2.1. Принципы развития половых клеток в различных группах животных

У животных спецификация половых клеток, сегрегация половых клеток от соматических клеток, является одним из наиболее ранних событий в развитии (Surani et al., 2004). Половые клетки приобретают тотипотентное состояние. Существует два основных способа закладки линии половых клеток, относящихся к преформации (этот термин от старого использования слова преформизм) и эпигенезу (Extravour and Akam, 2003). Первый включает наследование предсуществующих детерминант половых клеток специфическими клетками так, как это происходит у Caenorhabditis elegans и Drosophyla melanogaster (Leatherman and Jongens, 2003; Blackwell, 2004). В противоположность этому эпигенетический способ спецификации половых клеток является процессом, в котором потенциально эквивалентная группа плюрипотентных клеток приобретает способность стать половыми клетками в ответ на индуктивные сигналы, в то время как оставшиеся клетки становятся в будущем соматическими клетками (Lawson and Hage, 1994; Mclaren, 2003). Такой механизм спецификации половых клеток действует у мышей и, возможно, у других млекопитающих, включая человека.

2.2. Раннее развитие линии половых клеток у млекопитающих

Примордиальные половые клетки у мышей впервые обнаруживаются на стадии Е7.5 (на стадии раннего зачатка, ЕВ) как скопление примерно 40 клеток, которые являются основателями популяции линии половых клеток (Lawson and Hage, 1994; Mclaren, 2003). Эти клетки позитивны по щелочной фосфатазе и локализуются в пределах экстраэмбриональной мезодермы у основания аллантоиса (рис. 20.4, правая панель). Клональный анализ показал, что проксимальные клетки эпибласта на стадии Е6.0-Е6.5, стадии преполоски (PS) и первичной полоски (ES) дают начало PGC, а также тканям экстраэмбриональной мезодермы (Lawson and Hage, 1994). PGC формируются под влиянием сигнальных молекул, продуцируемым экстраэмбриональной эктодермой и первичной эндодермой (рис. 20.3). Втр4 и Втр8Ь являются сигнальными молекулами, которые регулируют компетентность и спецификацию половых клеток (Lawson etal., 1999).

Чтобы понять генетическую программу спецификации PGC, из единичных клеток PGC-основателей и окружающих их соматических клеток была получена кДНК (Saitou et al., 2002). Для того чтобы различить PGC и соматические клетки был использован ряд маркеров. При таком скрининге сначала был идентифицирован fragilis, новый белок семейства интерферониндуцируемых трансмембранных белков, и Stella, ядерно-цитоплазматический белок. Дальнейшие исследования показали, что fragilis экспрессируется в проксимальных клетках эпибласта на стадии Е6.25 (рис. 20.3), когда они становятся компетентными для образования как PGC, так и окружающих их клеток экстраэмбриональной мезодермы Fragilis-позитивные клетки во время гаструляции перемещаются в задний проксимальный район. Впоследствии среди этой популяции клеток обнаруживается популяция основателей PGC, экспрессирующих stella. Одновременно в основателях PGC обнаруживается экспрессия плюрипотентных генов, включая Sox2 и Oct4, что дает основание полагать, что PGC проявляют плюрипотентность, которая утрачивается соседними соматическими клетками. Напротив, в основателях PGC ряд генов репрессированы, включая Нахb1 и Haxa1, экспрессия которых в этот период значительно повышается в соседних соматических клетках. Репрессия Нах генов является частью механизма, который лежит в основе репрессии соматической судьбы основателей PGC (Saitou et al., 2002).

Рис. 20.3. Ранняя детерминация половых клеток у мыши

Плюрипотентные проксимальные клетки эпибласта (синий), которые происходят из ICM (см. рис. 20.1 и 20.2) получают экстраклеточный сигнал В MP4 и становятся компетентными к развитию половых клеток (розовый). Активация Blimp1 коммутирует эти клетки к развитию в линию примордиальных половых клеток (красный), в то время как остальные клетки становятся соматическими

Основываясь на анализе выхода основателей ППК, очевидно, что так же как и у других организмов, репрессия соматической программы является основной особенностью специализации PGC у мышей (Seydoux and Strome, 1999; Blackwell, 2004; Surani et al., 2004). Для определения кандидатов генной репрессии были проанализированы гистон лизин метилтрансферазы (НКМТ) с целью выяснить, существуют ли различия в их экспрессии в PGC и соседних соматических клетках. Экспрессия некоторых их этих генов, G9a, Pfm1, Set1 и EZh2 была выявлена как в PGC-основателях, так и в соматических клетках. Однако один ген, Blimp 1(В-lymphocyte maturation-induced protein 1), кодирующий белок, индуцирующий созревание лимфоцитов, экспрессировался только в основателях PGC, но не в соседних соматических клетках на стадии Е7 (Obinata et al., 2005). Blimp1 является репрессором транскрипции, содержит SET/PR домен, пролин-богатый район, который может рекрутировать Groucho и HDAC26, пять С2Н2 цинковых пальца, формирующих комплекс с G9a и кислым концом (Shaffer et al., 2002; Shapiro-Shelef et al., 2003; Gyori et al., 2004; Sciammas and Davis, 2004). Blimp1 впервые был идентифицирован, благодаря его роли при специализации плазматических клеток после репрессии В-клеточной программы в клетках-предшественниках (Turner et al., 1994). Blimp1 активно экспрессируется во время развития мыши (Chang et al., 2002).

Детальный анализ Blimp 1 в ранних эмбрионах мыши привел к неожиданным открытиям. Было установлено, что Blimp 1 начинает экспрессироваться в проксимальных клетках эпибласта на стадии Е6.25 в начале гаструляции, сначала только в 4–6 клетках, которые находятся в непосредственном контакте с клетками экстраэмбриональной эктодермы (рис. 20.3) (Obinata et al., 2005). Экспрессия Blimp 1 обнаруживается на одном конце короткой оси в участке, в котором будет сформирован задний проксимальный район. Число прогрессивно увеличивается, так что на стадии средней полоски их число достигает примерно 20; они формируют плотное скопление в заднем проксимальном районе на стадии Е6.75. На стадии Е7.5, раннего зачатка (ES), число Blimp 1-позитивных клеток увеличивается примерно до 40 (рис. 20.4). Эти клетки являются основателями PGC, экспрессируют классический PGC-маркер, щелочную фосфатазу, и в них начинается синтез stella (рис. 20.3). Эксперименты по генетическому прослеживанию линии подтвердили, что все Blimp 1-позитивные клетки, происходящие из эпибласта на стадии Е6.25 и далее, действительно являются клетками-предшественниками линии PGC. Эти данные находятся в противоречии с ранее существовавшей гипотезой, основанной на клональном анализе, согласно которой проксимальные клетки эпибласта на стадии Е6.0-Е6.5 не являются линиями ограниченными, дающими только PGC, поскольку клональные потомки индивидуальных клеток могут давать начало как соматическим, так и половым клеткам (Lawson and Hage, 1994; McLaren and Lawson, 2005). Это противоречие, вероятно, объясняется тем, что при клональном анализе маркированные клетки исходно могут быть Blimp 1-негативными, но при последующих делениях возникают позитивные клетки, которые дают PGC-клетки, в то время как дочерняя клетка дает соматических потомков. Механизм, который регулирует увеличение Blimp 1-позитивных клеток, пока неизвестен.

Рис. 20.4. Развитие половых клеток у разных видов животных

У С. elegans специализация линии половых клеток (красный) начинается после первого деления зиготы с экспрессией Pie 1 , которая приводит к транскрипционному покою Другая клетка (синий) дает начало соматическим клеткам. У D. melanogaster предшественниками половых клеток являются так называемые полюсные клетки, находящиеся на одной стороне зиготного синцития (многоядерного); транскрипционный покой в этих клетках зависит от локализации РНК гена Pgc У Mus musculus самые ранние предшественники половых клеток видны по экспрессии Blimp1 в основании аллантоиса. Blimp1 инициирует транскрипционный покой в этих клетках

2.3. Роль Blimp 1 в спецификации PGC

Дальнейший анализ роли Blimp 1 в спецификации PGC помог пониманию механизмов, лежащих в основе спецификации половых клеток у мышей. Утрата функции Blimp 1 показала, что она является решающим фактором PGC спецификации у мышей (Ohinata et al., 2005; Vincent et al., 2005). У Blimp 1 мутантов эмбрионы на стадии Е7.5 содержат аберрантный кластер почти PGC-подобных клеток, в то время как в контрольных эмбрионах PGC продолжают пролиферировать и начинают мигрировать из кластера. Более того, число аберрантных PGC-подобных клеток на стадии Е8.5 не увеличивается (Obinata et al., 2005).

Одноклеточный анализ мутантных PGC-клеток показал отсутствие репрессии Нох генов. Следовательно, Blimp 1, вероятно, играет роль в репрессии соматической программы в основателях PGC. У мутантов наблюдалось также нарушение в регуляции активации PGC специфических генов, таких как stella и Nanos3, а также некоторых плюрипотентных генов, таких как Sox2. Эти данные свидетельствуют, что Blimp 1 играет важную роль как транскрипционный регулятор в процессе спецификации PGC и препятствует приобретению соматической программы в этих клетках.

Исследования на В-клетках показали, что Blimp 1 индуцирует их дифференцировку в плазматические клетки, репрессируя основные молекулы, необходимые для их поддержания (Turner et al., 1994; Shaffer et al., 2002; Shapiro-Shelef et al., 2003; Sciammas and davis, 2004; более детально, см. гл. 21). Это происходит через образование Grouch и HDAC2 репрессорного комплекса (Ren et al., 1999). По-видимому, их «цинковые пальцы» также важны для образования комплекса с G9a (Gyory et al., 2004), являющейся НКМТ, которая необходима для H3K9me2. Однако функционирует ли Blimp 1 в процессе спецификации PGC через образование нового комплекса, по-прежнему неясно, поскольку нет данных о НКМТ активности домена Blimp 1SET/PR.

Blimp 1 является эволюционно консервативным геном как у позвоночных, так и у беспозвоночных животных и обладает различными функциями. Например, он играет роль в развитии разных линий у позвоночных, таких как рыба-зебра и шпорцевая лягушка (de Souza et al., 199; Roy and Ng, 2004; Hernandez-Lagunas et al., 2005), хотя и не является высоко специфичным для развития половых клеток. Это означает, что этот ген приобрел новую функцию в спецификации PGC у мышей и, возможно, у всех млекопитающих. Это предполагает. что для этого крайне консервативного гена должны были эволюционировать дополнительные контролирующие элементы, чтобы регулировать его экспрессию в PGC-предшественниках и клетках-основателях.

2.4. Репрессия соматической программы в половых клетках — явление, эволюционно консервативное

Механизм спецификации половых клеток не является эволюционно консервативным, что становится очевидным при сравнении его у мышей и двух других хорошо исследованных видов, D. melanogaster и С. elegans (Seydoux and Strome, 1999). Различия в механизмах спецификации половых клеток сначала объясняли различиями в ранних этапах развития у разных организмов, а также дополнительными сложностями, возникающими в результате феномена геномного импринтинга у млекопитающих. Важно отметить, что репрессия программы экспрессии соматических генов во время спецификации половых клеток является общим феноменом для разных организмов, хотя их молекулярные механизмы могут различаться (Seydoux and Strome, 1999; Leatherman and Jongens, 2003; Saitou et al., 2003; Blackwell, 2004).

У С. elegans первое клеточное деление зиготы является ассиметричным. В результате него появляется соматическая клетка (АВ); вторая клетка (Р1) отделяется и дает начало линии половых клеток (рис. 20.4). Действительно, каждая из этих PI, Р2 и РЗ клеток при делении дает соматические клетки; последние начинают транскрипцию и дифференцировку. Клетки Р1—РЗ, которые дадут линию половых клеток, остаются транскрипционно неактивными. Транскрипционная активность подавляется цинк-пальцевым белком PIE-1, который ингибирует элонгацию транскрипции за счет конкуренции за фосфорилирование Ser-2 карбокситерминального домена (CTD) РНК-полимеразы И (pol II) (Van Doren et al., 1998; Seydoux and Strome, 1999: Zhang et al., 2003; детали см. гл. 10). Однако и соматические, и половые бластомеры имеют транскрипционно пермиссивное состояние хроматина, что было показано высоким уровнем H3K4те в геноме. Позднее, когда бластомер Р4 делится и образует две клетки половой линии, Z2 и Z3, репрессивное состояние хроматина становится выраженным, утрачивается H3K4те и выявляется высокий уровень репрессивного H3K9me (Schaner et al., 2003). Таким образом, в процессе становления линии половых клеток у С. elegans хроматин из транскрипционно пермиссивного состояния меняется в неактивное состояние.

Становление линии половых клеток у D. melanogaster отличается от того, что наблюдается у мышей и червя. Предшественники линии половых клеток, которые называются полюсными клетками, выявляются до начала эмбрионального развития в оплодотворенном многоядерном яйце (рис. 20.4). Они тоже являются транскрипционно неактивными из-за отсутствия фосфорилирования pol II CTD, так же как это наблюдается у С. elegans (Seydoux and Dunn, 1997; Van Doren et al., 1998; Schaner et al., 2003). Хотя транскрипционный сайленсинг связан также и с репрессивной модификацией хроматина с помощью H3K9те, полярные клетки будут формировать только половые клетки. Таким образом, эти клетки подобны Z2 и Z3 клеткам С. elegans, которые предназначены только для образования линии половых клеток. Кроме того, транскрипционный сайленсинг в полярных клетках, по-видимому, регулируется геном полярного гранулярного компонента pgc (polar granule component), поскольку потеря pgc приводит к утрате репрессии, хотя полярные клетки по-прежнему обнаруживаются. В мутантных полярных клетках происходит фосфорилирование pol II CTD по Ser-2 (Deshpande et al., 2004; Martinho et al., 2004). Предполагается, что pgc может блокировать ключевой компонент, необходимый для фосфорилирования pol II CTD, ингибируя таким образом переход от комплекса преинициации к комплексу элонгации.

Анализ cпецификации половых клеток во время развития у мышей, мух и червей четко показывает, что репрессия транскрипции, которая, по-видимому, необходима для подавления программы соматических клеток, выявлена во всех трех организмах, хотя механизмы, с помощью которых это достигается, существенно различаются. Это, очевидно, объясняется различиями в ранних этапах развития разных видов.

2.5. Регуляция эпигенетической программы у мышей после спецификации PGC

Активное эпигенетическое программирование и репрограммирование в линии половых клеток продолжается после спецификации PGC (Seki et al., 2005). Этот период развития отмечен стиранием некоторых репрессивных эпигенетических модификаций, что позволяет клеткам половой линии приобрести плюрипотентные характеристики, которые, возможно, являются предпосылкой последующей тотипотентности.

Основными наблюдаемыми изменениями являются исчезновение H3K9me2 на стадии Е8.0 и уменьшение уровня HP 1а на стадии Е 9.0 в эухроматиновых и перицентрических гетерохроматиновых районах (Seki et al., 2005). Вместе с тем в PGC, начиная со стадии Е8.0 и далее, происходит уменьшение общего уровня метилирования ДНК. В то время как происходит уменьшение H3K9me2 и ДНК метилирования, наблюдается прогрессивное увеличение H3K27me3, репрессивной модификации, опосредованной Ezh-белком группы polycomb в, Ezh (рис. 20.5). Потеря ДНК метилирования сопровождается репрессией de novo ДНК-метилтрансфераз Dnmt За и Dnmt3b, а также временным уменьшением Dnmtl. Следует заметить, что потеря ДНК метилирования H3K9me2 также совпадает с возобновлением экспрессии гена Nanog, который является ключевым геном, связанным с плюрипотентностью (Yamaguchi et al., 2005). Nanog впервые экспрессируется во внутренних клетках на стадии поздней морулы и в клетках внутренней массы бластописты. Однако экспрессия этого гена быстро уменьшается после имплантации и возобновляется только после спецификации PGC. Вместе с экспрессией других плюрипотентных генов, включая Oct4, Sox2 и Esgl, это показывает, что половые клетки приобретают плюрипотентные свойства (рис. 20.5).

Дополнительные события интенсивного эпигенетического программирования происходят после попадания PGC в развивающиеся гонады (Surani et al., 2004). Во-первых, происходит увеличение метилирования H3K4 и ацетилирования H3K9, что является характерным для пермиссивного состояния хроматина, исключающего H3K9те. Кроме того, происходит повсеместное геномное деметилирование ДНК (рис. 20.5), включающее стирание родительских импринтов и метилирования в единичных копиях генов В женских эмбрионах в это время происходит реактивация неактивной Х-хромосомы.

Хотя существует эффективный механизм стирания «приобретенных» эпигенетических модификаций, не все эпигенетические метки полностью удаляются во время развития половых клеток. Например, метилирование ДНК семейства транспозонов IAP репрограммируется только частично (Lane et al., 2003). Неполное удаление эпигенетических меток, очевидно, может привести к эпигенетическому наследованию через линию половых клеток. И этому имеется ряд примеров у млекопитающих (Chong and Whitelaw, 2004) Чтобы понять, насколько широко этот феномен распространен и сколько генов могут быть в него вовлечены, нужны дальнейшие исследования.

Рис. 20.5. Ранние эпигенетические события во время спецификации половых клеток

Экспрессия Blimp1 в потомках эпибластных клеток приводит к подавлению экспрессии соматической генной программы (красный). За этим следует экспрессия Stella, Nanog и Esgl, увеличение H3K27me3, H3K4me3 и H3K9ас, утрата H3K9me2 и 5МеС. Примордиальные половые клетки входят в гонады, после чего происходит дальнейшее эпигенетическое репрограммирование

2.6. Линия половых клеток и стволовые клетки — обратимый фенотип

Половые и ICM-клетки являются теми клетками, из которых происходят плюрипотентные клетки в культуре. При культивировании в присутствии FGF2 PGC подвергаются изменениям и становятся плюрипотентными эмбриональными половыми (EG) клетками (Matsui et al., 1992; Resnick etal., 1992). Они во многих отношениях сходны с плюрипотентными ES-клетками, за исключением того, что в EG-клетках в процессе их получения происходит интенсивное стирание родительских импринтов (Tada et al., 1998).

Поскольку PGC проявляют свойства плюрипотентности, можно предположить, что существуют механизмы, позволяющие PGC сохранять специфические характеристики разных линий Каким образом это достигается, пока неясно. Возможно, что функция Blimp1 сохраняется после PGC спецификации для ее гарантии. Предполагается, что при получении EG-клеток это ограничение ослабляется и PGC приобретают явные плюрипотентные свойства, в том чисде способность дифференцироваться в разные клеточные типы, что редко происходит с половыми клетками in vivo. Следует заметить, что получение EG становится прогрессивно менее эффективным при использовании PGC со стадий Е11.5 и Е12.5, что также свидетельствует о том, что свойства этих клеток изменяются со стадии Е11.5, когда они начинают дифференцироваться в дефинитивные мужские и женские половые клетки.

2.7. Развитие половых клеток из плюрипотентных ES клеток

Плюрипотентные стволовые клетки, полученные из бластоцист, могут дифференцироваться во все типы соматических тканей, включая половые клетки (рис. 20.7). Большие усилия прилагаются для эффективного получения из ES-клеток в культуре разных тканей. Недавно было показано, что из культивируемых ES-клеток можно получить PGC и, возможно, спермий- и ооцит-подобные структуры (Hubner et al., 2003; Toyooka et al., 2003; Geijsen et al., 2004). Следовательно, с углублением знаний о генетической программе спецификации PGC и гамет механизм спецификации половых клеток может быть изучен in vitro. Это, возможно, позволит создать модельную систему для изучения эпигенетического репрограммирования в этой линии клеток. Такой подход, в конечном итоге, поможет пониманию того, что происходит с линией половых клеток у человека Более того, если станет возможной направленная дифференцировка культивируемых ES-клеток человека в ооциты, их можно будет использовать для «терапевтического» клонирования, и, таким образом, отпадет необходимость в донорских ооцитах, которые трудно получать. Эти ооциты могут быть использованы для трансплантации ядер соматических клеток и получения бластоцист, а затем ES-клеток. Ядра соматических клеток, перенесенные в ооциты, подвергаются репрограммированию в тотипотентное состояние (подробно о трансплантации ядер и репрограммировании см. главу 22). Такая процедура, вероятно, окажет огромное влияние на биомедицину, так как позволит создавать «персонифицированные» ES-клетки от больных. Кроме того, она позволит иметь большое разнообразие ES-клеток от больных со специфическими заболеваниями. Такие ES-клетки, в свою очередь, открывают возможность исследовать причины, лежащие в основе заболеваний человека. Они могут быть использованы, например, для тестирования терапевтических препаратов, купирующих болезнь.

Использование человеческих эмбрионов и ES-клеток в исследованиях и терапии поднимает много этических проблем. В различных странах существуют законодательства и руководства для исследований в этой области. Если получение жизнеспособных гамет из ES-клеток человека станет возможным и они будут способны к оплодотворению и дальнейшему развитию, это поднимет новые этические вопросы о том, может ли такой подход быть использован в медицине и каким образом.

2.8. От примордиальных половых клеток к гаметам

Следующим этапом в развитии линии половых клеток является начало гаметогенеза и вступление половых клеток в мейоз. Соматическое окружение в гонадах регулирует время этого события. У самок половые клетки останавливаются в мейотической профазе, в то время как у самцов половые клетки останавливаются в митозе. Многие сигналы окружающей среды диктуют, войдут ли половые клетки в мейоз или нет. Недавно был идентифицирован новый ген Meisetz и было показано, что он играет важную роль в инициации мейоза (Hayasshi et al., 2005). Этот ген также содержит SET/PR и многочисленные «цинковые пальцы», которые, как было установлено, каталитически активны по отношению к H3K4те. Экспрессия Meisetz специфична для половых клеток и обнаруживается во время входа их в мейотическую профазу у самок на стадии Е13.5 и в постнатальных семенниках. Мутация в гене Meisetz приводит к стерильности и самцов, и самок, что свидетельствует о его важной роли в половых клетках. В мутантных половых клетках наблюдается заметное нарушение в репарации двухнитевых разрывов ДНК и спаривании гомологичных хромосом во время мейоза. Эти исследования демонстрируют важную роль эпигенетических механизмов в половых клетках во время мейоза.

Обширные эпигенетические изменения продолжаются во время гаметогенеза и, в конце концов, соматические линкерные гистоны заменяются вариантами, специфичными для семенников (Kimmins and Sassone-Corsi, 2005), а затем происходит замена большинства гистонов на протамины. Исследования показали, что в репрессию генов и хромосомное спаривание вовлечены Suv39 и H3K9 метилтрансфераза. Кроме того, два белка, Suv39hln Suv39h2, имеющие SET-домен, имеют важное значение для мужских половых клеток, причем последний экспрессируется преимущественно в семеннике, накапливаясь в половом тельце. Мутации в Suv39hln Suv39h2 приводят к стерильности, поскольку происходит остановка спемаююниальных клеток (Peters et al., 2001). В мужских половых клетках присутствует также хроматоидное тельце, облакоподобная цитоплазматическая структура. Она является цитоплазматической органеллой, специфичной для половых клеток, которая взаимодействует с ядром, содержит компактную мРНК и является РНК-процессинговым тельцем, содержащим белки Dicer и Argonaute и микроРНК.

В самообновление стволовых клеток половой линии вовлечены некодирующие РНК в сперматогенезе, роль которых, возможно, опосредована механизмом интерференции РНК (и PHК) и гистон метилтрансферазами (НМТазы). Сообщалось, что члены семейства Piwi/Argonaute (у мышей они называются М/м) играют роль в явлении иРНК. Утрата Miwi-подобных белков (Mili) приводит к стерильности у мышей (Kuramochi-Miyagawa et al., 2004), вызывая высокий уровень транскриптов ретротранспозонов IAP и Linel Однако напрямую вовлечение Miwi-подобных белков в их репрессию показано не было.

Недавние исследования продемонстрировали возможность получения плюрипотентных стволовых клеток из спематогониальных стволовых клеток семенников новорожденных и даже взрослых животных (Kanatsu-Shinohara et al, 2004; Guan et al., 2006). Такие клетки можно постоянно поддерживать в культуре, но в отличие от ES-клеток они имеют родительский (андрогенный) импринт. Эти клетки способны дифференцироваться в разные соматические клетки in vitro и in vivo и являются жизнеспособными половыми клетками in vivo. Такие клетки должны стать важным объектом для изучения разных аспектов сперматогенеза и роли эпигенетических механизмов, которые регулируют их свойства как стволовых клеток и дифференцировку в мужские половые гаметы

Стирание импринтов в ранних половых клетках делает родительские хромосомы эпигенетически эквивалентными, что происходит в первый и последний раз в жизни млекопитающих. Трансплантация таких «свободных от импринтов» ядер непосредственно в ооциты приводит в развитию аберрантных эмбрионов, которые погибают на ранних эмбриональных стадиях, вероятно вследствие того, что из-за отсутствия соответствующих эпигенетических модификаций происходит нарушение экспрессии генов, которые в норме подвергаются импринтингу. Этот эксперимент также показывает, что импринты не могут приобретаться ядрами без импринтов при их трансплантации непосредственно в ооцит. ДНК метилирование импринтов начинается после рождения в процессе роста ооцитов из женских половых клеток. В мужских половых клетках это происходит на более поздних стадиях эмбриогенеза. В этом процессе важную роль играют de novo Dnmt3a метилтрансфераза и ее кофактор Dnm3L (детали см. в главе 19). Импринтинг является главным барьером партеногенетического развития у млекопитающих. Попытки манипулировать эпигенотипом женских гамет, возможно, позволят получать у млекопитающих эмбрионы полностью материнского происхождения.

В предыдущих разделах мы рассмотрели, как зрелые спермии и ооциты приобретают различные специфические эпигенетические метки во время гаметогенеза. Некоторые из этих различий, такие как родительские импринты, точно поддерживаются в эмбрионах после оплодотворения. Многие другие репрограммируются, поскольку геном эмбрионов приобретает тотипотентность. Важно знать, какую роль играют эпигенетические метки, унаследованные от родительских гамет, на самых ранних этапах дифференцировки эмбрионов. Если вы начинаете жизнь с одной клетки (оплодотворенная зигота) с полным геномом, которая затем делится, как вы достигаете различий в генной экспрессии и программах развития в дочерних клетках?

3. 1. Материнская наследственность и потенциальное асимметричное распределение?

У организмов (таких как дрозофила, шпорцевая лягушка, цыпленок), у которых яйцеклетка имеет большой размер, некоторые материнские белки и РНК располагаются в яйце ассиметрично Они наследуются только некоторыми клеточными потомками, которые впоследствии имеют особую судьбу, в то время как другие потомки, не унаследовавшие эти детерминанты, развиваются по-другому (Huynh and St Johnston, 2004). Такая стратегия возможна для относительно больших яйцеклеток (таких, как у дрозофилы), но затруднительна для млекопитающих с более мелкими яйцеклетками. Однако программа развития может диктоваться не только размерами яйцеклеток, но, что более важно, необходимостью формировать бластоцисту у млекопитающих, которая должна имплантироваться и образовывать плаценту для поддержания эмбриона. С точки зрения развития, ICM можно считать эквивалентной ооциту дрозофилы, поскольку их онтогенетичекое разнообразие на начальных этапах развития регулируется сигналами из экстраэмбриональной соматической ткани. Хотя недавно появились предположения, которые связывают симметрию оплодотворенной зиготы с симметрией бластоцисты и даже постимплантационных эмбрионов (Gardner et al., 1997; Weber et al., 1999), никаких детерминант дифференцировки, ассиметрично расположенных в яйцеклетке, у млекопитающих пока не найдено. Более того, эмбрионы млекопитающих обладают удивительной способностью «регулировать» развитие, т. е. если удалить или нарушить клетки, компенсаторный рост или клеточные движения позволяют поддерживать нормальное развитие эмбриона (Kelly, 1977). Тем не менее, небольшие различия в предрасположенности индивидуальных клеток (бластомеров) развиваться в ICM и ТЕ линии, вероятно, существуют уже на четырехклеточной стадии (Fujimori et al., 2003; Piotrowska-Nitsche et al., 2005).

3.2. Эпигенетические события при оплодотворении

Во время развития и дифференцировки клетки соматических линий приобретают специфическое и специализированное ДНК метилирование и модифицирование гистонов. Эти модификации, по-видимому, трудно стереть или обратить при пересадке соматических ядер в ооциты (глава 22). Эпигенетические метки в ооцитах и спермиях также специализированы, но они репрограммируются при оплодотворении таким образом, что геном эмбриона приобретает новую функцию, а именно становится тотипотентным (Reik et al., 2001; Surani, 2001). Известен ряд характеристик эпигенетического рисунка гамет и генетического репрограммирования после оплодотворения (рис. 20.2). Геномы и спермиев, и ооцитов имеют высокий уровень метилирования ДНК. Как пример особого класса последовательностей можно привести семейство ретротранспозонов, внутринистерные А частицы (intracistemal A particles, IAP), число копий которых в мышином геноме составляет около 1000 и которые имеют высокий уровень метилирования и в ооцитах, и в спермиях (Lane et al., 2003). Однако имеются определенные последовательности, особенно дифференциально метилированные районы (differentially methylated regions, DMR) в импринтных генах, которые являются метилированными только в ооцитах или спермиях (глава 19).

Геном ооцитов имеет высокий уровень модификаций гистонов, как активных (например, H3K9 ацетилирование, H3K4 метилирование), так и репрессивных (H3K9, H3K27 метилирование) (Morgan et al., 2005). Перед оплодотворением геном ооцита транскрипционно неактивен. Однако в ооците содержатся транскрипты и белки, необходимые для первых нескольких делений дробления, в том числе те, которые имеют важное значение для репрограммирования (рис. 20.1а). Геном спермия высоко специализирован, поскольку большинство гистонов во время сперматогенеза заменилось на протамины, способствующие, по-видимому, упаковке ДНК в компактную головку спермия (McLay and Clarke, 2003). В настоящее время неизвестно, какие модификации есть в оставшемся хроматине и где они раположены, что создает трудности для изучения этих немногочисленных районов хроматина.

Вскоре после оплодотворения в геноме спермия происходит четко отрегулированное репрограммирование. Протамины замещаются гистонами. Вероятно, будучи независимым от репликации (RI, replication independent), это состоит во включении гистонового варианта H3.З гистоновым шапероном HIRA (van der Heijden et al, 2005; см. гл 13). В то время в мужском пронуклеусе происходит обширное ДНК метилирование, затрагивающее как однокопийные последовательности, так и повторы, но не мужские метилированные импринтные гены (Olek and Walter, 1997; Mayer et al., 200; Oswald et al., 2000; Dean et al., 2001; Santos et al., 2002; Lane et al., 2003).

В мужском пронуклеусе перед репликацией ДНК H3 и Н4 гистоны ацетилированы, H3K4 метилирован; быстро появляются H3K9те и H3K27mel (Amey et al, 2002; Santos et al.. 2002; Lepikov and Walter, 2004). Однако H3K9me2/3 и H3K27me2/Зпоявляются только после репликации ДНК, по всей видимости, вместе с включением коровою гистона Н3.1 вместо H3.З (Santos et al., 2005). Во время первого митоза большинство проанализированных к настоящему времени гистоновых меток в женских и мужских хромосомах становятся очень схожими, по крайней мере, на низком уровне разрешения с использованием иммунофлуоресцентного окрашивания (Santos et al., 2005).

Ферментативная активность, ответственная за ранние этапы репрограммирования, вероятно, уже присутствует в ооците в виде белков или молекул РНК, которые могут быстро транслироваться. Мы уже упоминали HIRA, но после репликации ДНК участвует CAF-1, который необходим для включения зависимого от репликации (RD, replication dependent) Н3.1. Su (var) ферменты метилируют H3K9, a Ezh2 вместе с его кофактором Eed метилируют H3K27 (Eehardt et al. 2003; Santos et al, 2005). Вероятно, существенное деметилирование ДНК мужского генома вызывается процессом «активного деметилирования», для которого предложены различные механизмы, однако определенного фермента (ферментов) пока не изолировано (Morgan et al, 2005). Возможным кандидатом для участия в механизме деметилирования является семейство ферментов Aid/ Apobec, способных дезаминировать 5-метилцитозин в ДНК, превратив его в тимидин. Возникающее T: G несоответствие может репарироваться за счет механизма репарации с помощью эксцизии оснований (Morgan et al., 2004). У растений процесс деметилирования также включает зксцизионную репарацию, которая инициируется ДНК гликозилазой Demeter (Gerhing et at, 2006). Подобные деметилазы могут присутствовать и в цитоплазме ооцита при оплодотворении. Отсюда возникает вопрос, почему материнский геном не деметилируется одновременно с отцовским? Материнский хроматин или пронуклеус должны обладать неким механизмом специфической протекции; колокализация метилированной ДНК в материнском пронуклеусе вместе с H3K9me2 дает основание предполагать, что эта модификация гистона и есть кандидат для протекции (Amey et al., 2002; Santos et al., 2002, 2005).

Хотя имеющиеся данные предполагают, главным образом, приобретение гистонами модификаций, а не их утрату на глобальном уровне в этот период, возможно, что метилирование гистонов по аргинину является более динамичным. Действительно, в ооцитах присутствует Padi4, кандидат на вырезание метилированных аргининов в гистонах с помошью «леаминирования» (Sacramento et al., 2004).

Представляется, что основной результат быстрых изменений хроматина при оплодотворении заключается в том, что на двухклеточной стадии отцовский геном становится схожим с материнским. Это исключает метилирование ДНК, которое значительно отличается у двух геномов, в основном вследствие деметилирования генома спермиев. Кроме того, проведенный анализ не исключает, что на этой стадии устанавливается геноспецифические различия в модификации гистонов.

3.3 От зиготы к бластоцисте

Дальнейшее репрограммирование, в частности ДНК метилирование по всему геному, продолжается от двухклеточной стадии через стадию дробления преимплантационного развития до достижения эмбрионом стадии бластоцисты (Monk et al. 1987; Howlett and Reik, 191; Rougier et al., 1998). Точная динамика модификаций гистонов у мышей пока не описана, однако метилирование ДНК постепенно уменьшается с каждым клеточным делением до стадии 16-клеточной морулы. Причина заключатся в том, что Dnmtl, метилтрансфераза, которая полуконсервативно поддерживает метилирование CpG динуклекотидов во время репликации ДНК, исключается из ядра (Carlson et al., 1992). Следовательно, при каждом делении теряется 50 % всей геномной метилированной ДНК. Единственным, хорошо документированным исключением из этого являются DMR в импринтных генах. Не ясно, поддерживается ли их метилирование в этот период неизвестной Dnmt или за счет небольшого количества Dnmtl, способной попадать в ядро и специфически узнавать DMR. Примечательно, что на 8-клеточной стадии Dnmtl белок, по-видимому, появляется в ядре на один клеточный цикл. Если этот Dnmtl белок удалить (с помощью генетического элиминирования в ооците, который обеспечивает большую часть, если не целиком, этого белка, деления дробления), метилирование DMR, действительно, уменьшается на 50 %, что согласуется с представлением о его необходимости для поддержания метилирования в течение только одного цикла репликации (Howell et al., 2001).

На стадии 8—16 клеток наружные клетки морулы уплощаются и становятся эпителиальными. Это явление называют компактизацией и оно является первым внешним признаком дифференцировки эмбрионов млекопитающих. В течение последующих 2–3 делений в моруле происходит кавитация (например, образуется полость) и бластоциста становится различимой по своей внутренней массе (ICM) и наружной трофэктодерме (ТЕ). Клетки ICM формируют все линии эмбриона и плода, в то время как ТЕ клетки дают начало большинству (но не всем) линиям плаценты (экстраэмбриональные линии). Вскоре после этой стадии на поверхности ICM образуется еще один слой эпителиальных клеток, которые являются примитивной энтодермой, клетки которой тоже вносят вклад в развитие плаценты и желточного мешка, но не эмбриона. Известно несколько генетических детерминант распределения этих ранних событий: Oct4, Nanog и Sox2 важны для поддержания клеток ICM, в то время как Cdx2 необходим для детерминации или поддержания ТЕ клеток (Nichols et al.2003; Avilion et al., 2003; Chambers et al., 2003; Mitsui et al., 2003; Niwa et al., 2005). В какой степени материнский белок (присутствующий в ооците) или эпигенетическая регуляция этих генов могут вносить вклад в решение судьбы этих ранних клеток, пока не известно (Ferguson-Smith, 2001).

Однако большинство эпигенетических программных событий происходят как раз на этой стадии развития. Клетки ICM приобретают высокий уровень метилирования ДНК, по крайней мере, на основании данных иммунофлуоресценции (красные клетки внутри бластоцисты на левом рисунке титульной страницы), который возникает de novo с помощью метилтрансферазы Dnmt3b (Santos et. al., 2002). Это сопровождается усилением метилирования H3K9 и H3K27 гистонов с помощью G9a, Eset и Ezh2, соответственно (Erhardt et al., 2003). Хотя метилирование ДНК de novo не является критичным для начального этапа становления ICM клеток, метилирование гистонов с помощьюEzh2 и Eset является необходимым: при нокауте любого из этих генов развитие клеток ICM нарушается (CFCarroll et al., 2001; Dodge et al., 2004).

В противоположность увеличению эпигенетических модификаций в ДНК ICM, в ДНК в ТЕ, так же, как и в большинстве клеточных линий поздней плаценты, в основном остается гипометилированной (Chapman et al., 1984; Santos et al., 2002). Считается, что клетки плацентарного типа меньше нуждаются в эпигенетической стабильности, поскольку время их жизни более ограничено по сравнению с плодом, который развивается во взрослый организм.

Помимо этих крупномасштабных эпигенетических событий по всему геному, на этих стадиях также происходит репрограммирование более локус-специфическое. В женских эмбрионах XX на стадии дробления X хромосома, унаследованная от отца, инактивируется и в этом состоянии остается в экстраэмбриональных тканях, т. е. в ТЕ и плаценте (Huynh and Lee, 2003; Okamoto et al., 2005). Однако в ICM инактивированная X хромосома реактивируется, а затем после дифференцировки ICM в различные линии происходит случайная инактивация одной из X хромосом (Мак et al., 2004; более детально см. рис. 17.4). Механистически, импринтная X инактивация в преимплантационном эмбрионе связана с экспрессией некодирующей Xist РНК родительской хромосомы, чье «покрытие» хромосомы, как предполагают, приводит к сайленсингу генов и установлению репрессивных эпигенетических модификаций (Heard, 2004). Во вновь образующихся клетках ICM Xist транскрипция подавляется, репрессивные гистоновые модификации, в конце концов, утрачиваются, и хромосома реактивируется (Мак et al, 2004; Okato et al., 2004). Вскоре после этого происходит случайная X инактивация в клетках эпибласта. В следующем разделе мы покажем, что ES клетки «заморожены» на стадии реактивации X хромосомы и поэтому женские ES клетки содержат две активные X хромосомы.

4.1. Получение плюрипотентных стволовых клеток

В предыдущей главе мы выяснили, что в зиготе, а затем на стадии дробления и в бластоцисте происходят важные эпигенетические события, в результате чего эпигенетический рисунок в ICM и ТЕ отличается Сейчас мы рассмотрим генетические и эпигенетические свойства культивируемых ранних стволовых клеток, полученных из бластоцисты и более поздних линий, таких как эмбриональные стволовые клетки (Smith, 2001), трофобластные стволовые клетки (TS) (Rossant, 2001), эндодермальные клетки (XEN) (Kunath et al., 2005), эмбриональные половые клетки (EG) (Matsui et al, 1992).

Общим для этих клеточных типов является то, что их можно изолировать из интактных эмбрионов и получить из них культуру при определенных условиях культивирования. Такие культуры можно поддерживать длительное время и в них отсутствуют признаки старения. С ними можно осуществлять генетические манипуляции, затем вводить в живые эмбрионы, где они участвуют в развитии разных линий.

Одним из наиболее важных открытий в эмбриологии млекопитающих в 1980-е годы было развитие методов получения плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток (ES) из ICM. ES-клетки, эксплантированные из мышиных бластоцист в культуры, могут поддерживаться длительное время, а затем снова вводиться с помощью микроинъекпий в бластоиисты. Они колонизируют все эмбриональные линии, формируя таким образом химеры (рис. 20.6; Evans and Kaufman, 1981; Martin, 1981). Наиболее удивительным оказалось то, что потомки ES клеток могут колонизировать линию половых клеток и давать нормальное потомство, которое целиком происходит из генотипа ES-клеток. Это, а также возможность генетической манипуляции с геномом ES клеток с помощью гомологичной рекомбинации (что приводит к генному нокауту) произвело революцию в генетике мыши и сделало мышь генетической моделью организма.

ES-клетки имеют сходные свойства с клетками IСМ/эпибласта, однако имеются и существенные различия, что указывает на то, что они являются «синтетическим» клеточным типом, который, вероятно, не существует в нормальном эмбрионе (по-видимому, это относится и к другим плюрипотентным клеткам) (Smith, 2001).

Рис. 20.6. Получение Es и Ts клеток из бластоцисты

ES-клетки получают из клеток внутренней массы (ICM) и они могут поддерживаться в культуре без дифференцировки. Культивируемые клетки могут подвергаться генетическому манипулированию. ES-клетки могут быть введены в бластоцисты и колонизировать все ткани эмбриона, в том числе линию половых клеток, за исключением трофобластных клеток плаценты. TS-клетки получают из клеток трофэктодермы бластоцисты и при введении их в бластоцисты они вносят вклад в развитие клеток плацентарного типа

Например, для самообновление мышиных ES-клеток требуется Lif/gp130/Stat3 сигналинг, однако эмбрионы с мутацией этого сигнального пути развивают нормальную ICM (Smith, 2001). Вероятно, при получении и поддержании ES из ICM происходят эпигенетические изменения, которые, возможно, являются необходимыми. ICM клетки, растущие в культуре, довольно быстро теряют экспрессию Oct4 и только единственный штамм мышей, 129Sv, из которого относительно легко получить ES-клетки, сохраняет экспрессию Oct4 при культивировании (Buer et al., 2003). Сообщалось также об эпигенетических изменениях в импринтных генах в ES-клетках мыши и макаки; в мышиных клетках это может приводить к нарушению развития клеток в химерах (Dean et al., 1998; Humphreys et al., 2001; Fujimoto et al, 2005).

4.2. Эпигенетические свойства плюрипотентных стволовых клеток

ES-клетки могут дифференцироваться в разные клеточные линии (рис. 20.7). В какой мере эпигенетические механизмы поддерживают клетки в дифференцированном или недифференцированном состоянии? Очевидно, что существуют эпигеномные различия между недифференцированными ES-клетками, дифференцированными ES-клетками и соматическими клетками. Плюрипотентные клетки частично характеризуются гипердинамической пластичностью хроматина (Meshorer et al, 2006). Делеция в ES-клетках Parp (poly-ADP ribosylase, поли-АДФ рибозилаза), которая участвует в контроле изменения гистоновых меток, приводит с низкой частотой ктрансдифференцировке в клетки трофобласта. Это предполагает, что гистоновые маркеры необходимы для поддержания идентичности ES-клеток (Hemberger et al., 2003). Для этого необходимо также ДНК метилирование, поскольку сильная потеря ДНК метилирования приводит к частичному блокированию способности ES-клеток к дифференцировке, а те, которые дифференцируются, экспрессируют маркеры ткани трофэктодермы (Jackson et al., 2004).

Поддержание плюрипотентности ES-клеток зависит от транскрипционных факторов Oct4, Nanog и Sox2 (Boyer et al., 2005; Loh et al., 2006). Дифференцировка ES клеток in vitro характеризуется подавлением транскрипции плюрипотентных генов, которые репрессированы во всех соматических тканях. Для их молчания важное значение имеют эпигенетические механизмы: промотор Oct4, например, накапливает при дифференцировке репрессивные гистоновые модификации и ДНК метилирование (Feldman et al., 2006). Утрата ДНК метилирования, например, в эмбрионах с нокаутом Dnmtl приводит к репрессии Oct4 при дифференцировке (Feldman et al., 2006).

ES-клетки и их дифференцированные производные служат моделью эпигенетической регуляции инактивации X хромосомы. В женских ES-клетках и ICM Xist ген инактивирован и имеются две активные X хромосомы. При дифференцировке in vitro Xist на одной из X хромосом активируется, Xist РНК начинает «покрывать» эту хромосому в положении cis, в результате чего на сопутствующей хромосоме происходит «молчание» генов, аккумуляция репрессивных гистоновых модификаций и метилирование ДНК (Heard, 2004).

Рис. 20.7. Дифференцировка ES-клеток в различные клеточные типы in vitro

ES-клетки при определенных условиях культивирования мо­ гут дифференцироваться в различные типы клеток, такие как нейроны, мышечные клетки и даже половые клетки (ооциты) На вставке показаны нейроглиальные клетки, полученные из ES-клеток в культуре

Другие плюрипотентные клетки тоже могут быть переведены в культуру, но их эпигенетические свойства охарактеризованы меньше, чем у ES-клеток. Однако из исследований эпигенетической инактивации X хромосомы известно, что в женских TS-клетках имеется отцовская инактивированная X хромосома, содержащая репрессивные гистоновые метки (Hyynh and Lee, 2003). Женские XEN-клетки тоже имеют отцовскую X хромосому, которая инактивирована (Kunath et al., 2005).

Плюрипотентные клеточные линии получают также из примордиальных половых клеток (PGG) либо в период их миграции в эмбрионе (Е8-Е10.5), либо после того, как они оказываются в эмбриональных гонадах (Е11.5-Е13.5) (рис. 20.8) (Matsuietal, 1992). PGG на стадии развития Е8.5-12.5 подвергаются обширному эпигенетическому репрограммированию, включая ДНК метилирование импринтных генов и других последовательностей в геноме (Haikova et al., 2002; Lee et al., 2002). Большинство EG линий подвергается стиранию метилирования ДНК в импринтных генах и других последовательностях и это изменяет их потенциал развития, что обнаруживается при образовании химер (Tada et al., 1998). Пока неясно, имеются ли эпигенетические различия между эндогенными PGG и культивируемыми in vitro EG клетками, подобные тем, которые, как предполагается, сушествуют между ICM и ES-клетками.

4.3. Способность стволовых клеток к репрограммированию

Постоянное поддержание плюрипотентности в культуре без признаков старения вполне возможно требует постоянного эпигенетического репрограммирования стволовых клеток. То, что эти клетки имеют репрограммирующую активность, было показано в экспериментах по слиянию EG или ES-клеток с дифференцированными соматическими клетками (Tada et al., 1997, 2001; Cowan et al., 2005). Было установлено, что в тетраплоидных клеточных линиях, получившихся в результате слияния, соматический эпигенотип был репрограммирован (рис. 20.9). При слиянии EG и соматических клеток соматический геном утрачивал ДНК метилирование импринтных генов, а также других последовательностей в геноме (Tada et al., 1997). Напротив, при слиянии ES-клеток с соматическими ДНК метилирование импринтных генов сохранялось, но инактивированная X хромосома (в женских клетках) реактивировалась, промотор гена Oct4 становился ДНК деметилированным, что приводило к реэкспрессии Oct4 (Tada et al., 2001; Cowan et al., 2005; Surani, 2005).

Рис. 20.8. Связь между развитием половых клеток и плюрипотентностью

Ооцит и зигота, а также клетки морулы до определенной стадии являются тотипотентными (ооцит имеет ограничения, налагаемые родительским импринтингом). Плюрипотентные клетки можно получить из клеток внутренней клеточной массы (ICM), примордиальных половых клеток (PGC) и сперматогониальных стволовых клеток (SS) новорожденных и взрослых семенников. Таким образом, существует тесная связь между половыми клетками в процессе развития и плюрипотентностью

Рис. 20.9. Плюрипотентные клетки обладают способностью репрограммировать соматические клетки ES- или EG-клетки могут сливаться с соматическими клетками с образованием тетраплоидных клеток. Это приводит к эпигенетическому репрограммированию соматических ядер, в которых происходят изменения, например, в 5шеС, H3ас, Н4ас и H3K4me. Тетраплоидные ядра в результате слияния и репрограммирования приобретают плюрипотентный фенотип: при инъекции в бластоцисты они вносят вклад в различные клеточные типы эмбриона

Факторы репрограммирования, влияющие на ДНК метилирование и модификацию гистонов в этих гибридах, пока неизвестны. Например, неясно, требует ли деметилирование в EG или ES клетках активности ДНК деметилазы или репликация ДНК происходит в отсутствие Dnmtl, в результате чего происходит пассивное деметилирование. Тем не менее, ES- и EG-клетки должны рассматриваться как важный источник для выделения и характеристики эпигенетических факторов репрограммирования.