2.1. Амфибии

Доступность яиц Xenopus на протяжении всего года и легкость содержания этого водного животного в лаборатории обусловили то обстоятельство, что большая часть работ по пересадкам ядер у амфибий, после первоначального успеха с Rana, была предпринята на Xenopus Следует различать два рода экспериментов в соответствии с тем, инъецируются ядра в денуклеированные яйцеклетки или же в неденуклеированные ооциты (рис. 22.1). Пересадка ядра требует инъекции всей донорской клетки, плазматическую мембрану которой предварительно делают проницаемой либо физическими методами, например всасыванием этой клетки в пипетку, слишком маленькую по сравнению с размерами клетки, либо химическими методами, за счет кратковременной обработки интегрирующим мембрану веществом. Количество цитоплазмы донорской клетки, вводимое с ядром, равно приблизительно 10-5 объема яйцеклетки и никакого влияния не оказывает. Яйцеклетки, получившие пересаженное ядро, культивируются в простом непитательном солевом растворе, эквивалентном прудовой воде, и, следовательно, развиваются независимо от культурального раствора.

Пересадка ядер в ооциты выглядит совершенно иначе. Полностью выросшие ооциты, взятые из яичника самки, находятся в профазе первого мейоза (рис. 22.1). Ядра примерно 50 соматических клеток, инъецированные в ядро (зародышевый пузырек) этих растущих ооцитов, не реплицируют ДНК и не делятся, но на протяжении нескольких дней становятся все более активными в отношении транскрипции. Ооциты, получившие пересаженные ядра, культивируются подобно яйцеклеткам в непитательной солевой среде и не претерпевают никаких морфологических изменений на протяжении всего периода культивирования (две недели и больше).

Рис. 22.1. Схема, изображающая два типа экспериментов по трансплантации ядер у Xenopus

Верхняя часть рисунка иллюстрирует пересадки одиночных ядер в яйцеклетки, денуклеированные ультрафиолетовым облучением (УФ). Спустя три дня после пересадки ядра формируется плавающий головастик Нижняя часть рисунка показывает множественные пересадки ядер в растущие ооциты на стадии первой мейотической профазы (GV) Зародышевый пузырек, или ядро ооцита. Подвергшиеся инъекции ооциты не делятся и могут культивироваться в течение многих дней. Инъецированные ядра соматических клеток претерпевают изменения в экспрессии генов на протяжении первых четырех дней культивирования

2.2. Млекопитающие

Самые ранние попытки клонировать млекопитающих были выполнены с эмбрионами кроликов. В этих экспериментах ооциты сливали с клетками, взятыми от эмбрионов на стадии морулы, и было видно, что получающиеся в результате этого триплоидные клоны проделывали несколько делений дробления (Bromhall, 1975). В 1984 году МакГрат и Солтер применили слияние с помощью вируса Сендай для эффективной пересадки донорских ядер в денуклеированные зиготы. Этот метод был использован для экспериментов двух типов: (1) получают однородительские эмбрионы, замещая мужской пронуклеус женским (что дает начало гиногенетическому зародышу) или замещая женский пронуклеус мужским (что дает начало андрогенетическому эмбриону) (McGrath and Solter, 1984а,b; Suranietal., 1984). Однородительские эмбрионы не развиваются и неизменно погибают, давая первое доказательство того, что нормальное развитие млекопитающих критическим образом зависит от родительски-специфичного геномного импринтинга (2) Клонированные эмбрионы были получены путем пересадки ядер от эмбрионов-доноров, находящихся на стадии дробления, в денуклеированные зиготы. Ни один из таких реконструированных эмбрионов не развивался дальше поздней стадии дробления, из чего следует, что тотипотентность генома в ходе раннего развития быстро утрачивается и что клонирование млекопитающих, в противоположность амфибиям, может быть невозможным (McGrath and Solter, 1984b). Однако результаты, полученные на других видах млекопитающих, вскоре поставили этот вывод под сомнение.

 В 1986 году Вилладсену (Willandsen) удалось клонировать живых ягнят из ядер 4—16-клеточного эмбриона и вскоре после этого последовало создание клонированных телят и свиней (Robi et al., 1987; Prather et al., 1989). Почему клонирование сельскохозяйственных животных оказалось успешным в противоположность хорошо контролируемым экспериментам по клонированию мышей (McGrath and Solter, 1984Ь)? Основное различие в развитии этих видов животных заключается в сроках перехода от материнского контроля развития (на основе запасенной матерью РНК) к зиготическому контролю развития (на основе зиготически продуцируемой РНК). Этот основной переход, по-видимому, происходит на 8—16-клеточной стадии у овец и крупного рогатого скота (Calarco and McLaren, 1976; Camous et al., 1986), но уже на 2-клеточной стадии у эмбрионов мышей (Bolton et al., 1984). Таким образом, у клонируемых эмбрионов овец или коров временные ограничения для активации донорского генома могут быть менее жесткими, чем у клонируемых эмбрионов мышей, где для того, чтобы происходило дробление, донорское ядро должно быть активировано вскоре после пересадки.

Первым успешным получением клонированных животных путем пересадки ядра соматической клетки, а не пересадки ядра из клеток-доноров эмбриона на стадии дробления, было получение овцы из культивируемых фибробластов донора (Campbell et al., 1996b). За этим вскоре последовало создание «Долли» из донорского ядра клетки молочной железы (Wilmut et al., 1997); «Долли» оказалась первым млекопитающим, клонированным из донорской клетки взрослого животного. С тех пор были клонированы всего 15 видов млекопитающих, в том числе мыши, козы, свиньи, коровы, кролики, крысы, кошки и собаки (обзор см. Campbell et al., 2005).

Процедура клонирования млекопитающего, как и клонирование амфибий, включает два этапа. В большинстве, если не во всех успешных экспериментах по пересадке ядра соматической клетки, донорские ядра переносились в денуклеированные ооциты ( в отличие от ранних опытов по клонированию мышей, где донорское ядро от эмбриона на стадии дробления вводилось в денуклеированную зиготу; McGrath and Solter, 1984). На первом этапе пипеткой удаляли метафазное веретено яйцеклетки-реципиента, вслед за чем в денуклеированное яйцо пересаживали донорское ядро. У большинства млекопитающих донорское ядро вводилось в яйцеклетку путем электрослияния с денуклеированным яйцом. У мышей яйцеклетки особенно легко повреждаются, и пересадка ядра у этого вида наиболее эффективна путем физического переноса донорского ядра в яйцо (Wakayama et al., 1998). Как изображено на рис. 22.2, донорское ядро вводится в денуклеированное яйцо с помошью пьезоэлемента, который облегчает проникновение через zona pellucida и цитоплазматическую мембрану (Wakayama et al., 1998). Клонированные бластоцисты либо имплантируются в матку псевдобеременной приемной матери, чтобы получить клонированных мышей, либо эксплантируются в тканевую культуры, чтобы получить эмбриональные стволовые клетки от пересадки ядра (NT-ES, nuclear transfer embryonic stem cells). Клетки NT-ES генетически идентичны донору и могут, следовательно, использоваться для «заказной» («customized») клеточной терапии, называемой также «терапевтическим клонированием» (см. ниже).

Рис. 22.2. Пересадка ядер у мышей с помощью микроинъекций

(а) Схематическое изображение процедуры ядерной пересадки. Когда бластоциста эксплантируется на облученные клетки-фидеры, внутренняя клеточная масса (ICM) дает начало клеткам ES. Будучи перенесенной в синхронизированную псевдобеременную самку, такая бластоциста может развиться в мышь. Наружные клетки бластоцисты — трофэктодерма (ТЕ) — дают начало экстра- эмбриональным тканям (плаценте), а клетки ICM генерируют эмбрион, (б) Те же этапы, что и на а , показаны с помощью световой микроскопии (воспроизведено, с любезного разрешения, из Meissner, 2006)

Получение животных путем пересадки донорских ядер соматических клеток не эффективно, и те редкие животные, которые доживают до взрослого состояния, часто обнаруживают множественные аномалии. В отличие от этого, когда в качестве доноров ядер используются эмбриональные клетки, выживаемость клонов и у амфибий, и у млекопитающих гораздо выше В следующей главе акцент делается на отношении между возрастом донорского ядра и его влиянием на выживаемость клона в сопоставлении с фенотипом клонов амфибий и млекопитающих, полученных из взрослых и эмбриональных донорских клеток.

3.1. Амфибии

Когда ядра бластулы трансплантируются в хорошего качества реципиентныеяйцаЛсяо/ж?, свыше 30 % таких яиц развиваются в нормальных головастиков, и большинство этих последних можно вырастить до стадии фертильных взрослых животных. По мере того как донорские клетки дифференцируются, степень нормальности развития трансплантантных эмбрионов снижается (рис. 22.3), не столь быстро в случае эндодермальных донорских ядер, как при использовании других. У амфибий оказались информативными серийные ядерные пересадки, в которых донорские ядра берутся из бластулы, которая сама была получена в результате пересадки ядра соматической клетки (рис. 22.4). Это делается потому, что клетки эмбриона от первой пересадки часто представляют собой мозаику клеток, нормальных и ненормальных по хромосомам, из-за различий в скорости репликации ДНК между соматической клеткой и активированным яйцом; серийные трансплантации ядер демонстрируют возможности развития у ядер эмбриона от первой пересадки, которые меньше повреждены ядерной пересадкой. Несколько нормальных половозрелых, генетически маркированных лягушек, самцов и самок, были получены даже при использовании кишечного эпителия питающихся личинок (Gurdon and Uehlinger, 1966). Этот результат показывал, что процесс дифференцировки не обязательно связан с утратой способности обеспечивать нормальное развитие, и, следовательно, принцип сохранения генома по мере дифференцировки клеток не нарушается.

Рис. 22.3. Выживаемотъ эмбрионов Xenopus, полученных в ре­ зультате пересадки ядер снижается номере того, как донорские ядра берутся из все более и более специализированных донорских клеток

Сокращения, обозначающие стадию: (В) бластула; (G) гаструла: (N) нейрула; (ТВ) стадия хвостовой почки: (НВ) стадия биения сердца; (ST) стадия плавающего головастика; (FT) стадия питающегося головастика (перепечатано, с любезного разрешения, из Gurdon, 1960)

В опытах по трансплантации ядер у амфибии оказалось невозможным получить нормальное взрослое животное из ядра другой взрослой особи. Однако морфологически нормальные головастики были получены из ядер клеток многих различных тканей взрослых особей (Laskey and Gurdon, 1970), и эти головастики имели нормальный набор функционирующих специализированных типов клеток. Следовательно, клетки, коммитированные в направлении одного пути дифференцировки, содержат, тем не менее, генетический потенциал, обеспечивающий в комбинации с цитоплазмой яйца большинство неродственных типов клеточных дифференцировок.

Способность ядер одного клеточного типа обеспечивать другие типы клеточных дифференцировок можно оценить количественно, проверив, в какой степени функциональная мышечная и нервная дифференцировка, о которой можно судить по эмбрионам, совершающим плавательные движения после стимуляции, может быть достигнута при использовании ядер кишечного эпителия от плавающих головастиков. Такие эмбрионы часто могут быть получены с помощью серийных пересадок ядер от эмбрионов, полученных в результате первой пересадки, которые не совсем нормальны (см. рис. 22.4) (Gurdon, 1962). Кроме того, клетки бластулы от морфологически дефектных эмбрионов от первой пересадки могут формировать мышцы, будучи пересажены нормальным хозяевам, выращенным из оплодотворенных яиц (рис. 22.4) (Byrne et al., 2003). Этот результат показывает, что до 30 % клеток кишечного эпителия могут приводить, после пересадки ядер, к формированию функциональных аксиальных мышечных клеток (табл. 22.1). Спектр аномалий, возникающих в результате пересадки ядер у амфибий, не обнаруживает какого-либо постоянного характера, который на морфологическом уровне можно было бы соотнести с происхождением донорской клетки. Независимо от типа клеток и стадии развития донорских ядер эмбрионы, полученные в результате трансплантации ядер, погибают со сходным набором дефектов, включающим неполное дробление, неспособность к гаструляции, дефектное формирование оси и отсутствие структур головы. Внешне беспорядочная природа этих дефектов не удивительна, поскольку известно, что в клетках эмбрионов от первой пересадки часто наблюдаются крупные хромосомные аномалии (см. раздел 4.1, подраздел «Репрограммирование в клонах»).

Таблица 22.1. Эффективность ядерного репрограммирования: клетки личиночной эндодермы Xenopus

Рис. 22.4. Серийные пересадки ядер и пересадки ткани у Xenopus

Для стандартных первых пересадок единичное ядро соматической клетки трансплантируют в денуклеированное яйцо, которое затем выращивается прямо до стадии личинки Для серийных пересадок ядер эмбрион от первой пересадки на ранней стадии развития используется как донор ядер для дальнейшей серии пересадок ядер в яйцеклетки. Эти эмбрионы, полученные в результате серийных ядерных пересадок, выращиваются до стадии головастика. Наконец, от эмбриона, полученного в результате первой пересадки, который частично дефектен, берут кусочек ткани для пересадки эмбриону-хозяину, выращенному из оплодотворенного яйца. Пересаженная ткань становится частью вырастающего головастика

3.2. Млекопитающие

Обычные аномалии у клонированных животных

Большинство клонированных эмбрионов млекопитающих вскоре после имплантации перестают развиваться. Те же, которые доживают до рождения, часто обнаруживают общие аномалии вне зависимости от типа донорских клеток (табл. 22.2). Например, новорожденные клоны часто оказываются «переростками» и обнаруживают увеличенную плаценту; эти симптомы называют Синдромом Крупного Потомства (Large Offspring Syndrome) (Young et al., 1998; Hill et al., 2000; Tanaka et al., 2001). Более того, новорожденные клоны часто страдают респираторным дистрессом и дефектами почек, печени, сердца и мозга. Даже особи, выживающие длительное время, могут обнаруживать аномалии на последующих стадиях жизни. Например, стареющие клонированные мыши часто становятся ожиревшими, у них развиваются серьезные проблемы с иммунитетом или они преждевременно погибают (Ogonuki et al., 2002; Tamashiro et al., 2002). Как схематически представлено на рис. 22.5, две стадии, когда большинство клонов погибают, — это стадия непосредственно после имплантации и при рождении. Эти две стадии являются критичными для развития и могут быть особо чувствительными к ошибочной экспрессии генов (см. ниже). Однако получение взрослых и внешне здоровых клонированных животных было воспринято как доказательство, что пересадка ядер может давать нормальных клонированных животных, хотя и с низкой эффективностью. Важно отметить, что серьезные аномалии у клонированных животных могут часто проявляться лишь при старении животных (Ogonuki et al., 2002; Tamashiro et al., 2002). Стохастическое возникновение заболеваний и других дефектов в более позднем возрасте у многих или даже у большинства взрослых клонов означает, что компенсаторные механизмы, позволяющие клонированным животным выжить, не гарантируют их «нормальность». Скорее, фенотип выживающих клонированных животных оказывается распределенным по широкому спектру, который включает как аномалии, вызывающие внезапную смерть в раннем постнатальном возрасте, так и более легкие аномалии, позволяющие дожить до более преклонного возраста (рис. 22.5). Эти соображения иллюстрируют сложность определения легких дефектов генной экспрессии и подчеркивают необходимость более сложных тест-критериев, таких как тесты на стресс, вызываемый внешними факторами, или поведенческие тесты.

Таблица 22.2. Обратное отношение между состоянием дифференцировки клетки-донора и эффективностью репрограммирования

Эпигенетические versus генетические причины

Аномалии, характерные для клонированных животных, не наследуются потомством клонов, показывая, что их причиной являются «эпигенетические», а не генетические отклонения. Это потому, что эпигенетические изменения, в противоположность генетическим, являются обратимыми модификациями ДНК или хроматина, которые «стираются» при прохождении генома через зародышевый путь (Ogonuki et al., 2002; Tamashiro et al., 2002). Таким образом, проблемы, связанные с клонированием, обусловлены ошибочным «эпигенетическим/ геномным репрограммированием» трансплантированного донорского ядра, а не соматическими мутациями, приобретаемыми в соматических донорских клетках.

Рис. 22.5. Выживаемость клонов млекопитающих

Фенотипы клонов распределяются в широком диапазоне аномалий. Большинство клонов погибают на двух определенных стадиях развития — при имплантации и при рождении. Более мелкие аномалии генной экспрессии приводят к заболеваниям и смерти в более позднем возрасте

3.3. Получение клонированных млекопитающих из терминально дифференцированных клеток

Состояние дифференцировки донорской клетки и эффективность репрограммирования ядра

Вопрос, уже возникавший в плодотворных экспериментах по клонированию у амфибий, заставлял предполагать наличие обратной зависимости между состоянием клеточной дифференцировки донорского ядра и его способностью направлять развитие после пересадки в яйцеклетку (см. выше и рис. 22.3). Важно было выяснить, влияет ли состояние дифференцировки донорской клетки на эффективность репрограммирования и у млекопитающих. Как показано в табл. 22.2, репрограммирование можно измерить функционально, оценив развитие клонов на нескольких разных уровнях, включая (1) скорость формирования бластоцисты после пересадки ядра в яйцо, (2) долю клонированных эмбрионов, выживающих до рождения или до взрослого состояния после имплантации в матку, и (3) частоту, с которой из клонированных бластоцист, эксплантированных в культуру, можно получить плюрипотентные эмбриональные стволовые (ES) клетки.

Эффективность предимплантационного развития реконструированных ооцитов в бластоцисты особенно

чувствительна к таким экспериментальным параметрам, как стадия клеточного цикла и физическое состояние пересаживаемого ядра. Например, клонирование неделящихся донорских клеток более эффективно, чем клонирование активно пролиферирующих клеток (Campbell et al., 1996а; Cibelli et al., 1998). Так, как и ожидалось из этого отношения, яйцеклетки, реконструированные с использованием донорских ядер из фибробластов, клеток Сертоли, кумулюса или клеток NKT, находящихся в фазе Gj или G0 клеточного цикла, достигают стадии бластулы с относительно высокой эффективностью в противоположность клеткам ES или клеткам эмбриональной карциномы (ЕС), которые активно делятся и большая доля которых находится в фазе S (табл. 22.2). Благодаря экспериментальной вариабельности в ходе дробления измерение доли бластоцист, полученных из реконструированных ооцитов, не является надежным критерием для количественной оценки «способности к репрограммированию». Однако, коль скоро клонированный эмбрион достиг стадии бластоцисты, после имплантации в матку его развитие до рождения зависит от состояния дифференцировки донорского ядра. Клонированные эмбрионы, полученные от таких эмбриональных доноров, как клетки ES или ЕС, развиваются до рождения с эффективностью в 10—20 раз более высокой, чем эмбрионы, полученные от донорских клеток кумулюса или фибробластов (Eggan et al., 2001; Wakayama and Yanagimachi. 2001). предположительно потому, что ядро недеференцированной клетки более склонно к репрограммированию или нуждается в нем в меньшей степени, чем ядро дифференцированной соматической клетки. Это указывает на обратное отношение между стадией дифференцировки донорской клетки и эффективностью репрограммирования. Наконец, коль скоро эмбрион достиг стадии бластоцисты, он с довольно существенной вероятностью может дать начало клеткам ES; это показывает, что получение клеток ES из эксплантированных бластоцист гораздо меньше зависит от состояния дифференцировки донорского ядра (табл. 22.2).

Можно ли ядра терминально дифференцированных клеток репрограммировать до состояния тотипотентности ?

В ранних экспериментах по клонированию амфибий и млекопитающих популяции донорских клеток, используемых для трансплантации ядер, были гетерогенными, и нельзя было исключить, что начало редким выживающим клонам дали редкие взрослые стволовые клетки, присутствующие в донорской популяции, а не ядра дифференцированных клеток. Например, эпигенетическое состояние соматических стволовых клеток может походить на состояние эмбриональных стволовых клеток, легче репрограммируется и, таким образом,может предпочтительно давать выживающие клоны. Чтобы решить вопрос о том, можно ли ядро терминально дифференцированной клетки репрограммировать в достаточной мере для получения взрослого животного, требовались генетические маркеры, по которым можно было бы ретроспективно идентифицировать донорское ядро выжившего клона. Такие маркеры были использованы для однозначной демонстрации того, что ядра из зрелых иммунных клеток, из терминально дифференцированных нейронов и из злокачественных раковых клеток могут быть репрограммированы и могут дать взрослых клонированных мышей.

Моноклональные мыши из зрелых иммунных клеток

Моноклональные мыши были получены с использованием ядер периферических лимфоцитов, где генетические перестройки генов иммуноглобулина (Ig) и рецептора Т-клеток (TCR) можно было использовать в качестве стабильных маркеров, позволяющих выявлять идентичность и состояние дифференцировки донорского ядра данного клона. Поскольку предшествовавшие попытки получить моноклональных мышей были безуспешными, использовали процедуру двухэтапного клонирования, чтобы сначала получить клетки ES из клонированных бластоцист, а затем, на втором этапе, моноклональных мышей из клонированных клеток ES (рис. 22.6). Животные, полученные из донорских ядер В- и Т-клеток, были жизнеспособными и несли полностью перестроенные гены иммуноглобулина или TCR во всех тканях (Hochedlinger and Jaenisch, 2002). Как и ожидалось, иммунные клетки моноклональных мышей экспрессировали только те аллели локуса Ig и TCR, которые были продуктивно перестроены в соответствующих донорских клетках, использованных для пересадки ядер, а перестройка других генов Ig или TCR была подавлена. Эти результаты однозначно показывают, что ядра из терминально дифференцированных донорских клеток могут быть репрограммированы до состояния плюрипотентности с помощь клонирования ядер. Частота непосредственно получаемых клонированных эмбрионов из зрелых В- и Т-клеток (вместо двухэтапной процедуры, использованной в наших экспериментах), хотя ее и трудно оценить, была, вероятно, существенно ниже, чем частота клонов, полученных из фибробластов или клеток кумулюса (возможно, меньше I на 2000 оперированных эмбрионов; табл. 22.2). Недавно были непосредственно клонированы терминально дифференцированные клетки NKT (Inoue et al., 2005). Клетки NKT, подобно В- и Т-клеткам, обладают генетическими перестройками, делающими возможной ретроспективную идентификацию состояния дифференцировки этих клеток. Однако, хотя Т- клетки и клетки NKT и являются частью одной и той же клеточной линии, соответствующая эффективность ядерных пересадок существенно различалась (Hochedlinger and Jaenisch, 2002; Inoue et al., 2005).

Рис. 22.6. Двухэтапная процедура для получения моноклональных мышей из зрелых лимфоидных донорских клеток

(1) Ядра из клеток периферического лимфатического узла пересаживали в денуклеированные яйцеклетки и получали клонированные бластоцисты. Эти бластоцисты эксплантировали in vitro и получали клонированные клетки ES. (2) На втором этапе получали моноклональных мышей путем тетраплоидной комплементации (Eggan et al., 2001; Hochedlinger and Jaenisch, 2002)

Клонированные мыши из зрелых обонятельных нейронов

В противоположность В- и Т-клеткам ядра постмитотических нейронов необратимо выходят из клеточного цикла; в этом заключается часть программы их дифференцировки. Для проверки того, можно ли ядро зрелого нейрона репрограммировать до состояния тотипотентности, были получены фертильные клонированные взрослые мыши из постмитотических обонятельных нейронов с использованием такого же подхода, какой был применен для получения моноклональных мышей (см. рис. 22.6) (Eggan et al., 2004; Li et al., 2004). Как показано в табл. 22.2, эффективность получения клонированных клеток ES из обонятельных нейронов была в том же диапазоне, что и эффективность для ядер иммунных клеток. Эти наблюдения показывают, что постмитотическое нейрональное ядро может вновь вступить в клеточный цикл и его можно репрограммировать к плюрипотентности.

У мыши каждая из двух миллионов клеток в обонятельном эпителии экспрессирует только один из приблизительно 1500 генов рецепторов запаха (OR, odor-ant receptor), так что функциональная идентичность нейрона определяется природой рецептора, который он экспрессирует (это аналогично моноаллельной экспрессии генов иммунного глобулина или TCR в В- или Е-клетках, которая обсуждалась в главе 21). Один из механизмов, который обеспечивал бы стохастический выбор единственного обонятельного рецептора, мог бы быть связан с перестройками ДНК. Получение мышей, клонированных из зрелых обонятельных нейронов, позволило исследовать, связан ли выбор обонятельного рецептора с необратимыми перестройками ДНК. Если выбор обонятельного рецептора связан с необратимыми перестройками ДНК, можно было бы предсказать, по аналогии с описанными выше моноклональными мышами, что мышь, клонированная из нейрона, экспрессирующего Р2, будет экспрессировать этот рецептор во всех обонятельных нейронах и репертуар экспрессии рецепторов будет изменен (это были бы моносомные мыши, которые могли бы чувствовать только один запах) (рис. 22.7). Наоборот, если выбор OR связан с обратимым эпигенетическим механизмом, клонированные животные должны демонстрировать картину экспрессии Р2, идентичную той, которую демонстрирует мышь-донор, и нормальный репертуар экспрессии рецептора. Анализ экспрессии обонятельного рецептора показал, что механизм выбора рецептора полностью обратим и не связан с генетическими изменениями, как это видно при созревании В- и Т-клеток (Eggan et al., 2004).

Рис. 22.7. Клонирование ядер зрелых обонятельных нейронов

Мыши, клонированные из зрелых обонятельных нейронов имели нормальный репертуар экспрессии обонятельных рецепторов (ОЮ, в котором лишь 0,1 % нейронов экспрессируют рецептор Р2. — как и у мышей-доноров Экспрессию рецептора Р2 определяли, используя мышей-доноров, имевших ген маркера GFP, вставленный в ген рецептора Р2. Результаты этого опыта показали, что выбор экспрессии рецептора определяется не генетическими изменениями, а обратимым эпигенетическим механизмом

Рак и реверсия злокачественного состояния с помощью трансплантации ядер

Клонирование мышей из терминально дифференцированных лимфоцитов и постмитотических нейронов продемонстрировало, что пересадка ядер дает нам в руки инструмент для избирательного репрограммирования эпигенетического состояния клеточного генома без изменения его генетического состава. Рак вызывается генетическими, а также эпигенетическими изменениями, но влияние эпигенетики на злокачественный фенотип раковой клетки не было определено. Трансплантацию ядер раковых донорских клеток использовали как прямой подход к оценке обратимости трансформированного состояния. Действительно, предыдущие эксперименты с амфибиями показали, что ядра из клеток карциномы почки можно репрограммировать, и они будут поддерживать раннее развитие до стадии головастика (McKinnell, 1962). Аналогичный результат был получен на мышах, где ядра из линии клеток медуллобластомы смогли обусловить, хотя и с низкой эффективностью, раннее развитие, в результате чего были получены эмбрионы с задержкой дальнейшего развития (Li et al., 2003). Однако эти эксперименты не были однозначной демонстрацией того, что эти клоны были получены из раковых клеток, а не из загрязняющих культуру нетрансформированных клеток. Когда ядра целого ряда опухолевых клеток, в том числе клеток лейкемии, лимфомы, рака груди и меланомы, пересадили в денуклеированные мышиные яйцеклетки, большинство из них оказались способными поддерживать предимплатационное развитие до стадии нормально выглядящих бластоцист (Hochedlinger et al., 2004). Следовательно, внутриклеточная среда ооцита смогла подавить злокачественный фенотип этих опухолевых клеток и сделать возможным внешне нормальное раннее развитие. Однако лишь геном от модельной меланомы, индуцированной RAS, дал начало линии клонированных клеток ES, способных дифференцироваться в большинство, если не во все линии соматических клеток в химерных мышах. Тем не менее, из-за генетических изменений, имевшихся в донорских клетках, у всех этих химер развивался рак. Эти результаты показывали, что раковое ядро после взаимодействия с цитоплазмой яйцеклетки обеспечивало дифференцировку всех линий, показывая тем самым, что злокачественный фенотип этих раковых клеток в основном определялся эпигенетическими изменениями. Другой вывод был сделан из экспериментов по клонированию ядер донорских клеток ЕС. В противоположность ядру соматической раковой клетки злокачественный фенотип эмбриональных опухолей был обусловлен генетическими изменениями, поскольку его не удавалось обратить экспозицией с цитоплазмой яйцеклетки (Blelloch et al., 2004).

Стратегии, используемые в раннем развитии, у амфибий и у млекопитающих очень различаются. Например. дробление эмбриона лягушки проходит быстро, примерно по 30 минут на каждый клеточный цикл, в противоположность эмбриону млекопитающих, который проходит всего лишь одно деление дробления за 24 часа после оплодотворения. Кроме того, зиготический геном лягушки начинает экспрессироваться лишь спустя 12 митотических циклов, на переходе к средней бластуле, в противоположность геному мышиного эмбриона, активирующемуся на 2-клеточной стадии. Таким образом, можно не удивляться тому, что эти различные стратегии развития, используемые у амфибий и млекопитающих, влияют и на репрограммирование соматического донорского ядра. В этой главе эпигенетическое репрограммирование, имеющее место в нормальном развитии, сопоставляется с репрограммированием у клонов лягушек и млекопитающих. Интересный вопрос заключается в том, влияет ли эпигенетическое состояние соматического донорского ядра на картину экспрессии генов у клонированных эмбрионов. Это называется «эпигенетической памятью» и будет обсуждаться далее в этой главе.

4.1. Амфибии

Репрограммирование в нормальном развитии

У амфибий ядра и хромосомы ооцитов и яйцеклеток находятся в состоянии, совершенно ином, чем ядра и хромосомы соматических клеток. Зародышевый пузырек ооцита содержит максимально расправленные [expanded] хромосомы типа ламповых щеток, очень активные в отношении транскрипции (Callan and Lloyd, 1960), что, очевидно, отражает не только высокую долю транскрибируемых генов, но и плотную упаковку РНК-полимераз на ДНК большинства генов. Это исключительное транскрипционное состояние достигается во время раннего оогенеза и вероятно продолжается в яичнике на протяжении всей жизни взрослой самки. Зрелые спермин, напротив, максимально конденсированы и полностью неактивны в отношении транскрипции. Обычные гистоны хромосом в сперме заменены протаминами, которые обмениваются в ядрах спермиев, которые входят в яйцеклетку при оплодотворении, и ядра спермиев претерпевают необычайно быструю деконденсацию приблизительно за 20 минут. У амфибий отсутствуют процессы, эквивалентные инактивации Х-хромосомы и импринтингу, которые имеют место у млекопитающих Снижение уровня метилирования ДНК имеет место в период от оплодотворения до перехода к средней бластуле (5 часов), после чего этот уровень постепенно повышается по мере развития (Meehan, 2003). Резюмируя, можно сказать, что в нормальном развитии во время гаметогенеза и в течение нескольких часов непосредственно после оплодотворения имеют место существенные события репрограммирования ядра.

Наиболее очевидным изменением, которое претерпевают трансплантированные ядра у амфибий, является увеличение объема и дисперсия хроматина. В ядрах эмбриональных клеток это происходит быстрее, чем в ядрах дифференцированных илц взрослых клеток. Во всех отношениях эти трансплантированные ядра в конце концов принимают состояние ядер, присутствующих в яйцеклетках или ооцитах в норме. После трансплантации ядра наступают также изменения в синтезе нуклеиновых кислот. В ядрах неделящихся клеток, таких как клетки мозга взрослых животных, яйцеклетки быстро индуцируют синтез ДНК. Эмбрионы-трансплантаты, полученные в результате пересадок одиночных ядер в яйцеклетки, синтезируют рибосомную РНК и тРНК в такой же степени, что и эндогенные ядра эмбрионов, выращенных из оплодотворенных яиц. Картина транскрипции генов изменяется от характерной для донорских клеток к свойственной ранним эмбрионам; например, вся генная транскрипция выключается во время дробления эмбрионов-трансплантатов и затем реактивируется у выживших трансплантатов в соответствии с клеточным гипом. Мышечные гены экспрессируются в мышцах эмбрионов-трансплантатов даже в том случае, если они получены от ядер кишечника (Gurdon et al., 1984).

В случае пересадок ядер в ооциты в трансплантированных ядрах имеют место обширные изменения в транскрипции без какой-либо репликации ДНК. Например, у Xenopus ядра из клеток почки подавляют гены, специфичные для почки, и активируют гены, специфичные для ооцита. Некоторые из этих заново активированных генов специфичны для эмбриона, как и в случае ядер тимуса мыши, которые экспрессируют маркерный для стволовых клеток ген Oct-4, но подавляют активность специфичного для тимуса гена Thy-1 (Byrne et al., 2003). В заключение можно сказать, что у амфибий при пересадках ядер в яйцеклетки или ооциты наблюдается обширное репрограммирование транскрипции генов, так что ядра соматических клеток (и. в случае яйцеклеток, их митотическое потомство) изменяют свою транскрипцию в соответствии с транскрипцией клетки-реципиента.

Репрограммирование в клонах

С давних пор думали, что наиболее вероятное объяснение возрастающей доли связанных с развитием аномалий, наблюдаемой в экспериментах с пересадкой ядер у амфибий, связано с неполной репликацией ДНК. При нормальном развитии Xenopus пронуклеусы яйцеклетки и спермия начинают удвоение хромосом спустя 20 минут после оплодотворения, и оно завершается 20 минутами позже. В противоположность этому ядрам делящихся клеток в культуре требуется около 6 часов для завершения одного раунда репликации ДНК. Неудивительно поэтому, что часто можно наблюдать продолжение синтеза ДНК пересаженными ядрами соматических клеток гораздо дольше 40 минут после инъекции ядра — вплоть до начала конденсации хромосом для первого митоза. В результате репликция хромосом может быть неполной, и неполностью реплицированные хромосомы разрываются на части, когда трансплантированные ядра вынуждены вступать в свой первый митоз. Фрагменты разорванных хромосом наблюдали в эмбрионах, полученных в результате пересадки ядер (Di Berardino and Hoffner, 1970), и эта несовместимость между скоростью репликации ДНК и клеточного деления в зиготе по сравнению с соматическими ядрами, приводящая к анеуплоидии, по-видимому, скорее всего объясняет многие аномалии развития эмбрионов, полученных путем пересадки ядер, и в особенности высокую долю яйцеклеток, вообще неспособных пройти регулярное дробление; эти последние могут составить до 75 % всех яиц, получивших ядра от неделящихся дифференцированных клеток. Было отмечено, что серийные пересадки ядер из частично дробящихся эмбрионов, полученных в результате первой пересадки, часто дают нормальное развитие головастиков (см. выше). Это хорошо объясняется тем, что инкубация ядер соматических клеток в экстракте из яйцеклеток, находящихся в фазе митоза, значительно увеличивает число сайтов начала репликации ДНК, тем самым давая таким ядрам возможность завершить репликацию хромосом быстрее, чем это могут ядра из таких терминально дифференцированных клеток, как эритроциты (Lemaitre et al., 2005).

Два других предположения могут помочь объяснить аномалии ядерных трансплантатов, которые возникают после начала зиготической транскрипции при переходе к средней бластуле. Первое связано с количественной нерегулярностью активации ранних зиготических генов (Byrne et al., 2003), а второе — с сохранением специфичной для донора экспрессии генов в некорректной зародышевой линии эмбрионов-трансплантатов (см. ниже). Однако не было показано, что эти отличия от нормальной экспрессии генов прямо отвечают за наблюдаемые аномалии развития.

Механизмы репрограммирования

Большие количества и крупные размеры яиц и ооцитов амфибий вдохновили исследователей на попытки понять молекулярные основы репрограммирования. Наиболее предпочтительным путем было получение бесклеточных экстрактов, с помощью которых можно было бы воспроизвести in vitro события, происходящие после пересадки ядер в живые яйцеклетки и ооциты. Последовательное обеднение этих экстрактов могло бы позволить идентифицировать необходимые компоненты. Этот подход оказался особенно успешным при идентификации компонентов яйцеклетки, инициирующих синтез ДНК. В особенности можно отметить идентификацию нуклеоплазмина (Laskey etal., 1978; Philpott et al., 1991), присутствующего в больших количествах компонента яйцеклетки Xenopus, который может деконденсировать спермий и стимулировать обмен гистоновых белков. Такие же процессы имеют место, когда соматические ядра добавляются в экстракты из яйцеклеток (Dimitrov and Wolffe, 1996; Tamada et al., 2006). Другие компоненты экстракта яйцеклеток, возможно вносящие вклад в процесс репрограммирования ядра, включают комплекс ремоделинга ISW1 (Kikyo et al., 2000) и белки зародышевой клетки ERGY2, функция которых — обратимая разборка ядрышек (Gonda et al, 2003). Было высказано предположение, что ремоделирующий комплекс BRG-1 может играть роль в яйцеклетках и у ранних эмбрионов путем пермеабилизации и ресилинга [by permeabilizing and resealing] ядер в экстрактах (Hansis et al., 2004). Эти опыты трудно интерпретировать, потому что пока еще не известно, чтобы бесклеточные экстракты были способны инициировать транскрипцию ядер. Поэтому лучшее, что можно сделать, — это воздействовать на ядра in vitro и затем пересадить их в живой ооцит, чтобы испытать на транскрипцию (Byrne et al., 2003; Tamada et al., 2006).

В настоящее время представляется, что для успешного репрограммирования ядер необходимы три этапа: (1) удаление эпигенетических меток на ДНК или белках, которые характеризуют данное дифференцированное состояние; (2) обеспечение транскрипционными факторами, необходимыми для тех генов, которые должны быть заново экспрессированы; и (3) деконденсация хроматина для того, чтобы транскрипционные факторы получили доступ к генам, на которые они действуют.

4.2. Млекопитающие

Последовательное эпигенетическое репрограммирование является важным аспектом нормального развития (Rideout et al., 2001). В ходе гаметогенеза на два родительских генома последовательно накладываются изменения метилирования ДНК, а также гистонов. После оплодотворения геном эмбриона модифицируется далее в ходе дробления и после имплантации. В табл. 22.3 дается сводка данных о некоторых эпигенетических отличиях клонированных животных от нормальных, которые возникают в результате ошибочного репрограммирования. Для последующего обсуждения мы подчеркиваем эти эпигенетические различия между эмбрионами, полученными в результате нормального оплодотворения и клонирования, на разных стадиях развития. Стадии развития, указанные в табл. 22.3 и обсуждаемые по порядку, — это (1) гаметогенез, (2) дробление, (3) постимплантация и (4) постнатальное развитие.

Гаметогенез

Наиболее важное эпигенетическое репрограммирование в нормальном развитии происходит во время гаметогенеза — процесса, который делает и геном спермия, и геном ооцита «эпигенетически компетентными» для последующего оплодотворения и для надежной активации генов, критичных для раннего развития (Latham et al., 1999). При клонировании этот процесс сокращается, и большинство проблем, затрагивающих «нормальность» клонированных животных, может быть связано с неадекватным репрограммированием соматического ядра после трансплантации в яйцеклетку. Поскольку плацента развивается из трофоэктодермальной линии, составляющей первый дифференцированный тип клеток эмбриона, можно было бы предположить, что у большинства клонированных животных репрограммирование и дифференцировка в эту раннюю клеточную линию нарушены. Действительно. как подытожено ниже, доля аномально экспрессируемых генов у клонированных новорожденных животных существенно выше в плаценте по сравнению с соматическими тканями.

Дробление

В ходе дробления проходящая по всему геному волна деметилирования удаляет эпигенетические модификации, присутствующие в зиготе, так что ДНК бластописты в основном лишена метилирования. Между имплантацией и гаструляцией волна глобального метилирования de novo заново устанавливает общую картину метилирования, которая затем поддерживается на протяжении всей жизни в соматических клетках данного животного. У клонированных эмбрионов метилирование повторяющихся последовательностей является ненормальным (Bourc’his et al., 2001; Dean et al., 2001; Kang et al., 2003; Mann et al., 2003). Чтобы исследовать экспрессию генов, активность таких «генов плюрипотентности», как Oct-4, которые «молчат» в соматических клетках, но активны в эмбриональных клетках, была изучена у клонированных эмбрионов. Удивительно, но реактивация Oct-4 и «Oct-4-подобных» генов оказалась ошибочной и случайной у большой доли соматических клонов (Boiani et al., 2002; Bortvin et al., 2003). Поскольку эмбрионы без Oct-4 рано останавливаются в развитии, неполная реактивация «Oct-4-подобных» генов у клонов могла быть причиной частой неспособности большей части эмбрионов, полученных в результате пересадки ядер, выжить в постимплантационном периоде. Более того, в ряде исследований обнаружено аномальное метилирование ДНК у клонированных эмбрионов. Хотя остается все еще невыясненным, в какой степени эпигенетическая модификация структуры хроматина и метилирование ДНК, происходящие в нормальном развитии, должны имитироваться при ядерном клонировании, для того чтобы оно было успешным, имеющиеся данные полностью согласуются с представлением о том, что причиной аномальной экспрессии генов у клонированных животных является ошибочное эпигенетическое репрограммирование.

Таблица 22.3. Нормальные versus клонированные эмбрионы

Постимплантационное развитие

После имплантации и перед гаструляцией три ключевых события формируют эпигенетическое состояние генома эмбриона: (1) волна глобального метилирования de novo заново устанавливает общую картину метилирования, характерную для взрослого животного и поддерживаемую в дальнейшем в соматических клетках на протяжении всей жизни (Dean et al., 2003); (2) у эмбрионов женского пола выполняется компенсация доз посредством случайной инактивации одной из двух Х-хромосом; (3) теломеры приобретают длину, характерную для соматических клеток. Поскольку все эти события инициируются только у постзиготического эмбриона, у клонированных животных можно ожидать мало нарушений в регуляции этих эпигенетических событий. Тем не менее, у клонированных эмбрионов коровы наблюдали более низкие уровни общего метилирования по сравнению с постнатальными телятами (Cezar et al., 2003). Инактивация Х-хромосомы была случайной и ненарушенной у здоровых, но не у аномальных клонированных эмбрионов мышей (Eggan et al., 2000; Senda et al., 2004: Nolen et al., 2005). Однако неясно, действительно ли эти нарушения являются причиной аномального развития клонов, а не просто следствием аномального репрограммирования в ходе предимплантационного развития. Напротив, коррекция длины теломер у клонированных коров и мышей надежно выполнялась (Lanza et al., 2000; Tian et al., 2000; Wakayama et al., 2000; Betts et al., 2001) и, таким образом, не могла быть причиной нарушенной жизнеспособности клонированных животных.

Постнатальное развитие

Самый масштабный анализ экспрессии генов был выполнен на новорожденных клонированных мышах. Профиль экспрессии показал, что 4—5 % всего генома и 30—50 % импринтированных генов аномально экспрессируются в плацентах новорожденных клонированных мышей (Humpherys et al., 2002; Kohda et al., 2005). Это говорит о том, что развитие млекопитающих удивительно толерантно к широко распространенной дисрегуляции и что компенсаторные механизмы обеспечивают выживание некоторых клонированных особей вплоть до рождения. Однако эти результаты заставляют предполагать, что даже выживающие клоны могут иметь легкие дефекты, которые, хотя и не настолько серьезны, чтобы создавать риск для непосредственного выживания, в более позднем возрасте могут послужить причиной возникновения ненормального фенотипа.

Важно различать «репродуктивное клонирование» и «терапию с помощью трансплантации ядер» (называемую также SCNT, или терапевтическое клонирование). При репродуктивном клонировании путем пересадки соматического ядра в денуклеированную яйцеклетку получают эмбрион с целью создать клонированную особь. Напротив, целью терапии с помощью трансплантации ядер является получение линии эмбриональных стволовых клеток (обозначаемых как клетки ntES), «скроенных» для нужд пациента, послужившего донором ядер (Hochedlinger and Jaenisch, 2003).

Клетки ntES могли бы быть использованы как источник функциональных клеток, пригодных для лечения соответствующего заболевания путем трансплантации. На рис. 22.9 сопоставляются нормальное развитие из оплодотворенного эмбриона, репродуктивное клонирование и терапевтическое клонирование.

6.1. Репродуктивное клонирование

Как представлено выше, все данные, полученные в экспериментах по клонированию восьми разных видов млекопитающих, показывают, что получение нормальных особей с помощью пересадки ядер сталкивается с несколькими важными препятствиями. В общественных дебатах ключевым вопросом является вопрос о том, будет ли когда-нибудь возможно путем ядерного клонирования получить нормальную особь. Имеющиеся данные заставляют предполагать, что получение нормальных клонов может оказаться затруднительным, если не невозможным, по следующим причинам: (1) Как подытожено выше, все проанализированные клоны при рождении обнаруживают дисрегуляцию сотен генов. Тем не менее, развитие клонов до рождения и далее, несмотря на широко распространенные эпигенетические аномалии, позволяет предполагать, что развитие млекопитающих способно выдерживать дисрегуляцию многих генов.

(2) Некоторые клоны выживают до взрослого состояния за счет компенсации дисрегуляции генов. Хотя эта «компенсация» обеспечивает выживание, она не может предотвратить возникновение расстройств, проявляющихся в более позднем возрасте. Следовательно, можно ожидать, что большинство клонов, если не все, будут иметь по крайней мере легкие аномалии, которые могут быть не настолько серьезными, чтобы проявиться в виде очевидного фенотипа при рождении, но вызовут серьезные проблемы в последующем, как это видно у стареющих мышей. Разные клоны могут различаться по степени аномальной экспрессии генов: если ключевые «Oct-4-подобные» гены не активируются, клоны погибают немедленно после имплантации. Если же эти гены активированы, клон может выжить до момента рождения и дольше. Эти соображения показывают, что клонированные животные, даже если при поверхностном обследовании они выглядят «нормальными», могут не быть таковыми, но обладать слабыми аномалиями, которые фенотипически проявятся лишь в более позднем возрасте (Jaenisch, 2004). Эти соображения не позволяют рассматривать этот подход как потенциальную репродуктивную технологию у человека.

Рис. 22.9. Сравнение нормального развития с «репродуктивным клонированием» и «терапевтическим клонированием»

Во время нормального развития (слева) гаплоидная (In) клетка спермия оплодотворяет гаплоидный ооцит, в результате чего формируется диплоидная (2п) зигота, которая подвергается дроблению и становится зародышем-бластопистой. Бластописты, имплантированные в матку, в конечном счете дают начало новорожденным животным. В ходе «репродуктивного клонирования» (в центре) диплоидное ядро донорской клетки взрослого животного вводится в денуклеированный репипиентный ооцит. который, после искусственной активации, делится и превращается в клонированную бластоцисту. После пересадки суррогатным матерям некоторые из этих клонированных бластопист дают начало новорожденному клону. В противоположность этому, получение клеток ntES с помощью пересадки ядер ( справа ) требует эксплантации клонированных бластоцист в культуру для получения линии клеток ES, которая может дифференцироваться in vitro в клетки потенциально любого типа, входящие в состав тела, и использоваться для исследовательских или терапевтических целей (перепечатано, с любезного разрешения, из Hochedlinger and Jaenisch, 2003 [© Massachusetts Medical Society])

6.2. Применение ядерной трансплантации в терапии

Иммунное отторжение — частое осложнение при трансплантациях аллогенных органов, обусловленное иммунологической несовместимостью. Для лечения этой болезни «хозяин против прививки» реципиентам с трансплантатами обычно дают лекарства-иммунодепрессанты, что дает серьезные побочные эффекты. Эмбриональные стволовые клетки, полученные с помощью трансплантации ядер, генетически идентичны клеткам пациента, устраняя, таким образом, риск иммунной реакции и потребность в подавлении иммунитета. Что особенно важно, разрабатываются протоколы, позволяющие получать такие функциональные клетки, как нейроны, мышечные клетки и островковые клетки, которые можно использовать для лечения пациентов, страдающих такими серьезными нарушениями, как болезнь Паркинсона, сердечная недостаточность или диабет. Более того, эмбриональные стволовые клетки обеспечивают возобновляемый источник замещения тканей, позволяя проводить повторное лечение, когда это необходимо.

Действительно, осуществимость терапевтического клонирования была продемонстрирована на животных моделях болезней. Для этого в качестве «пациента» был использован штамм мышей, несущих делецию гена Rag2 (Rideout et al., 2002). Мыши, мутантные по Rag2. страдали серьезной комбинированной иммунной недостаточностью (SCID) из-за мутации в гене, катализирующем перестройки иммунорецептора в лимфоцитах. У этих мышей не было зрелых В- и Т-клеток, и это состояние было похоже на заболевание у человека («bubble babies»). На рис. 22.10 суммированы этапы этого эксперимента. На первом этапе ядра соматических донорских клеток (фибробластов) из хвостов дефектных по Rag2 мышей инъецировали в денуклеированные яйцеклетки Получившиеся в результате эмбрионы культивировали до стадии бластоцисты и изолировали аутологичные клетки ES. Затем одна из мутантных аллелей Rag2 была «сделана мишенью» для восстановления нормальной структуры гена с помощью гомологичной рекомбинации в клетках ES Чтобы получить соматические клетки для лечения, эти клетки ES были дифференцированы в эмбриоидные тела (эмбриоподобные структуры, содержащие различные типы соматических клеток) и далее в предшественники гематопоэза путем экспрессии НохВ4. Получившиеся в результате предшественники гематопоэза трансплантировали облученным животным, дефектным по Rag2, для лечения заболевания. Эти клетки генерировали функциональные В- и Т-клетки, которые проделали соответствующие перестройки своих аллелей иммуноглобулина и Т-клеточного рецептора, как и сывороточных иммуноглобулинов, в трансплантных мышах Rag2. Этот эксперимент продемонстрировал, что пересадку ядер, в сочетании с генной терапией, можно использовать для лечения генетических нарушений. Следовательно, терапевтическое клонирование должно быть применимо и в случае других заболеваний с известным генетическим дефектом, таких как серповидноклеточная анемия или бета-талассемия. Нерешенным остается вопрос, будет ли трансплантация ядер у человека столь же эффективной, как у коров, или такой же неэффективной, как у мышей.

Рис. 22.10. Схема терпевтического клонирования в сочетании с генной и клеточной терапией

Культивировали кусочек хвоста от мыши, гомозиготной по мутации активирующего рекомбинацию гена 2 (Rag2). Когда выросли фибробластоподобные клетки, они были использованы в качестве доноров для пересадки ядер путем прямой инъекции в денуклеированные ооциты MII с помощью микроманипулятора с пьезоэлектрическим управлением. Эмбриональные стволовые (ES) клетки, изолированные из полученных пересадкой ядер бластоцист, были генетически репарированы методом гомологичной рекомбинации. После репарации клетки ntES были дифференцированы in vitro в эмбриоидные тела (EBs), инфецированы ретровирусом HoxB4iGFP. размножены и инъецированы в хвостовую вену облученных, дефектных по Rag2 мышей (перепечатано, с любезного разрешения, из Hochedlinger and Jaenisch, 2003 [© Massachusetts Medical Society])

Использование ящерного клонирования для получения «заказных» [«customized»] клеток ES для восстановления тканей вызывает противоречивые оценки, поскольку, как утверждают его противники, само получение клеток ES с необходимостью было бы связано с разрушением потенциального человеческого существа. В качестве возможного решения этой этической дилеммы была предложена измененная пересадка ядра (ANT, altered nuclear transfer) как модификация обычной процедуры пересадки ядра (Hurlbut, 2005). ANT включает инактивацию гена в соматических донорских клетках, который необходим для развития плаценты, и тем самым предотвращает образование плода, поскольку ANT-бластоциста была бы не способна к имплантации (и, таким образом, не разрушалась бы никакая потенциальная человеческая жизнь), но все еще позволяла бы получать «заказные» ES-клетки. Используя Cdx2 в качестве гена-мишени, провели эксперимент на мышах по принципиальной проверке этого подхода, ANT (Meissner and Jaenisch, 2006). Остается посмотреть, удовлетворит ли эта модификация ANT тех, кто возражает против получения клеток ES из клонированных бластоцист человека.

6.3. Репродуктивное versus терапевтическое клонирование: в чем разница?

Почемы ошибочное репрограммирование порождает столько проблем для репродуктивного клонирования, но не для терапевтических приложений? Наиболее важная причина этого кажущегося парадокса заключается в том, что, в отличие от репродуктивного клонирования, использование ядерных пересадок для целей терапии не требует формирования плода, основываясь вместо этого на прямой дифференцировке функциональных клеток в культуре. Поскольку нет потребности в развитии плода, не следует ожидать, что функциональность дифференцированных клеток, получающихся в результате этого процесса, будет затронута нарушенным импринтингом, который в значительной мере определяет неспособность клонов к развитию (Jaenisch, 2004). Поскольку клетки ES, полученные из оплодотворенных эмбрионов, способны участвовать в формировании всех нормальных эмбриональных тканей, клетки ES, полученные с помощью пересадки ядер, должны обладать такой же способностью генерировать полный спектр нормальных тканей. Действительно, все имеющиеся данные согласуются с выводом о том, что клетки ES, полученные из клонированных эмбрионов, биологически и молекулярно неотличимы от клеток ES, полученных из оплодотворенных эмбрионов (Brambrink et al., 2006). Таким образом, если человеческие клетки ES, полученные из IVF-эмбрионов, пригодны для лечения болезней, то это же относится и к «заказным» клеткам ES, полученным с помощью ядерного клонирования из клеток пациента.