Stephen В. Baylin1 и Peter A. Jones2

1 Cancer Biology Program, The Sidney Kimmel Cancer Center ; Johns Hopkins Medical Institutions, Baltimore, Maryland 21231

2 Department of Urology Biochemistry and Molecular Biology, USC/Norris Comprehensive Cancer Center, Keck School of Medicine, University of Southern California, Los Angeles, California 90089-9181

 

Общее резюме

Рак вызывается наследуемым нарушением регуляции генов, которые определяют, когда клетки делятся, погибают и перемещаются из одной части тела в другую. В процессае канцерогенеза гены могут становиться активированными таким образом, что усиливают пролиферацию клеток или предотвращают клеточную гибель, или, наоборот, гены могут инактивироваться так, что они не могут более сдерживать эти процессы. Первый класс генов называется «онкогены», а второй — гены-суппрессоры опухолей («tumor suppressor genes»). Между этими двумя классами генов существует взаимодействие, которое и приводит к образованию раковой опухоли.

Гены могут инактивироваться как минимум тремя способами, включающими в себя (1) возможную мутацию гена, делающую его неспособным выполнять свою функцию, (2) полную утрату гена, что, таким образом приводит к неспособности его нормально работать и (3) ген. который не мутировал и не был утрачен, может быть наследственно выключен вследствие эпигенетических изменений. Такой эпигенетический сайленсинг может включать в себя модификации гистонов, связывание белков-репрессоров и неправильное метилирование остатков цитозина (С) в СрС-мотивах, которые находятся внутри контрольных участков, управляющих экспрессией генов.

В данной главе делается акцент на на этом третьем пути. Основные молекулярные механизмы, отвечающие за поддержание «молчащего» состояния, довольно хорошо понятны, что и представлено в этой книге. Далее, мы также знаем, что эпигенетический сайленсинг имеет важное значение для профилактики, диагностики и терапии раковых заболеваний. В нашем распоряжении сейчас имеются лекарства, одобренные американской FDA, которые могут ревертировать эпигенетические изменения и восстановить генную активность в раковых клетках. Поскольку изменения в метилировании ДНК можно анализировать с высокой степенью чувствительности, многие стратегии в ранней диагностике раковых заболеваний базируются на выявлении изменений в метилировании ДНК. Поэтому возможности эпигенетики в исследованиях, диагностике, профилактике и лечении рака у человека, являются совершенно исключительными.

 

1. Биологическая основа раковых заболеваний

В конечном счете, рак является заболеванием экспрессии генов, при котором нарушается нормальная работа сложных сетей, управляющих гомеостазом у многоклеточных организмов, что позволяет клеткам расти вне связи с нуждами организма как целого. Большие успехи были достигнуты в описании той подгруппы клеточных контрольных путей, которые нарушаются при раке у человека (табл. 24.1). Тот факт, что почти при всех раковых заболеваниях, наследуемым нарушениям подвержено это ограниченное число клеточных контрольных путей, и является ключевой идеей, которая продвинула данную область исследований (Hanahan and Weinberg, 2000). Основное внимание до последних нескольких лет было сосредоточено на генетических основах раковых заболеваний, в частности, на мутационной активации онкогенов или инактивации генов-супрессоров опухолей. Однако увеличивающийся массив данных, появившихся с середины 1990-х годов, показывает, что наследуемые изменения, регулируемые эпигенетическими модификациями, также могут играть критическую роль в эволюции раковых заболеваний всех типов у человека (рис. 24.1) (Jones and Laird, 1999; Jones and Baylin, 2002; Herman and Baylin, 2003). Эти данные, в частности паттерны метилирования ДНК и хроматина, которые при раке фундаментально изменяются, привели к новым возможностям в понимании, диагностике, лечении и профилактике раковых заболеваний.

Генетические и эпигенетические аномалии могут вызывать наследуемые нарушения путей обеспечения гомеостаза при помощи двух различных механизмов. Может иметь место либо активация онкогенов, в основном, через активацию точечных мутаций, либо могут быть инактивированы гены-супрессоры опухолей (Jones and Laird, 1999; Hanahan and Weinberg, 2000; Jones and Baylin, 2002; Herman and Baylin, 2003). Например, при раковых заболеваниях человека часто обнаруживаются мутации в сигнальном гене (онкогене), таком как RAS, которые усиливают активность генного продукта в стимуляции роста. Эти мутации часто являются доминантными и стимулируют возникновение онкологических заболеваний. С другой стороны, генетические мутации и эпигенетический сайленсинг генов-супрессоров опухолей, часто являются рецессивными, требующими разрушительных событий в обеих аллельных копиях гена для полной экспрессии трансформированного фенотипа. Идея о том, что в малигнизированной клеточной линии должны быть выведены из строя обе копии гена-супрессора опухолей была предложена Кнудсоном (Knudson, 2001) и широко принята. Сейчас понятно, что три класса «ударов» могут действовать в различных комбинациях, вызывая полную потерю активности генов-супрессоров опухолей Прямые мутации в кодирующей последовательности, потеря частей или целых копий генов, или эпигенетический сайленсинг могут взаимодействовать друг с другом, что может приводить ключевые контрольные гены в нерабочее состояние (рис. 24.2).

Табл. 24.1. Ключевые клеточные пути, которые нарушаются генетическими и эпигенетическими механизмами при раковых заболеваниях человека

Рис. 24.1. Эпигенетические изменения, связанные с метилированием ДНК, могут приводить к раковым заболеваниям при помощи различных механизмов

Утрата метилирования по цитозину в ДНК (гипо) приводит к нестабильности генома. Локальное гиперметилирование в промоторе гена (гипер) вызывает наследуемый сайленсинг и, следовательно, инактивацию генов-супрессоров опухоли. Кроме того, метилированные сайты CpG представляют собой горячие точки для мутаций типа транзиций С>Т, вызванных спонтанным гидролитическим дезаминированием. Метилирование сайтов CpG также повышает связывание некоторых химических канцерогенов с ДНК и повышает частоту мутаций, индуцированных УФ-излучением

 

2. Значение хроматина для раковых заболеваний

Несмотря на важнейшие достижения в понимании ключевых молекулярных повреждений путей клеточного контроля, способствующих возникновению раковых заболеваний, остается истиной то, что микроскопическое исследование цитологом-патологом структуры ядра по-прежнему является золотым стандартом в диагностике раковых заболеваний. Человеческий глаз может точно разглядеть изменения в архитектонике ядра, которая, в основном, отражает состояние конфигурации хроматина, и определенно диагносцировать раковый фенотип в одиночной клетке. В качестве признаков патологи в первую очередь используют величину ядра, его очертания, конденсированную ядерную мембрану, отчетливые ядрышки, плотный «гиперхроматиновый» хроматин и высокие значения ядерно-плазменного отношения. Эти структурные характеристики, которые видны под микроскопом (рис. 24.3), по-видимому, коррелируют с глубокими изменениями функций хроматина и получающимися в результате этого изменениями состояний экспрессии генов и (или) стабильности хромосом. Установление связи между изменениями, наблюдаемыми на микроскопическом уровне, с молекулярными метками, обсуждаемыми повсюду в этой книге, остается одной из главных проблем в онкологических исследованиях. В этой главе мы рассматриваем эпигенетические метки, типичным примером которых являются изменения в метилировании цитозина ДНК, метилирование в динуклеотидах CpG и модификации гистонов, которые в раковых клетках распределены аномально. Их все чаще связывают с наследуемыми событиями, которые затрагивают стабильность и функционирование генома, и, таким образом, вносят весьма существенный вклад в злокачественный фенотип.

Известны несколько примеров роли хроматин модифицирующей активности при раковых заболеваниях у человека (Wolffe, 2001). Например, и острая миелоидная лейкемия (AML), и острая промиелоцитная лейкемия (PML) вызываются хромосомными транслокациями. которые изменяют использование диацетилаз гистонов (HDACs). При PML ген PML объединяется с рецептором ретиноидной кислоты (RAR). Этот рецептор рекрутирует активность HDAC и метилирование ДНК и вызывает состояние транскрипционного сайленсинга, что было показано с помощью экспериментальных промоторных конструктов. Эти данные предполагают, что такое «нацеливание» изменения хроматина может потенциально приводить к сайленсингу гена-супрессора опухоли, который участвует в блокировке клеточной дифференциации (Di Croce et al., 2002). При AML, ДНК-связывающий домен транскрипционного фактора AML-1 объединен с белком, который называется ЕТО и который взаимодействует с HDAC. Репрессия клеточной дифференцировки неправильно нацеленной HDAC способствует абберантной репрессии гена и, в конечном счете, лейкемии (Amann et al., 2001). Это всего два примера прямого включения модификаций хроматина в онкогенный фенотип. Однако становится ясно, что модификации хроматина могут прямо и косвенно изменять паттерны метилирования цитозина — эпигенетического изменения ДНК, которое может либо инициировать, либо «запереть» сайленсинг ключевых генов, что ведет к наследуемым нарушениям важнейших клеточных путей.

Рис. 24.2. Как метилирование ДНК может участвовать в инактивации генов-супрессоров опухоли

Две активные аллели гена-супрессора опухоли показаны как два синих прямоугольника в верхней части рисунка Первый шаг инактивации гена показан как локализованная мутация (слева) или генный сайленсинг за счет метилирования ДНК (справа). Следующий «удар» показан или как потеря гетерозиготности (LOH), или как транскрипционный сайленсинг в результате дополнительных эпигенетических событий. В этом случае метилирование ДНК может играть роль одного из путей, что согласуется с гипотезой Кнудсона

 

3. Роль метилирования ДНК при раковых заболеваниях

Первое открытие того, что ДНК кроме четырех оснований, содержит 5-метилцитозин, непосредственно включенный в ДНК, вскоре привело к предположению, что изменения в метилировании ДНК могут играть роль в онкогенезе (табл. 24.2). За последние 40 лет было проведено много исследований, которые показывали различия в паттернах распределения 5-метилцитозина ДНК человека между раковыми и нормальными клетками. Среди них есть как минимум три основных способа, с помощью которых метилирование CpG может участвовать в онкогенном фенотипе. Они включают в себя гипометилирование ракового генома, локальное гиперметилирование промоторов генов-супрессоров опухоли и прямой мутагенез (рис. 24.1) (Jones and Laird, 1999; Jones and Baylin, 2002; Herman and Baylin, 2003). Хотя каждое из этих отклонений само по себе могло бы способствовать возникновению раковых заболеваний у человека, может быть, особенно важно то, что они все имеют место одновременно, показывая, таким образом, что нарушения гомеостаза эпигенетических механизмов — это главные причины, вызывающие рак у людей.

Наиболее известное и раньше других установленное изменение в паттернах метилирования ДНК у раковых клеток — это общее уменьшение данной модификации, приводящее к нестабильности генома (дополнительное обсуждение см. в главе 18). Хорошо известно, что это является ключевым признаком рака у человека (Fein-berg and Vogelstein, 1983; Feinberg et al., 1988; Jones and Laird, 1999; Jones and Baylin, 2002; Herman and Baylin, 2003). В более поздний период времени возрастающий объем данных показал, что аномальное метилирование островков CpG в 5’-районах генов, относящихся к раковым заболеваниям, является составной частью их транскрипционного сайленсинга, обеспечивая альтернативный механизм мутаций для инактивации генов с функциями подавления опухоли (Jones and Laird, 1999; Jones and Baylin, 2002; Herman and Baylin, 2003). Наконец, в дополнении к вышеописанной роли метилирования цитозина в дестабилизации генома и генном сайленсинге, 5-метилцитозин сам по себе является высоко нестабильным и, поэтому, мутабельным основанием. Это напрямую может вносить свой вклад в развитие раковых заболеваний, вызывая мутации типа транзиций, при которых meCpG превращается в TpG (Rideout et al., 1990). Тот факт, что эти модификации столь распространены при раковых заболеваниях, и, как сейчас известно, приводят напрямую к канцерогенезу, также создает новые возможности терапевтической реверсии, направленной на эпигенетические изменения (Egger et al., 2004).

Рис. 24.3. Структурные изменения хроматина в раковых клетках

Эти две микрофотографии сделаны у пациента со сквамозноклеточной карциномой кожи. На левой части показаны нормальные эпидермальные клетки, расположенные в одном миллиметре от прилегающей опухоли и показанные при том же увеличении на правой части рисунка Хроматин, окрашенный пурпурным цветом, благодаря его сродству к гематоксилину, оказывается гораздо более грубым и гранулярным в раковых клетках, чем в нормальном эпидермисе. Такие различия в окраске хроматина используются патологами в качестве диа­ гностических критериев раковых заболеваний

Таким образом, в настоящее время признается, что критическую роль в канцерогенезе человека играет метилирование цитозина в ДНК. Почти все гены человека содержат остатки метилированного цитозина в своих кодирующих областях, для которых в течение некоторого времени известно непропорциональное участие в образовании болезнетворных мутаций. Метилирование 5 углерода в цитозиновом кольце повышает частоту гидролитического дезаминирования этого основания в двунитевой ДНК. Однако продуктом дезаминирования 5-метилцитозина является в тимин, а не урацил (см. рис. 3.12). Механизмы репарации ДНК впоследствии менее эффективны при восстановлении неправильных сочетаний оснований в ДНК, вызванных дезаминированием. Известно, что метилированные сайты CpG производят более 1/3 всех мутаций типа транзиций, возникающих в зародышевой линии человека (Rideout et al., 1990). Это также справедливо для генов, вызывающих рак, таких как р53 (Rideout et al., 1990). Более удивительным является наблюдение, что этот механизм также принимает существенное участие в образовании инактивирующих мутаций в генах-супрессорах опухоли в соматических тканях. Например, более 50% всех мутаций р53, которые приобретаются при спорадических раковых заболеваниях толстой и прямой кишки, имеют место в сайтах метилирования цитозина (Greenblatt et al., 1994). Таким образом, модификация ДНК ДНК-метилтрансферазами (DNMTs) существенно повышает риск получения рака с помощью такого эндогенного механизма.

Было также показано, что метилирование цитозиновых остатков поддерживает образование канцерогенных аддуктов присоединения между ДНК и канцерогенами, такими как бензопирен из сигаретного дыма. В этом случае, метилирование цитозинового остатка повышает образование канцерогенных аддуктов между соседним гуаниновым остатком и бензопирендиолэпоксидом, приводящее к повышению вероятности мутаций в сайтах CpG в легких курильщиков (Greenblatt et al., 1994; Pfeifer et al., 2000). Интересно, что метилирование может также изменять частоту мутаций в гене р53 в коже, экспонированной солнечному свету (Greenblatt et al., 1994; Pfeifer et al., 2000). Это происходит из-за того, что метиловая группа смещает спектр поглощения цитозина в диапазон падающего солнечного света, тем самым повышая образование пиримидиновых димеров в ДНК клеток кожи. Таким образом, эта эпигенетическая модификация ДНК не только повышает спонтанный мутагенез, но также может влиять на то, как ДНК взаимодействует с канцерогенами и ультрафиолетом (Pfeifer et al., 2000).

Гипометилирование ДНК, которое было давно отмечено в опухолях животных и человека (табл. 24.2), влияет на стабильность хромосом и повышает шанс анеуплоидии. Геномная нестабильность — это признак ракового заболевания, и повышенная ломкость хромосом, вызываемая гипометилированием саттелитных и других последовательностей, может, по-видимому, приводить к образованию раковых заболеваний путем уменьшения стабильности генома (Narayan et al., 1998; Gaudet et al., 2003). Конкретные механизмы, с помощью которых достигается эта нестабильность, все еще не полностью поняты, но они легко могут быть результатом измененных взаимодействий ДНК и белков, вызванных гипометилированием.

Таблица 24.2. Временная шкала , проясняющая роль метилирования ДНК при раковых заболеваниях

 

4. Гиперметилированные промоторы генов при раковых заболеваниях

 

4.1. Гены, участвующие в процессе

Наиболее понятный механизм, при помощи которого метилирование ДНК приводит к раковым заболеваниям, это локальное гиперметилирование промоторов генов-супрессоров опухоли. Конкретные механизмы, при помощи которых осуществляется это гиперметилирование, детально обсуждаются ниже. Однако ясно, что это важнейший путь, приводящий к наследуемому сайленсингу генов, которые подавляют развитие рака (Jones and Laird, 1999; Jones and Baylin, 2002; Herman and Baylin, 2003). Обычно, гиперметилирование ДНК осуществляется в участках, обогащенных CpG, или в или CpG-островках, которые локализованы внутри и вокруг транскрипционного стартового сайта аномально «молчащих» генов при раковых заболеваниях. Важно знать, что метилирование цитозина в CpG-островках поблизости от местоположения стартового сайта гена особенно критично, так как эта же самая модификация ДНК, имеющая место внутри генов, обычно не коррелирует с транскрипционным статусом (Jones, 1999).

Перечень связанных с раком генов, на которые влияет упомянутое выше нарушение транскрипции, неуклонно растет. Как было описано ранее, сюда включаются гены в любых положениях на хромосомах (Jones and Baylin, 2002). Действительно, данное эпигенетическое изменение может сейчас численно превосходить те гены, которые часто мутируют в опухолях человека. Как было упомянуто ранее (табл. 24.1), потеря функции гена-супрессора опухоли как результат вызывающего сайленсинг данного гена метилирования CpG, по существу, затрагивает все известные пути. Чтобы понять значение генов для процесса канцерогенеза и сформулировать проблему в этой области на будущее, гены, по-видимому, могут быть разделены на три группы.

Первая группа содержит те гены, которые участвуют в определении гиперметилирования промотора и сайленсинга генов, как одного из важных механизмов потери функции гена-супрессора опухоли при раковых заболеваниях (табл. 24.3). Эти гены уже были распознаны как классические гены-супрессоры опухоли, которые при мутации в зародышевой линии семьи вызывают наследуемые формы рака (Jones and Laird, 1999; Jones and Baylin, 2002; Herman and Baylin, 2003). Они также часто мутируют при спорадических формах рака, но в таких опухолях они нередко могут быть гиперметилированы по одной или обеим аллелям (Jones and Laird, 1999; Jones and Baylin, 2002; Herman and Baylin, 2003). Кроме того, для этих генов гиперметилирование промотора может иногда составлять «второй удар» (по гипотезе Кнудсона) в связи с тем, что они ассоциированы с потерей функции второй копии этого гена при семейных опухолях, где «первым ударом» является мутация в зародышевой линии (Grady et al., 2000; Esteller et al., 2001b). В некоторых случаях было показано, что индуцированная 5-азацитидином реактивация этих генов в культуре опухолевых клеток восстанавливает ключевую функцию гена-супрессора опухоли, утраченную в процессе роста опухоли. Таким примером является функция коррекции неправильного спаривания оснований ДНК в клетках рака толстой кишки, где имеет место сайленсинг гена MLH1 (Herman et al., 1998).

Вторая группа эпигенетически сайленсированных генов — это те гены, которые, благодаря их функции, ранее были идентифицированы как кандидатуры на роль генов-супрессоров опухоли, но для них не было показана сколько-нибудь существенная частота инактивации за счет мутаций. Эти гены могут рассматриваться как потенциальные супресоры, потому что они находятся в таких позициях на хромосомах, которые при раковых заболеваниях часто подвергаются делениям (табл. 24.3). Примерами являются RASFF1A и FHIT на хромосоме Зр при раке легких и опухолях других типов (Dammann et al., 2000; Burbee et al., 2001). Остальные гены — это те, про которые известно, что они кодируют белки, содействующие функциям, существенным для предотвращения роста опухоли, такие как ген проапоптоза, DAP-киназы (Katzenellenbogen et al., 1999).

Эти гены бросают вызов всей области эпигенетики рака, поскольку, несмотря на то, что при опухолях в них обнаружено частое гиперметилирование промотора должно быть специально доказано (поскольку многие из этих генов часто, если не всегда, мутируют) каким именно образом эти гены участвуют в генезе опухоли. Мы вернемся к этому вопросу в дальнейшем.

Таблица 24.3. Классы гиперметилированных генов

Третья группа генов идентифицируется по стратегиям, применяемым для случайной идентификации аберрантно сайленсированных генов, ассоциированных с гиперметилированием промотора (Suzuki et al., 2002; Yamashita et al., 2002; Ushijima, 2005). По сравнению с генами из второй группы, трудно поместить их в функциональный контекст развития рака, поскольку их функции могут быть совершенно неизвестны.

 

4.2. Поиск новых генов, эпигенетически сайленсированных при раке

Чаще всего используемый подход при идентификации новых генов, эпигенетически сайленсированных при раке, заключается в том, чтобы рассматривать в качестве кандидата любой потенциальный ген-супрессор опухоли, если мутации не обнаружены, или если экспрессия гена в изучаемых опухолях низкая, или вообще отсутствует. Другой используемый подход — это применить технику случайного скриннинга раковых геномов на гиперметилированные гены (Toyota et al., 1999; Suzuki et al., 2002; Yamashita et al., 2002; Ushijima, 2005). Этот путь предоставляет огромные возможности для обогащения наших знаний в области биологии рака, но также вызывает много проблем. Как недавно было сказано в обзоре (Ushijima, 2005), каждый подход имеет свои сильные и слабые стороны.

Несколько подходов зависят от первого этапа, когда ДНК переваривается одним или несколькими рестрикционными ферментами, которые дифференциально расщепляют сайты CpG, в зависимости от того, метилированы ли они. Затем, чтобы определить потенциально гиперметилированные гены, продукты анализируют при помощи двухмерного электрофореза (Restriction Landmark Genomic Sequencing, RLGS), случайно амплифицируют, применяя случайные праймеры, или технику вычитания, чтобы дифференцировать метилированные последовательности нуклеотидов нормальной ДНК и ДНК из опухоли. Эти методы способны идентифицировать большое количество гиперметилированных генов, и каждый из них добавляет новые сведения относительно важных потенциальных кандидатов на роль генов-супрессоров опухоли. Однако идентифицированные последовательности нуклеотидов могут быть либо связаны, либо на связаны с островками CpG, которые стратегически расположены так, чтобы участвовать в сайленсинге генов. Повторяющиеся последовательности, которые часто бывают высокометилированными, иногда включены в конечные продукты. В результате, эффективность идентификации гиперметилированных генов-супрессоров опухоли часто бывает не очень высока и затруднительна в масштабах целого генома.

Другие подходы связаны с опознаванием на микрочипах нуклеотидных последовательностей содержащихся в геноме островков CpG (С.М. Chen et al., 2003), поскольку они часто связаны со стартовыми сайтами гена, и с зондированием чипов с помощью геномной ДНК, которая была переварена чувствительными к метилированию ферментами, либо с помощью кДНК, с учетом статуса экспресии генов. Этот подход обладает мощным потенциалом для идентификации гиперметилированных супрессоров опухоли, но он ограничен числом возможных островков CpG, которые могут быть чипированы.

Еще один подход состоит в том, чтобы обрабатывать культуры опухолевых клеток агентами, которые вызывают деметилирование ДНК, такими как 5-азацитидин или 5-аза-2’-деоксицитидин, и проводить гибридизацию РНК до и после обработки препаратами на генных микрочипах для выявления ап-регурированных генов (Suzuki et al., 2002; Yamashita et al., 2002). Этот подход потенциально может идентифицировать все гиперметилированные гены в культурах клеток всех типов человеческого рака. Однако изменения в генах, вызванные другими причинами, нежели деметилируюшая активность используемых препаратов, может понизить эффективность идентификации гиперметилированных генов. Меньше всего осознается тот факт, что самый низкий уровень экспрессии разыскиваемых генов, как до, так и после обработки препаратами резко ставит под вопрос чувствительность большинства генов микрочипов, заметно снижая эффективность данного подхода (Suzuki et al., 2002). Применение метода вычитания после обработки препаратами для обогащения генными транскриптами, содержание которых повышено, может повысить чувствительность подхода, основанного на генных микрочипах (Suzuki et al., 2002), но он должен быть адаптирован таким образом, чтобы удовлетворять требованиям флуоресцентного мечения зондов для микрочипов, что легко позволит покрыть весь геном Одновременное применение препаратов, модифицирующих изменения хроматина, которые действуют совместно с метилированием промотора ДНК, например, такими как ингибиторы HDAC, может помочь в подходах, основанных на генных микрочипах. Данный маневр помогает более специфично идентифицировать разыскиваемые гены, принимая во внимание ту роль, которую изменения хроматина играют в сайленсировании гиперметилированных генов, что детально обсуждается в последующем разделе. Этот последний подход позволил недавно идентифицировать важные гены, сайленсированнные при раке толстой кишки (Suzuki et al., 2002).

 

4.3. Определение функциональной важности генов, гиперметилированных при раковых заболеваниях

Стремительность, с которой стали обнаруживаться гиперметилированные гены при раке, представляет собой исследовательскую проблему, вызывающую опасения. Частое гиперметилирование промотора данного гена не гарантирует само по себе функционального значения для сайленсинга сопутствующего гена, что обычно бывает при потере функции, обусловленной генетической мутацией. Это имеет место особенно в том случае, когда гиперметилированный ген не является известным классическим супрессором опухоли и когда нет свидетельста тому, что этот ген также может часто мутировать при различных видах рака. Итак, обязательно, чтобы рассматриваемый ген изучался таким образом, чтобы важность потери функции определялась и с точки зрения процессов, контролируемых кодируемым белком, и с точки зрения последствий этого для развития опухоли. Есть несколько возрастающих по значению стадий таких исследований, очерченных в табл. 24.4; целью этих исследований является строгое документирование роли в образовании раковых заболеваний.

Первая, это, конечно, документирование гиперметилирования и его последствий для состояния экспрессии гена, включая способность гена подвергаться реэкспрессии при деметилировании промотора. Вторая — наличие гиперметилирования и сайленсинга данного гена должны быть хорошо установлены как в первичных пробах из опухолей, так и в культуре опухолевых клеток. Третья, как объясняется ниже, часто необходимо знать, в какой точке развития опухоли осуществляется сайленсинг гена (рис. 24.4). Четвертая — следует напрямую оценить, насколько канцерогенной является потеря функции гена. Можно начать с рутинного изучения культур клеток через оценку влияния восстановления гена на свойства клеток, такие как индукция апоптоза, эффект клонирования на мягком агаре, и влияние на канцерогенность клеток, растущих как ксенотрансплантат (гетеротрансплантат) в безтимусовых мышах. Пятая должна быть определена функция кодируемого белка либо через предварительные сведения относительно типа белка — через распознование его предполагаемых функций исходя из природы его структуры, или через изучение биологических свойств белка на моделях культур клеток. В конечном счете, однако, должен быть сделан шестой шаг, который может часто включать в себя трангенные нокаутные подходы, чтобы установить роль гена как гена-супрессора опухоли и чтобы понять, каковы функции кодируемых белков в развитии, обновлении клеток у взрослого организма и т.д. Изучение нокаутных мышей оказались чрезвычайно полезными для подтверждения функции HIC-1 как гена-супрессора опухоли, после того как он был идентифицирован посредством отбора тех участков генома раковых клеток, которые утратили гетерозиготность (W.Y. Chen et al., 2003, 2004). Эти сомнения и особенно шестой этап, показывают, насколько важно обнаружить гены, эпигенетически сайленсированные при раке, но создают широкий фронт работы, который следует рассмотреть исследователям в этой области.

Таблица 24.4. Этапы документирования важности гиперметилированного гена для опухолеобразования

1. Обосновать метилирование промотора островка CpG и скоррелировать с транскрипционным сайленсингом гена и способностью отменять сайленсинг деметилирующими препаратами в культуре клеток

2. Обосновать корреляцию гиперметилирования промотора со специфичностью к этому изменению в раковых клетках (культура клеток и первичные опухоли) против аналогов среди нормальных клеток и случаев изменения гиперметилирования в первичных опухолях

3. Обосновать положение измененного метилирования для развития опухоли рака данного типа

4. Обосновать потенциальное значение генного сайленсинга при опухолеобразовании при помощи изучения реинсерции генов в культуре клеток и влияния на клонирование на мягком агаре, при росте опухолевых клеток в голых мышиных эксплантах и т.п.

5. Установить функцию белка, кодируемого сайленсным геном — либо через известные свойства либо путем тестирования активности узнаваемых белковых мотивов в культуре и т.п.

6. Обосновать супрессорную активность и функцию гена при обновлении клетки и т.п., особенно для совершенно неизвестных генов, посредством изучения нокаутных мышей.

 

5. Эпигенетический сайленсинг генов и его роль в эволюции рака - значение для ранних стадий развития опухоли

Согласно классическому взгляду на развитие рака, сформулированному Фогелыитейном и его коллегами (Kinzler and Vogelstein, 1997), серия генетических изменений стимулирует продвижение от ранних предмалигнизованных стадий через появление инвазивного рака к началу метастазирующей стадии заболевания (рис. 24.4). Это развитие у разных опухолей не обязательно всегда осуществляется именно в таком порядке Мы знаем, что на всем протяжении такого хода событий, также имеют место эпигенетические изменения: наблюдается раннее появление как широко распространенных утрат нормального метилирования ДНК, так и его более локального прироста в промоторах генов, которые мы обсуждаем. Таким образом, имеется потенциальная возможность для взаимодействия эпигенетических и генетических событий, чтобы направлять последовательные клеточные аномалии на всем протяжении неопластической прогрессии. В соответствии с этим сценарием, данные, касающиеся двух эпигенетических аспектов — потери импринтинга (LOI — loss of imprinting) (как это обсуждалось в главе 23) и сайленсинга генов — оказываются крайне важными для ранних стадий развития рака.

Рис. 24.4. Ранняя роль аномального метилирования ДНК в развитии опухоли

Описано в класической модели (Kinzler and Vogelstein, 1997) генетических изменений в процессе эволюции рака толстой кишки. Показано, что измененное метилирование ДНК имеет место очень рано ( красная стрелка ), как сказано в тексте, во время превращения нормального эпителия в гиперпластический. Этот факт определяет его стратегическое положение ( левая нижняя черная стрелка и левый нижний прямоугольник ): стволовые клетки направляются на путь аномальной клональной экспансии (рис. 24.5) при содействии ключевых генетических изменений. Эти эпигенетические аномалии также имеют смысл маркеров, как показано в нижнем левом черном прямоугольнике. Аномальное метилирование ДНК продолжает накапливаться в процессе превращения опухолей из неинвазивных в инвазивные и, наконец, метастазирующие ( правая нижняя стрелка и правый прямоугольник ). Это создает дополнительную основу для лечения рака и для поисков маркеров, используемых в прогнозировании заболевания

Потеря импринтинга включает в себя процесс, при котором «молчащая» аллель импринтированных генов активируется во время канцерогенеза таким образом, что устанавливается двуаллельная экспрессия гена и избыток продукта данного гена (Rainier et al., 1993). Наиболее изученный пример касается гена IGF2 в таких опухолях, как рак толстой кишки (Kaneda and Feinberg, 2005). В этом случае гиперметилирование промотора в импринтированном гене Н19 на краю хромосомы является результатом сложного процесса контролирования хроматина (глава 19), чтобы аномально активировать «молчащую» аллель 7GF2 (Kaneda and Feinberg, 2005). Получающяяся в результате двуаллельная экспрессия IGF2 приводит к переизбытку белка TGF2, стимулирующего рост. Экспериментальные свидетельства предполагают, что это может играть роль на очень ранних стадиях образования рака толстой кишки (Kaneda and Feinberg, 2005; Sakatani et al., 2005). И действительно, недавние исследования на мышиных моделях предполагают, что сама по себе LOI может быть достаточна, чтобы инициировать процесс опухолеобразования (Holmetal., 2005).

Второй обычный неопластический переход — эпигенетический сайленсинг генов — происходит на ранних фазах неопластического развития. Это очень тесно связано с вопросами о роли клеточного стресса и экспозиции в развитии болезненных состояний. Часто оказывается, что гены, участвующие в процессе, устанавливают те стадии, на которых клетки, подвергнутые стрессу, выживают при повреждении ДНК и(или) хронических нарушениях, увеличиваются, как клон стволовых или прогениторных клеток и затем делаются предрасположенными к более поздним генетическим и эпигенетическим событиям, чтобы осуществить развитие опухоли (рис. 24.5). Первое свидетельство такого участия исходит из данных по нескольким классичесим генам-супрессорам опухоли, которые могут быть либо мутантными, либо эпигенетически сайленсированными в раковых опухолях человека. Например, эпигенетический сайленсинг гена pl6 nk4a очень рано осуществляется в популяциях предмалигнизованных клеток, во время начальных изменений, которые предваряют образование опухолей, таких, например, как рак легких (Belinsky et al., 1998), а также в маленьких популяциях гиперпластических эпителиальных клеток нормальных во всем остальном молочных желез некоторых женщин (Hoist et al., 2003). В эксперименте, когда нормальные человеческие клетки эпителия молочной железы выращиваются в культуре (на пластике), этот тип сайленсинга р16 является предпосылкой для самых начальных этапов трансформации клеток (Kiyono et al., 1998; Romanov et al., 2001). Такая потеря функции гена сопровождает неспособность групп клеток молочной железы достичь точки смертности и, по мере того, как эти клетки продолжают пролиферировать, в них развиваются усиливающиеся хромосомные аномалии и экспрессия теломеразы.

Второй пример касается MLHL гена, устраняющего неправильное спаривание оснований. Этот ген мутирует в зародышевой линии тех семей, члены которых предрасположены к раку толстой кишки, такого типа, при котором имеются множественные генетические изменения; это называется фенотип «микросаттелитной» нестабильности (Liuetal., 1995). Однако, 10—15% пациентов с несемейным раком толстой кишки, также имеют опухоли с таким фенотипом, и в большинстве этих раковых опухолей обнаруживается эпигенетический сайленсинг немутировавшего гена MLH1 (Herman et al., 1998; Veigl et al., 1998). В культуре клеток реэкспрессия этого «молчащего» гена MLH1 вызывает появление вновь функционального белка, который восстанавливает значительную часть поврежденной способности репарировать неправильно спаренные основания (Herman etal., 1998).

 Рис. 24.5. События эпигенетического сайленсинга генов и опухолеобразование

Самые ранние этапы опухолеобразования описываются как аномальная клональная экспансия, которая разворачивается при стрессовом воздействии на клеточное обновление. Она вызывается такими факторами, как старение и хронические нарушения, связанные, например, с воспалением. Это как раз те клеточные клоны, в которых могут произойти последующие генетические и эпигенетические события, направляющие развитие опухоли. Такие аномальные эпигенетические события, как аберрантный генный сайленсинг, о котором говорится в данной главе, могли бы быть во многих случаях наиболее ранними наследуемыми причинами, вызывающими аномальную клональную экспансию из компартментов стволовых (или прогениторных) клеток в обновляющейся системе клеток взрослого организма. Сайленсинг генов включается модификациями хроматина, которые репрессируют транскрипцию, а гиперметилирование ДНК этого хроматина служит «надежным запором», чтобы стабилизировать наследуемый сай­ ленсинг, как сказано в тексте главы. Генный сайленсинг, в свою очередь, нарушает нормальный гомеостаз, удерживая стволовые клетки и прогениторные клетки от того, чтобы должным образом двигаться по пути дифференцировки, существующей в данной системе эпителиальных клеток (верхние клетки все более темного синего цвета) и направляя их (большие красные стрелки) к аномальной клональной экспансии

Совсем недавно было показано, что ген Chfr, регулирующий чекпойнт, который также контролирует еще один тип целостности генома, хромосомную стабильность и плоидность, мутирует в опухолях, но чаще проявляет эпигенетический сайленсинг при раке легких и других видах рака, и, что особенно важно, на ранних стадиях развития рака толстой кишки (Mizuno et al., 2002). Изучение нокаутных мышей выявило роль этого гена, как супрессора опухоли, основываясь на его функции какубиквитинлигазы ЕЗ, которая регулирует Aurora А — ген, контролирующий митоза. Эмбриональные клетки мыши характеризуются хромосомной нестабильностью и предрасположенностью к трансформации.

Поскольку список гиперметилированных генов при раке расширился, ключевые события сайленсинга на ранних стадиях развития опухоли определяются теперь для возможных генов-супрессоров опухоли, у которых имеется лишь история эпигенетических изменений, но не мутаций. Например, сайленсинг гена репарации ДНК 06-MGMT происходит на ранних стадиях развития рака толстой кишки (Esteller et al., 2001а), и эта потеря функции может обусловливать возможность сохранения клетками алкилирующего повреждения по гуанозинам, и, таким образом, предрасположенность к точечным мутациям — заменам G-А. В самом деле, сайленсинг этого гена имеет место в предраковых полипах толстой кишки перед появлением высокой частоты таких мутаций как в гене р53, так и в гене RAS, на более поздних стадиях развития опухоли толстой кишки (Esteller et al., 2001а; Wolf et al., 2001). Аналогично этому, сайленсинг гена GST-Pi имеет место практически при всех предраковых повреждениях, предрасполагающих к раку простаты, подвергая клетки риску окислительного повреждения аденинов (Lee etal., 1994).

Третий тип «молчащих» генов — обнаруженных методом беспорядочного скрининга раковых геномов на эпигенетически сайленсированные гены — также начинает вносить существенный вклад в наше понимание ранней роли генного сайленсинга при раке. Особенно интригующий сценарий был установлен в процессе развития рака толстой кишки: эпигенетическая потеря функции происходит в семействе генов (обнаруженных методом микрочипирования, описанного ранее — Suzuki et al., 2002), которые могут допустить раннюю аномальную активацию пути развития, всегда связанную с возникновением и дальнейшей прогрессией этого заболевания. Транскрипционный сайленсинг генов группы secreted frizzled related protein genes (SFRPs) (Suzuki et al., 2004) удаляет антагонистический сигнал к взаимодействию Wnt-лиганд с их мембранными рецепторами (Finch et al., 1997). Этот сайленсинг коррелирует с Wnt-управляемой апрегуляцией общих уровней ?-катенина в клетке, особенно благодаря повышенному присутствию и увеличенной активности в ядре этого транскрипционного фактора (Suzuki et al., 2004). Такая транскрипция — это каноническое считывание для повышенной активности Wnt-пути (Morin et al., 1997; Gregorieff and Clevers, 2005). Наиболее важным является тот факт, что сайленсинг SFRP происходит в очень ранних повреждениях, которые предрасполагают к раку толстой кишки, прежде чем происходят обычные мутации в белках Wnt-пути «вниз по течению», которые тоже приводят к активации ?-катенина в ядре (Morin et al., 1997; Gregorieff and Clevers, 2005) Таким образом, ранняя активация Wnt пути, обусловленная эпигенетическими событиями, оказывается сбалансированной, чтобы позволить раннее распространение клеток, предрасположенных к тому, чтобы и далее активировать этот путь посредством мутаций. Сохранение как эпигенетических (действующих через Wnt-управляемое увеличение клеточного ?-катенина), так и генетических (действующих через повреждение белкового комплекса, разрушающего ?-катенин. или через активирование Wnt мутаций) изменений, похоже, позволяют им дополнять друг друга при контроле развития заболевания (Suzuki et al., 2004).

Еще один пример из данной группы генов — это HIC-1 (hypermethylated-in-cancer 1). который кодирует транскрипционный репрессор типа «цинкового пальца» HIC-1 был обнаружен методом случайного скрининга на гиперметилированные островки CpG в горячей точке для потери хромосомы в раковых клетках (Wales et al., 1995). Оказалось, что этот ген, который сайленсирует на ранней стадии развития рака, но не мутирует, играет роль гена-супрессора опухоли при использовании модели нокаутной мыши (WY. Chen et al., 2003, 2004). Он служит дополнением к мутациям р53 частично, через потерю функции, которая приводит к апрегуляции SIRT1 (Chen et al., 2005), ключевого белка, воспринимающего клеточный стресс, и участвующего в росте стволовых или прогениторных клеток (Howitz et al., 2003; Nemoto et al., 2004; Kuzmichev et al., 2005).

Таким образом, приведенные выше данные вносят свой вклад в тематические гипотезы, представленные на рис. 24.4. Это предполагает, что некоторые из наиболее ранних наследуемых изменений в развитии опухолей могут представлять собой эпигенетические изменения, которые часто включают в себя жесткий транскрипционный сайленсинг генов, поддерживаемый метилированием промотора ДНК. Сложные задачи по дальнейшему пониманию этих сценариев целиком связаны с ключевыми задачами по изучению эпигенетических изменений при раковых заболеваниях, которые обрисованы в табл. 24.5 и более полно обсуждаются далее. Решение этих задач, в особенности для понимания роли эпигенетических изменений на самых ранних стадиях неопластического формирования, может удивительно обогатить молекулярные стратегии, имеющие целью предотвращение и раннее вмешательство при раковых заболеваниях.

Таблица 24.5. Главные задачи исследований молекулярных событий, связанные с эпигенетическим сайленсингом генов при раке

1. Выяснить связи между одновременным появлением и утратой метилирования ДНК в одних и тех же раковых клетках

2. Определить молекулярную природу границ (и то, как они изменяются при опухолеобразовании), которые отделяют области транскрипционно активных зон от транскрипционно репрессивных областей, окружающих промоторы генов и которые могут препятствовать распространению репрессивного хроматина через активную зону. Роль возможных механизмов могут играть ключевые модификации гистонов, инсуляторные белки, белки, осуществляющие ремоделинг хроматина, и т. д.

3. Определить, какова последовательность событий в эволюции генного сайленсинга при раке, по отношению к модификации гистонов, метилированию ДНК и т. д. Что идет вначале и каковы ключевые белковые комплексы (ферменты метилирования ДНК, ферменты деацетилирования и метилирования гистонов, белки, связывающиеся CpG с метилом, комплексы сайленсинга группы Polycomb и т. д.), которые нацеливают вышеупомянутые процессы, определяющие данные события

4. Какие специфические ферменты, метилирующие ДНК, требуются для инициации и(или) поддержания наиболее стабильного генного сайленсинга, и какие белковые комплексы содержат их. с учетом их взаимодействие с ключевыми компонентами гистонового кода

5. Каковы все компоненты аппарата метилирования ДНК и хроматина и какова иерархия их участия, необходимого для поддержания генного сайленсинга, и насколько обратимы их действия?

 

6. Молекулярная анатомия эпигенетически сайленсированных раковых генов

Гены, сайленсированные в неопластических клетках, важны для понимания инициации и дальнейшего поддержания рака. Они также служат великолепными моделями для понимания того, как может инициироваться и поддерживаться сайленсинг гена, и как упакован геном млекопитающих, чтобы облегчить доступ к участкам транскрипции и репрессии транскрипции. В свою очередь, понимание функции хроматина, на которой сосредоточено основное внимание во многих главах этой книги, облегчает наше понимание того, что может служить триггером для аберрантного сайленсинга генов при раке, и того, как компоненты этого сайленсинга поддерживают сопутствующую ему транскрипционную репрессию.

Работа нескольких лабораторий внесла свой вклад в текущее понимание конфигурации хроматина, который окружает гиперметилированные островки CpG в промоторах многочисленных генов, аберрантно сайленсированных в раковых клетках. Эти исследования также показали, каким образом этот хроматин отличается от хроматина, окружающего те же самые гены, когда они обнаруживают базовую экспрессию. В нормальных клетках или в раковых клетках, где гены транскрипционно не репрессированы, эти гены характеризуются наличием зоны открытого хроматина, где островки CpG в ДНК не метилированы, нуклеосомы расположены с нерегулярными промежутками, так что могут быть определены гиперчувствительные сайты, и ключевые гистоновые остатки маркированы посттрансляционны-ми модификациями, типичными для активных генов Активные ковалентные гистоновые метки включают в себя ацетилирование H3 по 9 и 14-му лизинам (H3K9ас and H3K14ас) и метилирование H3K4 (Nguyen et al., 2001; Fahmer et al., 2002).

Ha 5’ и 3’ границах вышеупомянутого участка открытого хроматина обнаруживается резкий переход в структуре хроматина с характерными для транскрипционно репрессированных геномных участков чертами, фланкирующими островок CpG (рис. 24.6). В этих пограничных участках имеет место метилирование менее частых сайтов CpG и рекрутирование белков, связывающихся с метилцитозином (MBDs). и их партнеров (например, деацетилаз гистонов, или HDACs) к метилированным CpGs (глава 18) Участки вне островков CpG оказываются, таким образом, доступны для ферментов, которые катализируют метки метилирования гистонов, коррелирующие с сайленсингом гена. В результате действия всех этих факторов происходит деацетилирование ключевых гистоновых остатков и обнаруживаются репрессивные метки метилирования гистонов, связанные с транскрипционной репрессией, особенно H3K9me2 (Nguyen et al., 2001; Fahmer et al., 2002; Kondo etal., 2003).

Рис. 24.6. Модель взаимоотношений между метилированием ДНК и модификациями гистонов в районе островков CpG генного промотора в нормальных и опухолевых клетках

В экспрессируемом гене показана граница (сверху), молеуклярная природа которой пока не охарактеризована и которая защищает островок CpG, окружая сайт начала транскрипции (зеленая стрелка) от метилирования ДНК. Сайты. CpG в CpG-участках, фланкирующих эту защитную зону, наоборот, имеют метилированную ДНК (розовый шестиугольник, обозначенный М) и ассоциированы с такими ключевыми метками сайленсинга, как метилирование H3K9 (красный шестиугольник, обозначенный Me). Ключевые аминокислоты «хвостов» гистонов в защищенной зоне, такие как H3K9, находятся в ацетилированом состоянии (синие флажки, обозначенные Ас) и транскрипционные факторы (желтый овал, обозначенный TF) имеют доступ к участку сайта начала транскрипции. Когда в раковой клетке тот же ген аберрантно находится в состоянии сайленсинга (внизу), островок CpG характеризуется гиперметилированием ДНК, т.к. защитные границы теперь разорваны и отсутствуют. Это метилирование поддерживается комплексами ДНК-метилтрансферазы (розовые овалы, обозначены DMMT) и белковыми комплексами, связывающимися с метилцитозином, которые содержат гистон-ацетилазы (синие овалы, обозначены HDAQ), и гистон-метилтрансферазы (красные овалы, обозначены НКМТ), которые катализируют ключевые метки метилирования при сайленсинге на аминокислотных «хвостах» гистонов (таких как H3K9). TF-комплексы более не активны (отсутствие зеленой стрелки). Отображены главные подходы проводимых в настоящее время клинических испытаний по раковой эпигенетике, которые включают либо ингибиторы метилтрансфераз ДНК для блокирования гиперметилирования ДНК, либо ингибиторы HDAC для восстановления статуса ацетилирования ключевых аминокислотных остатков гистонов Как сказано в тексте, наиболее многообещающая антираковая терапия включает комбинированное использование ингибиторов DNMT1 и HDAC

Эти соседние участки активных и репрессированных паттернов хроматина (рис. 24.6) предполагают, что промоторы активных генов, содержащие островки CpG, присущи зоне, которая «защищена», или, иными словами, не является мишенью для репрессивных меток хроматина и метилирования ДНК (Nguyen et al., 2001; Fahmer et al., 2002; Kondo et al., 2003). Неотъемлемой частью этих концепций является вероятность того, что в экспрессируемых генах молекулярные «границы» существуют на 5’ и 3’ концах промоторных островков CpG. Главная проблема — это определить точную природу этих границ. В настоящее время кандидатами на эту роль могут быть: сами модификации гистонов, которые маркируют защищенный участок промотора, транскрипционные активаторные и коактиваторные комплексы, которые прямо поддерживают активную транскрипцию, комплексы белков, которые выполняют размещение нуклеосом и(или) их движение (т.е. ремоделеры нуклеосом), которые могут маркировать гены для активной транскрипции. Эти факторы могут стимулировать доступ активирующих транскрипционных комплексов, замену классических гистонов их разновидностями, такими, как H3.3 (глава 13), который, как оказалось, поддерживает активную транскрипцию, и действие инсуляторных белковых комплексов и их узнающих последовательностей. Именно с точки зрения определения того, как один или несколько этих процессов поддерживают зоны транскрипционно пермиссивного хроматина вокруг промоторов активных генов, содержащих неметилированные по ДНК островки CpG, гены, сайленсированные при раковых заболеваниях, представляют собой великолепную модель для изучения и понимания модуляций генной экспрессии в геномах млекопитающих.

Способ, которым вышеупомянутая траскрипционно активная организация хроматина промоторов, содержащих островки CpG, преобразуется в процессе развития опухоли, остается в основном неизвестным, расшифровка этого преобразования остается одной из главных проблем в области эпигенетики рака. Как было упомянуто ранее, аномально метилированные по ДНК островки CpG в промоторах генов, сопровождающиеся генным сайленсингом, часто обнаруживаются на самых ранних и предраковых стадиях развития опухоли, делая наше понимание лежащих в основе факторов потенциально очень важным для изучения биологии рака. Это также открывает новые возможности для выявления факторов риска при раке, для облегчения ранней диагностики рака и для выдвижения новых стратегий предупреждения и раннего вмешательства в канцерогенез.

Какой бы конкретный механизм, из тех, что будут рассматриваться далее в этом разделе, не был задействован. конечным результатом, проявляющимся в процессе развития опухоли, является «разлад» механизмов, которые охраняют участки островков CpG в генном промоторе от «вторжения» хроматина репрессивного типа, расположенного на 5’ и 3’ границах. Результатом является превращение конфигурации промотора из транскрипционно открытой в закрытую с более плотно упакованными нуклеосомами и потерей гиперчувствительных сайтов, а также появление множественных состояний деацетилирования и метилирования гистонов, характерных для транскрипционно репрессивного хроматина (рис. 24.6). Иерархия всех этих событий, в том смысле, которое из них является наиболее значимым в поддержке этой репрессии, все еще нуждается в определении. Однако одна важная черта, которая всплывает из анализа множественных генов, состоит в том, что какой бы ни была роль компоненты ДНК-метилирования в инициации и (или) поддержании генного сайленсинга, однажды состоявшись, она играет доминирующую роль в наследуемости транскрипционно-репрессивного состояния. Соответственно, такие терапевтические приемы как ингибирование активности HDAC специфическими лекарственными препаратами, не могут индуцировать реэкспрессию раковых генов, промоторы которых содержат в себе плотно метилированнные островки CpG Однако, если сначала применяется низкая доза такого деметилирующего агента, как 5’-деоксиазацитидин (DAC), то затем ингибиторы HDAC обнаруживают при реэкспрессии «молчащих» генов эффект аддитивности и(или) синнергизма (Cameron et al., 1999; Suzuki et al., 2002). Данная парадигма в сочетании с использованием микрочипов для поиска, реэкспрессии сайленсных базально генов доказала свою ценность даже для идентификации новых эпигенетически сайленсированных генов при раке (Suzuki et al., 2002). Аналогично этому, реэкспрессия генов, следующая за назначением DAC, может привести к устранению меток сайленсирующего метилирования гистонов из промоторных участков эпигенетически сайленсированых раковых генов (Nguyen et al., 2001; Fahmer et al., 2002; Kondo et al., 2003). В этом смысле, как показано на рис. 24.6, метилирование ДНК может служить «замком», чтобы стабилизировать эпигенетический сайленсинг раковых генов и обеспечить его стабильное наследование, приводящее к потере функции генов.

Еще один ключевой вопрос из области эпигенетического сайленсинга раковых генов касается того, какая из DNMT ответственна за установление и поддержание аномального метилирования ДНК промотора, которое часто сопровождает этот процесс. Современные данные позволяют предполагать, что эти этапы могут быть опосредованы каким-то другим способом, нежели это можно было бы предположить, исходя из классической роли Dnmt, установленной при исследовании развития мышей. При развитии мышей, как вытекает из исследований нокаутов трех известных биологически активных ДНК-метилтрансфераз — Dnmtl, Dnmt3a и Dnmt3b — два последних фермента отвечают за установление метилирования (метилирование ДНК de novo), тогда как Dnmtl ответственна за дальнейшее поддержание установленных паттернов (поддерживающее метилирование ДНК) (Li et al., 1992; более детально см. главу 18). Однако в культуре клеток рака толстой кишки исследования по генетическому разрушению DNMTs показывают, что поддержание большинства случаев общего метилирования ДНК, в том числе гиперметилирование промоторов и сопровождающий его сайленсинг генов, требует наличия как DNMT1, так и DNMT3b (Rhee et al., 2000, 2002). Изучение раковых клеток других типов дали более разнообразные результаты — от указания на некоторую степень партнерства этих двух ферментов в таком поддержании до описания генов, которые деметилируются и транскрипционно реактивируются при уменьшении количества одной только DNMT1 (Leu et al., 2003). Таким образом, вопрос о том, как DNMTs устанавливают и поддерживают аномальные паттерны метилирования ДНК в раковых клетках, требует того, чтобы исследования были продолжены. Особенно мы нуждаемся в прояснении того, посредством каких комплексов эти ферменты могли бы кооперироваться и с помощью каких механизмов они нацеливаются на промоторы генов. Несколько последних исследований показывают, что для такого рекрутирования ключевыми являются комплексы транскрипционной репрессии (Di Croce et al., 2002; Fuks et al., 2003: Brenner et al., 2005) Каковы бы ни были эти механизмы, следует помнить, что в эксперименте DNMTs млекопитающих обладают сложными функциями, включающими не только каталитическую активность, связанную с карбокситерминальными участками в отношении метилирования ДНК, но и активность, непосредственно связанную с транскрипционной репрессией в аминотерминальных доменах (см. рис. 18.3) (Robertson et al., 2000; Rountree et al., 2000; Fuks et al., 2001). Эти ферменты также могут связываться с ключевыми медиаторами транскрипционной репрессии, в том числе с HDAC и с белками, связывающимися с метилцитозином (MBDs), и потенциально рекрутировать их. Таким образом, роль DNMT в транскрипционном сайленсинге потенциально имеет много граней (от инициации до поддерживания), которые могут включать этапы метилирования ДНК, а могут и не включать их. Сайленсинг генов при раке поможет рассортировать эти возможности.

 

7. Резюме главных результатов исследований по осмыслению эпигенетического сайленсинга генов при раке

Приведенное выше обсуждение показывает, что мы узнали довольно много относительно молекулярных событий, которые лежат в основе появления метилированной ДНК промотора, а также генного сайленсинга в процессе развития опухоли, но едва ли не больше явлений еще требует прояснения. В табл. 24.5 суммированы как минимум некоторые наиболее важные вопросы, которые должны быть решены в будущих исследованиях. Во-первых, должны быть прояснены молекулярные события, определяющие одновременное появление общего гипометилирования ДНК и более локализованное гиперметилирование ДНК промотора. Эти перекрывающиеся состояния предполагают масштабные ошибки в нацеливании хроматина (мистаргетинг) в раковых клетках. Этиология этого явления должна послужить разъяснению того, как клетки млекопитающих укладывают свои геномы для создания соответствующих паттернов генной экспрессии и для поддержания целостности хромосом. Во-вторых, необходимо обрисовать детерминанты границ хроматина вокруг промоторов индивидуальных генов и их корреляцию как с нормальным, так и с аномальным состоянием транскрипции. Сами ли белки-инсуляторы, вовлеченные в защиту активных в норме генов от вторжения транскрипционно-репрессивного хроматина, и(или) модификации гистонов, устанавливают границы? Как могли бы эти детерминанты границ изменяться в процессе развития опухоли? В-третьих, каков порядок событий для появления аномального генного сайленсинга в раковых клетках? Требуется ли начальная даун-регуляция транскрипции гена? Предшествуют ли таргетному метилированию ДНК ключевые модификации хроматина, в том числе деацетилирование и метилирование гистоновых аминокислот и рекрутирование ферментов, которые служат связующим звеном в этом процессе (см. главу 10)? Если да, то каковы молекулярные взаимодействия, лежащие в основе такого таргетинга, и какую роль играют ключевые комплексы сайленсинга (такие как белки группы Polycomb, — см. главу 11), важные для нормальных и раковых стволовых клеток. В-четвертых, какие именно DNMT требуются для инициации и поддержания аномального метилирования ДНК промотора при раке, и как они взаимодействуют? Какой из компонентов хроматина, описанных выше, может взаимодействовать с этими ферментами и направлять их? Наконец, если аномальный генный сайленсинг уже установился при раке, какова точная иерархия молекулярных этапов, которые поддерживают его? Этот последний вопрос является не только ключевым фундаментальным вопросом, но и центральным в плане использования в медицине (что будет обсуждено далее) для реверсии аномального генного сайленсинга при профилактике и лечении рака.

 

8. Выявление рака посредством метилирования ДНК

Тот факт, что локальное гиперметилирование островков CpG является таким обычным в раковых клетках, в сочетании с возможностью определять метилирование с высокой степенью чувствительности, привело к развитию нескольких подходов по определению рака с использованием жидкостей организма. Приобретенные изменения в метилировании островков CpG могут быть определены на фоне, характерном для нормальных клеток, после конверсии цитозинов в урацилы, при том, что 5-метилцитозин в ДНК, обработанной бисульфитом натрия остается интактным. Очень чувствительными являются методы ПЦР, например ПЦР, специфическая к метилированию (MSP-methylation-specific PCR), при которой праймеры сконструированы так, чтобы амплифицировать только метилированные участки. Другие методы включают способы, основанные на ПЦР в реальном времени, такие как «MethyLight», где флуоресцентный зонд, который может связываться только с метилированной ДНК, используется для выявления паттернов метилирования (как показано на левом рисунка титульной страницы, где на оси Y — гены, а на оси X — типы опухолей). Эти методики могут выявлять одну метилированную аллель на фоне примерно 1,000-10,000 аллелей. Таким образом, приобретение аномального паттерна метилирования может быть легко определено; эти подходы применимы к смесям клеток или даже к разным биологическим жидкостям, таким как плазма крови, моча или мокрота (Laird, 2003). Диагностика рака посредством идентификации измененного метилирования цитозина довольно надежная из-за свойственной ДНК стабильности, в отличие от РНК и белков. Кроме того, из-за того что измененные паттерны метилирования часто канцероспецифичны, эти методы могут быть способны отличить один тип рака от другого. Сейчас имеется целый ряд исследований, как было упомянуто выше, обеспечивающих «proof of principle» для многообещающего использования гиперметилированных последовательностей ДНК промотора как исключительно чувствительной стратегии для предсказания риска раковых заболеваний или выявления их. Окончательное доказательство того, насколько ценным этот подход окажется для клиники, дожидается более широких исследований, в которых будет дана полная оценка современных гипотез. Такие исследования безусловно будут проведены в ближайшие несколько лет.

 

9. Эпигенетическая терапия

Наследуемая инактивация генов, имеющих отношение к раку, при помощи измененного метилирования ДНК и модификации хроматина привела к осознанию того, что сайленсированный хроматин может представлять собой жизнеспособную мишень для терапии. Таким образом, был разработан новый терапевтический поход под названием «эпигенетическая терапия», при котором лекарственные препараты, способные модифицировать хроматин или паттерны метилирования ДНК. используются либо по одному, либо в комбинации (рис. 24.7), чтобы повлиять на терапевтический результат (Egger et al., 2004).

Аналоги нуклеозидов, 5-азацитидин, 5-аза-2’-дезоксицитидин, и зебуларин, являются мощными, основанными на известных механизмах (mechanism-based) ингибиторами метилирования цитозина ДНК (рис. 24.7а). Эти препараты включаются в ДНК делящихся клеток после того, как в ходе метаболизма они превращаются в соответствующие дезоксинуклеозид-трифосфаты. Будучи включены в ДНК, они взаимодействуют со всеми тремя известными метилтрансферазами ДНК и образуют ковалентные промежуточные продукты, которые в конечном счете ингибируют метилирование ДНК в последующих раундах синтеза ДНК. Механизм действия этих веществ вполне понятен и их использовали в течение некоторого времени, чтобы реактивировать «молчащие» гены в культуре ткани или в моделях с ксенотрансплантациями (xenograft). Однако недавно они нашли применение при лечении некоторых гематологических злокачественных заболеваний, в частности, миелоидного диспластического синдрома (MDS), который является предлейкемическим состоянием, возникающим, в основном, у пожилых пациентов (Lubbert, 2000; Wijermans et al., 2000; Silverman et al., 2002; Issa et al., 2004). Клинические реакции для пациентов с таким нарушением и с лейкемиями, которые могут развиться из предлейкемического состояния, становятся все более драматичными. Соответственно, лекарства на основе 5-азацитидина и 5-аза-2’-деоксицитидина (их клинические названия — Видаза (Vidaza) и Децитабин (Decitabine), соответственно) сейчас одобрены American Food and Drug Administration (FDA) для лечения пациентов с данными нарушениями. Зебуларин (Zebu-larine), который также является основанным на известных механизмах (mechanism-based) ингибитором ДНК-метилтрансфераз, находится на более ранней стадии клинической разработки. К настоящему моменту не обнаружены эффективные ингибиторы, не требующие включения в ДНК, но для клинических целей они могли бы быть более желательны, так как могли бы давать меньше побочных эффектов. Сейчас предпринимаются многочисленные попытки синтезировать и (или) обнаружить такие препараты.

Хотя было показано, что Видаза и Децитабин клинически эффективны, оказалось труднее четко установить, что мишенями действия этих лекарств являются промоторы метилированных генов. Предварительные эксперименты позволили предположить, что ген-супрессор опухоли,/? 15у становится деметилированным после лечения Децитабином (Daskalakis et al., 2002); однако, остается показать, действуют ли эти препараты, индуцируя экспрессию гена, или по какому-нибудь другому механизму.

Клинические испытания проходят также с использованием HDACs (рис. 24.76). Известно несколько препаратов, способных вызывать существенное ингибирование HDACs. Некоторые из них, такие как фенилбутановая кислота или вальпроевая кислота, в течение некоторого времени использовались для лечения других заболеваний (Marks et al., 2001; Richon and O’Brien, 2002). Эти препараты ингибируют все деацетилазы, и неясно, связана ли их эффективность в лечении определенных форм злокачественных заболеваний именно с ингибированием деацетилирования гистонов, а не с какой-либо другой реакцией. Более новые соединения, такие как субероиланилидгидроксамовая кислота (SAHA) и депсипептид, являются более специфичными ингибиторами гистоновых деацетилаз и показывают хорошие клинические результаты (рис. 24.8). Однако, опять же, трудно быть уверенным в том, что эти лекарства действуют на пациентов только в соответствии с теоретическими механизмами.

Рис. 24/7. Структуры аналогов нуклеозидов — ингибиторов метилирования ДНК (а) и ингибиторов деацетилирования гистонов (б)

( а ) Известно три нуклеозидных аналога, которые могут ингибировать метилирование ДНК после включения в ДНК 5-аза-цитидин (Видаза) и 5-аза-2’-дезоксицитидин (Децитабин) одобрены для лечения лейкемии. Зебуларин находится на более ранней стадии разработки; ( б ) несколько примеров многих ингибиторов гистоновых деапетилаз, некоторые из них в настоящее время находятся на стадии клинических испытаний

Новейшие клинические испытания, основанные на взаимодействии хроматина с метилированием ДНК, обсуждавшемся в предыдущих разделах (Cameron et al., 1999; Suzuki et al., 2002), сфокусированы на комбинировании ингибиторов метилирования ДНК и ингибиторов HDACs, в попытке использовать более низкие дозы препаратов обоих классов, но получить при этом сильный синергистический эффект. Несколько интригующих клинических испытаний проводятся в настоящее время для проверки данных гипотез, однако все еще не ясно, будут ли работать эти подходы.

Рис. 24.8. Ингибиторы деаиетилаз гистонов могут вызывать регрессию опухоли

Компьютерные томограммы (СТ) пациента с мезотелиомой (левый снимок) Перед лечением в правом легком наблюдалась большая плоская белая масса, сжимавшая аэрируемую черную часть легкого (см. стрелку). (Правый снимок) Спустя 4 месяца после лечения препаратом SAHA; наблюдается сморщивание опухоли и гораздо более расправленное правое легкое (снимки любезно предоставлены Др. Полом Марксом — Paul Marks, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, NY.)

Хотя метод эпигенетической терапии имеет хорошую теоретическую базу отсутствие специфичности в действии некоторых агентов дает повод для беспокойства. Например, аналоги нуклеозидов являются неспецифическими ингибиторами ДНК-метилтрансфераз и ингибируют метилирование ДНК во всем геноме. Поэтому существует возможность непреднамеренной реактивации генов в результате такой терапии, хотя это не представляется проблемой для тех пациентов с серьезными заболеваниями, которые уже были пролечены. Точно так же, есть несколько дополнительных модификаций хроматина помимо деацетилирования, такие как метилирование ключевых аминокислот гистонов, о которых говорилось в предыдущих главах, которые потенциально могут быть мишенями для терапии. Существует, следовательно, значительная заинтересованность в поиске новых мишеней для терапии с целью активировать «молчащие» гены, и в ближайшие годы ожидаются волнующие результаты на этом поприще.

 

Литература

 Amann J.M., Nip J., Strom D.K., Lutterbach B., Harada H., Lenny N., Downing J.R., Meyers S., and Hiebert S.W., 2001. ETO, a target of t(8;21) in acute leukemia, makes distinct contacts with multiple histone deacetylases and binds mSin3A through its oligomerization domain. Mol. Cell. Biol. 21: 6470-6483.

Baylin S.B., Fearon E.R., Vogelstein B., de Bustros A., Sharkis S.J., Burke P.J., Staal S.P., and Nelkin B.D., 1987. Hypermethylation of the 5' region of the calcitonin gene is a property of human lymphoid and acute myeloid malignancies. Blood 70: 412-417.

Belinsky S.A., Nikula K.J., Palmisano W.A., Michels R., Saccomanno G., Gabrielson E., Baylin S.B., and Herman J.G., 1998. Aberrant methylation of pl6 INK4a is an early event in lung cancer and a potential biomarker for early diagnosis. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 11891-11896.

Brenner C., Deplus R., Didelot C., Loriot A., Vire E., De Smet C., Gutierrez A., Danovi D., Bernard D., Boon Т., et al., 2005. Мус represses transcription through recruitment of DNA methyltransferase compressor. EMBO J. 24. 336-346.

Burbee D.G., Forgacs E., Zochbauer Muller S., Shivakumar L., Fong K., Gao B., Randle D., Kondo M., Virmani A., Bader S., et al., 2001. Epigenetic inactivation of RASSF1A in lung and breast cancers and malignant phenotype suppression./. Natl. Cancer Inst. 93: 691-699.

Cameron E.E., Bachman K.E., Myohanen S., Herman J.G., and Baylin S.B., 1999. Synergy of demethylation and histone deacety-lase inhibition in the re-expression of genes silenced in cancer. Nat. Genet. 21: 103-107.

Chen CM., ChenH.L., HsiauT.H., HsiauA.H., ShiH,, Brock G.J., Wei S.H., Caldwell C.W., Yan P.S., and Huang T.H., 2003. Methylation target array for rapid analysis of CpG island hypermethyla-tion in multiple tissue genomes. Am. J. Pathol. 163: 37-45.

Chen W., Cooper T.K., Zahnow C.A., Overholtzer M., Zhao Z., Ladanyi M., Karp J.E., Gokgoz N., Wunder J.S., Andrulis I.L., et al., 2004. Epigenetic and genetic loss of Hid function accentuates the role ofp53 in tumorigenesis. Cancer Cell 6: 387—398.

Chen W.Y, Wang D.H., Yen R.C., Luo J., Gu W, and Baylin S.B., 2005. Tumor suppressor HIC1 directly regulates S1RT1 to modulate p53-dependent DNA-damage responses. Cell 123: 437-448.

Chen W.Y., Zeng X., Carter M.G.. Morrell C.N.. Chiu Yen R.W., Esteller M., Watkins D.N., Herman J.G., Mankowski J.L., and Baylin S.B., 2003. Heterozygous disruption of Hie /predisposes mice to a gender-dependent spectrum of malignant tumors. Nat. Genet. 33: 197-202.

Dammann R., Li C., Yoon J.H., Chin P.L., Bates S., and Pfeifer G.P., 2000. Epigenetic inactivation of a RAS association domain family protein from the lung tumour suppressor locus 3p21.3. Nat. Genet. 25: 315-319.

Daskalakis M., Nguyen T.T., Nguyen C., Guldbeig P., Kohler G., Wijermans P., Jones P.A., and Lubbert M., 2002. Demethylation of a hypermethylated P15/INK4B gene in patients with my-elodysplastic syndrome by 5-Aza-2’-deoxycytidine (decitabine) treatment. Blood 100: 2957-2964.

Di Croce L., Raker V.A., Corsaro M., Fazi E, Fanelli M., Faretta M., Fuks E, Lo Coco E, Kouzarides T., Nervi C., et al., 2002. Methyl-transferase recruitment and DNA hypermethylation of target promoters by an oncogenic transcription factor. Science 295: 1079-1082.

Egger G., Liang G., Aparicio A., and Jones P.A., 2004. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature 429: 457-463.

Ehrlich M., Gama-Sosa M.A., Huang L.H., Midgett R.M., Kuo K.C., McCune R.A., and Gehrke C., 1982. Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells. Nucleic Acids Res. 10: 2709-2721.

Esteller M., Risques R.A., Toyota M., Capella G., Moreno V., Peinado M.A., Baylin S.B., and Herman J.G., 2001a. Promoter hypermethylation of the DNA repair gene 0(6)-methylguanine-DNA methyltransferase is associated with the presence of G:C to A:T transition mutations in p53 in human colorectal tumori-genesis. Cancer Res. 61: 4689-4692.

EstellerM., Fraga M.F., Guo M., Garcia-Foncillas J., HedenfalkL, Godwin A.K., Trojan J., Vaurs-Barriere C., Bignon Y.J., Ramus S., et al., 2001b. DNA methylation patterns in hereditary human cancers mimic sporadic tumorigenesis. Hum. Mol. Genet. 10: 3001-3007.

Fahmer J.A., Eguchi S., Herman J.G., and Baylin S.B., 2002. Dependence of histone modifications and gene expression on DNA hypermethylation in cancer. Cancer Res. 62: 7213-7218.

Feinberg A.P. and Vogelstein B., 1983. Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts. Nature 301: 89-92.

Feinberg A.P., Gehrke C.W., Kuo K.C., and Ehrlich M., 1988. Reduced genomic 5-methylcytosine content in human colonic neoplasia. Cancer Res. 48: 1159-1161.

Finch P.W., He X.. Kelley M.J., Uren A.. Schaudies R.P., Popescu N.C., Rudikoff S., Aaronson S.A., Varmus H.E., and Rubin J.S., 1997. Purification and molecular cloning of a secreted, Frizzled-related antagonist of Wnt action. Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 6770-6775.

Flatau E., Bogenmann E., and Jones P.A., 1983. Variable 5-methylcy-tosine levels in human tumor cell lines and fresh pediatric tumor explants. Cancer Res. 43: 4901-4905.

Frost P., Liteplo R.G., Donaghue T.P., and Kerbel R.S., 1984. Selection of strongly immunogenic “turn” variants from tumors at high frequency using 5-azacytidine. J. Exp. Med. 159: 1491-1501.

Fuks E., Hurd P.J., Deplus R., and Kouzarides T., 2003. The DNA methyltransferases associate with HP1 and the SUV39H1 histone methyltransferase. Nucleic Acids Res. 31: 2305-2312.

Fuks E., Burgers W.A., Godin N., Kasai M., and KouzaridesT., 2001. Dnmt3a binds deacetylases and is recruited by a sequence-specific repressor to silence transcription. EMBO J., 20: 2536-2544.

Gaudet E., Hodgson J.G., Eden A., Jackson-Grusby L., Dausman J., GrayJ.W, Leonhardt H., and Jaenisch R., 2003. Induction of tumors in mice by genomic hypomethylation. Science 300: 489-492.

Gazzoli I., Loda M., Garber J., Syngal S., and Kolodner R.D., 2002. A hereditary nonpolyposis colorectal carcinoma case associated with hypermethylation of the MLH1 gene in normal tissue and loss of heterozygosity of the unmethylated allele in the resulting microsatellite instability-high tumor. Cancer Res. 62: 3925-3928.

Grady W.M., Wilis J., Guilford P.J., Dunbier A.K., Toro T.T., Lynch H., Wesner G., Ferguson K., Eng C, Park J.G., et al., 2000. Methylation of the CDH1 promoter as the second genetic hit in hereditary diffuse gastric cancer. Nat. Genet. 26: 16-17.

Greenblatt M.S., Bennett W.P., Hollstein M., and Harris C.C., 1994. Mutations in the p53 tumor suppressor gene: Clues to cancer etiology and molecular pathogenesis. Cancer Res. 54: 4855-4878.

Gregorieff A. and Clevers H., 2005. Wnt signaling in the intestinal epithelium: From endoderm to cancer. Genes Dev., 19: 877-890.

Hanahan D. and Weinberg R.A., 2000. The hallmarks of cancer. Cell 100: 57-70.

Herman J.G. and Baylin S.B., 2003. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. N. Engl. J. Med. 349: 2042-2054.

Herman J.G., Umar A., Polyak K., Graff J.R., Ahuja N., Issa J.P., Markowitz S., Wilson J.K., Hamilton S.R., Kinzler K.W, et al., 1998. Incidence and functional consequences of hMLHl promoter hypermethylation in colorectal carcinoma. Proc. Natl. Acad. Sci 95: 6870-6875.

Holm T.M., Jackson-Grusby L., BrambrinkT., Yamada Y, Rideout W.M., III, and Jaenisch R., 2005. Global loss of imprinting leads to widespread tumorigenesis in adult mice. Cancer Cell 8: 275-285.

Holst C.R., Nuovo G.J., Esteller M., Chew K., Baylin S.B., Herman J.G., and Tlsty T. D., 2003. Methylation ofplG lNK4a promoters occurs in vivo in histologically normal human mammary epithelia. Cancer Res. 63: 1596-1601.

Howitz K.T., Bitterman K.J., Cohen H.Y., Lamming D.W., Lavu S., Wood J.G., Zipkin R.E., Chung P., Kisielewski A., Zhang L.L., et al., 2003. Small molecule activators of sirtuins extend Saccharomyces cerevisiae lifespan. Nature 425: 191-196.

Issa J.P., Ottaviano Y.L., Celano P., Hamilton S.R., Davidson N.E., and Baylin S.B., 1994. Methylation of the oestrogen receptor CpG island links ageing and neoplasia in human colon Nat. Genet. 7: 536-540.

Issa J.P., Garcia-Manero G., Giles F.J., Mannari R., Thomas D., Faderl S., Bayar E., Lyons J., Rosenfeld C.S., Cortes J., and Kantaijian H.M. 2004. Phase 1 study of low-dose prolonged exposure schedules of the hypomethylating agent 5-aza-2’-deoxycytidine (decitabine) in hematopoietic malignancies. Blood 103: 1635-1640.

Jones P.A., 1999. The DNA methylation paradox. Trends Genet. 15: 34-37.

Jones PA. and Baylin S.B., 2002. The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat. Rev. Genet. 3: 415-428.

Jones P.A. and Laird P.W, 1999. Cancer epigenetics comes of age. Nat. Genet. 21: 163-167.

Jones P.A. and Taylor S.M., 1980. Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation. Cell, 20: 85-93.

Kaminskas E., Farrell A., Abraham S., Baird A., Hsieh L.S., Lee S.-L., Leighton J.K., Patel H., Rahman A., Sridhara R., et al., 2005. Approval summary: Azacitidine for treatment of myelodysplastic syndrome subtypes. Clin. Cancer Res. 11: 3604-3608.

Kaneda A. and Feinberg A.P., 2005. Loss of imprinting of IGF2: A common epigenetic modifier of intestinal tumor risk. Cancer Res. 65: 11236-11240.

Katzenellenbogen R.A., Baylin S.B., and Herman J.G., 1999. Hypermethylation of the DAP-kinase CpG island is a common alteration in B-cell malignancies. Blood 93: 4347-4353.

Kinzler K.W. and Vogelstein B., 1997. Cancer-susceptibility genes. Gatekeepers and caretakers. Nature 386: 761-763.

Kiyono T, Foster S.A., Koop J.I., McDougall J.K., Galloway D.A., and Klingelhutz A.J., 1998. Both Rb/pl6INK4a inactivation and telomerase activity are required to immortalize human epithelial cells. Nature 396: 84-88.

Knudson A.G., 2001. Two genetic hits (more or less) to cancer. Nat. Rev. Cancer 1: 157-162.

Kondo Y., Shen L., and Issa J.R, 2003. Critical role ofhistone methylation in tumor suppressor gene silencing in colorectal cancer. Mol Cell. Biol. 23: 206-215.

Kuzmichev A., Margueron R., Vaquero A., PreissnerT.S., Scher M., KirmizisA., OuyangX., BrockdorffN., Abate-ShenC., Famham P., and Reinberg D., 2005. Composition and histone substrates of polycomb repressive group complexes change during cellular differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 1859-1864.

Laird P.W., 2003. The power and the promise of DNA methylation markers. Nat. Rev. Cancer 3: 253-266.

Laird P.W., Jackson-Grusby L., Fazeli A., Dickinson S.L., Jung W.E., Li E., Weinberg R.A., and Jaenisch R., 1995. Suppression of intestinal neoplasia by DNA hypomethylation. Cell 81: 197-205.

Lapeyre J.N. and Becker F.F., 1979. 5-Methylcytosine content of nuclear DNA during chemical hepatocarcinogenesis and in carcinomas which result. Biochem. Biophys. Res. Commun. 87: 698-705.

Lee W.H., Morton R.A., Epstein J.I., Brooks J.D., Campbell P.A., Bova G.S., Hsieh W.S., Isaacs W.B., and Nelson W.G., 1994. Cytidine methylation of regulatory sequences near the xu-class glutathione S-transferase gene accompanies human prostatic carcinogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 11733-11737.

Leu Y.W., Rahmatpanah F., Shi H., Wei S.H., Liu J.C., Yan P.S., and Huang T.H., 2003. Double RNA interference of DNMT3b and DNMT1 enhances DNA demethylation and gene reactivation. Cancer Res. 63: 6110-6115.

Li E., Bestor T.H., and Jaenisch R., 1992. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell 69: 915-926.

Liu B., Nicolaides N.C., Markowitz S., Willson J.K., Parsons R.E., Jen J., Papadopolous N., Peltomaki P., de la Chapelle A., Hamilton S.R., et al., 1995. Mismatch repair gene defects in sporadic colorectal cancers with microsatellite instability. Nat. Genet. 9: 48-55.

Lubbert M., 2000. DNA methylation inhibitors in the treatment of leukemias, myelodysplastic syndromes and hemoglobinopathies: Clinical results and possible mechanisms of action. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 249: 135-164.

Marks P., Rifkind R.A., Richon V.M., Breslow R., Miller T., and Kelly W.K., 2001. Histone deacetylases and cancer: Causes and therapies. Nat. Rev. Cancer 1: 194-202.

Mizuno K., Osada H., Konishi H., Tatematsu Y., Yatabe Y., Mitsu-domi T., Fujii Y., and Takahashi T., 2002. Aberrant hypermethylation of the CHFR prophase checkpoint gene in human lung cancers. Oncogene 21: 2328-2333.

Morin P.J., Sparks A.B., KorinekV., Barker N., Clevers H., Vogelstein B., and Kinzler K.W., 1997. Activation of p-catenin-Tcf signaling in colon cancer by mutations in p-catenin or APC Science 275: 1787-1790.

Narayan A., Ji W., Zhang X.Y., Marrogi A., Graff J.R., Baylin S.B., and Ehrlich M., 1998. Hypomethylation of pericentromeric DNA in breast adenocarcinomas. Int. J. Cancer 77: 833-838.

Nemoto S., Fergusson M.M., and Finkel T., 2004. Nutrient availability regulates SIRT1 through a forkhead-dependent pathway. Science 306: 2105-2108.

Nguyen C.T., Gonzales F.A., and Jones P.A., 2001. Altered chromatin structure associated with methylation-induced gene silencing in cancer cells: Correlation of accessibility, methylation, MeCP2 binding and acetylation Nucleic Acids Res. 29: 4598-4606.

Pfeifer G.P., Tang M., and Denissenko M.F., 2000. Mutation hotspots and DNA methylation. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 249: 1-19.

Rainier S., Johnson L.A., Dobry C.J., Ping A.J., Grundy P.E., and Feinberg A.P., 1993. Relaxation of imprinted genes in human cancer. Nature 362: 747-749.

Rhee I., Bachman K.E., Park B.H., Jair K.W., Yen R.W., Schuebel K.E., Cui H., Feinberg A.P., Lengauer C., Kinzler K.W., et al., 2002. DNMT1 and DNMT3b cooperate to silence genes in human cancer cells. Nature 416: 552-556.

Rhee I., Jair K.W., Yen R.W., Lengauer C., Herman J.G., Kinzler K.W., Vogelstein B., Baylin S.B., and Schuebel K.E., 2000. CpG methylation is mamtained in human cancer cells lacking DNMT1. Nature 404: 1003-1007.

Richon V.M. and O’Brien J.P., 2002. Histone deacetylase inhibitors: A new class of potential therapeutic agents for cancer treatment. Clin. Cancer Res. 8: 662-664.

Rideout W.M., III, Coetzee G.A., Olumi A.F., and Jones P.A., 1990. 5-Methylcytosine as an endogenous mutagen in the human LDL receptor and p53 genes. Science 249: 1288-1290.

Robertson K.D., Ait-Si-Ali S., Yokochi T., Wade P.A., Jones P.L., and Wolffe A.P., 2000. DNMT1 forms a complex with Rb, E2F1 and HDAC1 and represses transcription from E2F-responsive promoters. Nat. Genet. 25: 338-342.

Romanov S.R., Kozakiewicz B.K., Hoist C.R., Stampfer M.R., Haupt L.M., and Tlsty T.D., 2001. Normal human mammary epithelial cells spontaneously escape senescence and acquire genomic changes. Nature 409: 633-637.

Rountree M.R., Bachman K.E., and Baylin S.B., 2000. DNMT1 binds HDAC2 and a new co-repressor, DMAP1, to form a complex at replication foci. Nat. Genet. 25: 269-277.

Sakai T., Toguchida J., Ohtani N., Yandell D.W., Rapaport J.M., and Dryja T.P., 1991. Allele-specific hypermethylation of the retinoblastoma tumor-suppressor gene. Am. J. Hum. Genet. 48: 880-888.

Sakatani T., Kaneda A., Iacobuzio-Donahue C.A., Carter M.G., de Boom Witzel S., Okano H., Ko M.S., Ohlsson R., Longo D.L., and Feinberg A.P., 2005. Loss of imprinting of Igf2 alters intestinal maturation and tumorigenesis in mice. Science 307: 1976-1978.

Silverman L.R., Demakos E.P., Peterson B.L., Komblith A.B., Holland J.C., Odchimar-Reissig R., Stone R.M., Nelson D., Powell B.L., DeCastro CM., et al., 2002. Randomized controlled trial of azacitidine in patients with the myelodysplastic syndrome: A study of the cancer and leukemia group B. J. Clin. Oncol., 20: 2429-2440.

Srinivasan P.R. and Borek E., 1964. Enzymatic alteration of nucleic acid structure. Science 145: 548-553.

Suzuki H., Gabrielson E., Chen W., Anbazhagan R., van Engeland M., Weijenberg M.P, Herman J.G., and Baylin S.B., 2002. A genomic screen for genes upregulated by demethylation and histone deacetylase inhibition in human colorectal cancer. Nat. Genet. 31: 141-149.

Suzuki H., Watkins D.N., Jair K.W., Schuebel K.E., Markowitz S.D., Chen W.D., Pretlow T.P., Yang B., Akiyama Y., Van Engeland M., et al., 2004. Epigenetic inactivation of SFRP genes allows constitutive WNT signaling in colorectal cancer. Nat. Genet. 36: 417-422.

Toyota M., Ho C., Ahuja N., Jair K.W, Li Q., Ohe-Toyota M., Baylin S.B., and Issa J.P., 1999. Identification of differentially methylated sequences in colorectal cancer by methylated CpG island amplification. Cancer Res. 59: 2307-2312.

Ushijima T., 2005. Detection and interpretation of altered methylation patterns in cancer cells. Nat. Rev. Cancer 5: 223-231.

Veigl M.L., Kasturi L., Olechnowicz J., MaA.H., LutterbaughJ.D., Periyasamy S., Li G.M., Drummond J., Modnch P.L., Sedwick W.D., and Markowitz S.D., 1998. Biallelic inactivation ofhMLHl by epigenetic gene silencing, a novel mechanism causing human MSI cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 8698-8702.

Wales M.M., Biel M.A., el Deiry W., Nelkin B.D., Issa J.P., Cavenee W.K., Kuerbitz S.J., and Baylin S.B., 1995. p53 activates expression of HIC-1, a new candidate tumour suppressor gene on 17pl3.3. Nat. Med. 1: 570-577.

Wijermans P., Lubbert M., Verhoef G., Bosly A., Ravoet C, Andre M., and Ferrant A., 2000. Low-dose 5-aza-2’-deoxycytidine, a DNA hypomethylating agent, for the treatment of high-risk myelodys-plastic syndrome: A multicenter phase II study in elderly patients. J. Clin. Oncol. 18: 956-962.

Wolf P., Hu Y.C., Doffek K., Sidransky D., and Ahrendt S.A., 2001. 06-methylguanine-DNA methyltransferase promoter hypermethylation shifts the p53 mutational spectrum in non-small cell lung cancer. Cancer Res. 61: 8113-8117.

Wolffe A.P., 2001. Chromatin remodeling: Why it is important in cancer. Oncogene, 20: 2988-2990.

Yamashita K., Upadhyay S., Osada M., Hoque M.O., Xiao Y., Mori M., Sato R., Meltzer S.J., and Sidransky D., 2002. Pharmacologic unmasking of epigenetically silenced tumor suppressor genes in esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Cell 2: 485-495.