Sarah C.R. Elgin1 и Gunter Reuter2

1 Department of Bilogy, Washington University, St. Louis, Missouri 63130

2 Institute of Genetics, Biologicum, Martin Luther University Halle, D-06120 Halle, Germany

 

Общее резюме

Гены, оказавшиеся в ненормальном соседстве с гетерохроматином в результате либо перестройки, либо транспозиции [transposition], обнаруживают мозаичный фенотип, показывая тем самым, что данный ген оказался сайленсированным в некоторых клетках, в которых в норме он активен (эффект положения мозаичного типа — PEV, position-effect variegation). Сайленсинг, происходящий при PEV, можно приписать упаковке репортерного гена в гетерохроматиновой форме; это показывает, что формирование гетерохроматина, будучи однажды инициировано, может распространяться и охватывать близлежащие гены. На Drosophila melanogaster возможен генетический, цитологический и биохимический анализ, и в этой главе мы показываем, как эти разные подходы в совокупности помогли идентифицировать многих потенциальных участников этой системы, позволив в результате охарактеризовать несколько белков, играющих ключевую роль в установлении и поддержании гетерохроматина. Формирование гетерохроматина решающим образом зависит от метилирования гистона H3 по лизину 9, с сопутствующей ассоциацией Белка Гетерохроматина 1 (НР1 — Heterochromatin Protein 1) и других взаимодействующих белков, в том числе H3K9-метилтрансфераз; множественные взаимодействия этих белков необходимы для поддержания и распространения гетерохроматина. «Нацеливание» на гетерохроматин, в том числе накопление H3K9ше, происходит, по-видимому, с участием машинерии РНК-интерференции (RNAi), хотя играют роль и специфические ДНК-белковые взаимодействия. Хотя гетерохроматиновые районы (перицентромерные районы, теломеры и маленькая четвертая хромосома) обладают общей биохимией, каждый из них отличается от других, а перицентромерные районы мозаичны. Гетерохроматин у Drosophila беден генами, но не лишен их вовсе, и гены, находящиеся в гетерохроматине, зависят в своей экспрессии от этой среды. Окончательная модель формирования и поддержания гетерохроматина (включая «нацеливание» и распространение) должна будет принять в расчет различные реакции разных генов на это хроматиновое окружение.

 

1. Гены, оказывающиеся в ненормальном соседстве с гетерохроматином, обнаруживают мозаичный фенотип

Большие сегменты эукариотического генома, в основном повторяющиеся последовательности, упакованы в постоянно неактивной форме как конститутивный гетерохроматин. Эта фракция хроматина была исходно идентифицирована как та часть генома, которая остается конденсированной и интенсивно окрашивающейся (гетеропикнотической), по мере того, как клетка переходит от метафазы к интерфазе; такой материал обычно ассоциирован с теломерами и перицентромерными районами хромосом. Гетерохроматиновые районы обнаруживают тенденцию к поздней репликации и демонстрируют лишь незначительную мейотическую рекомбинацию или даже вовсе никакой. Эти районы бедны генами, но не лишены их вовсе, и те гены, которые там есть, для своей оптимальной экспрессии часто зависят от этой среды. Около одной трети генома Drosophila считается гетерохроматиновой, включая целую Y-хромосому, большую часть маленькой четвертой хромосомы, перицентромерные 40 % Х-хромосомы и перицентромерные 20 % больших аутосом. На протяжении нескольких последних десятилетий мы узнали очень многое о биохимии гетерохроматина, и многие из этих сведений получены в наших исследованиях, проведенных на Drosophila (Richards and Elgin, 2002; Schotta et al., 2003).

Одной из первых мутаций, идентифицированных у D. melanogaster, была мутация white — мутация, результатом которой оказывается белая окраска глаз мухи, а не характерная для них красная пигментация. Используя Х-лучи в качестве мутагена, Меллер (Muller, 1930) наблюдал необычный фенотип, при котором глаз был мозаичным, с участками красных и участками белых фасеток (рис. 5.1). Этот фенотип заставлял думать, что сам ген white не поврежден — в конце концов, некоторые фасетки оставались красными, и даже можно было получить мух-ревертантов с полностью красными глазами, вновь используя Х-лучи как мутаген. Однако ген white был несомненно сайленсирован в некоторых клетках, в которых он экспрессируется в норме Последующие исследования политенных хромосом (представлены ниже, см. рис. 5.4) показали, что такие фенотипы были следствием инверсии или перестройки, когда одна точка разрыва находилась в пределах перицентромерного гетерохроматина, а другая — вблизи гена white (см. рис. 5.1). Поскольку причина такого мозаичного фенотипа — в изменении положения гена в пределах хромосомы, это явление называется эффектом положения мозаичного типа (PEV) У Drosophila было показано, что по существу каждый ген, который был изучен в соответствующей перестройке, проявляет мозаипизм, и перестройки, включающие перицентромерный гетерохроматин любой хромосомы, могут приводить к PEV. PEV наблюдали у ряда организмов, в том числе у дрожжей, мух и млекопитающих, но как инструмент для изучения формирования гетерохроматина он был использован в основном у Drosophila.

Рис. 5.1. Схематическое изображение мозаичности white в инверсии In(1)wm4 в Х-хромосоме

Локус white , в норме расположенный в дистальном эухроматине ( синий цвет ), теперь помещен в пределах 25 т.о. от точки разрыва в перицентромерном гетерохроматине ( розовый цвет ) Х-хромосомы благодаря индуцированной Х-лучами инверсии. Распространение гетерохроматиновой упаковки в эухроматиновый район приводит к сайленсингу; утрата сайленсинга в некоторых клетках в ходе дифференцировки дает мозаичный фенотип. Используя мух, обнаруживающих PEV, можно отселектировать мутации во втором сайте, которые либо супрессируют этот фенотип (мутации Su(var) ; приводят к утрате сайленсинга), либо усиливают фенотип (мутации Е(var) ; вызывают усиление сайленсинга)

PEV показывает, что такие перестройки позволяют упаковке в гетерохроматиновую конфигурацию «распространяться» вдоль по длине хромосомы. Все выглядит таким образом, как если бы перестройка удалила существующий в норме барьер или буферную зону. Следствием этого является измененная упаковка и сайленсинг генов, в норме организованных в эухроматиновой форме. Визуальное обследование политенных хромосом личинок, несущих такую перестройку, показывает, что район, несущий репортерный ген, упакован теперь в плотный блок гетерохроматина, но только в тех клетках, в которых этот ген неактивен (Zhimulev et al., 1986). Картина, наблюдаемая вследствие перестройки white, может варьировать по числу пигментированных клеток, величине пигментированных пятен и уровню содержания пигмента в наблюдаемых двух разных клеточных типах (рис. 5.1). В системе, использующей в качестве репортера индуцибельный ген lac-Z, исследователи наблюдали, что сайленсинг происходит в эмбриогенезе (когда впервые цитологически наблюдается гетерохроматин) и эпигенетически наследуется как в соматической, так и в зародышевой линиях; мозаичный фенотип был определен в ходе дифференцировки по мозаичной релаксации сайленсинга у личинок третьего возраста (Lu et al., 1996). Однако не все гены, обнаруживающие мозаицизм, остаются «молчащими» до периода после дифферениировки, и для разных генов баланс факторов, приводящий к решению «включить/ выключить», несомненно различен (дополнительное детальное обсуждение см. Ashburner et al., 2005b).

При наличии мух, имеющих PEV-фенотип, довольно просто провести скрининг на доминантные мутации во втором сайте (индуцированные химическими мутагенами, вызывающими точечные мутации или мелкие инсерции/делеции), которые либо являются супрессорами PEV (обозначаются Supressor of variegation, Su [varj) и приводят к утрате сайленсинга, либо являются энхансерами PEV (обозначаются Enhancer of variegation, E[var]), приводящими к усилению сайленсинга (рис. 5.1). Изолировали и охарактеризовали около 30 модификаторов PEV, но на основе такого скрининга можно предсказать существование значительно большего числа кандидатов на эту роль. Там, где такой ген был клонирован, а его продукт охарактеризован, обычно обнаруживают хромосомный белок или модификатор хромосомного белка (см. ниже). Небольшая выборка этих локусов вызывает как гаплоаномальный, так и триплоаномальный фенотип; т.е. если одна копия гена приводит к супрессии PEV, три его копии приводят к усилению PEV. Идентификация таких локусов привела к предположению, что белковые продукты этих генов играют структурную роль в гетерохроматине и что распространение гетерохроматиновой упаковки может управляться дозой этих белков в стохастическом режиме (рис. 5.2) (Locke et al., 1988). Однако «распространение» является не простым линейным континуумом, а сложным процессом, который, вероятнее всего, зависит от организации ДНК в том районе, который сайленсирован (см. ниже).

Результаты, наблюдаемые по перестройкам хромосом, заставляют предполагать, что эухроматиновый ген, в результате транспозиции вставленный в гетерохроматиновый район, также будет обнаруживать мозаичный фенотип. Так оно и оказалось. Для этой цели можно подвергнуть генноинженным манипуляциям Р-элемент — ДНК-транспозон, обнаруживамый во многих природных линиях Drosophila. Природный P-элемент имеет на каждом конце особые инвертированные повторяющиеся последовательностиикодируетвсеголишьодинфермент— P-специфическую ДНК-транспозазу Репортерные конструкты, лишенные ДНК-транспозазы, но содержащие другие гены, представляющие интерес для исследователя, можно вставить в геном Drosophila в присутствии активной транспозазы путем их совместной инъекции в эмбрионы Drosophila. Мобильный элемент на основе Р (такой, как показано на рис. 5.3а), несущий управляемую hsp70 копию white, можно использовать в мухах, лишенных эндогенной копии white, чтобы идентифицировать домены гетерохроматина Когда P-элемент вставляется в эухроматин, муха имеет красные глаза. Когда же этот Р мобилизуется (путем встраивания в ген, кодирующий транспозазу), приблизительно 1 % выявляемых линий обнаруживают мозаичный фенотип глаз. Гибридизация in situ показывает, что в этих случаях P-элемент перескочил в перицентромерный гетерохроматин, теломеры или небольшую четвертую хромосому (Wallrath and Elgin, 1995). Эта идентификация гетерохроматиновых доменов согласуется с более ранними цитологическими исследованиями.

Рис. 5.2. Зависимые от дозы эффекты некоторых модификаторов PEV

Полагают, что модификаторы PEV, обнаруживающие зависимый от дозы эффект, являются структурными белками гетерохроматина. В то время как в присутствии двух копий гена-модификатора дикого типа наблюдается мозаичный фенотип (обнаруживаемый здесь репортерным геном white ; средняя хромосома, средний глаз мухи), присутствие трех копий гена-модификатора дикого типа обычно обусловливает более экстенсивное формирование гетерохроматина, что приводит к усилению сайленсинга репортерного гена (нижняя хромосома, нижний глаз мухи). Наоборот, присутствие только одной копии гена-модификатора дикого типа обычно приводит к пониженному формированию гетерохроматина и к повышенной экспрессии репортерного гена (верхняя хромосома, верхний глаз мухи)

Использование таких P-элементов позволило сравнить упаковку одного и того же репортерного гена в гетерохроматиновом и эухроматиновом окружении. Гетерохроматин относительно устойчив к расщеплению нуклеазами, как неспецифическими (например, ДНКаза 1), так и специфическими (рестрикционные энзимы), и менее доступен для других экзогенных зондов, таких как метилтрансфераза dam. Анализ одного и того же трансгена hsp26 (маркированного фрагментом уникальной растительной ДНК, рис. 5.3а) в эухроматине и в перицентромерном гетерохроматине с использованием микрококковой нуклеазы (MNase) выявил сдвиг в сторону более упорядоченного расположения нуклеосом в гетерохроматине (рис. 5.36, в). Фрагменты, полученные путем расщепления ферментом MNase, четко определены, что позволяет предполагать наличие меньшей, чем обычно, мишени для MNase в линкерном районе. Упорядоченное расположение нуклеосом простирается на весь 5’-регуляторный район гена; этот сдвиг несомненно обусловливает наблюдаемую потерю 5’-гиперчувствительных (HS) сайтов (Sun et al., 2001). Действительно, хотя механизм сайленсинга понят еще не полностью, имеются многочисленные данные о транскрипционной репрессии сильно мозаичных генов, включая утрату связывания TFIID и других транскрипционных факторов (Cryderman et al., 1999b).

 

2. Скрининг супрессоров и энхансеров PEV позволил идентифицировать хромосомные белки и модификаторы хромосомных белков

PEV можно модифицировать различными факторами. Температура во время развития и количество гетерохроматина в геноме были первыми факторами, влияющими, как было показано, на степень мозаицизма. Как правило, повышение температуры во время развития (с 25 до 29°С) приводит к супрессии мозаицизма (утрате сайленсинга), тогда как более низкие температуры (например, 18°С) вызывают усиление мозаицизма (увеличение сайленсинга). Другие изменения в условиях культивирования, ускоряющие или замедляющие скорость развития, могут давать похожие эффекты. Сильная супрессия обнаруживается у мух, несущих дополнительную Y-хромосому (самки XXY и самцы XYY), тогда как у самцов без Y-хромосомы (Х0) обнаруживается значительное усиление. В целом дупликация гетерохроматинового материала подавляет, а делециии гетерохроматинового материала усиливают мозаицизм. Эти эффекты могут быть обусловлены титрованием фиксированного количества ключевых белков, необходимых для упаковки гетерохроматина. Первые мутации во втором сайте, супрессирующие или усиливающие PEV, были идентифицированы Шульцем (Schultz, 1950) и Споффордом (Spofford, 1967). В настоящее время приблизительно 150 генов предположительно рассматриваются как модификаторы локусов PEV.

Рис. 5.3. Гетерохроматин упакован в регулярный нуклеосомный порядок

Мобильный элемент (а), несущий маркированную копию гена теплового шока для исследования и hsp70-управляемую копию white в качестве визуального маркера, можно использовать для изучения одного и того же гена в разных хроматиновых доменах. Ядра эмбрионов Drosophila из линии, несущей этот трансген в эухроматиновом домене (39С-Х; красные глаза), и из линии, несущей тот же самый трансген в гетерохроматиновом домене (HS-2; мозаичный глаз), были переварены возрастающими количествами фермента MNase, ДНК очистили и разогнали в агарозном геле, а Саузерн-блот гибридизировали с зондом, уникальным для трансгена (б) . Линкерные сайты, расщепленные MNase, отмечены стрелками, (в) Сравниваются денситограммы последней дорожки каждой пробы ( сверху вниз — слева направо ). В гетерохроматине можно видеть набор 9—10 нуклеосом ( красная линия ) по сравнению с 5—6 нуклеосомами в эухроматине ( синяя линия ), что показывает наличие более регулярного «шага» в первом случае, (г) Схематическое представление этих результатов ( б, в — с любезного разрешения из Sun et al., 2001, с изменениями [©American Society for Microbiology])

Мутации Su(var) и E(var) идентифицируют гены, причинно связанные с началом сайленсинга гетерохроматиновых генов при PEV [with the onset of hetero-chromatic gene silencing in PEV]. Молекулярный анализ этих генов сыграл существенную роль в углублении понимания механизмов, приводящих к формированию гетерохроматина и сайленсингу генов. В большинстве случаев модифицирующее влияние мутаций на PEV является доминантным, и гетерозиготы Su(var)/+ или E(var)/+ демонстрируют фенотип с подавленным или усиленным PEV (рис. 5.1). Эффективное выделение и детальный генетический анализ мутаций Su(var) и E(var) зависят от наличия подходящей для эксперимента PEV-перестройки. Хотя было описано большое число PEV-перестроек (Flybase, 2005), лишь немногими из них можно легко воспользоваться для эффективного генетического скрининга и изоляции доминантных мутаций-модификаторов. Одна из наиболее полезных для такой экспериментальной работы PEV-перестроек— In(1)w m4 (Muller 1930). Эта перестройка обусловливает мозаицизм по white — фенотип, легко различимый на глазах взрослых мух, как показано на рис.5.1. Пенетрантность мозаицизма по white у w m4 является 100 %-ной, так что каждая муха в исходном штамме [the starting stock] имеет глаза с белой пятнистостью. Инактивация гена white не влияет на жизнеспособность или фертильность, что обусловливает возможность неограниченной работы с мухами, гомозиготными по w m4 .

В перестройке w m4 ген white в результате инверсии оказывается в непосредственной близости с гетерохроматиновым материалом Х-хромосомы, локализованным на дистальной границе ядрышкового организатора (Cooper, 1959). Этот район содержит тандемные порядки мобильных элементов типа R1; гетерохроматиновая точка разрыва In(1)w m4 находится внутри единицы повтора R1 (A. Ebert and G. Reuter, неопубликовано). После воздействия Х-лучами или EMS (этанметилсульфонат, химический мутаген) были изолированы ревертанты w m4 , имеющие фенотип w + (Tartof et al., 1984; Reuter et al., 1985). Анализ более 50 ревертантных хромосом w + (все они обнаружили реинверсию или транслокацию гена white в соседство с эухроматином) позволил предположить, что гетерохроматиновый материал, фланкирующий непосредственно точку разрыва, вызывает инактивацию гена white у w m4 . Большинство ревертантов снова обнаруживают белую пятнистость, если вводятся сильные мутации E(var), что заставляет предполагать, что некоторые гетерохроматиновые последовательности после перемещения остаются ассоциированными с геном white. Эти исследования позволяют считать повторяющуюся ДНК (в данном случае повторы R1) мишенью для формирования гетерохроматина.

Большинство известных мутаций-модификаторов PEV были изолированы с использованием сенсибилизированного генетического фона. Для изоляции доминантных супрессорных мутаций тест-генотип содержит доминантный энхансер, тогда как в схемах для изоляции энхансерных мутаций используется доминантный супрессор (Dorn et al., 1993b). Если тест-генотип содержит энхансер мозаичности, все мухи w т4 имеют белые глаза, и исключения, имеющие пятнистые или красные глаза, указывают на вновь индуцированные мутации Su(var). Соответственно, в тест-линии с доминантным супрессором все мухи w т4 имеют красные глаза, а исключительные мухи с мозаичным фенотипом указывают на вновь индуцированные мутации E(var). Эти сенсибилизированные генетические схемы благоприятствуют изоляции сильно доминантных мутаций Su(var) и E(var), которые оказались очень полезными для детального генетического анализа.

С использованием этого подхода в разных опытах по скринингу просмотрели более миллиона мух, и были изолированы более 140 мутаций Su(var) и 230 мутаций

E(var) (Schotta et al., 2003). Мутации были индуцированы EMS, Х-лучами или ремобилизацией элементов Р. Еще один набор мутаций Su(var) был изолирован в ходе прямого скрининга с w m4 (Sinclair et al., 1983). Скрининг с хромосомой Df(l'J), демонстрирующей сильный мозаицизм по гену yellow (маркер, желтая окраска тела), привел к изоляции 70 мутаций-модификаторов PEV (Donaldson et al., 2002). Кроме того, скрининг на доминантные модификаторы экспрессии транспозонного репортерного гена позволил идентифицировать несколько мутаций с эффектом Su(var) (Birchler et al., 1994). Известно, что выборка критических регуляторных генов даун — регулируется генами группы Polycomb (PcG) и ап — регулируется генами группы trithorax (trxG). В прямых тестах относительно немногие мутации в генах PcG модифицируют PEV (например, Sinclair et al., 1998). Напротив, многие мутации в генах trxG являются энхансерами PEV (Dorn et al., 1993а; Farkas et al., 1994).

В совокупности этот скрининг позволил идентифицировать большое число доминантных мутаций Su(var) и E(var). По данным выполненного к настоящему времени генетического анализа общее число мутаций Su(var) и E(var) можно оценить как приблизительно 150. Большое число генов Su(var) и E(var) с почти идентичными фенотипическими эффектами иногда приводит к несоответствиям в генетической номенклатуре. Чаще всего символы генов Su(var) и E(var) комбинируются с цифрами, указывающими хромосому, в которой локализована данная мутация, с номером гена и номером аллели Так, Su(var)3-9 17 символизирует аллель 17 девятого гена Su(var), идентифицированного в третьей хромосоме. В настоящее время были тщательно картированы лишь около 30 соответствующих генов и идентифицированы соответствующие аллели (табл. 5.1). Зависящие от дозы эффекты наблюдались для примерно одной трети идентифицированных генов, с использованием серии перекрывающихся нехваток и дупликаций. В этих случаях уменьшение количества генных продуктов из-за утери одной копии гена неизменно приводит к модификации мозаичного фенотипа. Делеции этих локусов Su(var) или E(var) супрессируют или, соответственно, усиливают сайленсинг генов. Исследования с использованием дупликаций позволили идентифицировать новые локусы-модификаторы, которые обнаруживают противоположное (антиподное) влияние на PEV, если путем дупликации или с помощью инсерции трансгена вводится лишняя копия данного гена. Общее число генов-модификаторов PEV, обнаруживающих зависящие от дозы эффекты, оценивается примерно в 15—20 (Schotta et al., 2003).

Если утрата одной копии гена приводит к супрессии PEV, а присутствие трех копий гена ведет к усилению PEV, это позволяет предполагать, что для установления гетерохроматина требуется, в стоихиометрических количествах, продукт, кодируемый этим геном, с сопутствующим сайленсингом гена (рис. 5.2). Были детально охарактеризованы три таких локуса, Su(var)2-5 (кодирующий НР1), Su(var)3-7 (кодирующий белок типа «цинковых пальцев») и Su(var)3-9 (кодирующий метилтрансферазу лизина гистонов). Su(var)2-5 был клонирован путем скрининга библиотеки экспрессии кДНК с помощью моноклонального антитела, распознающего гетерохроматин (James and Elgin, 1986). Кодируемый белок, ассоциированный с гетерохроматином, был впоследствии обозначен НР1 (белок гетерохроматина 1). Гибридизация in situ с использованием выделенной клонированной ДНК позволила идентифицировать ген в районе 28—29 политенных хромосом,

Таблица 5.1. Генетически установленные гены Su(var) и E(var) и их молекулярные функции

См. оригинальное цитирование во Flybase.

где ранее был картирован Su(var)2-5- Анализ нуклеотидной последовательности ДНК мутантных аллелей подтвердил, что локус Su(var)2-5 в положении 28F1-2 на хромосоме кодирует HP 1 (Eissenberg et al., 1990), HP1 содержит два консервативных домена, аминотерминальный хромодомен и карбокситерминальный домен «chromoshadow» (Paro and Hogness, 1991), и взаимодействует с несколькими другими хромосомными белками. Su(var)3- 7 был сперва цитогенетически картирован (с помощью серии перекрывающихся делеций и дупликаций) в районе 87Е1-4 в третьей хромосоме. Этот район был проанализирован на уровне ДНК как часть первой «прогулки по хромосоме» [chromosomal walk], выполненной у Drosophila (Bender et al., 1983). С помощью серии перекрывающихся геномных клонов Su(var)3-7был определен в пределах фрагмента ДНК величиной 7.8 т.о., который обладал трипло-энхансерным влиянием на репортер, обнаруживающий мозаичность (Reuter et al., 1990). Su(var)3-7кодирует белок с семью регулярно расположенными [regularly spaced] «цинковыми пальцами» — доменами, которые, как было показано, функционируют в связывании с ДНК (Cleard and Spierer, 2001). Su(var)3-9 был клонирован с помощью таггирования транспозоном P-элементом (Tschiersch et al., 1994). Ген Su(var)3-9 у Drosophila (и у всех других голометаболических насекомых, изученных к настоящему времени) образует бицистронную единицу с геном, кодирующим eIF2y (Krauss and Reuter, 2000). Поскольку транскрипционная единица Su(var)3-9 не имеет интронов, вполне вероятно, что Su(var)3-9 был вставлен в интрон гена eIF2y путем ретротранспозиции. Белок SU(VAR)3-9 содержит хромодомен в своем аминотерминальном участке и домен SET (идентифицированный впервые в белках SU(VAR)3-9, ENHANCER OF ZESTE [E(Z)] и TRITHORAX) (Jones and Gelbart, 1993; Tschiersch et al., 1994) на своем карбоксильном конце. Этот белок является метилтрансферазой гистонов, специфически модифицирующей гистон H3 по лизину 9.

Были описаны семь разных мутантных аллелей Su(var)2-5, в том числе миссенс-мутации в хромодомене, преждевременные стоп-кодоны и ошибки сплайсинга (Eisenberg et al., 1992). Мутации Su(var)3-7 были получены с помощью гомологичной рекомбинации (Seum et al., 2002); дополнительные аллели были выявлены как супрессоры сайленсинга, зависимого от P-элемента (Bush-еу and Locke, 2004). Сорок мутантных аллелей Su(var)3-9 были выявлены и определены на молекулярном уровне (Ebert et al., 2004). Иммуноцитологический анализ с использованием специфических антител или химерных белков слияния, экспрессируемых трансгеном [transgene-expressed fusion proteins], показал, что все три белка преимущественно ассоциированы с гетерохроматином (см. ниже и рис. 5.4) (James et al., 1989; Cleard et al., 1997; Schotta et al., 2002). Сильная колокализация особенно очевидна для НР1 и SU(VAR)3-9. Эти белки также связываются с теломерами и в ряде эухроматиновых сайтов (Fanti et al., 1998; Schotta et al., 2002).

Несколько инсерций P-элемента, несущих репортерный ген w + в теломерные районы, обнаруживают белую пятнистость. Этот феномен называется теломерным эффектом положения (ТРЕ). Упаковка, подобная гетерохроматину, наблюдается в ассоциированных с теломерами сателлитных последовательностях (TAS), кластерах повторяющейся ДНК, расположенных проксимально по отношению к ретровирусным элементам НеТ-А и TART, составляющим теломеры Drosophila (Cryderman et al., 1999a). В целом, не было обнаружено модификации ТРЕ мутациями в известных генах-модификаторах, хотя НР1 важен для целостности теломер. В клетках с недостаточностью по этому белку хромосомы часто сливаются в области своих теломер (Fanti et al., 1998). У Drosophila в ходе недавнего скрининга не было обнаружено никаких /гая5-действуюших доминантных модификаторов ТРЕ (Mason et al., 2004), что заставляет предполагать, что эти участки сайленсированы двумя (или несколькими) независимыми механизмами.

 

3. Иммунофлуоресцентное окрашивание политенных хромосом позволило идентифицировать белки, специфически ассоциированные с гетерохроматином

Одним из преимуществ работы с Drosophila является возможность изучения политенных хромосом, дающая визуальную «дорожную карту» генома. На стадии личинки хромосомы во многих терминально дифференцированных клетках реплицируются, но не проходят через митоз; нити хроматина остаются спаренными, в состоянии совершенного синапсиса, и все копии выравнены друг с другом. Наиболее крайний случай имеет место в слюнных железах, где эухроматиновые плечи хромосом претерпели 10 раундов репликации, дав в результате около 1000 копий. Однако репликация не является однородной; многие повторяющиеся последовательности недореплицируются, а сателлитные последовательности ДНК не реплицируются вовсе Все хромосомные плечи сливаются в общем хромоцентре. Таким образом, у D. melanogaster наблюдаются пять длинных плечей (X, второе левое [2L], второе правое [2R], третье левое [3L], третье правое [3R]) и короткое плечо четвертой хромосомы, выступающее из конденсированного хромоцентра, состоящего из перицентромерного гетерохроматина (рис. 5.4а) (обзор см. Ashburner et al., 2005)

Хотя генетический анализ позволил идентифицировать многие локусы, необходимые для формирования гетерохроматина, сам по себе он не позволяет определить, играет ли продукт данного локуса прямую или же косвенную роль. Специфическая ассоциация белка с гетерохроматином первоначально наблюдалась при скрининге моноклональных антител (полученных с использованием прочно-связывающихся ядерных белков, где анализировали паттерны распределения на политенных хромосомах. Антитела, специфичные к белку 22 кДа, впоследствии обозначенному как НР1, давали иммунофлуоресцентное «окрашивание» перицентромерного гетерохроматина, теломер и бэндированной [banded] части маленькой четвертой хромосомы, т.е. известных сайтов гетерохроматина (рис. 5.4а) (James and Elgin, 1986). Последующий анализ (описанный выше) показал, что белок НР1 кодируется Su(var)2-5, известным супрессором PEV (Eissenberg et al., 1990). Изучение хромосомной локализации специфическими антителами с использованием либо митотических хромосом (Fanti and Pimpinelli, 2004), либо политенных хромосом (обеспечивающих большее разрешение, но недостаточных по центромерному гетерохроматину) (Silver and Elgin 1976) остается наилучшим способом демонстрации того, что продукт локуса Su(var) кодирует хромосомный белок. Были идентифицированы приблизительно 10 таких специфичных для гетерохроматина белков; если есть мутации в генах, кодирующих эти белки, часто наблюдают доминантную супрессию PEV (см. табл. 5.1) (Ashburner et al., 2005b). Эти белки, в том числе недавно идентифицированный НР2 (рис. 5.4а) (Shaffer et al., 2002), являются кандидатами на роль структурных компонентов гетерохроматина.

Рис. 5.4. Иммунофлуоресцентное окрашивание политенныххромосом позволяет идентифицировать белки, преимущественно ассоциированные с гетерохроматином

(а) Политенные хромосомы, на фиксированных и давленых препаратах слюнных желез (микроскопия с фазовым контрастом, слева) «окрашены» с помощью инкубирования сначала с антителами, специфичными к данному хромосомному белку, а затем со вторичным антителом, конъюгированным с флуоресцентной меткой. НР1 ( справа ) и НР2 ( в центре ) имеют сходный рисунок распределения, демонстрирующий бросающуюся в глаза связь с перицентромерным гетерохроматином, маленькой четвертой хромосомой ( врезка, стрелка ) и небольшой группой сайтов в эухроматиновых плечах. Обратите внимание на то, что на эффективность любого антитела может влиять выбор протокола фиксации (см. Stephens et al. 2003). (б, в) Ассоциация НР1 и SU(VAR)3-9 с перицентромерным гетерохроматином является взаимозависимой. Мутации в Su(var)3-9 приводят к потере НР1 из перицентромерного гетерохроматина (но не четвертой хромосомы; см. текст) (б), тогда как мутации в Su(var)2-5 приводят к делокализации SU(VAR)3-9 (в) (из: Shatter et al. 2002, с изменениями)

 

4. Модификация гистонов играет ключевую роль в сайленсинге гетерохроматина

Анализ SU(VAR)3-9 позволил идентифицировать ключевую функцию, необходимую для сайленсинга гетерохроматиновых генов (Tschiersch et al., 1994). Этот белок содержит домен SET, функционирующий как фермент в метилировании H3K9 гистонов. То, что этот белок является метилтрансферазой лизина гистонов (HKMT), «нацеленной» на H3K9, было впервые показано в ходе изучения гомологичного белка человека, SUV39H1 (Rea et al., 2000). У Drosophila SU(VAR)3-9 является главной, но не единственной HKMT H3K9 (Schotta et al., 2002; Ebert et al., 2004). SU(VAR)3-9 контролирует диметилирование H3K9в основной массе перицентромерного гетерохроматина, но не в четвертой хромосоме, теломерах или эухроматиновых сайтах. Триметилирование H3K9, которое у Drosophila наблюдется, главным образом, во внутреннем хромоцентре, также контролируется SU(VAR)3-9. Диметилирование этого внутреннего района не зависит от SU(VAR)3-9, как и монометилирование H3K9 в перицентромерном гетерохроматине (Ebert et al., 2004). HKMTs, ответственные за эти модификации, все еще неизвестны. Важное значение диметилирования H3K9 в сайленсинге гетерохроматиновых генов демонстрируется сильным зависящим от дозы влиянием SU(VAR)3-9 на PEV (обсуждается выше), атакже тем фактом, что супрессия сайленсинга генов мутациями Su(var)3-9 коррелирует с активностью их HKMT Ферментативно гиперактивная мутация Su(var)3-9 pth является сильным энхансером PEV и вызывает повышенное содержание H3K9me2 и H3K9me3 в хромоцентре, а также порождает заметные сигналы H3K9me2 во многих эухроматиновых сайтах (эктопический гетерохроматин). S-Аденозилметионин функционирует как донор метальной группы для всех этих реакций метилирования; следовательно, мутации в гене, кодирующем S-аденозилметионинсинтазу, Su(z)5, являются доминантными супрессорами PEV (Larsson et al., 1996).

Исследования с использованием генов Su(var) начали вскрывать последовательность молекулярных реакций, необходимых для установления гетерохроматиновых доменов. Связывание SU(VAR)3-9 в гетерохроматиновых нуклеотидных последовательностях зависит как от его хромодоменов, так от SET-доменов (Schotta et al., 2002). Как контролируется SU(VAR)3-9 — все еще неизвестно. Метилирование H3K9 белком SU(VAR)3-9 устанавливает сайты связывания для НР1. Хромодомен НР1 специфически связывается с H3K9me2 и H3K9me3 (Bannister et al., 2001; Lachner et al., 2001). Что SU(VAR)3-9 связывается с HP1, было показано двугибридными тестами на дрожжах [yeast two-hybrid tests] и иммунопреципитацией (Schotta et al., 2002). Район SU(VAR)3-9, аминотерминальный по отношению к его хромодомену взаимодействует с доменом «chromoshadow» НР1. Этот район SU(VAR)3-9 взаимодействует также с карбокситерминальным доменом SU(VAR)3-7. SU(VAR)3-7 взаимодействует в трех разных сайтах с доменом «chromoshadow» НР1 (Delattre et al., 2000). При таком паттерне взаимодействий можно предположить, что эти три белка — НР1, SU(VAR)3-7 и SU(VAR)3-9 — физически связаны в мультимерных белковых комплексах гетерохроматина.

Ассоциация SU(VAR)3-9 и НР1 с перицентромерным гетерохроматином является взаимозависимой (Schotta et al., 2002). SU(VAR)3-9 вызывает диметилирование H3K9, который специфически узнается хромодоменом НР1 (Bannister etal., 2001; Lachner etal., 2001). Следовательно, у личинок нуль-Su(var)3-9 связывание НР1 с перицентромерным гетерохроматином нарушено (см. рис. 5.4Ь). Это отражает специфическую активность НР1, который связывается с H3K9me2, но не с H3K9me1; SU(VAR)3-9 не затрагивает монометилирование (Ebert et al., 2004). Диметилирование H3K9 во внутреннем хромоцентре, четвертой хромосоме в теломерах и в эухроматиновых сайтах не зависит от SU(VAR)3-9, и, следовательно, в мутантных линиях НР1 продолжает обнаруживаться во всех этих сайтах. В клетках дикого типа SU(VAR)3-9 связывается с этими сайтами, но, по-видимому, неактивен; неизвестная HKMT контролирует метилирование H3K9 в этих районах.

Напротив, если НР1 не присутствует (устранен мутациями), SU(VAR)3-9 больше не связывается с пери-центромерным гетерохроматином, но обнаруживается также по длине эухроматиновых хромосомных плечей (рис. 5.46). Теперь он виден почти во всех бэндах, где он вызывает эктопическое моно- и диметилирование H3K9 (H3K9me1 и H3K9me2) (рис. 5.5). Таким образом, НР1 существен для ограниченного связывания SU(VAR)3-9 с перицентромерным гетерохроматином. Эти данные позволяют представить себе последовательность реакций, начинающуюся со связывания SU(VAR)3-9 с гетерохроматиновыми доменами и последующего образования H3K9me2. Эта метка распознается хромодоменом НР1; связывание SU(VAR)3-9 с доменом «chromoshadow» белка НР1 обеспечивает его ассоциацию с гетерохроматином. Был создан химерный белок НР1-РС, в котором хромодомен НР1 был заменен хромодоменом белка Polycomb (PC) (Platero et al., 1996). Хромодомен PC прочно связывается с H3K27me3 (Fischle et al., 2003). Химерный белок HP1-PC узнает, следовательно, сайты связывания H3K27me3 Polycomb в эухроматиновых плечах; в присутствии такого химерного белка НР1-РС белок SU(VAR)3-9 также обнаруживается в сайтах связывания PC, демонстрируя свою сильную связь с доменом «chromoshadow» белка НР1 (Schotta et al., 2002).

В клетках нуль-SU(VAR)3-9 сильно уменьшено содержание еще одной гетерохроматин-специфичной метки метилирования — триметилирования H4K20 (H4K20me3) (Schotta et al., 2004). Было показано, что взаимозависимость между диметилированием H3K9 и триметилированием H4K20 отражает взаимодействие между белками SU(VAR)3-9, НР1 и SUV4-20. SUV4-20 является HKMT, контролирующей метилирование H4K20 в гетерохроматине. Это гетерохроматин-специфичная метка метилирования сильно ослаблена в нуль-клетках по SU(VAR)3-9, как и по НР1, заставляя предполагать ассоциацию SU(VAR)3-9, НР1 и SUV4-20 в комплекс взаимно зависимых белков. Мутации в гене Suv4-20 вызывают сильную супрессию индуцированного PEV сайленсинга генов, показывая, что для этого процесса требуется метка H4K20me3.

Рис. 5.5. Взаимодействие SU(VAR)3-9 и НР1 в установлении паттерна распределения H3K9me

(a) SU(VAR)3-9 отвечает за деметилирование НЗК9 (H3K9me2); утрата энзима приводит к утрате этой модификации в перицентромерном гетерохроматине, как показывает утрата окрашивания антителами политенных хромосом (сравни среднюю панель с верхней панелью ). Утрата НР1 приводит к утрате «нацеливания» SU(VAR)3-9; высокие уровни H3K9me2 видны теперь на всех хромосомных плечах ( нижняя панель ), (б) YH1 взаимодействует с H3K9me2 через свой хромодомен, а с SU(VAR)3-9 — через домен «chromoshadow». Узнавая и модификацию гистонов, и фермент, отвечающий за эту модификацию, НР1 обеспечивает механизм распространения гетерохроматина и эпигенетического наследования

Третья метка метилирования гистонов, функционально связанная с формированием гетерохроматина, — это метилирование H3K27, катализируемое HKMT E(Z). У Drosophila E(Z) контролирует все моно-, ди- и триметилирование H3K27 и в эухроматине, и в гетерохроматине. Следовательно, в нуль-клетках по E(z) все метилирование H3K27 утрачивается (Ebert et al., 2004). На функцию метилирования H3K27 в сайленсинге гетерохроматиновых генов указывает как Su(var)-эффект мутаций E(z) типа утраты функции, так и энхансерный эффект дополнительных копий гена E(z) (Laible et al., 1997). Неясно, является ли этот эффект прямым или косвенным. Метилирование H3K27 является критическим для системы сайленсинга Polycomb, которая действует в эухроматиновых доменах. Между паттернами распределения и функциональными ролями PC и НР1 наблюдается относительно небольшое перекрывание. Каким образом могла бы осуществляться подгонка метилирования H3K27 к зависимым от НР1 гетерохроматиновым комплексам — еще предстоит выяснить. Белок НР1 выполняет центральную линкерную функцию в формировании гетерохроматина и ассоциированном сайленсинге генов, связывании H3K9me2 и H3K9me3 и взаимодействии непосредственно с SU(VAR)3-9 и несколькими дополнительными белками. Учитывая число идентифицированных локусов Su(var), эта модель определенно становится более сложной. У млекопитающих и растений метилирование H3K9 гистонов и метилирование ДНК представляют взаимосвязанные метки репрессированного хроматина (Martienssen and Colot, 2001; Bird, 2002). Происходит ли вообще метилирование ДНК у Drosophila или нет, многие годы было предметом полемики. Недавние сообщения о низком уровне метилирования ДНК у ранних эмбрионов вновь подогрели эту дискуссию (Kunert et al., 2003). Анализ генома показывает, что единственная имеющаяся различимая ДНК-метилтрансфераза — это Dnmt2. Мутации в этом гене мало влияют на организм. Тем не менее, его роль в раннем эмбриогенезе исключать нельзя.

 

5. Хромосомные белки образуют взаимозависимые комплексы для поддержания и распространения гетерохроматиновой структуры

PEV отражает изменение в экспрессии гена вследствие генетической перестройки, а именно утрату экспрессии репортерного гена в некоторых клетках, в которых он в норме активен. Для объяснения PEV предложено несколько разных моделей; не все из них являются взаимоисключающими. Одна из возможностей, рассмотренная исходно, — это случайная потеря гена, возможно вследствие поздней репликации (Karpen and Spradling, 1990). Анализ с помощью количественного Саузерн-блоттинга показал, что это объяснение в общем виде неприменимо; гены, обнаруживающие мозаицизм, обычно полностью реплицируются в диплоидной ткани (Wallrath et al., 1996). Другие модели делают акцент на ассоциации гена, обнаруживающего мозаицизм, с гетерохроматиновым компонентом ядра и (или) на распространении гетерохроматиновой структуры с гетерохроматина, оказавшегося по соседству. Эта модель распространения, базирующаяся на многочисленных генетических и цитологических данных, объясняет сайленсинг как следствие распространения гетерохроматиновой упаковки через точку разрыва в эухроматиновые в норме районы. В нормальных хромосомах эухроматиновые и гетерохроматиновые районы, по-видимому, изолированы [insulated] друг от друга специфическими последовательностями или буферными зонами. Поскольку эти «изолирующие последовательности» [«insulating sequences»] (которые никогда не были полностью определены у Drosophila) отсутствуют в местах соединения эухроматина и гетерохроматина при PEV-перестройках (см. рис. 5.1), гетерохроматинизация эухроматиновых последовательностей индуцируется с переменным успехом. Эту гетерохроматинизацию можно видеть на цитологическом уровне в политенных хромосомах как сдвиг от бэндированной к аморфной структуре в основании хромосомных плечей (Hartmann-Goldstein, 1967); степень этого изменения можно модифицировать мутациями Su(var) и E(var) (Reuter et al., 1982).

Инактивацию эухроматиновых генов на расстоянии вдоль по длине хромосомы можно продемонстрировать генетически (Demerec and Slizynska, 1937). Затронутые районы становятся связанными с НР1 (Belyaeva et al., 1993) и обнаруживают H3K9me2, типичную метку гетерохроматина Drosophila (Ebert et al., 2004). Поскольку модель распространения постулирует конкуренцию между упаковкой в эухроматин и упаковкой в гетерохроматин, гены-модификаторы PEV могли бы кодировать функции контроля либо формирования гетерохроматина, либо формирования эухроматина. Обнаружение зависимых от дозы модификаторов, как обсуждается выше, свидетельствует в пользу такой модели (Locke et al., 1988; Henikoff, 1996). И действительно, недавно были идентифицированы мутации Su(var), контролирующие баланс между эухроматином и гетерохроматином (Ebert et al., 2004). PEV-перестройки позволили нам визуализировать и изучить случаи, где гетерохроматиновая упаковка распространяется на фланкирующий эухроматиновый домен. Этот эффект распространения несомненно зависит от ряда молекулярных реакций в эухроматиновых районах. Известны несколько модификаций гистонов, которые являются взаимоисключающими и которые определяют эти альтернативные хромосомные состояния. Ацетилирование H3K9, метилирование H3K4 и фосфорилирование H3S10 — типичные метки активного эухроматина, тогда как метилирование H3K9, H3K27 и H4K20 является специфической меткой «молчащих» районов. Следовательно, гетерохроматинизация эухроматиновых районов требует специфических реакций деацетилирования, деметилирования и дефосфорилирования в эухроматине, как это изображено на рис. 5.6. Этот переход исходно зависит от деацетилирования H3K9 ферментом HDAC1 Мутации в гене rpd3, кодирующем специфическую для H3K9 деацетилазу гистонов HDAC1, являются сильными супрессорами PEV(Mottus et al., 2000), выступая антагонистами эффекта SU(VAR)3-9 в сайленсинге генов (Czermin et al., 2001). Как было показано, HDAC1 in vivo ассоциирован с комплексом SU(VAR)3-9/HPl; эти два энзима работают кооперативно, метилируя предацетилированные гистоны.

Недавно наблюдали, что распространение гетерохроматина в эухроматин полностью блокируется у мутантов Su(var)3-1 (Ebert et al., 2004). Мутации Su(var)3-1 являются мутациями сдвига рамки считывания в гене, кодирующем киназу JIL1; они приводят к экспрессии усеченного белка JIL1, не имеющего карбокситерминального района. Белок JIL1 содержит два киназных домена и катализирует фосфорилирование H3S10 в эухроматине. Мутации JIL1 Su(var)3 ~ 1 не влияют на фосфорилирование H3S10, но, вероятно, нарушают дефосфорилирование H3S10, эффективно подавляя метилирование H3K9. Это заставляет предположить участие фосфатазы. Неизвестно, участвует ли энзим РР1 (который был идентифицирован с помощью мутаций Su(var)3-5) (Baksa et al., 1993) непосредственно в этой реакции. Деметилирование H3K4 является, по-видимому, еще одной предпосылкой для гетерохроматинизации эухроматиновых районов. Недавние работы показали, что аминооксидаза LSD1 функционирует у млекопитающих как деметил аза H3K4 (Shi et al., 2005). Предполагаемый гомолог LSD1 у Drosophila, SU(VAR)3-3, облегчает распространение гетерохроматина в эухроматиновые районы во всех испытанных PEV-перестройках (S. Lein et al., неопубликовано). В соответствии с этим в нуль-клетках по Su(var)3-3, у которых нет LSD1, приобретение метилирования H3K9 в эухроматине, фланкирующем точку разрыва, отменяется, хотя конститутивно гетерохроматиновые районы не затрагиваются. Эти открытия показывают, что для удаления специфических для эухроматина меток модификаций гистонов необходима координированная функция нескольких энзимов, прежде чем может иметь место переход к гетерохроматиновой упаковке (см. рис. 5.6). Вполне вероятно, будет обнаружено, что эти необходимые энзимы образуют комплексы с SU(VAR)3-9/HPl, как это было уже показано для HDAC1.

 

6. Как формирование гетерохроматина «нацеливается» у

Drosophila

?

Хотя мы многое узнали о механистических аспектах и биохимии структуры гетерохроматина, как это описано выше, остается открытым вопрос о том, каким образом формирование гетерохроматина «нацеливается» на избранные районы генома в его нормальной конфигурации. Все гетерохроматиновые домены обладают некоторыми общими чертами, и две такие особенности признаны существенными входными сигналами [inputs] для сборки гетерохроматина на данной нуклеотидной последовательности ДНК: положение локуса относительно пространственно обособленных [distinct] субдоменов гетерохроматина в ядре и присутствие повторяющейся ДНК

Рис. 5.6. Переход из эухроматинового состояния в гетерохроматиновое состояние требует ряда изменений в модификациях гистонов

(а) Активные гены маркированы H3K4me2 и me3; эта метка, если присутствует, предположительно должна быть удалена LSD1 (у Drosophila пока еще не охарактеризован). В эухроматине НЗК9 в норме апетилирован; эта метка должна быть удалена деацетилазой гистонов, HDAC1. Фосфорилирование H3S10 может интерферировать с метилированием НЗК9; дефосфорилирование, по-видимому, происходит с участием фосфатазы, «нацеливаемой» взаимодействием с карбоксильным концом киназы JIL1 Эти переходы создают обстановку для приобретения модификаций, связанных с сайленсингом (показано на б ), в том числе метилирования НЗК9 белком SU(VAR)3-9, связывания НР1 и последующего метилирования Н4К20 белком SUV4-20, ферментом, рекрутируемым НР1. Может также происходить метилирование НЗК27 энзимом E(Z)

В целом гетерохроматиновые массы видны на периферии ядра и вокруг ядрышка. У эмбрионов Drosophila эта тенденция выражена еще более отчетливо. Гетерохроматиновые массы впервые видны в раннем эмбриогнезе, когда ядра перемещаются к периферии яйца. Раннее развитие у Drosophila является синцитиальным вплоть до 14-го цикла ядерных делений, когда образуются клеточные стенки между ядрами, и образуется типичная бластула (шарик из клеток). Гетерохромати новый материал (центромеры, четвертая хромосома) концентрируется на одной стороне ядра, ориентированной в сторону внешней поверхности яйца (Foe and Alberts, 1985). Такое пространственное подразделение ядра сохраняется в ходе развития, приводя к концепции [the concept] гетерохроматиновых «компартментов» в ядре. Эти компартменты могут поддерживать высокую концентрацию факторов, необходимых для формирования гетерохроматина (таких как НР1 и HKMTs), и в то же время могут быть лишены факторов, необходимых для сборки эухроматина и экспрессии генов (таких как HATs и RNA pol II). Действительно, было показано, что близость к гетерохроматиновым массам, как по положению вдоль по длине хромосомы, так и в трех измерениях, является одним из факторов в PEV.

Было показано, что близость к массе центрического [centric] гетерохроматина влияет на мозаицизм как для эухроматиновых генов (примером которых является white; см. выше), так и для гетерохроматиновых генов (наиболее изученными примерами которых являются light и rolled). Можно наблюдать, что гетерохроматиновые гены, картированные в эти домены, обнаруживают мозаичность, когда перестройка помещает их в непосредственной близости от эухроматина; обычно они демонстрируют противоположную зависимость, требуя для полной экспрессии нормальных уровней HP 1 и показывая усиление мозаичности, когда количество НР1 мало.

Мозаицизм light зависит не только от его близости к эухроматину, но и от положения точки разрыва а именно от расстояния от гетерохроматина, измеряемого по длине хромосомного плеча (Wakimoto and Hearn 1990). Аналогичные данные были опубликованы для rolled. Исследования brown dominant (bw D ), эухроматинового гена, мозаицизм экспрессии которого был индуцирован вставкой повторяющейся ДНК, показали, что сдвиг в степени близости этого локуса к центрическому гетерохроматину может приводить к усилению сайленсинга (если ближе) или подавлению сайленсинга (если дальше) (Henikoff et al., 1995). Аналогичным образом транслокация четвертой хромосомы, несушей репортер white, в дистальную половину хромосомного плеча 2L или 2R приводит к резкой утрате сайленсинга; в ядрах слюнных желез это коррелирует с изменением во внутриядерном расположении, вплоть до того, что часто оказываются занятыми сайты, удаленные от хромоцентра (Cryder-manetal., 1999а).

В недавнем исследовании с использованием микроскопии высокого разрешения изучали как активность гена (используя антитела, специфичные к продукту), так и ядерную локализацию репортера (используя FISH — fluorescence in situ hybridization) в одной и той же клетке в нормальных временных рамках экспрессии. Инверсия, вызывающая мозаицизм white, а также bw D и трансген lacZ с мозаичной экспрессией изучались в дифференцирующихся глазных дисках или в глазах взрослых мух. В этом исследовании обнаружили сильную корреляцию между положением репортерного гена в клеточном ядре по отношению к перицентромерному гетерохроматину и уровнем экспрессии, что говорило в пользу существования гетерохроматинового «компартмента» и корреляции между положением в этом компартменте и сайленсингом гена (Harmon and Sedat, 2005). Однако эта корреляция не является абсолютной. Это неудивительно, при том что исследования с репортером white указывают на присутствие как эухроматиновых, так и гетерохроматиновых доменов, чередующихся в маленькой четвертой хромосоме (которая всегда располагается вблизи массы перицентромерного гетерохроматина). Эти последние наблюдения указывают на другие локальные детерминанты, вносящие вклад в упаковку хроматина в той или в другой форме.

У D. melanogaster, согласно оценке по цитологическим критериям, одна треть генома является гетерохроматиновой. Сюда входят крупные блоки, которые фланкируют центромеры, более мелкие блоки, связанные с теломерами, вся Y-хромосома и большая часть маленькой четвертой хромосомы. Центромерные районы состоят из крупных (0,2—1 млн о.) блоков сателлитной ДНК, чередующихся с «островками» сложных нуклеотидных последовательностей, обычно мобильных элементов (Le et al., 1995). Эти районы, хотя и бедны генами, не лишены их вовсе; согласно современным оценкам, в перицентромерном гетерохроматине находятся несколько сотен генов (Hoskins et al., 2002). Теломеры Drosophila не содержат типичных повторов, обогащенных G, которые наблюдаются в других местах, но состоят из копий ретротранспозонов НеТ-А и TART. Ассоциированные с теломерами последовательности (TAS — telomere-associated sequences), блоки из повторов 102—103 нуклеотидов, обнаруживаются в проксимальном положении, и трансгенные репортеры white, вставленные в эти районы, демонстрируют мозаичный фенотип. Хотя Y-хромосома и несет гены для ряда факторов мужской фертильности, основная масса этой хромосомы составлена из сателлитной ДНК, и она остается конденсированной во всех клетках за исключением мужской зародышевой линии. Размеры маленькой четвертой хромосомы порядка 4,3 млн о., в том числе около 3 млн о., состоящих из сателлитной ДНК. Дистальные 1,2 млн о. могут считаться эухроматиновыми в том отношении, что они политенизированы в слюнной железе (см. рис. 5.4), но, судя по их поздней репликации, полному отсутствию в них меиотических обменов и по их связи с НР1, НР2 и H3K9me2, они, по-видимому, являются гетерохроматиновыми (рис. 5.4). Плотность фрагментов транспозонов в этом районе в шесть—семь раз выше, чем в эухроматиновых плечах, подобно участкам на границе между центрическим гетерохроматином и эухроматином на других хромосомах (Kaminker et al., 2002). Интересно, что в исследованиях четвертой хромосомы с помощью P-элемента с репортером white, обсуждавшегося выше (рис. 5.3а), обнаружили чередование как эухроматиновых доменов (приводящих к «красноглазому» фенотипу) так и гетерохроматиновых доменов (приводящих к мозаичному фенотипу) (Sun et al., 2004).

Эти данные заставляют предполагать присутствие локальных элементов в ДНК, способных управлять формированием гетерохроматина или эухроматина. Генетический скрининг на переключение фенотипа (с красной окраски на мозаичность и наоборот) показал, что локальные делеции или дупликации 5—80 т.о. ДНК, фланкирующей транспозонный репортер, могут приводить к утрате или приобретению мозаичности, указывая на наличие cis-действующих (на короткие расстояния) детерминантов сайленсинга (рис. 5.7). Этот сайленсинг зависит от НР1 и коррелирует с изменением в структуре хроматина, как показывает изменение в доступности для нуклеаз; все это указывает на сдвиг от эухроматинового к гетерохроматиновому состоянию. Данные по картированию в одном из районов четвертой хромосомы позволяют предполагать, что транспозон 1360 является мишенью для формирования гетерохроматина, и показывают, что, коль скоро формирование гетерохроматина начинается в диспергированных повторяющихся элементах, оно может распространяться вдоль по длине четвертой хромосомы примерно на 10 т.о. или пока не столкнется с конкуренцией со стороны эухроматинового детерминанта (Sun et al., 2004). Наблюдения, показывающие, что тандемные или инвертированные повторы репортерных Р- элементов приводят к формированию гетерохроматина и сайленсингу генов, также позволяют предполагать наличие действующих на короткие расстояния cis-активных детерминантов, связанных с числом копий (Dorer and Henikoff, 1994).

Такие cis-активные элементы в ДНК могли бы функционировать посредством сиквенс-специфичного связывания белка, способного включать формирование гетерохроматина Были идентифицированы белки, специфически связывающиеся с некоторыми из сателлитных ДНК (например, D1 — Aulner et al., 2002). Вывод о важности этих взаимодействий был сделан, исходя из влияния специфичных для сателлитной ДНК веществ, связывающихся с ДНК и способных подавлять PEV (Janssen et al., 2000). Однако данные, полученные на дрожжах и растениях (Elgin and Grewal, 2003; Matzke and Birchler, 2005; см. Главы 8 и 9), позволяют предложить другую модель, а именно, что некий основанный на RNAi механизм мог бы использоваться для «нацеливания» формирования гетерохроматина на повторяющиеся элементы. Работы из нескольких лабораторий показали, что система RNAi у Drosophila имеется и играет важную роль в регуляции в ходе развития посредством посттранскрипционного сайленсинга генов (PTGS). D. melanogaster обладает двумя генами, кодирующими белки DICER, и многочисленными генами (aubergine, AGO1, AGO2, spindle [известный также как homeless], vasa intronic gene [VIG], armitage, Fmr1), кодирующими компоненты или белки, необходимые для сборки индуцируемого РНК сайленсирующего комплекса (RISC) (Sontheimer, 2005). Участие этой системы предположили в PTGS повторяющихся последовательностей, особенно тандемно повторяющихся генов Stellate, нескольких ретротранспозонов и трансгенов Alcohol dehy-rogenase (Adh) и в транскрипционном сайленсинге (TGS) трансгенов Adh (Aravin et al., 2001; Pal-Bhadra et al., 2002). Пал-Бхадра с соавторами (Pal-Bhadra et al., 2004) обнаружили при прямом тестировании, что мутации вpiwi (член семейства домена PAZ) и homeless (DEAD-боксовая геликаза) подавляют PEV, связанный с тандемными порядками гена white, и что мутации в piwi, aubergine и homeless подавляют сайленсинг трансгена white P[hsp70-w] в перицентромерном гетерохроматине или четвертой хромосоме. Эта супрессия PEV была связана со значительным снижением уровня метилирования H3K9. Связанные с повторами малые интерферирующие РНК (rasiRNAs) были идентифицированы с 40 % известных мобильных элементов (включая 1360) и других повторяющихся последовательностей (Aravin et al., 2003).

Рис. 5.7. Возможная модель гетерохроматинового «нацеливания»

dsRNA с повторяющихся последовательностей процессируется с помощью RISC и генерирует гипотетический «комплекс нацеливания», который управляет либо модификацией гистонов, либо ассоциацией с НР1 как начальным этапом в сборке гетерохроматина в сайте, идентифицированном малой ssRNA. Данные, полученные на четвертой хромосоме, позволяют предположить, что фрагменты ДНК-транспозона 1360 ( оранжевые полосы ) являются мишенью для формирования гетерохроматина: локальные делеции или дупликации, которые сдвигают положение репортера R-элемента ( треугольник ) в сторону от элемента 1360, ведут к утрате сайленсинга ( красный треугольник обозначает красный глаз ), тогда как близость к 1360 приводит к сайленсингу ( треугольник с точками обозначает мозаичный глаз ) (на основе данных Sun et al., 2004)

В совокупности эти обсуждавшиеся выше результаты заставляют предполагать, что формирование гетерохроматина может зависеть как от ядерной локализации (возможно, создающих богатый пул требующихся белков), так и от специфического «нацеливания» на основе RNAi-распознавания и процессинга двунитевой РНК с повторяющихся элементов, в особенности некоторых из ДНК-транспозонов. Такое «нацеливание» посредством RISC могло бы привлечь либо метилтрансферазу гистона H3, либо комплекс, включающий НР1 (либо и то, и другое) к сайту для включения процесса сборки, обсуждавшегося в разделе 4.

 

7. Не весь гетерохроматин идентичен

Хотя в общих терминах гетерохроматин был описан выше, ясно, что гетерохроматиновые домены варьируют в деталях. Все гетерохроматиновые домены характеризуются повторяющейся ДНК (см. выше), но это может варьировать от тандемных последовательностей коротких повторов (сателлитная ДНК), обнаруживаемых в блоках в центромерных районах, до высокой плотности перемежающихся повторяющихся последовательностей, что наблюдается в четвертой хромосоме. В то время как все гетерохроматиновые районы, по-видимому, ассоциированы с НР1 и H3K9me2, ясно, что связанные с этим белковые комплексы должны отличаться в иных отношениях. Исследование влияния 70 разных модификаторов на разные гены, демонстрирующие мозаицизм (в том числе w т4 , bw D , репортеры R-элемента в перицентромерном гетерохроматине или в порядке [array] TAS), показало, что на фоне существенного перекрывания в мишенях модификаторов имеет место удивительная сложность. С помощью использованного набора тестов эти модификаторы разделили на семь разных групп с точки зрения их способности влиять на сайленсинг в данном компартменте (Donaldson et al., 2002). Интересно, что единственным модификатором в этой группе, влияющим на сайленсинг в порядке TAS, была новая аллель Su(var)3-9.

Эти различия несомненно отражают изменения в локальной биохимии или в энзимах, используемых для этого. Например, цитологические результаты показывают, что в то время, как H3K9me2 сильно концентрируется вдоль по длине четвертой хромосомы, ответственный за это энзим — это не SU(VAR)3-9 (Schotta et al., 2002; К.A. Haynes et al., неопубликовано). Даже в пределах перицентромерного гетерохроматина следует ожидать мозаицизм, принимая во внимание различия в составляющих его основу блоках ДНК, которые варьируют от сателлитной ДНК до кластеров перемежающихся повторов (Le et al., 1995), которые могли бы использовать разную смесь гетерохроматиновых белков. Последствия были видны в исследованиях, где изучали влияние разных блоков перицентромерного гетерохроматина на экспрессию с репортера, и можно было наблюдать, что степень выраженности [severity] фенотипа зависит не просто от количества гетерохроматина в cis-конфигурации, но варьирует в зависимости от локального гетерохроматинового окружения (Howe et al., 1995). Связанные с гетерохроматином белки, которые могут играть роль в специфических субдоменах, включают AT-hook белок D1, преимущественно связанный с сателлитом III с плотностью 1,688 г/см3 (Aulner et al., 2002), и DDP1, мульти-КН-доменный белок, гомологичный вигилину, который связывается с богатой пиримидинами С-нитью додекасателлита (Cortes and Azonn, 2000).

 

8. PEV, формирование гетерохроматина и сайленсинг генов у различных организмов

Явление мозаицизма, обусловленного эффектом положения (PEV), первоначально было установлено на Drosophla просто потому, что это был один из первых организмов, на которых для получения мутаций было использовано Х-излучение. Х-излучение с гораздо большей вероятностью, чем другие обычно используемые мутагены, индуцирует хромосомные перестройки, результатом которых может быть PEV. Сходные мутации были изолированы у мышей, где пятнистая окраска меха указывает на PEV. Генетический анализ выявил вставку аутосомного района, несущего аллели дикого типа генов окраски меха, в Х-хромосому (Cattanach, 1961; Russel and Bangham, 1961). Мозаичность наблюдается только у самок, несущих эту вставку в сочетании с гомозиготной мутацией в исходных генах окраски меха. У этих самок аллель дикого типа становится инактивированной вследствие Х-инактивации путем гетерохроматинизации (глава 17). У растений единственный несомненный случай PEV был описан у Oenothera blandina (Catcheside, 1939). В этих случаях, как и у Drosophila, PEV-сайленсинг эухроматиновых генов связан с перемещением этих генов в новое гетерохроматиновое окружение.

Транскрипционный сайленсинг генов наблюдали также для повторяющихся последовательностей (RIGS; repeat-induced gene silencing), особенно у растений. Анализ затрагиваемых последовательностей обнаружил появление эпигенетических меток (метилирование гистонов и ДНК), аналогичных тем, которые обнаруживаются в гетерохроматине и в районах, сайленсированных PEV. Если ввести в Arabidopsis фрагменты ДНК, содержащие тандемно расположенные гены люциферазы, наблюдается мозаичная экспрессия люциферазы. Опять-таки, за наблюдаемый сайленсинг генов отвечает формирование гетерохроматина. Лежащие в основе этого молекулярные механизмы консервативны у высших эукариотических организмов.

Центральной особенностью сайленсинга гетерохроматиновых генов у Drosophila является взаимодействие НР1 с H3K9me2 и HKMT SU(VAR)3-9. НР1 консервативен от дрожжей Schizosaccharomyces pombe до человека и неизменно связан с перицентромерным гетерохроматином. Гены НР1 человека можно использовать для «спасения» нехваток [deficiency] у Drosophila (Ма et al., 2001). Однако у растений НР1 как таковой не был идентифицирован. SU(VAR)3-9 представлен еще более широко, будучи идентифицирован у дробянковых дрожжей (Clr4), Neurospora (DIM5), Arabidopsis и млекопитающих (SUV39H). Все эти гомологи (SU(VAR)3-9 катализируют метилирование H3K9 и функционируют в формировании гетерохроматина. Опять-таки, трансген SUV39H1 человека может полностью компенсировать утрату эндогенного белка в мутантных линиях Drosophila (Schotta et al., 2002). У высших растений (Arabidopsis, рис и кукуруза) обнаружено несколько белков (SUVH), гомологичных SU(VAR)3-9 (Baumbusch et al, 2001). Большое число HKMTs может отражать пластичность развития у растений или необходимость реагировать на факторы внешней среды (см. дальнейшее обсуждение в главе 9). Четыре белка SUVH — SUVH1, SUVH2, SUVH4 (KYP) и SUVH6 - были изучены детально (Jackson et al., 2002; Naumann et al., 2005). Bee они оказались метилтрансферазами H3K9 гистонов. SUVH2 играет центральную роль в контроле состояний гетерохроматина, обнаруживая зависимое от дозы влияние на формирование гетерохроматина, подобное тому, что сообщалось для SU(VAR)3-9 Drosophila (Naumann et al., 2005). Утрата функции SUVH2 сильно подавляет зависимый от повторов сайленсинг, а сверхэкспрессия вызывает значительное усиление такого сайленсинга у растений с люциферазными трансгенами.

Другие гены, идентифицированные с помощью мутаций Su(var) Drosophila, кодируют белки с консервативными функциями. HKMT SUV4-20 была охарактеризована у млекопитающих и у Drosophila (Schotta et al., 2004). У этих организмов она контролирует триметилирование по H4K20. Деметилазы гистонов, ацетилазы и деацетилазы также являются консервативными (Т. Rudolph et al., неопубликовано). Эволюционный консерватизм многих ключевых энзимов, контролирующих модификацию гистонов, говорит в пользу идеи гистонового кода (Jenuwein and Allis, 2001). Однако изучение специфичных для хроматина меток модификации гистонов, наблюдающихся у Drosophila, млекопитающих и растений (Arabidopsis), выявляет и некоторые специфичные для рода элементы.

В число существенных признаков конститутивного гетерохроматина у млекопитающих входят H3K9me3, H3K27me1 и H4K20me3 (Peters etal., 2003; Rice etal., 2003; Schotta et al., 2004). Гетерохроматин Drosophila характеризуется H3K9me1/me2, H3K27me1/me2/me3 и H4K20me3 (Schotta et al., 2002, 2004; Ebert et al., 2004). В противоположность млекопитающим у Drosophila H3K9me3 недопредставлен. У млекопитающих H3K9me1 не является меткой гетерохроматина. У Arabidopsis, как у Drosophila, H3K9me1/me2 — метки гетерохроматина, тогда как H3K9me3 — эухроматиновая метка (Naumann et al., 2005). H3K27me1 и H3K27me2 являются гетерохроматиновыми метками у Arabidopsis, тогда как эти же метки у Drosophila обнаруживаются в эухроматине и гетерохроматине. H3K27me3 — исключительно эухроматиновая метка у Arabidopsis. H4K20mel у Arabidopsis является гетерохроматиновым, но H4K20me2 и H4K20me3 — эухроматиновыми. Еще одно бросающееся в глаза различие между Arabidopsis и животными касается хромосомного распределения фосфорилирования H3S10. Эта метка является гетерохроматиновой у Arabidopsis (A. Fischer and G. Reuter, неопубликовано), но эухроматиновой у Drosophila (Wang et al., 2001; Ebert et al., 2004). Сходство и различие в специфичных для гетерохроматина метках модификации гистонов между млекопитающими, Drosophila и Arabidopsis несомненно указывают на то, что гистоновый код не является полностью универсальным, а, скорее, существует в виде разных диалектов. -

 

9. Подведение итогов: мы не знаем о гетерохроматине очень многое

Хотя PEV предоставил нам чрезвычайные возможности для изучения формирования гетерохроматина и сайленсинга генов, сам этот фенотип остается загадочным. Почему мы наблюдаем мозаичный паттерн сайленсинга? Что нарушает равновесие, приводя к переключению с активного состояния в «молчащее» или наоборот? Почему этот эффект оказывается клонально наследуемым? PEV обычно анализируется как проблема поддержания репортерного гена в состоянии «ВКЛЮЧЕНО» или «ВЫКЛЮЧЕНО», но во многих случаях (особенно при использовании репортеров на базе Р-элемента) наблюдаются красные фасетки на желтом или бледно-оранжевом фоне, заставляя предполагать, что экспрессия генов была снижена единообразно, но что в некоторых клетках эта даун-регуляция была утрачена. Тщательный анализ таких линий мог бы привести к идентификации состояний хроматина с промежуточным влиянием на экспрессию генов. Хотя эти данные свидетельствуют в пользу грубой модели утраты или поддержания сайленсинга на основе действия масс, окончательная модель будет сложной, включающей многочисленные взаимодействующие белки (см., например, предложения Henikoff, 1996) Соблазнительно рассматривать нуклеосому как суммирующее устройство, собирающее модификации и выдающее результаты в терминах как конкретных паттернов связывания белков, так и возможности ремоделинга в этом районе. Состояние хроматина могло бы тогда отражать результаты конкуренции за достижение различных модификаций. Такая модель могла бы быть полезной в рассортировке отмеченных выше эффектов. Она также совместима с наблюдениями, показывающими, что частота сайленсинга репортера, зависимого от GAL4, чувствительна к уровню содержания GAL4 (Ahmad and Henikoff, 2001).

Система RNAi обеспечивает правдоподобный механизм «нацеливания» формирования гетерохроматина предположительно путем «нацеливания» комплекса, включающего НР1, HKMT H3K9 или оба этих белка. Однако многие вопросы остаются открытыми. Каков источник dsRNA? Должна ли эта РНК продуцироваться в cis-конфигурации (на что указывают результаты, полученные на S. pombe) или же она может действовать в trans-конфигурации (что заставляют предполагать результаты, полученные на растениях); т.е. может ли образование dsRNA с одного сайта 1360 привести к «нацеливанию» на все сайты 1360? Являются ли все повторяющиеся элементы потенциальными мишенями? Это кажется маловероятным, если учесть описанные выше данные анализа четвертой хромосомы. Если ключевую роль играет выборка повторяющихся элементов, что определяет этот выбор? Результаты, полученные на четвертой хромосоме, свидетельствуют, что плотность и распределение критичных повторяющихся элементов будет влиять на экспрессию генов, находящихся поблизости. Это говорит о необходимости выявлять этот признак при секвенировании генома.

Каким образом осуществляется распространение гетерохроматина и что является нормальными барьерами для такого распространения? Отметим, что нет никаких данных в пользу транзитивной RNAi у Drosophila, т.е. распространения сайленсинга на мишени в транскрипте, лежащие «вверх по течению» от последовательности dsRNA (Celotto and Gravely, 2002). Это согласуется с отсутствием доказательств в пользу какой-либо зависимой от РНК РНК-полимеразы в этой системе. Система сборки на основе взаимодействий НР1, H3K9me2 и HKMT вполне могла бы объяснить распространение гетерохроматина приблизительно на 10 т.о., как это наблюдается на четвертой хромосоме; этот тип распространения мог бы ограничиваться сайтом ацетилирования гистонов. Но что можно сказать о распространении, происходящем в перестройках, которое, как оказалось, простирается на сотни тысяч оснований? Эта форма распространения не является непрерывной [contiguous], но, опять-таки, критически зависит от белков хроматина, в особенности от JIL-1, выступающего в роли, которая не зависит от его киназной активности. Эти и другие вопросы остаются без ответа.

 

Благодарности

Мы благодарим Gabriella Farkas за создание используемых здесь рисунков, Anja Ebert за иммунопитологические фотографии и членов наших исследовательских групп за критический просмотр этой главы. Наша работа поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft и Epigenome Network of Excelelnce of the European Union (G.R.) и грантами National Institutes of Health (S.C.R.E.).

 

Литература

Ahmad K. and Henikoff S. 2001. Modulation of a transcription factor counteracts heterochromatin gene silencing in Drosophila. Cell 104: 839-847.

Aravin A.A., Numova H. M., Tulin A. V., Vagin, V.V., Rozovsky Y.M., and Gvozdev V.A. 2001. Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline. Curr. Biol. 11: 1017-1027.

Aravin A. A., Lagos-Quintana M.. Yalcin A., Zavolan M., Marks D., Snyder B., Gaasterland T., Meyer J., and Tuschl T. 2003. The small RNA profile during Drosophila melanogaster development. Dev. Cell 5: 337-350.

Ashbumer M., Golic K.G., and Hawley R.S. 2005a. Chromosomes. In Drosophila: A laboratory handbook. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, pp. 24-57.

Ashbumer M., Golic K.G., and Hawley R.S. 2005b. Position effect variegation. In Drosophila: A laboratory handbook, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, pp. 1007-1049.

Aulner N., Monod C, Mandicourt G., Jullien D., Cuvier O., Sail A., Janssen S., Laemmli U.K, and Kas E. 2002. The AT-hook protein D1 is essential for Drosophila melanogaster development and is implicated in position-effect variegation. Mol. Cell. Biol. 22: 1218-1232.

BaksaK., Morawietz H., Dombradi V., Axton M., Taubert H., Szabo G., Torok I., Gyurkovics H., Szoor B., Gloover D., et al., 1993. Mutations in the phosphatase 1 gene at 87B can differentially affect suppression of position-effect variegation and mitosis in Drosophila melanogaster. Genetics 135: 117-125.

Bannister A.J., Zegermann P., Patridge J.F., Miska E.A., Thomas J.O., Allshire T.C., and Kouzarides T. 2001. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature 410: 120-124.

Baumbusch L.O., ThorstensenT., Krauss V., Fischer A., Naumann K., Assalkhou R., Schulz I., Reuter G., and Aalen R. 2001. The Arabidopsis thaliana genome contains at least 29 active genes encoding SET domain proteins that can be assigned to four evolutionary conserved classes. Nucleic Acids Res. 29: 4319-4333.

Belyaeva E.S., Demakova O.V., Umbetova G.H., and Zhimulev I.F. 1993. Cytogenetic and molecular aspects of position-effect variegation in Drosophila melanogaster V. Heterochromatin-associated protein HP1 appears in euchromatic chromosoma] regions that are inactivated as a result of position-effect variegation. Chromosoma 102: 583-590.

Bender W., Spierer P., and Hogness D.S. 1983. Chromosome walking and r jumping to isolate DNA from the Ace and rosy loci and the bithorax complex of Drosophila melanogaster. J. Mol. Biol. 168: 17-33.

Birchler J.A., BhadraU., Rabinow L., Linsk R., and Nguyen-Huyuh A.T. 1994. Weakener of white (Wow), a gene that modifies the expression of white eye color locus and that suppresses position effect variegation in Drosophila melanogaster. Genetics 137: 1057-1070.

Bird A. 2002. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16: 6-21.

Bushey D. and Locke J. 2004. Mutations in Su(var)205 and Su(var)3-7 suppress P-element-dependent silencing in Drosophila melanogaster. Genetics 168: 1395-1411.

Catcheside D.G. 1939. A position effect in Oenothera. J. Genet. 38: 345-352.

Cattanach B.M. 1961. A chemically-induced variegated-type position effect in the mouse. Z. Vererbungsl. 92: 165-182.

Celotto A.M. and Graveley B.R. 2002 Exon-specific RNAi: A tool for dissecting the functional relevance of alternative splicing. RNA 8: 718-724.

Cleard F. and Spierer P. 2001. Position-effect variegation in Drosophila: The modifier Su(var)3-7 is a modular DNA-binding protein. EMBO Rep. 21: 1095-1100.

Cleard E, Delattre M., and Spierer P. 1997. SU(VAR)3-7 a Drosophila heterochromatin-associated protein and companion of HP1 in the genomic silencing of position-effect variegation. EMBO J. 16: 5280-5288.

Cooper K.W. 1959. Cytogenetic analysis of major heterochromatic elements (especially Xh and Y) in Drosophila melanogaster and the theory of “heterochromatin”. Chromosoma 10: 535-588.

Cortes A. and Azorin F. 2000. DDP1, a heterochromatin-asociated multi-KH-domain protein of Drosophila melanogaster, interacts specifically with centromeric satellite DNA sequences. Mol. Cell. Biol. 20: 3860-3869.

Cryderman D.E., Morris E.J., Biessmann H., Elgin S.C.R., and Wallrath L.L. 1999a. Silencing at Drosophila telomeres: Nuclear organization and chromatin structure play critical roles. EMBO J. 18: 3724-3735.

Cryderman D. E., Tang H., Bell C, Gilmour D.S., and Wallrath L.L. 1999b. Heterochromatic silencing of Drosophila heat shock genes acts at the level of promoter potentiation. Nucleic Acids Res. 27: 3364-3370.

Czermin B., Schotta G., Hblsmann B.B., Brehm A., Becker P.B., Reuter G., and Imhof A. 2001. Physical and functional interaction of SU(VAR)3-9 and HDAC1 m Drosophila. EMBO Rep. 2: 915-919.

Delattre M., Spierer A., Tonka C.H., and Spierer P. 2000. The genomic silencing of position-effect variegation in Drosophila melanogaster. Interaction between the heterochromatm-associated proteins Su(var)3-7 and HP1. J. Cell Sci. 113: 4253-4261

Demerec M. and Slizynska H. 1937. Mottled white 258-18 of Drosophila melanogaster. Genetics 22: 641-649.

Donaldson K.M., Lui A., and Karpen G.H. 2002. Modifiers of terminal deficiency-associated position effect variegation in Drosophila. Genetics 160: 995-1009.

Dorer D.R. and Henikoff S. 1994. Expansion of transgene repeats causes heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila. Cell 77: 993-1002.

Dorn R., Krauss V., Reuter G., and Saumweber H. 1993a. The enhancer of position-effect variegation E(var)93D, codes for a chromatin protein containing a conserved domain common to several transcriptional regulators. Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 11376-11380.

Dorn R., Szidonya J., Korge G., Sehnen M., Taubert H., Archouk-ieh I., Tschiersch B., Morawietz H., Wustmann G., Hoffmann G., and Reuter G. 1993b. P Transposon-induced dominant enhancer mutations of position-effect variegation in Drosophila melanogaster. Genetics 133: 279-290.

Ebert A., Schotta G., Lein S., Kubicek S., Krauss V., Jenuwein T., and Reuter G. 2004. Su(var) genes regulate the balance between euchromatin and heterochromatin in Drosophila. Genes Dev. 18: 2973-2983.

Eissenberg J.C., Morris G.D., Reuter G., and Hartnett T. 1992. The heterochromatin-associated protein HP-1 is an essential protein in Drosophila with dosage-dependent effects on position-effect variegation. Genetics 131: 345-352.

Eissenberg J.C., James T.C., Foster-Hartnett D.M., Hartnett T., Ngan V., and Elgin S.C.R. 1990. A mutation in a heterochromatin-specific chromosomal protein is associated with suppression of position effect variegation in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 9923-9927.

Elgin S.C.R. and Grewal S.I.S. 2003. Heterochromatin: Silence is Golden. Curr. Biol. 13: R895-R898.

Fanti L. and Pimpinelli S. 2004. Immunostaining of squash preparations of chromosomes of larval brains. Methods Mol. Biol. 247: 353-361.

Fanti L., Giovinazzo G., Berloco M., and Pimpinelli S. 1998. The heterochromatin protein 1 prevents telomere fusions in Drosophila. Mol. Cell 2: 527-538.

Farkas G., Gausz J., Galloni M., Reuter G., Gyurkovics H., and Krach F. 1994. The trithorax-like gene encodes the Drosophila GAGA factor. Nature 371: 806-808.

Fischle W., Wang Y.. Jacobs S.A., Kim Y., Allis C.D., and Khorasani-zadeh S. 2003. Molecular basis for the discrimination of repres sive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains. Genes Dev. 17: 1870-1881.

Flybase 2005. The Drosophila database. Available from World Wide Web at the URLs http://morganZharvard.edu and http://www.ebi.ac.uk/flybase/

Foe V.E. and Alberts B.M. 1985. Reversible chromosome condensation induced in Drosophila embryos by anoxia: Visualization of interphase nuclear organization. /. Cell Biol. 100: 1623-1636.

Harmon B. and Sedat J. 2005. Cell-by-cell dissection of gene expression and chromosomal interactions reveals consequences of nuclear reorganization. PLoS Biol. 3: e67.

Hartmann-Goldstein I. J. 1967. On the relationship between hetero-chromatization and variegation in Drosophila, with special reference to temperature sensitive periods. Genet. Res. 10: 143-159.

Henikoff S. 1996. Dosage-dependent modification of position-effect variegation in Drosophila. Bio Essays 18: 401-409.

Henikoff S., Jackson J.M., and Talbert P.B. 1995. Distance and pairing effects on the brown Dominant heterochromatic element in Drosophila. Genetics 140: 1007-1017.

Hoskins R.A., Smith C.D., Carlson J.W., Carvalho A.B., Halpem A., Kaminker J.S., Kennedey C, Mungall C.J., Sullivan B.A., Sutton G.G., et al., 2002. Heterochromatic sequences in a Drosophila whole-genome shotgun assembly. Genome Biol. 3: RESEARCH0085

Howe M., Dimitri P., Berloco M.. and Wakimoto B.T 1995. cis-effects of heterochromatin on heterochromatic and euchromatic gene activity in Drosophila melanogaster. Genetics. 140: 1033-1045.

Jackson J.P., Lindroth A.M., CaoX., and Jacobsen S.E. 2002. Control of CpNpG DNA methylation by the KRYPONITE histone H3 methyl -transferase. Nature 416: 556-560.

James T.C. and Elgin S.C.R. 1986. Identification of a nonhistone chromosomal protein associated with heterochromatin in Drosophila melanogaster and its gene. Mol. Cell Biol. 6: 3862-3872.

James T.C, Eissenberg J.C, Craig C, Dietrich V., Hobson A., and Elgin S.C.R. 1989. Distribution patterns of HP1, a heterochromatin-associated nonhistone chromosomal protein of Drosophila Eur. J. Cell Biol. 50: 170-180.

Janssen S., Cuvier O., Muller M, and Laemmli U.K. 2000. Specific gain- and loss-of-function phenotypes induced by satellite-specific DNA-binding drugs fed to Drosophila melanogaster. Mol Cell 6: 1013-1024.

Jenuwein T. and Allis CD. 2001. Translating the histone code. Science 293: 1074-1080.

Jones R.S. and Gelbart W.M. 1993. The Drosophila Polycomb-group gene Enhancer of zeste contains a region with sequence similarity to trithorax. Mol. Cell. Biol. 13: 6357-6366.

Kaminker J.S. Bergman CM., Kronmiller B., Carlson J., Svir-skas R., Patel S., Frise E., Wheeler D.A., Lewis S.E., Rubin CM., et al., 2002. The transposable elements of the Drosophila melanogaster genome: A genomics perspective. Genome Biol. 3: RESEARCH0084.

Karpen G.H. and Spradling A.C. 1990. Reduced DNA polytenization of a minichromosorne region undergoing position-effect variegation in Drosophila. Cell 63: 97-107.

Krauss V. and Reuter G. 2000. Two genes become one: The genes encoding heterochromatin protein SU(VAR)3-9 and translation initiation factor subunit elF-2y are joined to a dicistronic unit in holometabolic insects. Genetics 156: 1157-1167.

Kunert N., Marhold J., Stanke J., Stach D., and Lyko F. 2003. A Dnmt2-like protein mediates DNA methylation in Drosophila. Development 130: 5083-5090.

Lachner M., O’Carroll D., Rea S., Mechtler K., and Jenuwein T. 2001. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature 410: 116-120.

Laible G., Wolf A., Dorn R., Reuter C, Nislow C, Lebesorger A., Popkin D., Pillus L., and Jenuwein T 1997. Mammalian homo-logues of the Polycomb-group gene Enhancer of zeste mediate gene silencing in Drosophila heterochromatin and at S. cerevisiae. EMBO J. 16: 3219-3232.

Larsson J., Zhang J., and Rasmuson-Lestander A. 1996. Mutations in the Drosophila melanogaster S-adenosylmethionine synthase suppress position-effect variegation. Genetics 143: 887-896.

Le M.H., Duricka D., and Karpen G.H. 1995. Islands of complex DNA are widespread in Drosophila centric heterochromatin. Genetics 141: 283-303.

Locke J.. Kotarski M.A.,and Tartof K.D. 1988. Dosage-dependent modifiers of position effect variegation in Drosophila and a mass action model that explains their effect. Genetics 120: 181-198.

Lu B.Y., Bishop C.P., and Eissenberg J.C 1996. Developmetal timing and tissue specificity of heterochromatin-mediated silencing. EMBO J. 15: 1323-1332.

Ma J., Hwang K.K., Worman H.J., Courvalin J.C, and Eissenberg J.C. 2001. Expression and functional analysis of three isoforms of human heterochromatin-associated protein HP1 in Drosophila. Chromosoma 109: 536-544.

Martienssen R.A. and Colot V. 2001. DNA methylation and epigenetic inheritance in plants and filamentous fungi. Science 293: 1070-1074.

Mason J.M., Ransom J., and Konev A.Y. 2004. A deficiency screen for dominant suppressors of telomeric silencing in Drosophila. Genetics 168: 1353-1370.

Matzke M.A. and Birchler J.A. 2005. RNAi-mediated pathways in the nucleus. Nat. Rev. Genet. 6: 24-35

Mottus R., Sobels R.E., and Grigliatti T.A. 2000. Mutational analysis of a histone deacetylase in Drosophila melanogaster: Missense mutations suppress gene silencing associated with position effect variegation. Genetics 154: 657-668.

Muller H.J. 1930. Types of visible variations induced by X-rays in Drosophila. J. Genet. 22: 299-334.

Naumann K., Fischer A., Hofmann I., Krauss V., Phalke S., Irmler K., Hause G., Aurich A.C., Dorn R., Jenuwein T., and Reuter G. 2005. Pivotal role oL4/SUVH2 in control of heterochromatic histone methylation and gene silencing in Arabidopsis. EMBO J. 24: 1418-1429.

PaJ-Bhadra M., Bhadra U., and Birchler J.A. 2002. RNAi related mechanisms affect both transcriptional and post-transcriptional transgene silencing in Drosophila. Mol. Cell 9: 315-327.

Pal-Bhadra M., Leibovitch B.A., Gandhi S.G., Rao M., Bhadra U., Birchler J.A., and Elgin S.C.R. 2004. Heterochromatic silencing and HP1 localization in Drosophila are dependent on the RNAi machinery. Science 303: 669-672.

Paro R. and Hogness D.S. 1991. The Polycomb protein shares a homologous domain with a heterochromatin-associated protein of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 263-267.

Peters A.H.F.M., Kubicek S., Mechtler K., OSullivan J., Derijck A.A.H.A., Perez-Burgos L., Kohlmaier A., Opravil S., Tachibana M., Shinkai Y., et al., 2003. Partitioning and plasticity of repressive histone methylation states in mammalian chromatin. Mol. Cell 12: 1577-1589.

Platero J.S., Sharp E.J., Adler P.N., and Eissenberg J.C. 1996. In vivo assay for protein-protein interaction using Drosophila chromosomes. Chromosoma 104: 393-404.

Rea S., Eisenhaber R, O’Carroll D., Strahl B.D., Sun Z-W., Schmid M., Opravil S., Mechtler K., Ponting C.P., Allis C.D., and Jenuwein T. 2000. Regulation of chromatin structure by site-specific histone H3 methyltransferases. Nature 406: 593-599.

Reuter G., Werner W., and Hofmann H.J. 1982. Mutants affecting position-effect heterochromatinization in Drosophila melanogaster. Chromosoma 85: 539-551.

Reuter G., Wolff I., and Friede B. 1985. Functional properties of the heterochromatic sequences inducing w m4 position-effect variegation in Drosophila melanogaster. Chromosoma 93: 132-139.

Reuter G., Giarre N., Farah J., Gausz J., Spierer A., and Spierer P. 1990. Dependence of position-effect variegation in Drosophila on dose of a gene encoding an unusual zinc-finger protein. Nature 344: 219-223.

Rice J.C, Briggs S.D., Ueberheide B., Barber C. M., Shabanowitz J., Hunt D.F., Shinkai Y., and Allis CD. 2003. Histone methyltransferases direct different degrees of methylation to define distinct chromatin domains. Mol. Cell 12: 1591-1598.

Richards E.J. and Elgin S.C.R. 2002. Epigenetic codes for heterochromatin formation and silencing: Rounding up the usual suspects Cell 108: 489-500.

Russel L.B. and Bangham J.W. 1961. Variegated type position effects in the mouse. Genetics 46: 509-525.

Schotta C., Ebert A., Krauss V., Fischer A., Hoffmann J., Rea S., Jenuwein T, and Reuter G. 2002. Central role of Drosophila SU(VAR)3-9 in histone H3-K9 methylation and heterochromatic gene silencing. EMBO J. 21: 1121-1131.

Schotta C., Ebert A., Dorn R., and Reuter G. 2003. Position-effect variegation and the genetic dissection of chromatin regulation in Drosophila. Semin. Cell Dev. Biol. 14: 67-75.

Schotta G., Lachner M., Sarma K., Ebert A., Sengupta R., Reuter G., Reinberg D., and Jenuwein T. 2004. A silencing pathway to induce H3-K9 and H4-K20 trimethylation at constitutive heterochromatin. Genes Dev. 18: 1251-1262.

Schultz J. 1950. Interrelations of factors affecting heterochromatin-induced variegation in Drosophila. Genetics 35: 134.

Seum C., Pauli D., Delattre M., Jaquet Y., Spierer A., and Spierer P. 2002. Isolation of Su(var)3- 7mutations by homologous recombination in Drosophila melanogaster. Genetics 161: 1125-1136.

Shaffer C.D., Stephens G.E., Thompson B.A., Funches L., Bemat J.A., Craig C.A., and Elgin S.C.R. 2002. Heterochromatin protein 2 (HP2), a partner of HP1 in Drosophila heterochromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 14332-14337.

Shi Y., Lan E., Matson C., Mulligan P., Wlietstine J.R., Cole P.A., Casero R.A., and ShiY. 2005. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell 119: 941-953.

Silver L.M., and Elgin S.C.R. 1976. A method for determination of the in situ distribution of chromosomal proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 73: 423-427.

Sinclair D.A.R., Mottus R.C, and Grigliatti T.A. 1983. Genes which suppress position effect variegation in Drosophila melanogaster axe clustered. Mol. Gen. Genet. 191: 326-333.

Sinclair D.A.R., Clegg N.J, Antonchuk J, Milner T.A., Stankunas K., Ruse C, Grigliatti T.A., Kassis J., and Brock H.W 1998. Enhancer of Polycomb is a suppressor of position-effect variegation in Drosophila melanogaster. Genetics 148: 211-220.

Sontheimer E.J. 2005. Assembly and function of RNA silencing complexes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6: 127-138.

Spofford J.B. 1967. Single-locus modification of position-effect variegation in Drosophila melanogaster. I. white variegation. Genetics 57: 751-766.

Stephens G.E., Craig C.A., LKY, Wallrath L.L., and Elgin S.C.R. 2003. Immunofluorescent staining of polytene chromosomes: Exploiting genetic tools. Methods Enzymol. 376: 372- 393.

Sun F.-L., Cuaycong M.H., and Elgin S.C.R. 2001. Long-range nucleosome ordering is associated with gene silencing in Drosophila melanogaster pericentromeric heterochromatin. Mol. Cell. Biol. 21: 2867-2879.

Sun F.-L., Haynes K., Simpson C.L., Lee S.D., Collins L., Wuller J., Eissenberg J.C., and Elgin S.C.R. 2004. cis-acting determinants of heterochromatic formation on Drosophila melanogaster chromosome four. Mol. Cell. Biol. 24: 8210-8220.

Tartof K.D., Hobbs C., and Johnes M. 1984. A structural basis of variegating position effects. Cell 37: 869-878.

Tschiersch B., Hofmann A., Krauss V., Dorn R., Korge G., and Reuter G. 1994. The protein encoded by the Drosophila position effect variegation suppressor gene Su(var)3- 9 combines domains of antagonistic regulators of homeotic gene complexes. EMBO J. 13: 3822-3831.

Wakimoto B.T. and Heam M.G. 1990. The effects of chromosome rearrangements on the expression of heterochromatic genes in chromosome 2L of Drosophila melanogaster. Genetics 125: 141-154.

Wallrath L.L. and Elgin S.C.R. 1995. Position effect variegation in Drosophila is associated with an altered chromatin structure. Genes Dev. 9: 1263-1277.

Wallrath L.L., Gunter V.P., Rosman L.E., and Elgm S.C.R. 1996. DNA representation of variegating heterochromatic P element inserts in diploid and polytene tissue of Drosophila melanogaster. Chromosoma 104: 519-527.

Wang Y., Zhang W., Jin Y., Johansen J., and Johansen K.M. 2001. The JIL-1 tandem kinase mediates histone H3 phosphorylation and is required for maintenance of chromatin structure in Drosophila. Cell 105: 433-443.

Zhimulev I.F., Belyaeva E.S., Fomina O.V, Protopopov M.O., and Bolsh-kov VN. 1986. Cytogenetic and molecular aspects of position effect variegation in Drosophila melanogaster. Chromosoma 94: 492-504.