНК Х-хромосомы не обнаруживает подобной обогащенности, хотя и демонстрирует более слабые различия в специфических повторяющихся элементах, которые могут играть роль в процессе инактивации (см. раздел 4.5). Кроме того, хотя хроматин Xi часто описывается как «конденсированный», тщательный микроскопический анализ и ЗБ-реконструкция хромосом Ха и Xi, помеченных специфичным к ДНК Х-хромосомы зондом, позволяют предполагать, что различие между ними является в большей мере вопросом формы, чем количества хроматина на единицу объема (Eils et al., 1996).

Дальнейшие параллели между Xi и конститутивным гетерохроматином последовали в результате использования непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии для изучения распределения модификаций и вариантов гистонов по метафазным хромосомам и в интерфазных ядрах. Факультативный гетерохроматин неактивной Х-хромосомы и в клетках человека, и в клетках мыши обеднен ацетилированным гистоном Н4 (Jeppesen and Turner, 1993) и в этом отношении напоминает конститутивный, центрический гетерохроматин. Это явилось первой демонстрацией того, что неактивная Х-хромосома маркирована модификацией гистонов специфического типа. Последующие эксперименты, проведенные в нескольких лабораториях, подтвердили эти наблюдения и показали далее, что ацетилированные изоформы всех четырех коровых гистонов (H2A, H2B, H3 и Н4) обеднены и конститутивным, и факультативным гетерохроматином в интерфазных и метафазных клетках (O’Neill et al., 2003 и помещенные там ссылки). В частности, и центрический гетерохроматин, и Xi обеднены H3, ди- и три-метилированным по К4 (H3K4me2 и H3K4me3). Обычно полагают, что эти последние, как и ацетилирование, являются маркерами транскрипционно активного (или потенциально активного) хроматина.

Ситуация становится сложнее, когда рассматривается появление меток, ассоциированных с транскрипционным сайленсингом, а не изчезновение меток, связанных с транскрипционной активностью. Например, гистоны H3, ди- и триметилированные по К9 (H3K9me2/3), — характерные метки транскрипционно «активных» генов, и с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии нередко можно видеть, что они обогащены центическим гетерохроматином (Lachner et al., 2003). Однако по ряду технических и биологических причин, обогащенность ими Xi выглядела неопределенной. По этой причине, следует подчеркнуть значение специфичности антител для получения надежных результатов иммунофлуоресценции Например, лизины 9 и 27 в H3 оба являются частью тетрапептидного ARKS, и антитела, полученные против одного, могут давать перекрестную реакцию с другим. Такие перекрестные реакции должны быть тщательно исключены, прежде чем полученные результаты можно будет надежно интерпретировать. Кроме того, использованная процедура иммунизации и использованный иммуноген могут влиять на тонкую специфичность антисывороток. Например, антисыворотки к H3K9me3, полученные с поперечносшитыми [cross-linked] пептидами, сильнее связываются с этим модифицированным гистоном, когда он находится в гетерохроматиновом районе, чем когда он в эухроматине (Maison et al., 2002). Антисыворотки, полученные таким образом, являются ценными реагентами ддя исследований по гетерохроматину, но не идеальными ддя количественных сравнений гетерохроматина и эухроматина. Наконец, было отмечено, что усиленное иммунофлуоресцентное окрашивание в интерфазе может быть просто результатом более высокой плотности нуклеосом в гетерохроматине (Perche et al., 2000).

Тщательный анализ распределения модификаций гистонов по Xi в культивируемых клетках человека позволил глубже проникнуть в сложность этой системы (Chadwick and Willard, 2004). Определенные и неперекрывающиеся районы в Xi обогащены H3K9me3 и H3K27me3. Таким образом, в отличие от утраты ацетилирования, обогащенность этими модификациями является региональным, а не общим свойством Xi. Любопытно, что районы, обогащенные H3K27me3, оказываются также обогащенными Xist-РНК и вариантным гистоном макроH2A1.2 (Costanzi and Pehrson, 1998). Каким образом макроH2A1.2 мог бы ассоциироваться с Xi и какова его возможная роль в процессе инактивации — эти вопросы обсуждаются далее, в разделе 4.4. Напротив, те районы Xi, которые обогащены H3K9me3, показывают также повышенные уровни гетерохроматинового белка НР1 (о котором известно, что он связывается с метилированными H3K9) и H4K20me3 (метка, также ассоциированная с конститутивным, центрическим гетерохроматином). Важно отметить, что иммуноокрашивание тельца Барра в интерфазных клетках показало такие же паттерны совместного окрашивания, что заставляет предполагать, что различные домены сохраняются на протяжении всего клеточного цикла.

Рис. 17.7. Модели неслучайной Х-инактивации

Первичной неслучайной X-инактивацией обозначают отклонения в первоначальном выборе Х-хромосомы, которая будет инактивирована. Теоретически это могло бы происходить у гетерозиготных самок, где имеется отклонение в вероятности двух аллелей, связывающихся с блокирующим фактором. При вторичной неслучайной Х-инактивации выбор Х-хромосомы, которая будет инактивирована, является случайным, но события клеточного отбора приводят к прогрессивной утрате клеток, инактивирующих одну из двух Х-хромосом. Например, там, где на одной Х-хромосоме имеется вредная мутация, клетки, инактивирующие другую Х-хромосому, хромосому дикого типа, будут предпочтительно теряться

Возникающая картина — это картина сочетания модификаций гистонов, вариантов гистонов, негистоновых белков и Xist-PHK, взаимодействие которых формирует хроматин с его отличительными свойствами транскрипционного «молчания», репликации в поздней S-фазе, конденсированным внешним обликом и (возможно) ядерной локализацией, которые характерны для Xi. Однако точное функциональное значение отдельных хроматиновых доменов на Xi еще предстоит установить. Важное и беспокоящее наблюдение заключается в том, что частота наблюдаемых доменов широко варьирует от одной клеточной линии человека к другой (Chadwick and Willard, 2004). Это может быть не более, чем подтверждением известной избыточности в системе Х-инактивации (например, как отмечалось ранее, в зрелых клетках сайленсинг поддерживается даже тогда, когда Xist-PHK утрачивается), но это также и предупреждение, что культивируемые клеточные линии, особенно иммортализованные. не всегда являются надежным проводником в том, что происходит в первичных тканях, и уж точно не на ранних стадиях развития.

Модификации гистонов, ассоциированные с эухроматином и факультативным, и конститутивным гетерохроматином, суммированы в табл. 17.1. До сих пор лишь Xi, но не конститутивный гетерохроматин, оказалась обогащенной метилированием H3K27 и убиквитинированием гистона H2A по лизину 119 (H2AK119ub) (Plath et al., 2003; Silva et al., 2003; de Napoles et al., 2004; Smith et al., 2004).

Все модификации, перечисленные в табл. 17.1, ассоциированы с общей, гетерохроматиновой конформацией неактивной Х-хромосомы и были идентифицированы с помощью иммунофлуоресцентного анализа либо метафазных хромосом, либо тельца Барра в интерфазных клетках. Однако локальные изменения в модификациях гистонов могут также играть важную роль на различных этапах процесса Х-инактивации. Такие изменения могут быть идентифицированы с помощью микроскопии высокого разрешения или с помощью иммунопреципитации хроматина (СЫР) для того, чтобы картировать модификации, которые объяснялись в главе 10, внутри или по соседству с критичным районом Xic. Например, в недифференцированных ES-клетках крупный домен, простирающийся более чем на 340 т. п.н. в 5’-направлении от гена Xist, характеризуется гиперметилированием H3K9. Гиперметилирование уменьшается по мере того, как клетки дифференцируются и продолжается Х-инактивация (Heard et al., 2004). В женских ES-клетках тот же общий район хроматина обогащен метилированными H3K27 (Rougeulle et al., 2004), а сайты внутри него обогащены ацетилированными H3 и Н4 (O’Neill et al., 1999). Проводимые в настоящее время исследования должны показать, в какой мере эти локальные модификации гистонов в районе Xic являются ранними каузативными событиями, приводящими в действие процесс Х-инактивации, и в какой степени — событиями, совершающимися «вниз по течению» и являющимися (возможно, существенными) компонентами идущего процесса ремоделинга хроматина.

Таблица 17.1. Модификации гистонов. характерные для конститутивного и факультативного гетерохроматина

Указаны модификации гистонов, которыми обогащен (+) или обеднен (-) конститутивный и факультативный гетерохроматин по сравнению с эухроматином. Символ «означает, что уровень модификации неотличим сколько-нибудь от эухроматина. (me) — метилирование. Относится ко всем способным ацетилироваться лизинам. Обогащение в локальных «горячих пятнах», но не повсюду. Временное обогащение в некоторых клеточных типах.

Конститутивный центрический гетерохроматин обогащен метилированной ДНК, прежде всего 5’-метилцитозином в димерах CpG (глава 18). Это согласуется с его низким уровнем транскрипционной активности Как это, возможно, ни удивительно, уровень метилирования CpG на Xi в целом не является существенно более высоким, чем в остальном геноме. Однако специфические «островки» CpG, ассоциированные с «молчащими» генами, в высокой степени метилированы, и экспериментальные данные позволяют предполагать, что метилирование ДНК играет важную роль в стабилизации неактивного состояния. Так, мыши, у которых отсутствуют ферменты, которые либо метилируют немодифицированные до этого CpG (de novo метилтрансферазы ДНК, Dnmta и Dnmtb), либо поддерживают модификацию прежде модифицированных остатков (поддерживающий энзим, Dnmtl), инициируют и осуществляют случайную Х-инактивацию нормальным образом (Sado et al., 2000, 2004). Однако гены на гипометилированной Xi у этих мутантных мышей реактивируются легче, чем Xi у животных дикого типа с нормальными уровнями метилирования (Sado et al., 2000).

4.3. Энзимология модификаций гистонов на Хi

Ферменты, отвечающие за ацетилирование коровых гистонов (HDACs) во время Х-инактивации или за деметилирование H3K4, пока неизвестны. Поскольку ингибитор деацетилазы трихостатин A (TSA, trichostatin А) может предотвращать или, по крайней мере, задерживать появление деацетилированной X в дифференцирующихся женских ES-клетках, есть основания предположить участие HDACs (O’Neill et al., 1999). Однако мы не знаем, какие из 11 HDACs класса I и II отвечают за это вероятнее всего (энзимы класса III не подавляются TSA). Мы не знаем также механизм, ответственный за удаление метилирования H3K4. Ферменты, способные удалять метальные группы с H3K4, находящихся в моно- или диметилированном состоянии, были идентифицированы только недавно, а ферменты, способные деметилировать H3K4 в триметилированном состоянии, еще предстоит открыть. На этом этапе мы не можем исключить, что метилирование H3K4 и (или) деапетилирование гистонов удаляются с Xi путем замещения гистонов или же пассивным образом в ходе репликации ДНК.

В настоящее время мы больше знаем об энзимах, ответственных за помещение модификаций гистонов в нужное место. Метилирование H3K27 выполняется Ezh2/Enxl — гомологом белка группы polycomb (PcG) у Drosophila, энхансером zeste (E(Z)) (Silva et al., 2003) (E(Z)) является метилтрансферазой гистонов (HKTM), функционирующей в комплексе PRC2 PcG (глава 11). PRC2 рекрутируется к Xi во время дифференцировки ES-клеток с такой же кинетикой, что и метилирование H3K27. Интересно, что белки PcG участвуют также в убиквитинизации H2A по лизину 119 на Xi. В частности, белок RinglA/RinglB, коровый компонент комплекса PRC2 PcG, функционирует как лигаза ЕЗ для убиквитинирования H2A. Делеция и Ring 1 А, и Ring 1В приводит к потере убиквитинирования H2A как на Xi, так и по всему геному (de Napoles et al., 2004).

4.4. Последовательность событий, приводящих к Х-инактивации; ES-клетки как модельная система

Мышиные ES-клетки оказались бесценной модельной системой для исследования динамики инактивации Х-хромосомы. Повышенные уровни Xist-РНК и то, как она покрывает одну из Х-хромосом, впервые обнаруживаются в большой доле клеток спустя 1–2 дня дифференцировки. Имеются данные о том, что в ап-регуляции Xist играют роль как транскрипционные, так и посттранскрипционные механизмы (Panning et al., 1997; Sheardown et al., 1997; Rougeulle et al., 2004). Однако в недифференцированных женских ES-клетках Xist транскрибируется с обеих Х-хромосом, а в мужских — с единственной X, но продукт транскрипции, РНК, быстро деградирует, и лишь небольшие его количества выявляются по соседству с локусом Xist. Были представлены данные о том. что по мере дифференцировки имеет место стабилизация Xist-PHK на одной из двух Х-хромосом женских клеток (Panning et al., 1997; Sheardown et al., 1997). Механизм, лежащий в основе этого этапа избирательной стабилизации РНК, остается неизвестным, как и его вклад в общее увеличение содержания Xist-РНК и в покрытие ею хромосомы в cis-конфигурации.

Было обнаружено, что ряд этапов Х-инактивации совпадает с началом аккумуляции Xist-PHК в дифференцирующихся ES-клетках XX. В их число входят рекрутирование белков PcG и ассоциированное с этим метилирование H3K27, моноубиквитинирование H2A, деацетилирование H3K9 и утрата метилирования в H3K4 (Heard et al., 2001; Silva et al., 2003; de Napoles et al., 2004; Rougeulle et al., 2004). Глобальное деацетилирование гистонов — относительно позднее событие, происходящее в большинстве клеток на 3—5-й день; поэтому весьма вероятно, что оно участвует в поддержании и (или) стабилизации неактивного состояния, а не в его инициации (Keohane et al., 1996). Такая трактовка предполагает, что паттерны ацетилирования в промоторах отдельных генов, претерпевающих инактивацию, отражают паттерны, определяемые с помощью иммунофлуоресцентного анализа целой хромосомы или крупных доменов. Первоначальные исследования с использованием ChIP, заставляют предполагать, что это действительно так, однако необходимы дальнейшие эксперименты с вовлечением большего числа генов (O’Neill et al., 2003).

Аккумуляция вариантного гистона macroH2A1.2 на Xi происходит в ходе дифференцировки ES-клеток XX гораздо позже (Mermoud et al., 1999). Этот вариантный гистон имеет более 200 дополнительных аминокислотных остатков в своем карбокситерминальном конце и несколько аминокислотных замен по всей молекуле. Интересно, что в соматических клетках экспрессия Xist-PHK требуется для того, чтобы сохранить macroH2A на Xi (Csankovski et al., 1999), но ее недостаточно, чтобы рекрутировать macroH2A на ранних этапах дифференцировки (Mermoud et al., 1999; Wutz et al., 2002).

Избирательное метилирование ДНК на Xi — еще более позднее событие в ES-клетках, Динуклеотиды CpG, о которых известно, что они высокометилированы HaXi во взрослых клетках, не становятся метилированными в женских ES-клетках до гораздо более поздних стадий дифференцировки, 14—21-го дня (Keohane et al., 1996). Это согласуется с результатами в самом развивающемся эмбрионе (Lock et al., 1987) и с идеей, согласно которой метилирование ДНК отвечает за стабилизацию, или фиксацию неактивного состояния, а не участует в инициации и распространении.

Таким образом, возникающая картина — это картина скоординированной и тщательно регулируемой последовательности событий, посредством которых изменения хроматина на Xi помещаются на место по мере развития (суммировано на рис. 17.8). Замечательно, что некоторые из этих изменений, например деацетилирование гистонов и метилирование ДНК, происходят после того, как клетки начали продвигаться по различным дифференцировочным путям. Создается впечатление, что программа, отвечающая за завершение [completion] Х-инактивации, выполняется независимо от других программ клеточной дифференцировки. Важно, однако, отметить, что в некоторых аспектах случайная Х-инактивация может происходить только после того, как дифференцировка началась. Например, включение экспрессии Xist-трансгенов в недифференцированных ES-клетках переключает различные модификации гистонов, ассоциированные с гетерохроматинизацией, а также переход к репликации в поздней S-фазе (Wutz and Jaenisch, 2000), но сколько-нибудь заметное включение macroH2A отсутствует; только после того как индуцирована дифференцировка клеток, macroH2A ко-локализуется с Xist-РНК на хромосоме, содержащей трансген Xist (Rasmussen et al., 2001). Ассоциация macroH2A с хроматином, покрытым Xist, зависит от постоянного присутствия Xist-РНК (Csankovszki et al., 1999), но не требует транскрипционного сайленсинга, поскольку она видна также в хромосомах, покрытых мутантной Xist-РНК, лишенной районов, необходимых для сайленсинга (Wutz et al., 2002). Таким образом, Х-инактивация может рассматриваться как конечный результат серии параллельных процессов, из которых лишь некоторые являются взаимозависимыми.

Рис. 17.8. Слои эпигенетического сайленсинга накапливаются на Xi в ходе дифференцировки

Диаграмма показывает, как пять разных эпигенетических изменений, связанных с транскрипционным сайленсингом. размещаются на неактивной Х-хромосоме на разных стадиях развития и дифференцировки как у развивающегося эмбриона, так и в клетках ES в культуре. В некоторых клеточных типах метилирование H3K27 является временным, преходящим, обнаруживаемым лишь на ранних стадиях дифференцировки, но не у зрелых клеток

Важно подчеркнуть, что конкретные энзиматические комплексы или модификации гистонов могут играть критическую роль на определенных этапах процесса Х-инактивации, но могут становиться менее важными или избыточными позднее, возможно, после того, как более постоянные механизмы сайленсинга, основанные на метилировании ДНК. будут помешены в нужное место. Например, метилирование H3K27, катализируемое PRC2, является существенным для успешной Х-инактивации на ранних этапах онтогенеза, но необязательным в более поздние сроки.

Следует также отметить, что в ходе установления импринтированной Х-инактивации у предимплантационных эмбрионов может иметь место иной порядок событий. В частности, обогащение H3K27me3 не обнаруживается до 16-клеточной стадии, значительно позже начала экспрессии Xist (стадия 24 клеток) (Мак et al., 2004; Okamoto et al., 2004). Это может указывать на потребность в специфических, регулируемых в развитии кофакторов для рекрутирования комплекса PRC2 PcG kXL

4.5. Распространение «молчащего» хроматина

XIC является существенным для Х-инактивации, и было высказано предположение, что сайленсинг распространяется с XIC; при этом проксимальные гены сайленсируются раньше, чем более дистальные. Одним из объяснений этого могло бы быть, что Xist-РНК распространяется прогрессивно по хромосоме, начиная с сайта своего синтеза. Это согласовывалось бы с результатами экспериментов, в которых трансгены Xist вставлялись в аутосомы и где покрытие такой аутосомы Xist-РНК приводило к сайленсингу генов и изменениям хроматина (см. выше).

Распространение неактивного состояния от XIC широко исследовалось в естественно случающихся транслокациях Х;аутосома. Действительно, такие транслокации прекрасно демонстрируют существование XIC (Rastan, 1983). Было показано, что хроматин, несущий характерные маркеры факультативного гетерохроматина (например, утрата ацетилирования гистонов, поздняя репликация и транскрипционный сайленсинг), распространяется от Xi в аутосомную часть гибридной хромосомы (White et al., 1998; Duthie et al., 1999; Sharp et al., 2002). Этим устанавливается важный принцип, согласно которому факультативный гетерохроматин не является исключительным для Х-хромосомы, что согласуется с результатами, полученными с трансгенами Xist, экспрессируемыми на аутосомах. Однако распространение «молчащего» хроматина по аутосомному плечу хромосомы варьирует между транслокациями и ограничено по масштабам.

Существуют две модели, объясняющие ограниченное распространение сайленсинга в cis-сцепленные аутосомы. Во-первых, аутосомы могут сопротивляться начальному распространению Xist-РНК и связанного с этим сайленсинга генов в начале Х-инактивации. В качестве альтернативы можно предположить, что первоначальное распространение на аутосомы могло бы быть эффективным, но сайленсинг может плохо поддерживаться в онтогенезе, что обозначается как «распространение и отступление» [«spread and retreat»]. На сегодняшний день данные говорят в пользу «распространения и отступления», но эти две модели не исключают друг друга, и требуются дальнейшие исследования. Следует заметить, что в раннем развитии против тех клеток, в которых происходит обширный сайленсинг аутосомы, может действовать отбор из-за утраты экспрессии критичных аутосомных генов.

В некоторых транслокациях Х;аутосома распространение является прерывистым, как будто бы перескакивает через определенные районы и оставляет транскрипционно активными эухроматиновые районы, окруженные «молчащими», гетерохроматиновыми районами (Sharp et al., 2002). Распространение конститутивного гетерохроматина в соседние эухроматиновые районы, приводящее к эффекту положения мозаичного типа у Drosophila (глава 5), может обнаруживать сходное поведение. Такие наблюдения легче согласовать с механизмом раннего клеточного отбора, основанным на распространении и отступлении сайленсинга, чем с непрерывным распространением стабильного сайленсинга.

Предположили, что есть элементы, распределенные вдоль Х-хромосомы, называемые «путевыми станциями» [«way stations»], которые служат пунктами сборки гетерохроматина и тем самым усиливают распространение и (или) поддержание Х-инактивации (описано в: Gartler and Riggs, 1983). Эти элементы должны были бы быть менее обычными или, по крайней мере, менее регулярно распределенными на аутосомах. Было высказано предположение, что семейство обычных диспергированных повторов, длинные перемежающиеся повторы (LINES) являются хорошими кандидатами на роль «путевых станций» (Lyon, 1998, 2003). Эти повторяющиеся последовательности обычны в геномах человека и мыши, но особенно часты вдоль Х-хромосомы Более того, элементы LINE наиболее обычны в более конденсированных, бедных генами, G-бэндированных районах геномов человека и мыши, позволяя предположить, что они могут каким-то образом благоприятствовать конформации хроматина, ассоциированной с транскрипционным сайленсингом Недавнее завершение определения нуклеотидной последовательности ДНК Х-хромосомы человека выявило такое распределение элементов LINE, которое в целом согласуется с возможной ролью «путевых станций», но эта идея остается недоказанной.

4.6. Уход от инактивации Х-хромосомы

Как обсуждалось ранее, известно, что ряд генов избегают инактивации. Если использовать механистические термины, уход от Х-инактивации приписали редкости «путевых станций» по соседству с этими генами или присутствию граничных элементов, блокирующих распространение Xist-PHK и (или) других компонентов сайленсинга. Имеются некоторые данные о том, что гены, избегающие инактивации, в раннем развитии являются «молчащими», по крайней мере до некоторой степени. Например, в случае гена Smcx мыши уход от инактивации варьирует в зависимости от стадии развития и от типа ткани (Sheardown et al., 1996). Это, следовательно, в большей мере согласуется с обсужденной выше идеей распространения и отступления в контексте сайленсинга аутосомных генов в транслокациях Х;А.

4.7. Х-инактивация у сумчатых млекопитающих

Эутерии и сумчатые млекопитающие разошлись около 130 миллионов лет тому назад. Сумчатые, как и эутерии, используют систему детерминации пола XY (самец):ХХ (самка) и механизм компенсации дозы, в котором одна из двух женских Х-хромосом инактивирована. Как упоминалось ранее, эта неактивная X у сумчатых всегда представлена гомологом, полученным от отца (Хр). Следующее отличие сумчатых от плацентарных млекопитающих заключается в том, что степень сайленсинга генов в отдельных локусах часто варьирует в разных тканях. Имеются также некоторые данные, что нестабильность сайленсинга возрастает в ходе развития и онтогенеза. Это опять-таки напоминает модель распространения и отступления, предложенную для сайленсинга аутосомных локусов у плацентарных млекопитающих. Интересно, что обогащенность элементами LINE на Х-хромосоме возникла после расхождения эутерий и метатерий, так что возможно, что нестабильность сайленсинга на Х-хромосоме сумчатых также связывается с идеей «путевых станций». Более того, отсутствие у сумчатых метилирования в островках CpG, ассоциированных с генами, сцепленными с X, могло бы вносить дополнительный вклад в нестабильность Xi.

Относительно мало известно о молекулярном механизме Х-инактивации у сумчатых и пока еще не идентифицирован у сумчатых гомолог Xist. Отсутствие гомолога Xist не исключает, конечно, существования негомологичной РНК, выполняющей ту же функцию, что и инициатор Х-инактивации, но пока ничего подобного не было найдено. Единственные два свойства, однозначно общие для неактивной X у эутерий и сумчатых млекопитающих, — поздняя репликация в фазе S и маркировка низкими уровнями ацетилирования гистона Н4 (Wakefield et al., 1997).

Ввиду мужской летальности по мутациям, нарушающим компенсацию дозы у других организмов, в том числе у других млекопитающих, удивительно, что сумчатые толерантны к неполной компенсации дозы. Одно из возможных объяснений вытекает из того факта, что Х-хромосома сумчатых несет меньше генов, чем ее гомолог у плацентарных млекопитающих (Graves, 1996; Marshall Graves and Shetty, 2001). Лишь гены, находящиеся на длинном плече Х-хромосомы эутерий, присутствуют на Х-хромосоме сумчатых. Гены, находящиеся на коротком плече, у сумчатых распределены по аутосомам. Большая часть X сумчатых является, таким образом, обедненной генами и конститутивно гетерохроматиновой. Возможно, эта редукция числа генов сделала возможной толерантность некоторых типов клеток к ослаблению компенсации дозы; в то же время это ослабление недостаточно велико, чтобы организм вообще мог обходиться без компенсации. Кроме того сумчатые могут сайленсировать Xi более эффективно в раннем онтогенезе, когда различия в дозах являются, вероятно, наиболее критичными, аналогично тому, что имеет место для импринтированных локусов. Эти два объяснения могут оба играть свою роль

5.1. Стабильность Х-инактивации в соматических клетках

Множественные слои эпигенетических модификаций вносят свой вклад в сайленсинг неактивной Х-хромосомы, и в результате репрессированное состояние обычно очень стабильно. Иллюстрацию этого мы находим в ранних экспериментах, где прослеживали способность 5-азацитидина (5azaC), ингибитора метилирования ДНК, вызывать реверсию сайленсинга Х-хромосомы в линиях клеток XX (Mohandas et al., 1981). Наблюдали, что с низкой частотой происходит спорадическая реактивация отдельных генов. Однако анализ клеточных линий, в которых данный ген реактивировался, показал, что другие гены обычно оставались неактивными, как и вся хромосома, если судить о ней на цитогенетическом уровне. Аналогичные данные были получены с использованием TSA в качестве ингибитора деацетилаз гистонов I типа (Csankovszki et al., 2001).

Спорадическая реактивация отдельных сцепленных с X генов наблюдалась также при старении у мышей. Еще резче это выражено у сумчатых, где Х-инактивация не столь стабильна и где в ходе онтогенеза происходит прогрессивная реактивация.

Что можно сказать о роли Xist-РНК? Данные, полученные с использованием клеточных линий человека, продемонстрировали, что утрата района Х-хромосомы, включающей Xist, не приводит к сколько-нибудь заметной реактивации X (Brown and Willard, 1994). Эти результаты удалось подтвердить на линиях мышиных фибробластов, используя условно-нокаутную аллель Xist (Csankovszki et al., 1999). Здесь было показано, что утрата Xist приводит к делокализации вариантного гистона macroH2A с Xi. Более недавние исследования показали, что модификации гистонов, катализируемые комплексами PcG, триметилирование H3 лизина 27 и убиквитинирование H2A также утрачиваются в условно-нокаутных по Xist линиях фибробластов (Plath et al., 2004). Была выявлена редкая спорадическая реактивация отдельных генов, которая была усилена воздействием 5azaC или TSA Однако, опять-таки, не наблюдалось никакой явной реактивации всей хромосомы. Таким образом, удаление множественных эпигенетических меток сайленсинга еще не достаточно для реверсии сайленсинга всей хромосомы.

Избыточность механизмов сайленсинга Xi в соматических клетках часто называют системой «сдержек и противовесов» [«belts and braces»]. Предполагается, что индивидуальные уровни эпигенетического сайленсинга являются и самоподдерживаюшимися, и поддерживаемыми с помощью механизмов положительной обратной связи. Аналогичные механизмы положительной обратной связи наблюдали и в других эпигенетических системах; например, связь поддержания метилирования гистонов и метилирования ДНК в перицентрическом гетерохроматине (главы 9 и 18).

5.2. Реактивация Х-хромосомы в нормальном развитии

В то время как Х-инактивация в соматических клетках очень стабильна, существуют обстоятельства в ходе нормального развития, при которых вся Х-хромосома реактивируется. Лучше всего изученный пример — реверсия Х-инактивации в развивающихся примордиальных зародышевых клетках (PGSs, primordial germ cells). У мышей PGCs специфицируются примерно на 7—8-й день развития, вскоре после гаструляции В это время клетки эмбриона уже претерпели случайную Х-инактивацию. Впоследствии развивающиеся PGCs мигрируют вдоль района задней кишки эмбриона и приходят в генитальные гребни, структуры, дающие начало взрослым гонадам. Именно в это время PGCs реактивируют свою Xi (Monk and McLaren, 1981). Это событие совпадает во времени с более общим эпигенетическим репрограммированием, включающим стирание родительских импринтов и деметилирование ДНК по всему геному (дополнительные детали см. главу 20).

Реактивация X в PGCs может указывать на специализированный механизм для ревертирования многослойной структуры гетерохроматина. Наблюдали, что исчезновение экспрессии Xist-PHК коррелирует с реактивацией X, но при условии, что сайленсинг в соматических клетках XX не зависит от Xist, не вполне очевидно, что причина в этом. Возможно, что PGCs не могут установить все метки, ассоциированные с сайленсингом, и поэтому более чувствительны к реактивации. В соответствии с этим находятся данные о том, что в развивающихся PGCs у мышей метилирование островков CpG на Xi не происходит (Grant et al., 1992).

Второй пример реактивации X — это реверсия инактивации импринтированной Хр во время размещения линии ICM эмбрионов на стадии бластоцисты, обсуждавшаяся в разделе 3.5, которая, опять-таки, ассоциирована с более широким кругом явлений репрограммирования генома. Эта реактивация также коррелирует с исчезновением X/S/-PHK и утратой многих эпигенетических меток, связанных с сайленсингом.

5.3. Реактивация Х-хромосомы в ходе экспериментального репрограммирования

Реактивацию X наблюдали также в специальных экспериментальных условиях. Она происходит при пересадке соматических ядер в неоплод отворенные ооциты (Eggan et al., 2000) и после слияния соматических клеток с такими тотипотентными клетками, как ES, эмбриональные зародышевые (EG) клетки или клетки эмбриональной карциномы (ЕС) (см., например, Tada et al., 2001).

Эмбрионы, полученные в результате пересадки ядер, представляют особенно интересный пример. Эксперименты на мышах (Eggan et al., 2000) продемонстрировали быструю реактивацию маркерного гена на Xi у эмбрионов-трансплантатов на стадии дробления. Несмотря на это, ядро сохраняло некоторую память о том, которая X была неактивной, поскольку у клонированных эмбрионов на стадии плода Xi клетки-донора была также Xi в клетках трофэктодермы плаценты. Напротив, клетки собственно эмбриона обнаруживали случайную инактивацию X (рис. 17.9). Предположительно реактивация и репрограммирование X, происходящие в развивающихся ICM, дают эмбриону еще один шанс перенастроить эпигенетическую информацию от донорского ядра.

Реактивация X в продуктах слияния соматических клеток XX и плюрипотентных эмбриональных клеток изучена хуже. Предполагается, что она происходит также в результате воздействия на соматический геном факторов, присутствующих в клетках ЕС, ES или EG Было продемонстрировано, что реактивация происходит относительно быстро, в пределах примерно 5 суток после слияния, и происходящая на высоком уровне экспрессия Xist исчезает в слившихся клетках после длительного культивирования. Причинная связь этих событий не была показана

5.4. Уроки из опытов с индуцибельными трансгенами Xist

Серия экспериментов с использованием индуцибельных трансгенов Xist в клетках ES очень углубила наше понимание стабильности versus реверсибельности Х-инактивации. Во-первых, было показано, что Xist-РНК может установить Х-инактивацию в недиффернцированных клетках ES и на очень ранних стадиях дифференцировки, но не в более позднее время (Wutz and Jaenisch, 2000). Это называется «окном возможности» [«window of opportunity»]. Оказалось, что эта способность клеток реагировать на Xist-РНК в общих чертах коррелирует с обратимостью Х-инактивации. Так, сайленсинг ревертировал, когда трансген выключался в клетках ES или на ранних стадиях дифференцировки, но не на более поздних этапах дифференцировки и не в соматических клетках.

Рис. 17.9. Регуляция Х-инактивации у клонированных эмбрионов мыши

Рисунок иллюстрирует донорскую клетку XX с инактивированной Х-хромосомой (А), покрытой Xist-PHК (зеленая линия) В этой модели транскрипция с донорского ядра, включая Xist-PHK, репрессирована факторами ооцита до 2-клеточной стадии, приводя к реактивации X. Затем, на 2-клеточной стадии экспрессия Xist возобновляется. Затем Xist реэкспрессируется вновь с аллели неактивной X от донорской клетки. Это можно было бы приписать сохранению такой метки, как метилирование ДНК в промоторе Xist Этот паттерн поддерживается в клетках, относящихся к линиям ТЕ и РЕ, но не в плюрипотентном эпибласте, где экспрессия Xist вновь прекращается, приводя ко второму событию реактивации. В ICM стирание эпигенетических меток, управляющих экспрессией донорского Xist, делает возможной последующую случайную Х-инактивацию в собственно эмбрионе

Возвращаясь к реактивации и репрограммированию X, можно сказать, что данные по индуцибельным трансгенам означают, что в определенных клеточных условиях, а именно, в недифференцированных клетках ES. инактивация X произойдет, когда исчезает экспрессия Xist-РНК. Если мы посчитаем, что те клетки, для которых документально доказано, что в них происходит реактивация X (т. е. клетки PGCs, ICM, клетки EG и ЕС), все сходны с клетками ES в отношении плюритпотентности и пластичности, тогда прекращение экспрессии Xist может во всех случаях лежать в основе реактивации X.