Michael Grunstein1 и Susan М. Gasser2

1 University of California, LosAngeles, California 90095-1570

2 Fried rich Miescher Institute for Biomedical Research, 4058 Basel, Switzerland

 

Общее резюме

В ядре эукариот фракция хроматина, содержащая активные гены, называется эухроматином. Во время митоза она подвергается конденсации, чтобы обеспечить сегрегацию хромосом, а в интерфазе клеточного цикла снова деконденсируется, чтобы сделать возможной транскрипцию. Цитологическими методами было обнаружено, что некоторые хромосомные домены остаются конденсированными и во время интерфазы. Эти конститутивно компактные участки хроматина и были названы гетерохроматином. С развитием новых методов эту часть генома стали определять по молекулярным, а не цитологическим критериям: было показано, что конститутивно компактный хроматин в области центромер и теломер содержит тысячи копий простых повторяющихся последовательностей. Такой гетерохроматин, как правило, реплицируется на поздних этапах S-фазы клеточного цикла и образует скопления по периферии ядра и вблизи ядрышка. Существенной чертой гетерохроматина является способность к стохастичному распространению своей характерной, устойчивой к действию нуклеаз, структуры и связанной с нею репрессии транскрипции на соседние гены. Например, в случае гена white дрозофилы, детерминирующего красный цвет глаз, такая эпигенетическая репрессия проявляется в появлении чередующихся красных и белых участков глаза. Это явление получило название «мозаичность, обусловленная эффектом положения» (position-effect variegation — PEV) В его основе — узнавание метилированной по 9-му остатку лизина формы гистона H3 (H3K9) гетерохроматиновым белком 1 (heterochromatin protein 1 — НР1) и распространение этой метки вдоль хромосомы. У пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae в ходе эволюции возник другой механизм образования гетерохроматина, но приводит он к очень похожему результату.

S. cerevisiae — микроорганизм, широко используемый при производстве пива и в хлебопечении. Однако, в отличие от бактерий, это — эукариот. Хромосомы у пекарских дрожжей, как и у более сложно организованных эукариот, связаны с гистонами, заключены в ядро и реплицируются в ходе S-фазы клеточного цикла с использованием множественных точек начала репликации (ориджинов).

Тем не менее, геном у дрожжей очень маленький: всего 14 миллионов пар оснований ДНК на 16 хромосом. Это ненамного больше, чем геномы некоторых бактериофагов. Всего в геноме дрожжей около 6000 довольно тесно расположенных генов: промежутки между ними обычно составляют не более 2 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов). Подавляющее большинство генов у дрожжей находится в хроматине открытой конфигурации, обеспечивающей их активную транскрипцию или возможность ее быстрой индукции. Это обстоятельство и очень небольшое количество простых повторяющихся последовательностей ДНК делает практически невозможной детекцию гетерохроматина у дрожжей цитологическими методами.

Тем не менее, с помощью молекулярных методов было показано, что у дрожжей имеются четко выделяющиеся гетерохроматиновые участки по соседству с теломерами всех 16-ти хромосом, а также в двух «молчащих» локусах типов спаривания III хромосомы. Репрессия транскрипции этих двух локусов существенна для поддержания компетентного к спариванию гаплоидного состояния. И субтеломерные области, и «молчащие» локусы типов спаривания репрессируют интегрированные репортерные гены позиционно-зависимым эпигенетическим механизмом, реплицируются во время поздней S-фазы и расположены по периферии ядра. Таким образом, эти локусы имеют все характерные для гетерохроматина черты, за исключением цитологически наблюдаемой конденсации в интерфазе. Для ученого, изучающего гетерохроматин, дрожжи сочетают преимущества малого генома, возможности использования генетических и биохимических методов исследования микроорганизмов и важные аспекты организации хромосом высших эукариот.

 

1. Генетические и молекулярные методы исследования дрожжей

Дрожжи представляют собой гибкую и быструю генетическую систему для изучения клеточных процессов.

При времени клеточной генерации около 90 мин. всего за два дня можно вырастить колонии, содержащие миллионы клеток. К тому же дрожжи можно поддерживать в гаплоидной и диплоидной формах, что резко упрощает их генетический анализ. Как и бактерий, гаплоидные клетки дрожжей можно использовать для получения ауксотрофных мутантов со специфическими требованиями к составу питательной среды. Рецессивные летальные мутации можно поддерживать в культуре гаплоидных клеток в виде условных летальных аллелей (например, температуро-чувствительных мутантов) или в культуре гетерозиготных диплоидных клеток (содержащих и аллель дикого типа и мутацию). Наличие высокоэффективной системы гомологичной рекомбинации у дрожжей позволяет произвольно изменять любую выбранную хромосомную последовательность ДНК. К тому же, можно осуществлять манипуляции с участками хромосом в составе рекомбинантных плазмид, которые стабильно поддерживаются в делящихся клетках дрожжей, благодаря включению в них коротких последовательностей центромеры и ориджина репликации ДНК. В дрожжах стабильно поддерживаются даже линейные плазмиды (минихромосомы), содержащие теломерные повторы по концам.

Явление мозаичности, обусловленной эффектом положения, на модели репортерного гена white дрозофилы сыграло важную роль в изучении эпигенетической регуляции генов, а также генов, влияющих на эту уникальную форму репрессии (см. более детально в главе 5). Открытию и изучению аналогичного явления в области теломер у дрожжей, теломерного эффекта положения (telomere position effect — ТРЕ) помогло использование в качестве репортерных генов Ura3 и Ade2 (рис. 4.1). В присутствии 5-фтороротовой кислоты (5-fluoroorotic acid-5-FOA) продукт гена Ura3 превращает ее в 5-фторурацил (5-fluorouracil-5-FU) — ингибитор синтеза ДНК, вызывающий гибель клеток Однако, при интеграции в область гетерохроматина ген Ura3 оказывается репрессированным в части клеток, и именно эти клетки оказываются способными расти на среде с 5-FOA. Таким образом, определяя эффективность роста на среде с 5-FOA с помощью серийных разведений культуры клеток дрожжей (рис. 4.1а), можно количественно измерять степень репрессии репортерного гена в очень широких пределах (например, в 10— 106-кратных). Более того, мутации, нарушающие ТРЕ, могут быть легко идентифицированы по повышению чувствительности к 5-FOA.

Аналогично, при интеграции гена Ade2 в область гетерохроматина происходит его репрессия, и в клетке накопливается предшественник биосинтеза аденина, окрашивая ее в красный цвет Существенно, что эпигенетическая природа репрессии Ade2 видна в пределах одиночной колонии генетически идентичных клеток. Ген может быть «включен» в некоторых клетках и «выключен» в остальных. Внешне это проявляется как наличие красных участков на фоне белой колонии или наоборот (рис. 4.16). В отличие от теста с использованием Ura3, селекции против клеток, в которых остался не репрессированным ген Ade2, не происходит, поэтому фенотип клеток с интегрированным в субтеломерный гетерохроматин геном-репортером можно использовать как показатель скорости переключения и наследования эпигенетического состояния. Цветной тест с использованием Ade2 представляет собой удивительную иллюстрацию полустабильной природы репрессированного и дерепрессированного состояний.

Рис. 4.1. Сайленсинги ТРЕ у дрожжей

(а) Ген Ura3 , встроенный рядом с простыми TG-богатыми теломерными повторами в левом плече VII хромосомы, подвергается сайленсингу теломерным гетерохроматином в данном штамме дрожжей. При выращивании на обычной богатой среде (YPD) не наблюдается различий между клетками дикого типа (wt), клетками с репрессированным субтеломерным геном Ura3 и мутантами по сайленсингу, у которых теломерный гетерохроматин утрачен, а ген Ura3 экспрессируется. На среде, содержащей 5-FOA (нижняя панель), с другой стороны, клетки с репрессированным геном Ura3 (например, клетки дикого типа) могут расти, а клетки, экспрессирующие его (sir2nyku70 мутанты), не могут. Это объясняется тем, что продукт гена Ura3 превращает 5-FOA в токсичный интермедиат 5-фторурацил. Тест с серийными разведениями позволяет детектировать события сайленсинга даже при частоте 1 на 106 клеток.

(б) Клетки, содержащие ген Ade2 дикого типа, дают «белую» колонию, а клетки с мутантным ade2 — красную, что связано с накоплением красного интермедиата биосинтеза аденина. При встраивании гена Ade2 рядом с теломерой в правом плече V хромосомы происходит его эпигенетический сайленсинг. И «молчащее», и активное состояния гена Ade2 наследуются в генетически идентичных клетках, в результате чего образуются колонии с белыми и красными секторами (весьма похоже на картину, наблюдаемую при PEV)

Вместе с описанными генетическими подходами к протеазо-дефицитным штаммам, растущим в синхронных и асинхронных крупномасштабных культурах, вполне применимы биохимические методы. В последние годы арсенал доступных средств расширился изощренными методами анализа с помощью микрочипов и белковых сетей, легко охватывающих весь небольшой геном дрожжей. Эти методы позволяют осуществлять полногеномный анализ транскрипции, связывания факторов транскрипции, модификации гистонов и белок-белковых взаимодействий. Этот широкий арсенал изощренных методов позволил ученым исследовать механизмы регуляции формирования гетерохроматина и его физиологическую роль в клетках дрожжей. Однако, прежде чем описать эти открытия, необходимо более детально рассмотреть жизненный цикл дрожжей.

 

2. Жизненный цикл дрожжей

Дрожжи S. cerevisiae размножаются путем митотических делений в гаплоидном или диплоидном состоянии, образуя почку, которая постепенно увеличивается и в какой-то момент отделяется от материнской клетки (рис. 4.2а). Гаплоидные клетки дрожжей могут спариваться друг с другом (коньюгировать), поскольку существуют в виде одного из двух типов спаривания, обозначаемых как а и а, напоминающих два пола у млекопитающих. Клетки каждого типа образуют свой феромон, привлекающий клетки противоположного типа: клетки типа а синтезируют 12-членный пептид, называемый а-фактор, который связывается мембранным рецептором а-фактора на поверхности клеток типа α. И наоборот, клетки типа а синтезируют 13-членный пептид. который связывается рецептором α-фактора на поверхности клеток типа а. Эти взаимодействия приводят к остановке клеток на стадии от средней до поздней G1-фазы клеточного цикла. При этом клетки приобретают грушевидную форму, называемую «шму» (shmoo) по имени персонажа известного мультфильма (рис. 4.2б). Клетки противоположных типов сливаются своими выпячиваниями, образуя диплоидную клетку а/а. В диплоидных клетках способность к спариванию репрессирована: они размножаются вегетативно (т.е. путем митотических делений), как и гаплоидные клетки. С другой стороны, в условиях голодания в них индуцируется мейотическая программа, приводящая к формированию аска (сумки) с четырьмя спорами, по две каждого типа спаривания. При поступлении достаточного количества питательных веществ гаплоидные споры превращаются в клетки, способные к спариванию, т.е. возобновляется нормальный жизненный цикл.

Рис. 4.2. Жизненный цикл почкующихся дрожжей

(а) Клетки дрожжей митотически делятся в гаплоидной и диплоидной формах. Голодание индуцирует споруляцию диплоидных клеток, а при сближении гаплоидных клеток противоположных типов происходят спонтанные скрещивания. Это является результатом секреции феромонов, вызывающих в клетке противоположного типа остановку клеточного цикла на стадии G1 и, после достаточно продолжительного действия феромона. — индукцию пути спаривания. Диплоидное состояние репрессирует путь спаривания.

(б) В ответ на действие феромона гаплоидные клетки «выпячиваются» по направлению клеток противоположного типа Получающаяся форма называется «шму» (по имени известного мультипликационного персонажа) Ядерная оболочка видна как флюоресценция зеленого цвета

Хотя в лабораторных условиях гаплоидные клетки дрожжей обычно маркируются одним из двух типов спаривания, в естественных условиях они переключают свои тип спаривания практически с каждым клеточным циклом (рис. 4.3а). Такое переключение индуцируется эндонуклеазной активностью (НО), осуществляющей сайт-специфический двунитчатый разрыв в области локуса МАТ. Происходящий затем процесс конверсии генов переносит информацию о противоположном типе спаривания из конститутивно «молчащего» донорского локуса НМLa или HMRα, в активный локус МАТ. Такие штаммы называют гомоталлическими (homothallic). Это означает, что вегетативно растущая клетка типа МАТа быстро даст МАТα потомство и наоборот. В условиях лаборатории удобно использовать клетки со стабильным типом спаривания, поэтому лабораторные штаммы конструируют с дефектным геном эндонуклеазы НО, что исключает расщепления локуса МАТ и. соответственно, переключение типов спаривания. В результате образуется гетероталлический штамм. Такие штаммы содержат «молчащие» локусы НМ и активный локус МАТ стабильно а- или α-типа. Два «молчащих» локуса типов спаривания (рис. 4.3б), по одному для каждого «пола», поддерживаются в конститутивно «молчащем» эпигенетическом состоянии и стали классической моделью для изучения гетерохроматина.

 

3. Гетерохроматин у дрожжей находится в «молчащих» локусах типов спаривания

НМ

и теломерах

У дрожжей информация, детерминирующая типы спаривания (а или а), находится в трех локусах, НМ La, МАТ, и HMRa, III хромосомы. Локусы HMLα (~11 т.п.н. от левой теломеры) и HMRa (-23 т.п.н. от правой теломеры; рис. 4.36,в) расположены между короткими элементами ДНК, называемыми сайленсерами Е и I. Только когда любая из двух «молчащих» кассет копируется и интегрируется в активный локус МАТ, она приобретает способность транскрибироваться в нормальной клетке. Перенос информации из локуса HMLα в локус МАТ приводит к образованию клетки с типом спаривания α (МАТα), а перенос информации из локуса HMRa в локус МАТ — клетки типа а (МАТа) (рис. 4.36). Это показывает, что гены и промоторы в локусах ЯМ невредимы, но находятся в стабильно репрессированном состоянии до тех пор, пока остаются в этих локусах. Это — существенное для поддержания способности к скрещиванию обстоятельство, поскольку одновременная экспрессия в одной и той же клетке транскриптов обоих типов (а и α) приводит к возникновению не способного к скрещиванию стерильного состояния. Регистрация стерильного фенотипа оказалась весьма полезной для идентификации мутаций, нарушающих сайленсинг локусов НМ. Белки-регуляторы сайленсинга (silent information regulatory proteins — SIRs) SIR1, SIR2, SIR3 и SIR4 были обнаружены именно как необходимые для полной репрессии «молчащих» локусов НМ (см. обзор Rusche et al., 2003). Мутации sir2, sir3, и sir4 приводят к полной утрате сайленсинга, в то время как при мутациях sirl лишь часть клеток МАТа утрачивает способность к спариванию из-за нарушения репрессии локуса НМ. Благодаря частичному фенотипу sirl-дефектных клеток удалось показать, что альтернативные состояния (спаривающееся-неспаривающееся) могут наследоваться в последовательных поколениях делящихся генетически идентичных клеток (Pillus and Rine 1989). Это послужило ясной демонстрацией того, что репрессия типов спаривания обладает характерными чертами эпигенетически контролируемого процесса. Кроме того, в других исследованиях было показано, что в образовании структуры гетерохроматина участвуют N-концевые участки молекул гистонов H3 и Н4, белок-активатор репрессора 1 (repressor activator protein 1 - Rap1) и комплекс узнавания ориджинов репликации (origin recognition complex — ORC) (см. обзор Rusche et al., 2003).

Рис. 4.3. Переключение типов спаривания у дрожжей

(а) Гомоталлические штаммы дрожжей способны переключать тип спаривания с каждым клеточным циклом. Переключение происходит до репликации ДНК, поэтому и материнская, и дочерняя клетки приобретают новый тип спаривания.

(б) Показано положение «молчащего» и экспрессирующегося локусов типа спаривания на III хромосоме. Активный локус МАТ может переключаться посредством конверсии генов примерно один раз на каждый клеточный цикл, благодаря двунитчатым разрывам ДНК эндонуклеазой НО. Указанные проценты показывают частоту, с которой события конверсии переключают локусы МАТ между противоположными типами. Направленность переключения обеспечивается энхансером рекомбинации (RE) на левом плече III хромосомы.

(в) Репрессия «молчащих» локусов типов спаривания HMR и HML происходит под действием двух сайленсеров, фланкирующих эти гены. Они называются Е (от essential) и I (от important) (Brand et al., 1997) и содержат участки связывания белков Rap1 (R), Abf1 (А) и ORC (О). Комбинируя такие сайты связывания в разных комбинациях, можно создавать искусственные сайленсеры, хотя их эффективность ниже, чем у природных. НМL α и HMRa расположены на расстоянии 12 и 23 т.п.н. от теломеры III хромосомы, соответственно. Домены теломерного гетерохроматина III хромосомы репрессируются независимо от локусов НМ процессом, инициируемым множественными сайтами связывания Rap1 (R)

Гетерохроматин присутствует также непосредственно по соседству с повторами теломерной ДНК дрожжей (C1-3A/TG1-3). Как упоминалось выше, при интеграции репортерных генов, таких как Ura3 или Ade2, рядом с теломерными повторами происходит их репрессия по мозаичному и эпигенетическому типу (Gottschling et al. 1990) Этот эффект (ТРЕ), как и сайленсинг локусов НМ, зависит от Rap1, Sir2, Sir3, Sir4 и N-концевых участков молекул гистонов (Kayne et al., 1988; Aparicio et al., 1991). Генетические исследования свидетельствуют о том, что, за исключением Sir1, близкие механизмы обеспечивают сайленсинг в области локусов НМ и в примыкающих к теломерам участках. Более того, учитывая способность репортерных генов в субтеломерных участках достаточно часто переключаться между «молчащим» и экспрессирующимся состояниями, данный тип репрессии, по-видимому, весьма близок явлению мозаичности, обусловленной эффектом положения (PEV) у дрозофилы.

У дрожжей четыре белка Sir, осуществляющих репрессию, не имеют существенной взаимной гомологии. Белки Sir1, Sir3 и Sir4 консервативны только у самих S. cerevisiae и близких им видах почкующихся дрожжей. Sir2, напротив, является родоначальником большого семейства НАД-зависимых деацетилаз гистонов, консервативного от бактерий до человека (рис. 4.4). Роль 8п2-подобных деацетилаз гистонов в репрессии транскрипции обнаружена даже у организмов, не имеющих других Sir белков, таких как делящиеся дрожжи и двукрылые. У дрожжей Schizosaccharomyces pombe активность Sir2 необходима для сайленсинга транскрипции вблизи теломер, а у дрозофилы она влияет на стабильность эффекта PEV (см. обзор Chopra and Mishra, 2005). Сопряженный с деацегилированием гидролиз НАД белком Sir2 приводит к образованию О-ацетил-АДФ-рибозы, интермедиата, возможно имеющего свою собственную функцию (Tanner et al. 2000; также см. раздел 13). Важно отметить, что помимо гистонов ферменты семейства Sir2 модифицируют множество других субстратов, причем имеется обширная ветвь этого семейства, состоящая из цитоплазматических ферментов (рис. 4.4). Разнообразие функций Sir2 можно проиллюстрировать тем, что у млекопитающих ферменты этого семейства деацетилируют факторы транскрипции FOXO и р53 в ответ на стресс и повреждение ДНК, изменяя тем самым их взаимодействие. У почкующихся дрожжей Sir2 имеет важную роль помимо участия в сайленсинге, а именно подавляет нереципрокную рекомбинацию высокоповторяющихся генов рДНК локуса в области ядрышка (Gottlieb and Esposito 1989).

 

4. Гетерохроматин отличается репрессивной структурой, которая распространяется на весь «молчащий» домен

Репрессия активности генов в эухроматине может происходить вследствие связывания репрессорного белка или комплекса, узнающего определенную последовательность в промоторе гена и препятствующего движению или посадке аппарата транскрипции. Репрессия в области гетерохроматина достигается другим способом, который не является промотор-специфичным. Она начинается с определенных участков, от которых распространяется непрерывно по всему домену, репрессируя все промоторы, находящиеся в соответствующей области (рис. 4.5) (Renauld et al., 1993). Наиболее четко это было показано с помощью метода иммуно-преципитации хроматина: оказалось, что белки Sir2, Sir3 и Sir4 физически связаны с хроматином по всему «молчащему» субтеломерному домену (Hecht et al., 1996; Strahl-Bolsinger et al., 1997). Доказательства, что такая связь приводит к формированию менее доступной репрессивной структуры были получены в других экспериментах. Например, ДНК «молчащих» доменов хроматина плохо метилировалась экспрессируемой в дрожжевых клетках бактериальной метилазой dam, тогда как последовательности ДНК вне этих доменов метилировались вполне эффективно. По-видимому, гетерохроматин затрудняет доступ к ДНК таким молекулам как dfom-метилтрансфераза (Gottschling. 1992). Аналогично, 3-т.п.н. локус HMR избирательно устойчив к действию определенных рестрикционных эндонуклеаз в изолированных ядрах (Loo and Rine, 1994), а нуклеосомы между двух сайленсер-элементов в «молчащих» локусах НМ расположены близко друг к другу, образуя нуклеазо-резистентный домен, отсутствующий в активных локусах (Weiss and Simpson, 1998). Итак, гетерохроматин у дрожжей имеет особую структурную организацию.

Рис. 4.4. Семейство деацетилаз Sir2

Sir2 является прототипом большого семейства НАД-зависимых деацетилаз. Семейство белков Sir2 необычно консервативно и найдено у организмов от бактерий до человека. Его эволюционное древо содержит как ядерные, так и цитоплазматические ветви. Это филогенетическое древо без корня было построено с помощью программ CLUSTAL W® и TREEVIEW® для сравнения последовательности коровых доменов гомологов, идентифицированных в библиотеках кДНК и уникальных генов. Шесть подклассов и несвязанная группа описаны в работе Фрая (Frye 2000). Гомологи млекопитающих обозначены как SirT1-7 жирным шрифтом, а белки почкующихся дрожжей подчеркнуты Остальные обозначены названием вида (модифицировано с разрешения из Frye 2000 [©Elsevier])

Рис. 4.5. Модель гетерохроматина дрожжей в теломерах и локусах НМ

Для распространения SIR-комплексов механизмы сайленсинга и теломер, и НМ- локусов используют Rap1, Sir2, Sir3 и Sir4, но они различаются тем, что теломерный зависит также от yKu, в то время как НМ- сайленсеры используют факторы ORC, Abf1 и Sir1. Предполагается, что теломерный гетерохроматин образует обратную петлю сам на себя. В результате получается структура, защищающая теломеру от деградации. Ее конденсация и сворачивание приводят к сайленсингу генов. В случае HM -гетерохроматина репрессированный домен между сайленсерными элементами состоит из тесно расположенных нуклеосом, образующих конденсированную структуру И теломерные, и НМ «молчащие» области недоступны аппарату транскрипции и деградирующим ферментам

Не столь ясен вопрос о степени гиперконденсации гетерохроматина у дрожжей и многоклеточных организмов, и обусловленного ею затруднения доступа факторов транскрипции к ДНК. Репрессивный комплекс, образующийся при взаимодействии белков Sir с гистонами, оказался неожиданно динамичным: эти белки могут включаться в хроматин «молчащего» локуса НМ даже при остановке клеток в фазе клеточного цикла, в которой образования гетерохроматина обычно не происходит (Cheng and Gartenberg, 2000). Возможно, именно этим обстоятельством объясняется способность Sir-содержащего хроматина связываться с определенными факторами транскрипции даже в репрессированном состоянии (Sekinger and Gross, 1999). Тем не менее, хотя эти исследования и свидетельствуют о том, что гетерохроматин не является механическим препятствием для связывания с ДНК всех негистоновых белков, в нем не обнаруживается транскрипционной активности и связанных РНК-полимераз. Судя по результатам экспериментов Чена и Видома (Chen and Widom, 2005), специфически подавляемым гетерохроматином процессом является связывание с промотором комплексов РНК-полимеразы II и транскрипционных факторов TFIIB и TFIIE. Итак, хотя «молчащий» хроматин дрожжей является динамичным образованием, допускающим обмен белков SIR и, возможно, некоторых факторов транскрипции, он избирательно препятствует связыванию основного аппарата транскрипции и тем самым блокирует синтез мРНК (более детально см. главу 10).

 

5. Отдельные этапы сборки гетерохроматина

 

Формирование гетерохроматина у всех видов включает несколько молекулярных этапов, некоторые из которых были найдены и у почкующихся дрожжей. Один из наиболее изученных из них — сайт-специфическая нуклеация гетерохроматина, требующая участия сайт-специфических ДНК-связывающих факторов. Затем гетерохроматин распространяется из сайтов инициации. Распространение ограничивается специальными пограничными механизмами, которые у дрожжей хорошо изучены. Наконец, дрожжи успешно использовали для демонстрации роли субъядерных компартментов в опосредованной гетерохроматином репрессии. Формирование гетерохроматина в области теломер несколько отличается от его формирования в локусах НМ, но в обоих случаях действует общий принцип, что специфические ДНК-связывающие факторы инициируют распространение репрессоров общего назначения. В деталях эти механизмы описаны ниже (рис. 4.6).

Рис. 4.6. Этапы сборки теломерного гетерохроматина

ЭТАП 1. Рекрутирование Sir4, затем Sir2 и Sir3 связанным с теломерами Rap1. Нателомерах Rap1 и yKuрекрутируют Sir4даже в отсутствии Sir2 и Sir3. Только Sir4 может быть рекрутирован в отсутствии остальных Sir-белков, причем его связыванию препятствуют Rifl и Rif2 (Mishra and Shore 1999).

ЭТАП 2. Опосредованное Sir2 деацетилирование гистона H4K16. Sir4-Sir2 и Sir4-Sir3 активно взаимодействуют, образуя Sir-комплексы по длине TG-повторов. НАД-зависимая гистон-деацетилазная активность Sir2 стимулируется образующимися комплексами и деанетилирует К16 остаток гистона Н4 в близлежащих нуклеосомах.

ЭТАП 3. Распространение SIR-комплекса по нуклеосомам. SIR-комплексы распространяются по нуклеосомам, возможно, с использованием О-ацетил-АДФ-рибозных интермедиатов, образующихся в результате НАД-гидролиза (Liou et al. 2005). Sir3 и Sir4 связываются с деацетилированными хвостами гистона Н4. Хотя деацетилированный N-концевой хвост гистона H3 также связывает белки Sir3 и Sir4, он не показан.

ЭТАП 4. Свертывание « молчащей» теломеры в структуру более высокого уровня. «Молчащий» хроматин «созревает» в конце М-фазы с образованием недоступной структуры. Этот процесс может включать более высокие уровни свертывания и связывание с ядерной оболочкой.

 

5.1.

НМ

гетерохроматин

«Молчащие» локусы типов спаривания HML и HMR ограничены по бокам короткими последовательностями ДНК — сайленсерами, обозначаемыми как Е (essential — существенный) и I (important — важный; рис. 4.36, в).

Сайленсеры содержат участки связывания, как минимум, двух полифункциональных ядерных факторов, а именно Rap1 и Abf1, а также ориджин-узнающего комплекса (origin recognition complex — ORC) (Brand et al., 1987). Хотя делепия HMR-E, содержащего все три участка узнавания, гораздо сильнее влияет на сайленсинг, чем делеция HMR-1, содержащего лишь два из них, каждый из сайленсеров в локусах HMR и HML может служить специфическим сайтом нуклеации для связывания репрессирующего Sir-комплекса и последующего распространения белков Sir на лежащие между сайленсерами нуклеосомы. Показано, что между молекулами Rap1, ассоциированными с разными участками связывания in vitro, существуют непосредственные физические контакты. Это свидетельствует о том, что факторы, ассоциированные с сайленсерами Е и I, могут взаимодействовать друг с другом путем «выпетливания» лежащего между ними репрессированного домена. Такая модель легко объясняет наличие кооперативного эффекта этих сайленсеров на инициацию репрессии (Hofmann et al., 1989).

Избыточность функции сайленсерных элементов является характерной чертой гетерохроматиновой репрессии и наблюдается также внутри самих сайленсеров. Факторы транскрипции общего назначения Rap1 и Abf1, а также ориджин-узнающий комплекс ORC, обеспечивающий посадку пререпликативного комплекса на ориджины репликации, функционально дублируют друг друга. Как показали эксперименты с делециями, сайтов связывания любых двух из этих факторов достаточно для сайленсинга (Brand et al., 1987), хотя сколько-нибудь существенного структурного сходства между Rap1, Abf1 и ORC не обнаружено. Их функциональная избыточность объясняется рекрутируемыми (вовлекаемыми) ими белками. Например, Rap1 рекрутирует белок Sir4 в области сайленсеров НМ и теломер, Abf1 взаимодействует с Sir3, а ORC имеет высокое сродство к Sir1, специфическому для репрессии локусов НМ фактору SIR (см. обзор Rusche et al., 2003). Сам Sir1 непосредственно взаимодействует с N-концом Sir4, образуя мостик между ORC и комплексом SIR2-3-4. Таким образом, разные связывающиеся с сайленсерами факторы приводят к рекрутированию Sir4, а затем и комплекса SIR2-3-4, необходимого для репрессии во всех случаях. Видимая избыточность между Rap1, Abf1 и ORC (в сайленсерах), а также гетеродимера Ки (в области теломер, см. ниже), может быть связана с их способностью инициировать репрессию с помощью прямых контактов с разными компонентами комплекса SIR.

Следует заметить, что Sir1 участвует скорее в формировании гетерохроматиновой репрессии, чем ее поддержании. После установки репрессированного состояния участия Sir1 уже не требуется (Pillus and Rine, 1989). Его важная роль в установке репрессии была показана путем пришивки к нему ДНК-связывающего домена Gal4. При замещении сайленсера HMR-Е сайтами связывания Gal4 такой химерный GBD-Sir1 белок эффективно инициирует репрессию в отсутствии самого сайленсера и узнающего его фактора (Chien et al., 1993). Однако такая репрессия все равно требует участия остальных белков Sir и сохранности гистоновых хвостов. Следовательно одной из основных функций сайленсер-связывающих факторов является рекрутирование белка Sir1, который, в свою очередь, инициирует репрессию, рекрутируя другие Sir-белки во взаимодействия с близлежащими нуклеосомами. Это подтверждается и данными о том, что, в отличие от других Sir-белков, Sir1 не распространяется с комплексом SIR за пределы сайленсеров (рис. 4.5) (Rusche et al., 2002).

 

5.2. Теломерный гетерохроматин

В области теломер РНК-содержащий фермент теломераза поддерживает простую, но не регулярную TG-богатую повторяющуюся последовательность длиной в 300-350 н.п. Она содержит 16—20 сайтов связывания белка Rap1. Этот набор Rap1-связывающих сайтов образует ненуклеосомный «колпачек» на конце хромосомы и играет критическую роль в поддержании длины теломеры (Marcand et al., 1997). По длине теломерных повторов Rap1 связывается центральным ДНК-связывающим доменом со своими сайтами узнавания и С-концевым доменом с Sir4. Последнее происходит даже в отсутствие других SIR-белков и N-концов гистона Н4. Поскольку дефекты Sir4 нарушают связывание других белков с теломерным хроматином (Luo et al.. 2002), он, по-видимому, служит главным звеном между этапами нуклеации и следующим за ней формированием репрессированной структуры хроматина (рис. 4.6).

Связывающийся с концевыми участками ДНК комплекс yKu70/yKu80 помогает белку Rap1 рекрутировать Sir4 на концы хромосом. И действительно, утрата yKu резко уменьшает степень теломерной репрессии, а химерный белок GBD-yKu эффективно инициирует репрессию репортерных генов с поврежденными сайленсерными элементами. Необходимость yKu можно преодолеть элиминацией Rap1-связывающего фактора Rifl, конкурирующего с С-концевым доменом Rap1 за связывание с Sir4 (рис. 6) (Mishra and Shore, 1999). О кооперативных эффектах yKu и Rap1 в нуклеации гетерохроматина свидетельствует наблюдение, что 600-п.н. повторяющейся последовательности ДНК теломеры, содержащей более 30 сайтов связывания Rap1, недостаточно для нуклеации репрессии во внутренних локусах хромосом, хотя инсерпии 900-п.н. последователности, содержащей около 45 сайтов связывания Rap1, может быть достаточно (Stavenhagen and Zakian, 1994). Следует заметить, что в промоторах по всему геному дрожжей Rap1 служит транскрипционным фактором общего назначения. участвующим в активации многих генов, например, кодирующих белки рибосом. Почему в этих промоторах Rap1 рекрутирует факторы активации, а не нуклеации гетерохроматина, пока неизвестно.

 

6. Деацетилирование гистонов белком Sir2 обеспечивает сайты связывания для распространения SIR-комплексов

Молекулярные взаимодействия белков SIR хорошо изучены. Белок Sir4 играет роль ключевого «скелетного» фактора для их сборки. Sir4 и Sir2 активно взаимодействуют in vitro. Sir4 также независимо взаимодействует с Sir3, в то время как Sir3 и Sir2 взаимодействуют слабо (Moazed et al., 1997; Strahl-Bolsinger et al., 1997; Hoppe et al., 2002). Sir3 и Sir4 образуют также и гомодимеры (Moretti et al., 1994). При коэкспрессии в клетках насекомых Sir2, Sir3 и Sir4 образуют стабильный 360-kD комплекс, содержащий эти SIR-белки в стехиометрическом соотношении 1: 1: 1 (Cubizolles et al.. 2006). С моделью функционального гетеротримерного комплекса SIR2-3-4 согласуются и результаты исследования распределения этих трех белков в гетерохроматиновых доменах с помощью метода иммунопреципитации хроматина. Оказалось, что их содержание в разных участках гетерохроматиновых доменов одинаково (Hecht et al., 1996; Strahl-Bolsinger et al., 1997). Тем не менее, вполне очевидно, что белок Sir3 играет особую роль в распределении гетерохроматина. При суперэкспрессии Sir3 наблюдается расширение «молчащего» домена, совпадающее с распространением самого Sir3 за свою обычную границу в положении ~3 т.п.н. до -15 т.п.н. (Renauld et al., 1993; Hecht etal., 1996). Несбалансированная экспрессия одиночных Sir2 и Sir4 или даже их субдоменов имеет прямо противоположный эффект в виде нарушения ТРЕ, хотя скоординированная эктопическая экспрессия Sir3 и Sir4 противодействует дисбалансу и восстанавливает сайленсинг (Maillet et al., 1996). Все это иллюстрирует важное значение дозы белков комплекса SIR для его репрессорной функции, аналогично ситуации с комплексами Polycomb у дрозофилы. Уникальная способность Sir3 распространяться вдоль доменов хроматина при суперэкспрессии коррелирует с наблюдением, что in vitro он образует стабильные мультимеры (Liou et al., 2005).

Основа, по которой распространяется SIR-комплекс, представляет собой нуклеосомы с деацетилированными по N-концевым участкам гистонами H3 и Н4 (Braun-stein et al., 1996; Suka et al., 2001). Механизм распространения можно объяснить способом взаимодействия SIR-белков с гистонами (рис. 4.7). Белки Sir3 и Sir4 связываются с деацетилированными N-концами гистонов H3 и Н4 in vitro и in vivo (Hecht et al., 1995, 1996), причем участия хвостов H2A и Н2В для этого взаимодействия не требуется. Наиболее важная в этом отношении область гистонов — 16—29-й аминокислотные остатки гистона Н4, среди которых 16-й остаток лизина, в частности, должен быть деацетилирован (положительно заряжен) для связывания Sir3 (Johnson et al., 1990,1992). В отличие от мутаций по другим сайтам ацетилирования, даже консервативные мутации по остатку H4K16 полностью нарушают теломерный сайленсинг. Хвосты гистонов H3/Н4, и особенно область 16—24-го остатков Н4, способствуют компактизации нуклеосомных цепей in vitro, а деацетилирование H4K16 в этом случае, вероятно, регулирует наднуклеосомные уровни сворачивания нуклеосомной цепи. Как же регулируется само деацетилирование H4K16 in vivo?

Рис. 4. 7. Пограничные функции гетерохроматина у почкующихся дрожжей

Распространение гетерохроматина посредством деацетилирования белком Sir2 гистона Н4 по остатку К16 ограничивается конкурирующей активностью гистоновой ацетил-трансферазы Sas2, ацетилирующей H4K16 в прилегающем эухроматине, тем самым предотвращая связывание Sir3. Метилирование H3K79 в прилегающем эухроматине также влияет на распространение гетерохроматина. Пограничные функции могут иметь и такие факторы как Reb1, Tbf1 и белки млекопитающих и вирусов Ctf 1 и VP 16, прикрепление к ядерным порам и присутствие генов тРНК. Вполне возможно, что некоторые из них действуют, рекрутируя гистоновые ацетилтрансферазы

 

7. Sir2 деацетилирует гистон Н4 по 16-му остатку лизина

Sir2 является НАД-зависимой деацетилазой гистонов, активность которой возрастает при ассоциации с Sir4. Активность Sir2 сопрягает деацетилирование с превращением НАД в О-ацетил-АДФ-рибозу с использованием АДФ-рибозил-трансферазной активности (Tanneret al., 2000). Учитывая, что положительно заряженный остаток H4K16 играет ключевую роль в формировании гетерохроматина, удивительно, что Sir2 может деацетилировать его in vitro и in vivo, хотя он также деацетилирует другие остатки лизина в N-концевом участке Н4 и остатки К9 и К14 гистона H3 (Imai et al., 2000; Suka et al., 2002; Cubizolles et al., 2006). Все эти сайты-мишени расположены в доменах гистонов H3 и Н4, необходимых для сайленсинга. Интересно, что О-ацетил-АДФ-рибоза сама по себе способствует не только мультимеризации Sir3, но также и взаимодействию Sir3 и Sir4-Sir2 in vitro (Liou et al., 2005). В совокупности эти данные показывают, что деацетилирование гистонов белком Sir2 способствует формированию и мультимеризации Sir-комплекса, а также подготавливает деацетил ированные сайты на соседних нуклеосомах к связыванию с SIR-белками.

Различные этапы инициации и распространения гетерохроматина в теломерных областях и локусах НМ показаны на рис. 4.6. В теломерах Rap1 и yKu рекрутируют Sir4, a Sir4 рекрутирует Sir2 для деацетилирования N-концевых доменов гистонов Н4 и H3. Sir4 также рекрутирует Sir3. Деацетилирование гистоновых хвостов приводит к образованию сайтов связывания Sir3/Sir4 и запускает процесс нуклеации комплексом SIR2-3-4. Взаимодействие Sir3 и Sir4 друг с другом и N-концами гистонов, как считается, стабилизируют SIR-комплексы на нуклеосомной фибрилле, что позволяет им распространяться по гистоновым хвостам. Наконец, репрессированное состояние может стабилизироваться свертыванием хромосомной фибриллы (обсуждается ниже). Большинство этих процессов очень сходным образом протекает в области локусов ЯМ, хотя исходное рекрутирование Sir4 опосредовано Rap1, Abf1, ORC и Sir1. Что же останавливает процесс распространения?

 

8. Ацетилирование гистонов в эухроматине ограничивает распространение SIR-комплексов

Поскольку деацетилирование гистона Н4 по 16-му остатку лизина белком Sir2 критично для формирования гетерохроматина, не удивительно, что модификация этого сайта также играет ключевую роль в ограничении распространения гетерохроматина. Интересно, что из всех сайтов ацетилирования гистонов в моноацетилированных молекулах гистона Н4 в эухроматине модифицирован только H4K16 (Clarke et al., 1993). Одним из ферментов, участвующих в ацетилировании H4K16 в субтеломерных областях, у дрожжей является Sas2, член консервативного класса MYST гистоновых ацетилтрансфераз (HATs — his-tone acetyltransferases). При делениях Sas2, предотвращающих ацетилирование H4K16, и при мутациях H4K16 в аргинин, имитирующих деацетилированное состояние, SIR-комплекс распространяется на нижних уровнях в правой теломере VI хромосомы примерно в пять раз дальше, чем в клетках дикого типа. Это показывает, что распространение субтеломерного гетерохроматина контролируется, как минимум отчасти, противоположными активностями Sir2 и Sas2 в отношении H4K16 (рис. 4.7) (Kimura et al., 2002; Suka et al., 2002).

В области локусов НМ ограничение распространения «молчащего» хроматина, возможно, еще более важно, чем в теломерных участках, поскольку по ходу соответствующего плеча III хромосомы расположены существенные для роста гены, а сайленсеры имеют бидирекциональную активность, то есть репрессируют соседние последовательности ДНК с обеих сторон. Одной из границ, предотвращающих дальнейшее распространение сайленсинга, в направлении теломеры от локуса HMR служит ген тРНК (Donze and Kamakaka, 2001). Его пограничная функция зависит от HAT активности и связана с его транскрипционным потенциалом. Существенно, что одной из таких HAT является Sas2, хотя и ацетилтрансфераза гистона H3, Gcn5 также способствует пограничной функции генов тРНК. Это позволяет предположить, что активаторы транскрипции в целом могут ограничивать распространение SIR-комплексов, рекрутируя гистоновые ацетилтрансферазы. И действительно, пограничные активности были обнаружены у факторов транскрипции Reb1 и Tbf1, фактора млекопитающих CTCF, а также кислого транс-активирующего домена вирусного фактора VP16 (Fourel et al., 1999, 2001). Каждый из них способствует гипер-ацетилированию гистонов и тем самым препятствует распространению SIR-комплексов, ослабляя их связь с нуклеосомами (рис. 4.7).

Наконец, было показано, что ограничению распространения «молчащих» доменов хроматина, помимо вышеописанного механизма, способствуют присутствие в эухроматине гистона H2A.Z и ассоциированного с РНК-полимеразой фактора Bdfl (Meneghini et al., 2003), метилирование гистона H3 по 79-му остатку лизина (van Leeuwen et al., 2002) и присоединение ДНК к ядерным порам (Ishii et al., 2002). И хотя механизмы действия этих факторов неизвестны, интересно отметить, что некоторые активные гены ассоциированы с ядерными порами (Ishii et al., 2002; Brickner and Walter, 2004). Итак, обшей чертой пограничных факторов у дрожжей может быть сильная стимулирующая транскрипцию или ремоделирующая нуклеосомы активность, которая прямо или опосредовано нарушает взаимодействие гистонов с белками гетерохроматина

 

9. Образование теломерных петель

Существует ряд данных, свидетельствующих о возможности образования петель по концам хромосом, в результате которого теломеры могут преодолевать пограничные элементы и стабилизировать репрессивную структуру хроматина в субтеломерных генах (рис. 4.5,4.6). Например, несмотря на то, что сайты связывания Rap1 присутствуют только в пределах первых 300 н.п. повторяющихся TG-богатых последовательностей ДНК на концах теломер, с помощью иммунопреципитации хроматина обнаружено присутствие Rap1 в нуклеосомах на расстоянии до ~3 т.п.н. от TG-повторов (Strahl-Bolsinger et al., 1997). Аналогично, yKu обнаружен на расстоянии ~3 т.п.н. от нормальных сайтов своего связывания на конце хромосомы (Martin et al., 1999). Более того, при нарушении сайленсинга мутациями генов SIR происходит потеря Rap1 и yKu во внутренних последовательностях при их полной сохранности в области концевых TG-повторов (Martin et al., 1999). Для объяснения распространения содержащего белки Rap1 и yKu гетерохроматина на расстояние около 3 т.п.н. даже в препаратах хроматина фрагментированного на куски <500 н.п. была предложена модель петлеобразования по концам хромосомы, в которой связанные с TG-повторами молекулы Rap1 и yKu взаимодействуют с SIR-белками более внутренних областей in trans (рис. 4.5, 4.6). Такая структура, возможно, участвует в реализации «кэпирующей» функции связанных с теломерой белков.

Результаты в пользу модели петлеобразования теломер были получены в работе де Брюна и соавторов (de Bruin et al., 2001), которые использовали неспособность таких активаторов транскрипции как Gal4 осуществлять свою функцию, когда они находятся ниже активируемого гена. Были сконструированы штаммы, в которых верхняя активирующая последовательность (upstream activating sequence — UAS) Gal4 помещалась ниже гена-репортера, и вся рекомбинантная конструкция вставлялась во внутренние локусы хромосом или вблизи теломеры. Оказалось, что во внутренних локусах эта конструкция не способна к галактозо-индуцибельной транскрипции, а в субтеломерных участках Gal4 UAS элемент может активировать промотор, расположенный в 1.9 т.п.н. выше, Sir3-зависимым механизмом. Вероятно, в присутствии Sir3 теломерный конец образует обратную петлю, позиционирующую Gal4 UAS в непосредственной близости от промотора активируемого гена (de Bruin et al., 2001).

 

10. Нарушение непрерывности репрессии естественных субтеломерных элементов теломерными петлями

Выше мы нарисовали упрощенную картину образования непрерывных участков «молчащего» хроматина, начинающихся с теломерных сайтов связывания белка Rap1. В действительности в природных теломерах все происходит более сложным образом в значительной степени из-за наличия пограничных элементов в области субтеломерных повторяющихся последовательностей. В большинстве экспериментов по включению в эту область репортерных конструкций для изучения теломерной репрессии субтеломерные повторяющиеся элементы X и Y’ удаляют. В результате репортерный ген оказывается непосредственно по соседству с TG-повторами. С другой стороны, все природные теломеры содержат субтеломерный повторяющийся элемент X, расположенный между TG-повторами и самым близким к теломере геном. Около 50—70% природных теломер содержат также не менее одной копии более длинного субтеломерного элемента У’ (рис. 4.8). И X, и У’ элементы содержат сайты связывания регуляторов транскрипции Tbf1 и Reb1, ограничивающие распространение «молчащего» хроматина (Fourel et al., 1999). Однако, X элементы содержат также каноническую последовательность ORC и сайты связывания Abf1, действующие противоположным образом. Они реинициируют или усиливают репрессию репортерных генов, находящихся с внутренней от них стороны. В результате сайленсинг в природных теломерах приобретает прерывистый характер, что отличает его от модели непрерывного распространения, изображенной на рис. 4.6. Для объяснения такого несовпадения Прайд и Луис (Pryde and Louis, 1999) также предложили модель петлеобразования в области теломеры, в которой область не репрессированного хроматина оказывается между двумя репрессированными доменами. Тем самым прерывистый характер «молчащих» доменов объяснялся без отказа от представлений о нуклеации и распространения гетерохроматина от TG-повторов.

 

11. Взаимодействие теломер

in trans

и перинуклеарное прикрепление гетерохроматина

Одной из наиболее консервативных черт гетерохроматина является его локализация в дискретных ядерных субкомпартментах. Это верно и для почкующихся дрожжей, у которых теломеры во время интерфазы образуют кластеры и остаются тесно ассоциированными с ядерной периферией. Такие кластеры были впервые обнаружены методом иммунно-окрашивания как фокусы локализации белков Rap1 и SIR на фоне их диффузного распределения по всему ядру (рис. 4.9). Подавление сайленсинга мутациями по остатку H4K16 или нарушениями в активности белков Rap1 и yKu сопровождается диспергированием белков SIR из этих кластеров (Hecht et al., 1995; Laroche et al., 1998). Позже было показано, что с ядерной оболочкой связаны не только теломеры, но и локусы HML и HMR Эта связь осуществляется несколькими дублирующими друг друга механизмами, зависящими либо от ассоциированного с тедомерой фактора yKu, либо от формирования «молчащего» хроматина как такового (Hediger et al., 2002). В «молчащем» хроматине функция прикрепления к ядерной оболочке приписывается субдомену белка Sir4, который связывается с белком ядерной оболочки Esc1 (enhances silent chromatin 1; Taddei et al., 2004). Взаимодействия Sir4-Esc1 прикрепляют SIR-репрессированные домены хроматина к участкам ядерной оболочки, отличным от ядерных пор. Даже в отсутствии прикрепления с помощью yKu-механизма ассоциация теломер с ядерной мембраной может поддерживаться посредством комплекса Sir4-Esc1 до тех пор, пока сохраняется сама репрессия. Более того, участки репрессированного хроматина, отделившиеся от теломер в результате рекомбинации, сохраняют SIR-зависимую ассоциацию с ядерной оболочкой (Gartenberg et al., 2004).

Рис. 4.8. Организация природных теломер и характер их сайленсинга

Показаны субтеломерные элементы и содержащиеся в них сайты связывания белков. Теломеры деляться на два основных класса: с Х-содержащими и Х+Y’-содержащими концами. Элементы STAR и STR подавляют распространение репрессии и оставляют область сниженной репрессии внутри Y’- и Х-элементов. Этого не наблюдается в искусственно укороченных теломерах, в которых присутствует градиент репрессии, распространяющийся на 3—4 т.п.н. от TG-повторов. Предполагается что природные теломеры образуют петли, аналогичные изображенным на рис. 4.6, в результате чего репрессированные области контактируют друг с другом, а не репрессированные остаются между областями контакта, (адаптировано из работы Pryde and Louis, 1999)

Рис. 4.9. SIR-белки и Rap1 образуют кластеры по периферии ядра

На панели а, Rap1 (зеленый) указывает на семь кластеров, представляющих все 64 теломеры данной диплоидной клетки Они расположены либо по периферии ядра, либо по соседству с ядрышком (голубое, помечено антителами к Nop1). ДНК помечена красным красителем. На панели б теломерная ДНК ( красная ) идентифицирована с помощью флюоресцентной гибридизации in situ (FISH), а HML помечен зеленым красителем. Они имеют одинаковую локализацию примерно в 70% случаев и находятся рядом с ядерной оболочкой (синяя) (Heun et al. 2001). Панель в показывает фокальное распределение Sir4 (зеленый) рядом с ядерной оболочкой (помечена МаЬ414, красная). Такой характер распределения утрачивается в штамме с делецией yKu 70, что совпадает с утратой теломерного сайленсинга (Laroche et al. 1998)

Исходно прикрепление теломер к ядерной оболочке, вероятно, происходит посредством yKu-зависимого пути, поскольку он работает даже в отсутствии сайленсинга. Благодаря этому прикреплению и взаимодействию между теломерами in trans происходит формирование ядерного субкомпартмента, который в свою очередь связывает SIR-белки (рис. 4.10). Этот компартмент имеет ключевое значение для образования градиента сайленсинга в области теломер. Даже фланкированные сайленсерами конструкты локуса НМ более эффективно репрессируются, когда интегрируются вблизи теломер (Thompson et al., 1994; Maillet et al., 1996) или когда они искусственно прикрепляются к ядерной оболочке трансмембранным фактором (Andrulis et al., 1998). Существенно, что способность усиливать репрессию за счет близости к теломерам утрачивается, когда Sir3 и Sir4 перестают захватываться кластерами или суперэкспрессируются (Maillet et al., 1996; Marcand et al., 1996). Это показывает, что градиент концентрации SIR-белков является той самой характеристикой теломерных кластеров, которая важна для усиления репрессии. Наконец, предполагается, что захват репрессоров общего назначения, присутствующих в лимитирующих концентрациях, помогает клетке обеспечить эпигенетическое наследование молчащего состояния, как показано на рис. 4.10. Вкратце, предложенная модель предполагает, что сборке вновь реплицированной ДНК в гетерохроматиновую структуру способствует ее локализация в субкомпартменте, обогащенном факторами сайленсинга.

 

12. Наследование эпигенетических состояний

Универсальной характеристикой гетерохроматина является передача «молчащего» состояния по наследству. Это означает, что формирование гетерохроматина на дочерних цепях происходит вскоре после репликации. Пионерское исследование вопроса о наследовании состояний хроматина в клеточном цикле принадлежит Миллеру и Насмиту (Miller and Nasmyth, 1984), изучавшим возникновение и потерю сайленсинга на термочувствительных мутантах sir3. Изменение температуры с пермиссивной на непермиссивную приводил к немедленной утрате сайленсинга, что доказывает необходимость продукта гена Sir3 для поддержания репрессированного состояния. Однако в обратных экспериментах при переходе от непермиссивной температуре к пермиссивной немедленного восстановления репрессии не происходило: требовалось прохождение клеточного цикла. Авторы сделали вывод, что для установления наследуемого репрессированного состояния хроматина требуется некое событие в S-фазе клеточного цикла. Позднее было показано, что в действительности требуются события, происходящие в фазах S и G2/M (Lau et al., 2002).

Рис. 4.10. Спонтанное формирование субкомпартментов сайленсинга

Показана простая модель формирования субъядерных компартментов. (1) Сначала происходит рекрутирование Sir4 в центры нуклеации ДНК-связывающими белками, способными связывать Sir4. В их число входят Rap1, ORC, Abf1 и yKu. (2) Присутствие Sir4 в определенном локусе в свою очередь приводит к его перемещению на ядерную периферию посредством одного из двух Sir4-зависимых путей (yKu или Esc1). (3) Высокая локальная концентрация SIR у ядерной оболочки способствует сборке и распространению комплексов сайленсинга. (4) Способность «молчащих» локусов оставаться связанными с периферией повышает локальную концентрацию SIR-белков и усиливает сайленсинг других локусов в этой области. Важно, что связанный с теломерами yKu может независимо рекрутировать теломеры к ядерной оболочке также, как Sir4 рекурутирует сайленсерные последовательности

Вначале предполагалось, что для установления и наследования «молчащего» хроматина существенно использование ориджинов репликации из связанных с сайленсерами ARS элементов. Однако, на ориджинах локуса HML инициации репликации не наблюдалось, поэтому это объяснение сочли маловероятным. И действительно, в экспериментах по замене ORC химерным белкос GDB-Sir1 было окончательно доказано, что срабатывание ориджинов репликации не имеет существенного значения для наследования «молчащего» хроматина. С другой стороны, исследования в нескольких направлениях показывали, что прохождение через S-фазу необходимо для формирования гетерохроматина. Это широко трактовалось как необходимость в репликации ДНК и связанной с нею пересборке нуклеосомной структуры. Однако недавние эксперименты показали, что установка репрессированного состояния может происходить и в отсутствие репликации ДНК (Kirchmaier and Rine, 2001; Li et al., 2001). Следовательно, искомыми факторами, необходимыми для формирования репрессированного хроматина, могут быть какие-то белки, специфически активируемые во время поздней S-фазы или играющие специфическую роль на границе S-G2 фаз. Таковыми могут быть вновь синтезируемые гистоны или модифицирующие их ферменты. Также среди них могут быть шапероны, такие как CAF1 (chromatin assembly factor 1), обеспечивающие критические этапы сборки гистонов.

Другие исследования показали, что устойчивый сайленсинг достигается не ранее телофазы, то есть существенно позже периода сборки нуклеосом в S-фазе. По-видимому, субъединица когезина Seel ингибирует стабильную репрессию до тех пор, пока не разрушается на границе метафазы и анафазы (Lau et al., 2002). Это согласуется с данными о том, что факторы транскрипции могут успешно нарушать или противодействовать установке «молчащего» хроматина в G2/М-фазе, но не после того, как клетки прошли М-фазу и вступили в G1-фазу (Aparicio and Gottschling, 1994). В совокупности эти данные показывают, что помимо какого-то критического компонента или события в S-фазе, необходим дополнительный этап, включающий прохождение митоза и прямо или опосредованно зависящий от утраты сцепления между сестринскими хроматидами.

 

13. Старение и Sir2 связаны нестабильностью повторов РДНК

У дрозофилы активные повторы рДНК расположены по соседству с центромерным гетерохроматином, а у многих высших эукариот ядрышки и конденсированный гетерохроматин расположены рядом друг с другом. Следовательно генетическая и физическая ассоциация белка Sir2 с активно транскрибирующимися повторами рДНК, не зависящая от других SIR-белков, у дрожжей имеет существенное функциональное значение (Gotta et al., 1997). И действительно, Sir2 подавляет рекомбинацию рДНК (Gottlieb and Esposito, 1989) и репрессирует транскрибируемые PH К-полимеразой II гены-репортеры, встроенные в область рДНК-повторов. Из-за своей тандемно повторенной организации рДНК склонна к процессам неэквивалентной рекомбинации, приводящим к изменению числа ее повторов. С такой нестабильностью связаны и процессы возникновения кольцевых внехромосомных молекул рДНК (рис. 4.11) (Sinclair and Guarente, 1997). Sir2 требуется и для репрессии репортерных генов, встроенных в рДНК, и для предотвращения аберрантной рекомбинации, ведущей к потере повторов рДНК. Вероятными механизмами его действия являются позиционирование нуклеосом (Fritze et al., 1997) и выравнивание сестринских хроматид относительно друг друга, предотвращающее события неравного обмена (Kobayashi et al., 2004).

Наиболее неожиданным фенотипическим эффектом нуль-мутаций Sir2 является уменьшение продолжительности жизни, которое у дрожжей не связано напрямую с нарушением теломерной репрессии и уменьшением длины области TG-повторов. Короткоживущий фенотип дефектных по Sir2 дрожжей проявляется в том, что они проходят в среднем менее 12 клеточных делений по сравнению с 20—25 у дрожжей дикого типа (Kaeberlein et al., 1999). В настоящее время твердо установлено, что образование и накопление внехромосомных кольцевых молекул рДНК (ERC) в результате неэквивалентной рекомбинации у дрожжей коррелирует со старением (рис. 4.11). Важно отметить не только то, что при потере Sir2 уменьшается продолжительность жизни дрожжей, но и что при суперэкспрессии Sir2, сопровождающейся увеличением количества его комплексов с рДНК, продолжительность жизни увеличивается. Другие мутации, уменьшающие эффективность вырезания рДНК, например элиминация барьерного белка репликативных вилок Fobl (Defossez et al., 1999), также увеличивают продолжительность жизни дрожжей, также как искусственная продукция ERC достаточна для индукции клеточного старения (Sinclair and Guarente, 1997). Итак, у дрожжей нестабильность рДНК явно коррелирует со старением, хотя ее роль в старении может быть и непрямой. Согласно одной из моделей высокое содержание ERC «вытитровывает» белки репарации и репликации ДНК из других участков генома и тем самым приводит к накоплению повреждений и/или уменьшению репликации генома.

Так как Sir2 является НАД-зависимой деацетилазой, а уровни НАД действуют как метаболический термостат, предположили, что влияние Sir2 на продолжительность жизни у дрожжей может быть связано с эффектами ограниченного питания, которое, как известно, замедляет старение у многих видов. Однако, хотя это предположение и подтверждается данными об увеличении активности Sir2 у дрожжей, дрозофилы и млекопитающих в условиях ограниченного питания, продолжительность жизни у дрожжей, выращиваемых в условиях пониженного уровня глюкозы (ограниченного питания), увеличивается механизмом, не зависящим и аддитивным по отношению к эффектам Sir2 (Kaeberlein et al., 2004). Следовательно, Sir2 и ограниченное питание повышают продолжительность жизни независимыми путями.

Рис. 4.11. Рекомбинация рДНК приводит к старению клеток у дрожжей

рДНК организована в массив из 140—200 прямых повторов 9.1-т.п.н. единицы {красный блок). Они кодируют 18S, 5.8S, 25S и 5S рРНК и содержат два Sir2-чувствительных элемента ниже гена 5S и внутри гена 18S. рДНК повторы имеют склонность вырезаться в стареющих клетках дрожжей и накапливаться в материнских клетках в виде кольцевых молекул (Kaeberlein et al., 1999). Это явление коррелирует с преждевременным старением. Sir2 препятствует ему, подавляя процессы неравной рекомбинации и вырезания

Накопление вырезанных колец рДНК не было обнаружено у каких-либо других видов. Однако для Caenorhabditis elegans и грызунов предполагалось, что уменьшение продолжителности жизни связано с другими видами нестабильности генома. Аналогично эффекту потери Sir2, приводящей к неравным обменам между сестринскими хроматидами, у дрожжей, возможно, что нарушения теломерного гетерохроматина у млекопитающих приводят к слиянию хромосом «конец-в-конец», тем самым нарушая способность клеток к делениям. И хотя пока неизвестно, влияет ли на эти механизмы белок Sir2 у млекопитающих, тем не менее роль геномной нестабильности как общего фактора старения весьма вероятна, как и специфическая роль нарушений в структуре гетерохроматина.

 

14. Резюме

С помощью генетических, биохимических и цитологических методов при исследовании почкующихся дрожжей были установлены фундаментальные принципы репрессии (сайленсинга) генов при формировании гетерохроматина. Они включают механизмы инициации, распространения и ограничения распространения гетерохроматина, баланс факторов гетерохроматина и их распределение на уровне субъядерного пространства, образование петель гетерохроматина и роль клеточного цикла в его формировании. Более того, разрабатываются системы реконструкции гетерохроматина дрожжей in vitro. Эти исследования in vivo и in vitro представляют надежную механистическую основу для нашего понимания принципов формирования гетерохроматина из хроматиновых фибрилл у всех эукариот.

 

Литература

Andrulis E.D., Neiman A.M., Zappulla D.C., and Stemglanz R. 1998 Perinuclear localization of chromatin facilitates transcriptional silencing. Nature 394: 592-595.

Aparicio O.M. and Gottschling D.E. 1994. Overcoming telomeric silencing: A trans-activator competes to establish gene expression in a cell cycle-dependent way. Genes Dev. 8: 1133-1146.

Aparicio O.M., Billington B.L., and Gottschling D.E. 1991. Modifiers of position effect are shared between telomeric and silent mating-type loci in S. cerevisiae. Cell 66: 1279-1287.

Boscheron C., Maillet L., Marcand S., Tsai-Pflugfelder M., Gasser S.M., and Gilson E. 1996. Cooperation at a distance between silencers and proto-silencers at the yeast HML locus. EMBO J. 15: 2184-2195.

Brand A.H., Micklem G., and Nasmyth K. 1987. Ayeast silencer contains sequences that can promote autonomous plasmid replication and transcriptional activation. Cell 51: 709-719.

Braunstein M., Sobel R.E., Allis CD., Turner B.M., and Broach J.R. 1996. Efficient transcriptional silencing in Saccharomyces cerevisiae requires a heterochromatin histone acetylation pattern. Mol. Cell. Biol. 16: 4349-4356.

Brickner J.H. and Walter P. 2004. Gene recruitment of the activated INOl locus to the nuclear membrane. PLoS Biol. 2: e342.

Chen L. and Widom J. 2005. Mechanism of transcriptional silencing in yeast. Cell 120: 37-48.

Cheng T.H. and Gartenberg M.R. 2000. Yeast heterochromatin is a dynamic structure that requires silencers continuously Genes Dev. 14: 452-463.

Chien C.T., Buck S., Stemglanz R., and Shore D. 1993. Targeting of SIR1 protein establishes transcriptional silencing at HM loci and telomeres in yeast. Cell 75: 531-541

Chopra V.S. and Mishra R.K. 2005. To SIR with Polycomb: Linking silencing mechanisms. Bioessays 27: 119-121.

Clarke D.J., O’Neill L.P., and Turner B.M. 1993. Selective use of H4 acetylation sites in the yeast S. cerevisiae. Biochem. J. 294: 557-561.

Cubizolles E, Martino E, Perrod S., and Gasser S.M. 2006. A homotrimer-heterotrimer switch in Sir2 stmcture differentiates rDNA and telomeric silencing. Mol. Cell 21: 825-836.

de Bruin D., Zaman Z., Liberatore R.A., and Ptashne M. 2001. Telomere looping permits gene activation by a downstream UAS in yeast. Nature 409: 109-113.

Defossez P.A., Pmsty R., Kaeberlein M., Lin S.J., Ferrigno P., Silver P.A., Keil R.L., and Guarente L. 1999. Elimination of replication block protein Fobl extends the life span of yeast mother cells. Mol. Cell 3: 447-455.

Donze D. and Kamakaka R.T. 2001. RNA polymerase III and RNA polymerase II promoter complexes are heterochromatin barriers in S. cerevisiae. EMBO J. 20: 520-531.

Fourel G., Revardel E., Koering C.E., and Gilson E. 1999. Cohabitation of insulators and silencing elements in yeast subtelomeric regions. EMBO J. 18: 2522-2537.

Fourel G., Boscheron C., Revardel E., Lebrun E., Hu Y.E, Simmen K.C, Muller K., Li R., Mermod N.. and Gilson E. 2001. An activation-independent role of transcription factors in insulator function. EMBO Rep. 2: 124-132.

Fritze C.E., Verschueren K., Stnch R., and Easton Esposito R. 1997. Direct evidence for SIR2 modulation of chromatin stmcture in yeast rDNA. EMBO J. 16: 6495-6509.

Frye R.A. 2000. Phylogenetic classification of prokaryotic and eukaryotic Sir2-like proteins. Biochem. Biophys. Res. Comm. 273: 793-798.

Gartenberg M.R., Neumann F.R., Laroche T., Baszczyk M., and Gasser S.M. 2004. Sir-mediated repression can occur independently of chromosomal and subnuclear contexts. Cell 119: 955-967.

Gotta M., Strahf-Bofsinger S., Renaufd H., Laroche T, Kennedy B.K., Gmnstein M., and Gasser S.M. 1997. Localization of Sir2p: The nucleolus as a compartment for silent information regulators. EMBO J. 16: 3243-5503.

Gottlieb S. and Esposito R.E. 1989. A new role for a yeast transcriptional silencer gene, SIR2, in regulation of recombination in ribosomal DNA. Cell 56: 771-776.

Gottschling D.E. 1992. Telomere-proximal DNA in Saccharomyces cerevisiae is refractory to methyltransferase activity in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 4062-4065.

Gottschling D.E., Aparicio O.M., Billington B.L., and Zakian V.A. 1990. Position effect at S. cerevisiae telomeres: Reversible repression of PolII transcription. Cell 63: 751-762.

Hecht A., Strahl-Bolsinger S., and Gmnstein M. 1996. Spreading of transcriptional repressor SIR3 from telomeric heterochromatin. Nature 383: 92-96.

Hecht A., Laroche T., Strahl-Bolsinger S., Gasser S.M., and Gmnstein M. 1995. Histone H3 and H4 N-termini interact with SIR3 and SIR4 proteins: A molecular model for the formation of heterochromatin in yeast. Cell 80: 583-592.

Hediger E, Neumann F.R., Van Houwe G., Dubrana K., and Gasser S.M. 2002. Live imaging of telomeres: yKu and Sir proteins define redundant telomere-anchoring pathways in yeast. Curr. Biol. 12: 2076-2089.

Heun P., Laroche T, Raghuraman M.K., and Gasser S.M. 2001. The positioning and dynamics of origins of replication in the budding yeast nucleus./. Cell Biol. 152: 385-400.

Hoppe G.J., Tanny J.C., Rudner A.D., Gerber S.A., Danaie S., Gygi S.P., and Moazed D. 2002. Steps in assembly of silent chromatin in yeast: Sir3-independent binding of a Sir2/Sir4 complex to silencers and role for Sir2-dependent deacetylation. Mol. Cell. Biol. 12: 4167-4180.

Imai S.I., Armstrong C, Kaeberlein M., and Guarente L. 2000. Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase. Nature 403: 795-800.

Ishii K., Arib G., Lin C, Van Houwe G., and Laemmli U.K. 2002. Chromatin boundaries in budding yeast: The nuclear pore connection. Cell 109: 551-562.

Johnson L.M., Fisher-Adams G., and Gmnstein M. 1992. Identification of a non-basic domain in the histone H4 N-terminus required for repression of the yeast silent mating loci. EMBO J. 11: 2201-2209.

Johnson L.M., Kayne P.S., Kahn E.S., and Gmnstein M. 1990. Genetic evidence for an interaction between SIR3 and histone H4 in the repression of the silent mating loci in S. cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6286-6290.

Kaeberlein M., McVey M., and Guarente L. 1999. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in S. cerevisiae by two different mechanisms. Genes Dev. 13: 2570-2580.

Kaeberlein M., Kirkland K.T., Fields S., and Kennedy B.K. 2004. Sir2-independent life span extension by calone restriction in yeast. PLoS Biol. 2: 296-307.

Kayne P.S., Kim U.J., Han M., Mullen J.R., Yoshizaki F., and Gmnstein M. 1988. Extremely conserved histone H4 N terminus is dispensable for growth but essential for repressing the silent mating loci in yeast. Cell 55: 27-39.

Kimura A., Umehara T., and Horikoshi M. 2002. Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing. Nat. Genet. 3: 370-377.

Kirchmaier A.L. and Rine J. 2001. DNA replication-independent silencing in S. cerevisiae. Science 291: 646-650.

Kobayashi X, Horiuchi T., Tongaonkar R, Vu L., and Nomura M. 2004. Sir2 regulates recombination between different rDNA repeats, but not recombination within individual rRNA genes in yeast. Cell 117: 441-453.

Laroche T., Martin S.G., Gotta M., Gorham H.C., Pryde RE., Louis E.J., and Gasser S.M. 1998. Mutation of yeast Ku genes disrupts the subnuclear organization of telomeres. Curr. Biol. 8: 653-656.

Lau A., Blitzblau H., and Bell S.P. 2002. Cell-cycle control of the establishment of mating-type silencing in S. cerevisiae. Genes Dev. 16: 2935-2945.

Li Y.C., Cheng T.H., and Gartenberg M.R. 2001. Establishment of transcriptional silencing in the absence of DNA replication. Science 291: 650-653.

Liou G.G., Tanny J.C., Kruger R.G., Walz T., and Moazed D. 2005. Assembly of the SIR complex and its regulation by O-acetyl-ADP-ribose, a product of NAD-dependent histone deacetylation. Cell 121: 515-527.

Loo S. and Rine J. 1994. Silencers and domains of generalized repression. Science 264: 1768-1771.

Luo K., Vega-Palas M.A., and Grunstein M. 2002. Rap1-Sir4 binding independent of other Sir, yKu, or histone interactions initiates the assembly of telomeric heterochromatin in yeast. Genes Dev. 12: 1528-1539.

Maillet L., Boscheron C, Gotta M., Marcand S., Gilson E., and Gasser S.M. 1996. Evidence for silencing compartments within the yeast nucleus: A role for telomere proximity and Sir protein concentration in silencer-mediated repression. Genes Dev. 10: 1796-1811.

Marcand S., Gilson E., and Shore D. 1997. A protein-counting mechanism for telomere length regulation in yeast. Science 275: 986-990.

Marcand S., Buck S.W., Moretti P., Gilson E., and Shore D. 1996. Silencing of genes at nontelomeric sites in yeast is controlled by sequestration of silencing factors at telomeres by Rap1 protein. Genes Dev. 10: 1297-1309.

Martin S.G., Laroche T., Suka N, Grunstein M., and Gasser S.M. 1999. Relocalization of telomeric Ku and SIR proteins in response to DNA strand breaks in yeast. Cell 97: 621-633.

Meneghini M.D., Wu M., and Madhani H.D. 2003. Conserved histone variant H2A.Z protects euchromatin from the ectopic spread of silent heterochromatin. Cell 112: 725-736.

Miller A.M. and Nasmyth K.A. 1984. Role of DNA replication in the repression of silent mating type loci in yeast. Nature 312: 247-251.

Mishra K. and Shore D. 1999. Yeast Ku protein plays a direct role in telomeric silencing and counteracts inhibition by Rif proteins. Curr. Biol. 9: 1123-1126.

Moazed D., Kistler A., Axelrod A., Rine J., and Johnson A.D. 1997. Silent information regulator protein complexes in S. cerevisiae: A S1R2/SIR4 complex and evidence for a regulatory domain in SIR4 that inhibits its interaction with SIR3. Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 2186-2191

Moretti P, Freeman K., Coodly L., and Shore D. 1994. Evidence that a complex of SIR proteins interacts with the silencer and telomere-binding protein RAPl. Genes Dev. 8: 2257-2269.

Palladino E, Laroche X, Gilson E., Axelrod A., Pillus L., and Gasser S.M. 1993. SIR3 and SIR4 proteins are required forthe positioning and integnty of yeast telomeres. Cell 75: 542-555.

Pillus L. and Rine J. 1989. Epigenetic inheritance of transcriptional states in S. cerevisiae. Cell 59: 637-647.

Pryde F.E. and Louis E.J. 1999. Limitations of silencing at native yeast telomeres. EMBO J. 18: 2538-2550.

Renauld H., Aparicio O.M., Zierath P.D., Billington B.L., Chhablani S.K., and Gottschling D.E. 1993. Silent domains are assembled continuously from the telomere and are defined by promoter distance and strength, and by SIR3 dosage. Genes Dev. 7: 1133-1145.

Rusche L.N., Kirchmaier A. L., and Rine J. 2002. Ordered nucleation and spreading of silenced chromatin in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biol. Cell 7: 2207-2222.

-------- , 2003. The establishment, inheritance, and function of silenced chromatin in Saccharomyces cerevisiae. Annu. Rev. Biochem. 72: 481-516.

Sekinger E.A. and Gross D.S. 1999. SIR repression of a yeast heat shock gene: UAS and TATA footprints persist within heterochromatin. EMBO J. 18: 7041-7055.

Sinclair D.A. and Guarente L. 1997. Extrachromosomal rDNA circles—A cause of aging in yeast. Cell 91: 1033-1042.

Stavenhagen J.B. and Zakian V.A. 1994. Internal tracts of telomeric DNA act as silencers in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 8: 1411-1422.

Strahl-Bolsinger S., Hecht A., Luo K., and Grunstein M. 1997. SIR2 and SIR4 interactions differ in core and extended telomeric heterochromatin in yeast. Genes Dev. 11: 83-93.

Suka N., Luo K., and Grunstein M. 2002. Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine 16 and spreading of heterochromatin. Nat. Genet. 3: 378-383.

Suka N., Suka Y., Carmen A.A., Wu J., and Grunstein M. 2001. Highly specific antibodies determine histone acetylation site usage in yeast heterochromatin and euchromatin. Mol. Cell 8: 473-479.

Taddei A., Hediger E, Neumann F.R., Bauer C, and Gasser S.M. 2004. Separation of silencing from perinuclear anchoring functions in yeast Ku80 Sir4 and Esc1 proteins. EMBO J. 23: 1301-1312.

Tanner K.G., Landry J., Stemglanz R., and Denu J.M. 2000. Silent information regulator 2 family of NAD-dependent histone/ protein deacetylases generates a unique product, 1-O-acetyl-ADP-ribose. Proc. Natl Acad. Set. 97: 14178-14182.

Thompson J.S., Johnson L.M., and Gmnstein M. 1994. Specific repression of the yeast silent mating locus HMR by an adjacent telomere. Mol. Cell. Biol. 14: 446-455.

van Leeuwen R, Gafken PR., and Gottschling D.E. 2002. Dotlp modulates silencing in yeast by methylation of the nucleosome core. Cell 109: 745-756.

Weiss K. and Simpson R.T. 1998. High-resolution stmctural analysis of chromatin at specific loci: S. cerevisiae silent mating type locus HMLa. Mol Cell. Biol. 18: 5392-5403.