Дробянковые дрожжи, S. pombe, обнаружены при брожении, связанном с производством пива в субтропических регионах; «pombe», в сущности, и означает «пиво» на языке суахили. S. pombe, в основном, являются гаплоидными (1N) одноклеточными организмами. В богатой питательными веществами среде клетки дикого типа претерпевают митотическое деление приблизительно каждые 2 часа. Но можно использовать целый ряд условий или условных мутантов, чтобы заблокировать клетки на разных стадиях клеточного цикла или синхронизировать клеточные культуры в G/S, G2 или в метафазе. Это особенно полезно, поскольку фаза G1 у быстро растущих культур очень короткая, и клетки почти немедленно переходят после цитокинеза в фазу S; основная часть клеточного цикла приходится на G2 (рис. 1) (Egel, 2004).

Рис. 6.1. Жизненный цикл дробянковых дрожжей S. pombe

Дробянковые дрожжи имеют короткую G1, занимающую менее 10 % клеточного цикла (покрытая пунктиром площадь расширена для облегчения восприятия). В богатой питательными веществами среде клетки, находящиеся в фазе G1, переходят в фазу S. за которой следуют длительная G2 (-70 % клеточного цикла), митоз и цитокинез. В условиях азотного голодания клетки противоположных типов спаривания (+ и -) конъюгируют, после чего ядра сливаются в процессе, называемом кариогамией. Премейотическая репликация и рекомбинация делают возможным прохождение мейоза I и II; в результате образуются четыре ядра, которые обособляются в четыре споры, заключенные в аск. Перенос в среду, богатую питательными веществами, вызывает прорастание спор и возобновление вегетативного клеточного цикла

Подобно S. cerevisiae, S. pombe может переключаться с одного из противоположных типов спаривания на другой; эти типы спаривания называются Плюс (+) и Минус (-). Типы спаривания эквивалентны диморфным полам у высших эукариот, хотя они гаплоидны. Информация для обоих типов спаривания находится в геноме в виде эпигенетически регулируемых «молчащих» кассет — локусов mat2-Р(+) или mat3-М(-). Эти «молчащие» локусы обеспечивают генетическую матрицу для идентичности по типу спаривания, но сам тип спаривания определяется тем, какая конкретная информация (+ или -) находится в активном локусе mat1 Переключение информации в активном локусе mat1 (и, следовательно, типа спаривания) происходит путем рекомбинации между «молчащим» локусом и локусом mat1 в соответствии со строгим паттерном (Egel, 2004). В условиях азотного голодания клетки перестают делиться и останавливаются в G,, что активирует половую фазу жизненного цикла — конъюгацию пар клеток + и — с образованием диплоидных зигот (рис. 6.1). После спаривания и слияния ядер происходит премейотическая репликация (увеличивающая содержание ДНК с 2N до 4N). затем происходят спаривание и рекомбинация гомологичных хромосом, и за этим следует редукционное деление мейоза 1 и эквационное деление мейоза II. Это дает четыре отдельных гаплоидных ядра (1N), которые инкапсулируются в споры, заключенные в аск. Последующее предоставление богатого источника питательных веществ делает возможным прорастание спор и возобновление вегетативного роста и митотического деления клеток.

Были изолированы или сконструированы непереключающиеся дериваты, у которых все клетки относятся либо к «+»-, либо к «-»-типу спаривания. Это облегчает контролируемое спаривание между штаммами разных генотипов. Хотя в норме S. pombe гаплоидны, можно отселектировать диплоидные штаммы Такие диплоидные клетки могут затем делиться митозом в ходе вегетативного роста до начала азотного голодания, когда они также претерпевают мейоз и образуют «азиготические аски» (рис. 6.1).

1.1. Сайленсинг хроматина у S.

pombe

отличается от такового у S.

cerevisiae

Дробянковые дрожжи являются очень полезным модельным организмом для изучения «молчащего» хроматина и связанных с этим эпигенетических эффектов. Они непохожи на S. cerevisiae, но более сходны с N. crassa, растениями и многоклеточными животными в отношении механизмов, которые они используют для достижения сайленсинга через гетерохроматин. И у S. cerevisiae, и у S. pombe теломеры и районы локусов типа спаривания в геноме подвержены сайленсингу, и, кроме того, у S. pombe сайленсинг обнаруживают центромеры. Однако, как описано в главе 4, S. cerevisiae используют для достижения сайленсинга хроматина уникальный набор белков — белки Sir. С другой стороны, дробянковые дрожжи и другие эукариоты, по-видимому, используют сочетание различных модификаций гистонов (в частности, метилирование гистона H3K9) и белки РНК-интерфернции (RNAi) для того, чтобы сайленсировать хроматин. Как детально обсуждается ниже, в исследованиях на S. pombe обнаружили, что этот «молчащий» хроматин имеет существенное значение для функционирования каждого специализированного района гетерохроматина (т.е. центромер и локусов типа спаривания). В центромерах гетерохроматин необходим для обеспечения нормального расхождения хромосом (Allshire et al., 1995; Ekwall et al., 1995), тогда как в локусах типа спаривания он облегчает и регулирует переключение типа спаривания (обзор см. Egel, 2004). Кроме того, «молчащий» хроматин формируется по соседству с теломерами, хотя для этого теломерного «молчащего» хроматина еще нужно найти функцию (Nimmo et al., 1994; Kanoh et al., 2005). Маркерные гены, вставленные в рДНК, тоже сайленсируются (Thon and Verhein-Hansen 2000; Cam et al., 2005).

В отличие от N. crassa и высших эукариот, у S. pombe, по-видимому, отсутствует сколько-нибудь заметное метилирование ДНК (Wilkinson et al., 1995) — обычный механизм, используемый для сайленсирования хроматина у многих эукариот (главы 9 и 18); так, сайленсинг у дробянковых дрожжей опосредован главным образом модификациями хроматина. Как обсуждается ниже, для установления этих модификаций и, таким образом, «молчащего» хроматина используется машинерия RNAi.

1.2. Гены, помещенные в центромеры дробянковых дрожжей, сайленсированы

Формирование гетерохроматина в центромерах дробянковых дрожжей важно для обеспечения нормального расхождения хромосом при делении ядра. Исследования показали, что центромера в действительности состоит из двух различных хроматиновых структур: гетерохроматина и содержащего CENP-Акинетохорного хроматина Это было продемонстрировано путем изучения варьирующего сайленсинга репортерных генов, вставленных в разные центромерные участки.

На уровне ДНК центромерные районы у дробянковых дрожжей состоят из внешних [outer] повторов (подразделенных на элементы, известные как dg и dh, или К и L), которые фланкируют центральный домен, включающий внутренние [inner] повторы (imr, или В), и центральный кор (cnt, или СС) (рис. 6.2а). Три центромеры, сеп 1, cen2 и cen3, занимают -40, -60 и -120 т.о. на хромосомах I, II и III, соответственно (обзоры см. Egel, 2004; Pidoux and Allshire, 2004). Повторяющаяся природа центромерной ДНК у дробянковых дрожжей напоминает более крупные, более сложные повторяющиеся структуры, связанные с центромерами многих многоклеточных животных, но с ними легче манипулировать (Takahashi et al., 1992; Steiner et al., 1993; Ngan and Clarke, 1997). Поскольку у других эукариот повторяющаяся ДНК часто коррелирует с присутствием гетерохроматина (см. также главу 5), наличие повторяющейся ДНК в центромерах дробянковых дрожжей позволяет предполагать, что они могли бы обладать такими свойствами гетерохроматина, как способность препятствовать экспрессии генов. Как описывается ниже, два блока гетерохроматина фланкируют центральный домен каждой центромеры дробянковых дрожжей. Сам этот центральный домен собран в хроматин другого типа (CENP-A-хроматин), который отличается от соседнего гетерохроматина.

Хорошо известно, что тип хроматина, окружающего ген, может сильно влиять на его экспрессию. Первоначально это было продемонстрировано у плодовой мушки Drosophila melanogaster, где хромосомные перестройки, перемещающие ген white в соседство с центромерным гетерохроматином, приводят к его варьирующей экспрессии в глазных фасетках и, таким образом, к мозаичной окраске глаза (см. рис. 5.1 в главе 5). Сейчас очевидно, что трансгены у многих организмов могут испытывать влияние того окружения, в котором они оказались.

У дробянковых дрожжей сайленсинг генов можно отслеживать с помощью фенотипических тестов, подобных тем, которые используются у S. cerevisiae и оценивают экспрессию репортерных генов. Например, когда репортер ura4 + сайленсирован, формируются колонии, резистентные к 5-фтороротовой кислоте. Другой пример: сайленсинг репортера ade6 + приводит к образованию красных, а не белых колоний (рис. 6.3а). Перемещение нормально экспрессирующегося гена, такого как ura4 + или ade6+, внутрь центромеры (что определяется по элементам внешних повторов и центрального домена) приводит к его транскрипционному сайленсингу. Сайленсинг во внешних повторах очень прочный — такой, что большинство клеток формируют колонии, в которых стабильно поддерживается репрессия маркеров (т.е. в случае репортера ade64 формируются красные колонии). Однако в центральном домене сайленсинг ade6 + сравнительно нестабилен, результатом чего являются мозаичные колонии, выглядящие как секторированные колонии с красными, белыми либо краснобелыми секторами (рис. 6.3а). Однако на расстоянии всего 1 т.о. дистально от внешних повторов никакого сайленсинга не происходит (Allshire et al., 1994, 1995), показывая тем самым, что эта репрессия транскрипции ограничена центромерой, определяемой центральным доменом и фланкирующими внешними повторами.

Рис. 6.2. Отличающийся гетерохроматин внешних повторов и центральные кинетохорные домены в центромерах дробянковых дрожжей

(а) Изображение центромеры дробянковых дрожжей. Центральный домен ( розовый цвет , кинетохор) состоит из элементов imr и cnt, внешние повторы содержат транскрибируемые повторы dg и dh ( зеленый цвет , гетерохроматин) Все три центромеры имеют сходное общее устройство; однако число внешних повторов различается: cenl (10 т.о.) имеет два, cen2 (65 n/j/) имеет три и cen3 — приблизительно тринадцать. Кластеры генов тРНК ( двойные концы стрелок ) находятся в районе imr и на концах всех трех центромер. Транскрипция маркерных генов, помещенных внутрь внешних повторов или в центральный домен, сайленсируется. (b) Гетерохроматин : внешние повторы упакованы в нуклеосомы, которые метилированы по H3K9me2, что делает возможным связывание хромодоменных белков Chp1, Chp2 и Swi6. Центральный «кинетохорный» хроматин : CENP-A обнаруживается в центральном домене, где он, вероятно, замещает большую часть H3, чтобы сформировать специализированные нуклеосомы ( розовые квадратики ). Было показано, что, в дополнение к CENP-A, несколько кинетохорных белков (указаны) связываются с нуклеотидными последовательностями центрального домена, но не с внешними повторами. Сборка кинетохора в центральном домене опосредует прикрепление к микротрубочкам после образования веретена и расхождение хромосом. Мутация компонентов гетерохроматина облегчает сайленсинг маркерных генов во внешних повторах, но не в центральном домене. Дефекты в некоторых компонентах кинетохора делают возможной экспрессию маркерных генов в центральном домене, но не во внешних повторах

1.3. Центромеры дробянковых дрожжей состоят из разных гетерохроматиновых и центральных кинетохорных доменов

У дробянковых дрожжей разница в качестве сайленсинга по длине центромер отражает тот факт, что репрессия транскрипции является результатом разных хроматиновых структур, включая ассоциации различных негистоновых белков, во внешних повторах и в центральном домене (Partridge et al., 2000). Имеются две разные хроматиновые структуры, которые были охарактеризованы в центромерных районах дробянковых дрожжей: гетерохроматин над участками внешних повторов и хроматин «CENP-А», покрывающий центральный домен, где собирается кинетохор. В этих двух доменах с сайленсингом репортерных генов связаны (и для него требуются) разные белки.

Гетерохроматин

В хроматине аминотерминальные «хвосты» гистонов H3 и Н4 подвержены ряду посттрансляционных модификаций, которые обычно коррелируют с активными или репрессивными состояниями (глава 3). Центромерный гетерохроматин во внешних повторах ассоциируется с ди- и триметильными состояниями гистона H3 по лизину 9 (H3K9me2 и H3K9me3) (Nakayama et al., 2001; Yamada et al., 2005). Для формирования центромерного гетерохроматина требуется действие нескольких белков, модифицирующих хроматин и, тем самым, стимулирующих связывание других факторов. Для формирования гетерохроматина сначала требуются деацетилазы гистонов (HDACs; такие как ClrЗ, Clr6 и Sir2), чтобы деацетилировать гистон H3. Это впоследствии позволяет метил-трансферазе лизина гистонов (HKMT) Clr4 метилировать гистон H3 по лизину 9 над центромерными внешними повторами. Эта модификация создает специфический сайт связывания, который распознается хромодоменным мотивом, присутствующим в Swi6 и Chp2 (гомологах гетерохроматинового белка 1 [НР1], описываемого в главе 5) и в еще одном хромодоменном белке Chp1 (рис. 6.26). Все эти белки вносят вклад в формирование «молчащего» хроматина над внешними повторами (Allshire et al., 1995; Cowieson et al., 2000; Partridge et al., 2000; Bannister et al., 2001; Nakayama et al., 2001; Shankaranarayana et al., 2003; Sadaie et al., 2004).

Рис. 6.3. Мозаицизм и облегчение сайленсинга маркерных генов

(а) Экспрессия ade6+ из центрального домена носит мозаичный характер, давая в результате красные, белые и секторированные колонии. Клетки, экспрессирующие ade6+, образуют белые колонии; когда же ade6+ репрессирован, образуются красные колонии, (б) ade6+, вставленный во внешние повторы, накрепко сайленсирован, что в результате дает однородные красные колонии. Для этого сайленсинга требуются белки гетерохроматина, такие как Swi6 (который связывается с метилированным H3K9). и компоненты RNAi, такие как Dcr1 (Dicer, РНКаза-III-рибонуклеаза)

Хроматин, ассоциированный со вставками репортерного гена во внешние повторы (например, гена ura4+), заметно обогащен белками H3K9me2 и Swi6. Это показывает, что модификация хроматина и Swi6 могут распространяться из соседней центромерной повторяющейся ДНК в вклинивающиеся [interposing] последовательности (Cowieson et al., 2000; Nakayama et al., 2001). Локализация Swi6 и сайленсинг зависят от метилирования H3K9, что иллюстрируется нарушением локализации Swi6 в клетках, у которых нет специфичной для H3K9 HKMT, Clr4, или у мутантов по H3, где лизин 9 замещен аргинином (Ekwall et al., 1996; Mellone et al., 2003). Белок Swi6 димеризуется через свой «chromoshadow»-домен (Cowieson et al., 2000) и это, вероятно, облегчает его распространение вдоль хроматиновых фибрилл, которому способствует последовательное действие HDACs и специфичной для H3K9 HKMT Clr4.

Кроме Swi6, с хроматином внешних повторов в центромерах ассоциируются также хромодоменные белки Chp1 и Chp2 путем связывания гистона H3, метилированного по лизину 9. Было показано, что Chp1 является компонентом эффекторного комплекса RNAi, RITS (глава 8), и необходим для полного метилирования гистона H3K9 над внешними повторами и вставленными репортерными генами (Partridge et al., 2002; Motamedi et al., 2004; Sadaie et al., 2004).

Хроматин центрального кинетохорного домена

Прежде чем обсуждать детали формирования гетерохроматина на внешних повторах в центромерах, важно принять во внимание, что хроматин центрального домена, где собирается кинетохор, очень отличается от гетерохроматина, фланкирующего внешние повторы, потому что именно там собирается кинетохор. В противоположность сайленсингу во внешних повторах сайленсинг репортерных генов в центральном домене сеп 1 (имеющем длину приблизительно 10 т.о.), по существу, не зависит от Clr4 и поэтому не связан с метилированием гистона H3 по лизину 9. Действительно, было показано, что центральный домен обладает отличающимся составом хроматина. Первоначально это было продемонстрировано в ходе анализа с использованием микрококковой нуклеазы, MNase (объяснение ее действия см. в главе 5), когда обнаружили «мазок» [smear] в противоположность регулярной «лесенке» с интервалом 150 п.н., характерной для хроматина фланкирующих внешних повторов (Polizzi and Clarke, 1991; Takahashi et al., 1992). Этот особый паттерн отличает хроматин центрального домена от гетерохроматина и эухроматина и имеет отношение к его сборке в особом CENP-A-хроматине и сборке кинетохора над этим районом. У всех изученных эукариот с активными центромерами специфически связывается белок, подобный гистону H3 и известный как CTNP-A (или сепH3), (Cleveland et al., 2003), а CENP-A-хроматин играет решающую роль в определении места сборки кинетохора (рис. 6.26).

В хроматине центрального домена центромер у дробянковых дрожжей большая часть гистона H3 замещена ортологом CENP-A, известным как Cnp1 (рис. 6.46) (Takahashi et al., 2000). Откладка CENP-ACnp1 может происходить зависимым от репликации образом в фазе S или независимым от репликации способом в G2 (дополнительные детали см. в главе 13). Кинетохорные белки сами управляют локализацией и сборкой CENP-ACnp1 специфически в пределах центрального домена центромеры (Goshima et al., 1999; Takahashi et al., 2000; Pidoux et al., 2003). Ams2 (фактор GATA), например, управляет связанной с репликацией откладкой CENP-ACnp1 в фазе S. В его отсутствие независимая от репликации откладка с помощью Mis6 в G2 может обеспечивать компенсацию, доводя уровни CENP-ACnp1 до максимума в интерфазе (Chen et al., 2003; Takahashi et al., 2005). Если структура хроматина CENP-ACnp1 разрушается (как в случае мутантов cnpl, mal2, mis6, sim4 и других), специфический «смазанный» паттерн, получаемый при обработке ми-крококковой нуклеазой, превращается в паттерн, более типичный для основной массы хроматина (т.е. в нуклеосомную «лесенку»). Мутанты, затрагивающие хроматин центрального домена, не оказывают никакого заметного влияния на сайленсинг во внешних повторах (Cowieson et al., 2000; Jin et al., 2002; Pidoux et al., 2003; Hayashi et al., 2004). Более того, тот факт, что CENP-ACnp1, Ма12, Mis6, Sim4 и другие кинетохорные белки связываются только с центральным доменом, показывает, что центральный кинетохорный домен является структурно сложным и функционально отличается от «молчащего» хроматина внешних повторов (рис. 6.26).

Были протестированы не все белки кинетохорного домена, но создается впечатление, что сайленсинг в центральном домене является результатом сборки интактного кинетохора, который, как и у S. cerevisiae, включает по меньшей мере 50 белков (Measday and Hieter, 2004). Этот крупный комплекс белков предположительно ограничивает доступ РНК-полимеразы II к репортерным генам, помешенным в этот район, и тем самым тормозит их транскрипцию. У таких мутантов, как cnpl, mal2, mis6 и sim4, при пермиссивной температуре целостность кинетохора, несомненно, частично нарушена, и это делает возможной увеличенную транскрипцию репортерных генов. Побочный результат этого состоит в том, что в норме «молчаший» репортерный ген был использован для тестирования дефектов в хроматине центрального кора, что привело к идентификации новых кинетохорных белков (Pidoux et al., 2003).

Рис. 6.4. «Молчащий» хроматин в ядрах S. pombe

Два интерфазных ядра с гетерохроматином (центромеры, теломеры и «молчащие» локусы mat2-mat3), декорированных красной флуоресцентной иммунолокализацией Swi6, и кинетохорный хроматин (только центромеры), декорированный зеленой флуоресцентной иммунолокализацией CENP-ACnp1. Красные сигналы не в самом соседстве с зелеными представляют теломеры или mat2-mat3. Все нентромеры собраны в кластер на периферии ядра рядом с организующим центром митотического веретена

Центромерные районы не полностью лишены генов, и любопытно, что несколько генов тРНК находятся между внешними повторами и центральным кинетохорным районом (рис. 6.2а) (Kuhn et al., 1991; Takahashi et al., 1991). Недавно было показано, что они действуют как барьер, предотвращая вторжение гетерохроматина в центральный домен (Scott et al., 2006).

1.4. Центромерные внешние повторы без посторонней помощи делают возможной сборку «молчащего» хроматина

Зависимый от Clr4 «молчащий» хроматин собирается не только в центромерах, но и над районом размером около 20 т.о., содержащим «молчащие» локусы типа спаривания (mat2-mat3) (Noma et al., 2001) и соседствующим с терминальными теломерными повторами (консенсус TTACAGG), добавляемыми теломеразой (Nimmo et al., 1994, 1998; Allshire et al., 1995; Kanohetal., 2005). Район cenH (т.е. гомологичный центромере), который находится "Между mat2 и mat3, имеет большое сходство, свыше ~7 т.о., с внешними повторами, обнаруживаемыми в центромерах (Grewal and Klar, 1997). Кроме того, по крайней мере 0.5 т.о. нуклеотидных последовательностей ДНК, имеющих >84 % идентичности с повторами cenH, могли бы действовать в cis-конфигурации, осуществляя сборку «молчащего» хроматина.

Сборка зависимого от Clr4 «молчащего» хроматина происходит даже на соседних маркерных генах, когда центромерный внешний повтор (dg) или нуклеотидные последовательности mat2-mat3 (cenH) вставляются в районы генома, где в норме сайленсинг не происходит («эктопический» сайленсинг; рис. 5) (Ayoub et al., 2000; Partridge et al., 2002; Volpe et al., 2003). Простое объяснение могло бы заключаться в том, что связывающиеся с ДНК белки узнают эти повторы и, когда связываются, эти белки рекрутируют HDACs и HKMT Clr4, результатом чего является метилирование H3K9, связывание хромодоменных белков и формирование гетерохроматина. Однако ситуация на самом деле еще более сложная. Теперь известно, что центромерные внешние повторы транскрибируются. Замечательно, что эта транскрипция приводит к образованию двухнитчатой РНК (dsRNA) — субстрата для RNAi-машинерии, — а она затем рекрутирует Clr4 HKMT для включения сборки «молчащего» хроматина (Volpe et al., 2002; Sadaie et al., 2004). RNAi также действует на родственные повторы cenH, обнаруживаемые в районе mat2-mat3 и в повторах TAS в теломерах (Cam et al., 2005; Kanoh et al., 2005).

Рис. 6.5. Нуклеотидные последовательности центромерных повторов опосредуют сайленсинг

Вставка фрагментов (1—2 т.о.) рядом с экспрессируемым геном ura4+ в локусе, который в норме не склонен к сайленсингу, приводит к метилированию НЗК9, связыванию Swi6 и Chp1 и транскрипционному сайленсингу

Однако картина еще более усложняется тем обстоятельством, что в mat2-mat3 RNAi действует, устанавливая «молчащий» хроматин, в то время как связывающиеся с ДНК белки Arf1 и Perl связываются вблиз cenH и поддерживают «молчащий» хроматин над mat2-mat3 даже в отсутствие ключевых компонентов RNAi (Jia et al., 2004; Kim et al., 2004). Аналогично этому, перекрывающиеся механизмы сайленсинга действуют и в теломерах; терминальные повторы без посторонней помощи могут рекрутировать Clr4 HKMT и. таким образом, Swi6 через связывающийся с теломерными повторами белок Tazl, но RNAi действует также через cenH-часть элементов TAS, формируя расширенный район «молчащего» хроматина в теломерах (Nimmo et al., 1994; Allshire et al., 1995; Kanoh et al., 2005). Существует ли сравнимый перекрывающийся механизм для поддержания «молчащего» хроматина в центромерах? Хотя в клетках, лишенных RNAi, сайленсинг репортерных генов внешних повторов и самих транскриптов центромерных внешних повторов является дефектным, H3K9me2 сохраняется на хроматине внешних повторов в отсутствие компонентов RNAi (Sadaie et al., 2004). Какие факторы отвечают за поддержание этого метилирования? Одна возможность заключается в том, что белки, родственные CENP-B (Abpl, Cbhl, Cbh2), содержащие консервативный связывающийся с ДНК домен, связываются с ДНК центромерных повторов и являются необходимыми для эффективного формирования «молчащего» хроматина (Irelan et al., 2001; Nakagawa et al., 2002) Другие наблюдения показывают, что HDAC Clr4 также действует независимо от RNAi, поддерживая целостность гетерохроматина (Yamada et al., 2005).

1.5. РНК-интерференция направляет сборку «молчащего» хроматина

Феномен RNAi был впервые открыт у Caenorhabditis elegans, где было найдено, что результатом экспрессии dsRNA является утрата экспрессии гомологичного гена. Вскоре стало очевидным, что эта форма RNAi связана с процессом транскрипционного сайленсинга генов (TGS), описанного у растений, и подавлением [quelling] у N. crassa (описывается ниже).

У растений и многоклеточных животных известно, что dsRNA, будучи подвергнута процессингу с помощью машинерии RNAi, дает малые РНК, которые осуществляют модификации ДНК и (или) хроматина на гомологичном хроматине. Наличие у дробянковых дрожжей ортологов основных компонентов пути RNAi, т.е. Argonaute (Ago1), Dicer (Dcrl) и РНК-зависимой РНК-полимеразы (Rdpl), стимулировало их исследование у этих организмов (Volpe et al., 2002), что привело к значительным успехам в понимании опосредованных RNAi модификаций хроматина и сайленсинга.

Фенотипические последствия утери функции Ago1, Dcr1 или Rdpl сходны с таковыми у мутантов swi6: пониженное содержание H3K9me2 и потеря сайленсинга над внешними повторами центромер (рис. 6.36). Однако у мутантов по RNAi были выявлены перекрывающиеся некодирующие РНК-транскрипты (ncRNA) дискретной величины, происходящие с центромерных внешних повторов. Эти ncRNA гомологичны естественно встречающимся малым РНК, называемым короткими интерферирующими РНК (siRNAs; ~21 н.), которые изолированы и секвенированы у S. pombe (Reinhart and Bartel, 2002; Cam et al., 2005). Эти siRNAs генерируются Dicer (компонентом RNAi) посредством расщепления двунитчатых дериватов гомологичных некодирующих транскриптов длинного центромерного повтора [mediated by cleavage of the double-stranded derivatives of the long centromere repeat homologous noncoding transcripts].

Хромодоменный белок Chp1 также оказывается компонентом машинерии RNAi. Chp1 связывается с хроматином H3K9me2 и необходим для сайленсинга репортерных генов во внешних повторах центромер, но он также требуется и для генерации siRNAs, гомологичных центромерным повторам (Noma et al., 2004), и для нормальных уровней метилирования H3K9 на центромерных повторах (Partridge et al., 2002; Sadai et al., 2004). Роль Chp1 была далее подтверждена идентификацией эффекторного комплекса RITS (RNA-induced transcriptional silencing), который содержит Chp1, Ago1, Tas3 и siRNAs, гомологичные центромерным внешним повторам (Motamedi et al., 2004). Кроме RITS был идентифицирован комплекс, содержащий Rdpl (RDRC — RNA-directed RNA polymerase complex), который содержит предсказанную РНК-геликазу (Hrrl) и предполагаемую поли (А) полимеразу (Cidl2). Эти компоненты, по-видимому, также являются важной составной частью процесса RNAi и сборки интактного «молчащего» хроматина на внешних повторах в центромерах (рис. 6.6) (Motamedi et al., 2004).

Наличие независимого от RNAi (и зависимого от Atfl/Pcrl) механизма сайленсинга, действующего в «молчащем» локусе типа спаривания для поддержки гетерохроматина, было обнаружено путем обработки клеток без RNAi ингибитором HDAC трихостатином А (TSA). Результатом этого явилась полная утрата «молчащего» хроматина из района mat2-mat3, имитирующая эффект делетирования atfl или pcrl у мутантов по RNAi (Hall et al., 2002; Jia et al., 2004). Однако, как отмечалось выше, для формирования «молчащего» хроматина в центромерных внешних повторах Atfl и Perl не требуются (Kim et al., 2004). Кратковременное воздействие TSA также вызывает утрату сайленсинга в центромерах, приводя к гиперацетилированию гистонов, сопряженных с дефектной функцией центромеры (Ekwall et al., 1997). Хотя это индуцированное TSA «эписостояние» является метастабильным, оно может воспроизводиться в нескольких циклах клеточного деления и даже в мейозе Наиболее вероятное объяснение заключается в том, что гетерохроматин трудно установить заново, коль скоро достигается это аномальное гиперацетили-рованное состояние. Эписостояния могут также устанавливаться в нарушенном (compromised) локусе mat2-mat3, и они тоже воспроизводятся в мейозе (Nakayama et al., 2000).

1.6. Транскрипция центромерных повторов РНК-полимеразой II связывает RNAi с модификациями хроматина

В предыдущем разделе было показано, что RNAi и модификации гистонов необходимы для сборки центромерного гетерохроматина, который может распространяться на соседние вставленные репортерные гены. Эти наблюдения поднимают такие очевидные вопросы, как вопрос о том, каким образом RNAi связана с ковалентной модификацией гистонов в формировании «молчащего» хроматина, и вопрос о том, как конкретные районы генома становятся мишенью для такой направляемой RNAi модификации хроматина и сайленсинга.

У многих организмов экспрессия специфических dsRNA, гомологичных рассматриваемому гену, приводит либо к транскрипционному (модификация ДНК/хроматина) сайленсингу гена (TGS), либо к посттранскрипционному (деградация иРНК) сайленсингу гена (PTGS). Может ли любая dsRNA у дробянковых дрожжей процессироваться так, что образует siRNAs, и индуцируют ли такие siRNAs только посттранскрипци-онный сайленсинг (РНК-нокдаун) или же они могут осуществлять также и модификации хроматина (например, H3K9me2), которые сайленсируют транскрипцию с гомологичного гена? Экспрессия dsRNAs, гомологичных репортеру GFR, продуцирует siRNAs, которые вызывают редукцию транскриптов GFP, но транскрипционная активность репортерного гена GFP не снижается

Таким образом, хотя GFP-siRNAs понижают уровни иРНК GFP, они не способны осуществлять модификации хроматина, которые приводят к транскрипционному сайленсингу. Эти GFP-siRNAs должны, следовательно, действовать лишь посттранскрипционно, разрушая иРНК GFP (Sigova et al., 2004). Неясно, почему GFP-siRNAs не индуцируют модификацию хроматина на гомологичном гене, но это может быть связано с природой синтезирующегося транскрипта или с силой промотора RNA pol II, приводящей в действие экспрессию GFP.

Какая РНК-полимераза отвечает за транскрипцию центромерных повторов? Мутация любой из двух субъединиц RNApol II (Rpb2 и Rpb7) приводит к дефектному сайленсингу центромер (Djupedal et al., 2005; Kato et al., 2005), хотя эти мутации демонстрируют очень разные фенотипы. У мутанта rpb7-1 обнаруживаются пониженные уровни транскрипции центромерных повторов, что приводит к меньшему образованию ncRNA и, следовательно, меньшему образованию siRNA и утрате «молчащего» хроматина. Это означает, что RNA pol II необходима для транскрипции центромерных повторов, чтобы обеспечить первичный субстрат для RNAi. Напротив, у мутанта грЬ2-т203 центромерные транскрипты образуются, но они не процессируются в siRNA, и содержание H3K9me в центромерах уменьшается. Эти исследования показывают не только то, что для RNAi требуется транскрипт RNApol II, но и что, подобно другим событиям процессинга РНК, образование центромерной siRNA может быть сопряжено с транскрипцией через взаимодействия между машинерией RNAi, хроматином, модифицирующими ферментами и RNA pol II (рис. 6.6). Возможно, что ассоциированные с RITS siRNAs могут «наводиться» на синтезируемые транскрипты по мере того, как они появляются из RNA pol II, занятой гомологичным локусом. Коль скоро происходит узнавание, комплекс RITS-siRNA мог бы стабилизироваться на этих транскриптах, результатом чего могло бы стать рекрутирование таких модифицирующих хроматин активностей, как Clr4 Удивительно, что центромерные siRNAs также исчезают в клетках, лишенных активности HKMT Clr4 (Noma et al., 2004; Hong et al., 2005). Возможно, что отсутствие Clr4 влияет на продукцию siRNA путем дестабилизации связей между различными компонентами в интерфейсе между транскрипцией, RNAi и модификацией хроматина (Motamedi et al., 2004). Альтернативная возможность сводится к тому, что метилирование H3K9 может быть необходимо для того, чтобы сделать возможным генерацию siRNAs в cis-конфигурации посредством действия различных активностей, осуществляющих процессинг РНК (например, RdRP), на первичные центромерные транскрипты (рис. 6.6) (Noma et al., 2004; Sugiyama et al., 2005; глава 8).

1.7. «Молчащий» хроматин в центромерах необходим для опосредования когезии сестринских центромер и нормальной сегрегации хромосом

Как гетерохроматин центромерных внешних повторов и CENP-ACnp1-хроматин кинетохора влияют на общую функцию расхождения хромосом? Зависимый от Clr4 «молчащий» хроматин собирается на внешних повторах в центромерах, в родственном повторе в локусе типа спаривания и по соседству с теломерами. Эксперименты с «голыми» плазмидными ДНК-конструктами [naked DNA plasmid constructs] показали, что внешние повторы каким-то образом вносят свой вклад в сборку функциональной центромеры, наделяя эти Cen-плазмиды способностью сегрегировать на митотическом и мейотическом веретене. Но ни внешних повторов, ни центрального домена самих по себе недостаточно для сборки функциональной центромеры (Clarke and Baum, 1990; Takahashi et al., 1992; Baum et al., 1994; Ngan and Clarke, 1997; Pidoux and Allshire, 2004).

Puc. 6.6. Транскрипция центромерных повторов связывает RNAi, образование гетерохроматина и когезию

Транскрипция внешних повторов с помощью RNA pol II обеспечивает первичный субстрат для RNAi и зависимого от Dicer образования siRNA. Загрузка Ago1 в комплексе RITS (Ago1, Tas3, Chp1) молекулами siRNA делает возможным «нацеливание» гомологичного транскрипта. Действие RDRC (Rdpl, Cidl2 и Hrrl) делало бы возможной продукцию dsRNA, обеспечивая большее количество субстрата для Dcr1 для производства siRNA и, возможно, усиления сигнала. Взаимодействия между транскриптом, субъединицами RNA pol II и компонентами RNAi рекрутируют Clr4, который метилирует гистон H3 по лизину 9, делая возможным связывание хромодоменных белков, рекрутирование когезина и когезию сестринских центромер

Мутанты, вызывающие утрату сайленсинга во внешних повторах (т.е. дефектные по Clr4, компонентам RNAi или Swi6), повысили частоту утери хромосом в митозе и встречаемость отстающих хромосом на веретенах поздней анафазы (рис. 7а) (Allshire et al., 1995; Ekwall et al., 1996; Bernard et al., 2001; Nonaka et al., 2002; Hall et al., 2003; Volpe et al., 2003). Клетки без Swi6 дефектны по когезии в центромерах, но сохраняют когезию вдоль хромосомных плеч (Bernard et al., 2001; Nonaka et al., 2002). Формирование должным образом би-ориентированного веретена требует, чтобы сестринские кинетохоры прикреплялись к микротрубочковым фибрилам, отходящим от противоположных полюсов веретена. Силы, прилагаемые к би-ориентированным кинетохорам, требуют, чтобы сестринские кинетохоры прочно удерживались вместе (рис. 6.76). Swi6 необходим для рекрутирования когезина к хроматину внешних повторов и, тем самым, опосредует прочную физическую когезию между сестринскими центромерами (рис. 6.6). Таким образом, одна из функций «молчащего» хроматина в центромерах — быть посредником в когезии.

Когезин также прочно ассоциирован с теломерами и районом mat2-mat3 (Bernard et al., 2001; Nonaka et al., 2002). Кроме того, когезин также рекрутируется к «молчащему» хроматину, сформированному на гене ura + в ответ на расположенный рядом эктопический центромерный повтор (рис. 6.5), подчеркивая связь между «молчащим» хроматином и когезией (Partridge et al., 2002). Таким образом, рекрутирование когезина, по-видимому, является общим свойством ассоциированного со Swi6 «молчащего» хроматина. Каким образом Swi6-хроматин осуществляет рекрутирование когезина — неизвестно, но Swi6 взаимодействует с субъединицей Psc3 когезина (Nonaka et al., 2002). Кроме того, Dfp1, регуляторная субъединица консервативной киназы Hskl (Cdc7), взаимодействует с Swi6 и требуется для рекрутирования когезина к центромерам (Bailis et al, 2003). Эта функциональная связь между гетерохроматином и когезией хроматид, по-видимому, сохраняется и у других организмов, поскольку уменьшение содержания компонента RNAi, Dicer, по-видимому, влияет на целостность гетерохроматина и когезию сестринских центромер в клетках позвоночных (Fukagawa et al., 2004).

1.8. Эпигенетическое наследование функционального состояния центромеры

Интересное эпигенетическое явление было описано в отношении сборки функциональных центромер у дробянковых дрожжей на плазмидах, содержащих минимальные участки для центромерной функции. Хотя конструкты, сохраняющие лишь часть внешнего повтора и большую часть центрального домена, собирают функциональную центромеру неэффективно, но, как это ни удивительно, коль скоро это активное функциональное состояние центромеры установлено, оно может воспроизводиться в ряду многих митотических делений и даже в мейозе (Steiner and Clarke, 1994; Ngan and Clarke, 1997). Одно из объяснений этого сводится к тому, что внешние повторы обеспечивают среду, благоприятную для сборки кинетохора (Pidoux and Allshire, 2005), но, будучи собранным, CENP-ACnp1-хроматин (и, следовательно, кинетохор) воспроизводится в этом положении с помощью матричного механизма, который может быть сопряжен с репликацией (Takahashi et al., 2005). Возможно, что гетерохроматин каким-то образом индуцирует откладку CENP-ACnp1 в центральном домене или способствует ей (рис. 6.8) и что один только блок гетерохроматина не обеспечивает эффективную сборку кинетохора. Альтернативное объяснение заключается в том, что один внешний повтор не достаточен для рекрутирования достаточных количеств когезина, и это приводит к дефектной центромерной когезии и повышенным частотам утери хромосом. Такие центромерные конструкты после нескольких клеточных делений могут стохастически накапливать достаточные количества когезина, результатом чего оказывается увеличенная митотическая стабильность. Однажды достигнутое, это стабилизированное состояние должно каким-то образом дуплицироваться на дочерних молекулах, чтобы сделать возможным его воспроизведение в последующих делениях (рис. 6.8).

Рис. 6.7. Утрата гетерохроматина приводит к дефектному расхождению хромосом

(а) Клетки, лишенные RNAi или компонентов гетерохроматина, обнаруживают увеличенную частоту хромосомных потерь и отстающих хромосом на веретенах в поздней анафазе, (б) Отстающие хромосомы в клетках с дефектным гетерохроматином могут быть результатом дезорганизации кинетохоров, так что одна центромера может прикрепляться к микротрубочкам от противоположных полюсов. Такая меротелическая ориентация могла бы сохраняться при переходе в анафазу; разрыв прикрепления к одному или другому полюсу приводил бы к случайной сегерегации, результатом чего были бы случаи потери-приобретения хромосом

Рис. 6.8. Установление и поддержание хроматина CENP-A

ДНК центрального домена сама по себе не способна устанавливать функциональную центромеру; необходимы внешние повторы. Утрата гетерохроматина из установленных центромер не влияет на сборку CENP-ACnp1 или кинетохора на центральном домене. Это позволяет предполагать, что гетерохроматин каким-то образом указывает сайт CENP-ACnp1-хроматина и, тем самым, сборки кинетохора. Неизвестно, как CENP-ACnp1-хроматин откладывается в нуклеосомах или каким образом этот специализированный хроматин поддерживается в центральном домене

Как упоминалось выше, TSA также может устанавливать дефектное по центромере состояние, вызываемое утратой сайленсинга (Ekwall et al., 1997). С учетом связи между формированием «молчащего» хроматина и когезией в центромерах представляется вероятным, что индуцированное TSA гиперацетилирование блокирует эффективную реконструкцию «молчащего» хроматина посредством RNAi и что дефектная функция центромеры воспроизводится благодаря утрате сайленсинга и, таким образом, когезии сестринских центромер (дополнительные детали см. в главе 14).

1.9. Различные механизмы сайленсинга у грибов

В первой половине этой главы мы описали, как у одного, относительно простого эукариотного организма, дробянковых дрожжей S. pombe, репортерные гены сайленсируются двумя разными типами хроматина в центромерах. Хроматин CENP-A расположен в середине центромеры и фланкирован с обеих сторон блоками гетерохроматина. Хроматин CENP-A маркирует район, над которым формируется кинетохор, предположительно прикрепляющийся к микротрубочкам. RNAi используется при формировании фланкирующего гетерохроматина для «нацеливания» некодирующих транскриптов. получаемых с внешних повторов, и поставляет модифицирующие хроматин энзимы, такие как Clr4 (H3K9-метилтрансфераза гистонов), которая создает сайты связывания для хромодоменных белков и, тем самым, прочного сайленсинга. Этот гетерохроматин участвует в центромерной функции, обеспечивая плотную физическую когезию и, возможно, способствуя организации кинетохора. Использование RNAi в формировании «молчащего» хроматина в центромерах может быть производным от ее роли в защите генома от РНК-вирусов и мобильных элементов, как это было описано у растений. В самом деле, возможно, что сами центромерные повторы являются остатками древних мобильных элементов.

В пользу этой возможности говорят ранние исследования центромер нитчатого гриба N. crassa — объекта второй половины этой главы. Хотя у пары разных грибов, представленных в этой главе, работают несомненно общие эпигенетические механизмы, ясно, что эти грибы демонстрируют серьезные различия, как это описано ниже. Например, в отличие от хорошо изученных почкующихся и дробянковых дрожжей Neurospora использует метилирование ДНК — классический эпигенетический процесс, общий для таких высших эукариот, как млекопитающие и цветковые растения Кроме того, исследования на Neurospora вскрыли несколько независимых систем сайленсинга, действующих на разных стадиях ее жизненного цикла. Первый такой механизм, названный механизмом точечных мутаций, индуцируемых повторами (RIP — repeat-induced point mutation), имеет как эпигенетические, так и генетические аспекты и несомненно служит в качестве системы защиты генома. Второй механизм, названный механизмом подавления (quelling), представляет собой основанный на RNAi механизм, который приводит к сайленсингу трансгенов и их нативных гомологов. Третий, названный мейотическим сайленсингом с помощью неспаренной ДНК (MSUD — meiotic silencing by unpaired DNA), также базируется на RNAi, но отличается от подавления (quelling) временем своего действия, мишенями и предполагаемой целью. Хотя мы все еще находимся в начале эпигенетических исследований у всех организмов, включая модельные грибы, представленные в этой главе, уже ясно, что S. pombe и N. crassa будут по-прежнему служить богатым источником информации по эпигенетическим механизмам, действующим у эукариот.

Нитчатый гриб Neurospora crassa (рис. 6.9 и 6.10) впервые сделан экспериментальным организмом Доджем (Dodge) в конце 1920-х годов и примерно 10 годами позже приспособлен Бидлом и Тейтумом (Beadle и Tatum) для своих знаменитых исследований в рамках концепции «один ген — один белок», связывающих биохимию и генетику (Davis, 2000). Бидл и Тейтум выбрали Neurospora отчасти потому, что этот организм быстро растет и легко размножается на ростовых средах определенного состава, а также потому, что на Neurospora просто выполнять такие генетические манипуляции, как мутагенез, тесты на комплементацию и картирование. Neurospora, хотя и не столь широко используется, как некоторые модельные эукариоты, продолжает привлекать исследователей в силу ее умеренной сложности и потому, что она хорошо подходит для разнообразных генетических, эмбриологических [developmental] и субклеточных исследований (Borkovich et al., 2004). Neurospora оказалась особенно полезной для исследований по фотобиологии, циркадным ритмам, популяционной биологии, морфогенезу, митохондриальному импорту, репарации и рекомбинации ДНК, метилированию ДНК и другим эпигенетическим процессам.

Жизненный цикл N. crassa проиллюстрирован на рис. 6.9. Вегететивная фаза начинается, когда либо половая спора (аскоспора), либо бесполая спора (конидий) прорастают, давая начало многоядерной клетке, которая формирует разветвляющиеся нити (гифы; рис. 6.10В). Два типа спаривания (А и а) морфологически неразличимы (рис. 6.10Б). Для прорастания аскоспор требуется тепловой шок, что удобно, тогда как конидии прорастают спонтанно. Система гиф быстро распространяется (линейный рост >5 мм в час при 37°С), образуя «мицелий». После того как мицелий хорошо развился, образуются воздушные гифы, продуцирующие многочисленные оранжевые конидии, характерные для этого организма (рис. 6.10А,Б). Конидии, содержащие от одного до нескольких ядер каждый, могут либо служить началом новых вегетативных культур, либо осуществлять оплодотворение в скрещиваниях. Если питательные вещества ограничены, Neurospora готовится вступить в половую фазу своего цикла, продуцируя заново образующиеся плодовые тела («протоперитеции»). Когда специализированная гифа («трихогина»), выступающая из протоперитециума, контактирует с тканью противоположного типа спаривания, ядро подхватывается [is picked up] и транспортируется обратно в протоперитеций. Половая фаза Neurospora и других нитчатых аскомицетов отличается от таковой у дрожжей тем, что имеет продолжительную гетерокариотическую фазу между оплодотворением и кариогамией (слиянием ядер). Гетерокариотические клетки, получающиеся в результате оплодотворения, разрастаются в развивающийся перитеций. При конечных делениях эти клетки двухъядерные и содержат по одному ядру каждого типа спаривания. Эти клетки изгибаются, образуя крючковидные клетки («crazier» — «епископский посох»), происходит последний митоз, дающий четыре ядра, и создаются септы, давая одну двухъядерную клетку в крючке «посоха». Эта клетка дает начало аску. Генетический анализ показал, что, в целом, -100 асков (или более) перитеция происходят от одного материнского и одного отцовского ядра. Когда происходит кариогамия, получающееся диплоидное ядро немедленно вступает в мейоз. Таким образом, диплоидная фаза жизненного цикла непродолжительна и ограничена одной клеткой. Продукты мейоза претерпевают одно митотическое деление, а затем упаковываются в аскоспоры и в развивающихся аскоспорах проходят дополнительные митозы (см. рис. 6.9 и Davis, 2000).

Рис. 6.9. Жизненный цикл N. crassa

Указываются стадии, на которых происходят эпигенетические процессы, описанные в тексте (с любезного разрешения, из: Shiii et al. 2001, с изменениями)

Геном N. crassa (~40 млн о.) состоит из семи хромосом с примерно 10000 предсказанными генами, кодирующими белки (Galagan et al., 2003), и общей длиной генетической карты, равной, огрубленно, 1000 единицам (Perkins et al., 2001). Лишь около 10 % этого генома состоят из повторяющейся ДНК, и, помимо тандемного порядка из -70 копий сегмента рДНК длиной ~9 т.н., кодирующего три большие рРНК, большая часть повторяющейся ДНК состоит из инактивированных перемещающихся элементов. Тот факт, что большинство штаммов Neurospora не имеет активных транспозонов и имеет очень мало близких паралогов, почти наверняка отражает действие RIP, первой открытой у эукариот системы защиты генома, зависящей от гомологии (Selker, 1990). Мы знаем, что у Neurospora имеются по крайней мере три процесса сайленсинга генов, которые должны служить для консервации структуры генома: RIP, подавление (quelling) и MSUD (Borkovich et al., 2004). У всех этих процессов имеются эпигенетические аспекты и все они имеют прямые или косвенные связи с метилированием ДНК — базовым эпигенетическим механизмом, обнаруживаемым у Neurospora и многих других эукариот. Мы обсудим метилирование ДНК, а затем RIP, подавление (quelling) и MSUD.

2.1. Метилирование ДНК у

Neurospora

Со времени своего открытия десятилетия тому назад метилирование ДНК у эукариот остается в высшей степени загадочным. Все еще вызывают споры такие базовые вопросы, как вопрос о том, что определяет, какие именно хромосомные районы метилируются, и какова функция метилирования ДНК. Neurospora проявила себя как превосходная система для изучения контроля и функции метилирования ДНК. У некоторых модельных эукариот, в том числе нематоды С. elegans и дрожжей S. cerevisiae и

S. pombe, сколько-нибудь заметное метилирование ДНК отсутствует, а сообщения о метилировании ДНК у еще одного модельного организма, D. melanogaster, остаются спорными. У некоторых организмов, таких как млекопитающие, метилирование ДНК имеет существенное значение для выживаемости, усложняя некоторые анализы. В ДНК Neurospora около 1,5 % цитозинов метилированы, но этим метилированием можно пренебречь, что облегчает генетические исследования. Хотя следует быть осторожным при экстраполяции с одной системы на другую, по крайней мере некоторые аспекты метилирования ДНК оказываются консервативными. Например, все известные ДНК-метилтрансферазы (DMTs), включая DMTs и прокариот, и эукариот, обнаруживают поразительную гомологию в своих каталитических доменах (Grace Goll and Bestor, 2005). Полученные за последнее десятилетие данные по Neurospora, Arabidopsis, мышам и другим системам выявили как важное сходство, так и интересные различия в контроле и функциях метилирования ДНК, демонстрируя ценность проведения исследований на многих модельных системах.

Рис. 6.10. Изображения N. crassa

(А) Вегетативный рост в природных условиях на сахарном тростнике (фото D. Jackobson; Stanford University)

(Б) Агаровые «косяки» с вегетативными культурами N. crassa в лаборатории (фото N.B.Raju, Stanford University)

(В) Гифы N. crassa, окрашенные DAPI, чтобы показать многочисленные ядра (фото М. Springer, Stanford University).

(Г) Розетка созревающих асков, демонстрирующая разные паттерны аскоспор. (Г перепечатано, с любезного разрешения, из: Raju, 1980 [©Elsevier])

Открытие метилирования ДНК у Neurospora первоначально вызвало интерес в связи с тем, что оно не было ограничено симметричными сайтами, такими как динуклеотиды CpG или тринуклеотиды CpNpG. Риггс (Riggs), а также Холлидей и Нью (Holliday и Pugh), предложили привлекательную модель для «наследования» или «поддержания» паттернов метилирования, базирующуюся на симметричной природе метилированных сайтов у животных. Хотя результаты разнообразных исследований in vitro и in vivo были в пользу модели «поддерживающей метилазы» (глава 18), можно представить себе и механизмы поддерживающего метилирования, которые не основываются на точном копировании в симметричных сайтах; такие механизмы могут действовать у ряда организмов (см., например: Selker et al., 2002). Вероятность того, что наблюдаемое метилирование в асимметричных сайтах представляло собой «метилирование de novo», казалась очень привлекательной, потому что механизмы, слепо воспроизводящие паттерны метилирования, могут усложнять определение нуклеотидных последовательностей, метилируемых изначально [in the first place]. Действительно, проведенные на Neurospora исследования с ДНК-опосредованной трансформацией и ингибиторами метилирования продемонстрировали воспроизводящееся метилирование de novo (см., например: Singer et al., 1995). Дополнительные исследования определили, отчасти, основные сигналы для метилирования de novo (см., например: Tamaru and Selker, 2003).

Рис. 6.11. Индуцированная повторами точечная мутация (RIP)

Для упрощения показаны лишь две хромосомы. Пустой прямоугольник представляет ген или любой хромосомный сегмент, который во время дупликации (например, в штамме, показанном наверху справа ) подвержен R1P (символизируется знаком молнии ) между оплодотворением и кариогамией. Результаты генетических экспериментов показывают, что дупликации могут повторно подвергаться залпам транзиций С в Т (символизируются заполненными прямоугольниками ) на протяжении этого периода времени, равного -10 митозам, как раз к конечному премейотическому синтезу ДНК [right up to the final premeiotic DNA synthesis] (Selker et al., 1987; Watters et al., 1999). Показаны четыре возможные комбинации хромосом в потомстве, и красное «т» изображает метилирование ДНК, которое часто (хотя и не всегда) связано с продуктами RIP

Первым метилированным пэтчем, охарактеризованным в деталях, был участок длиной 1,6 т.о., который состоит из дивергировавшей тандемной дупликации сегмента ДНК длиной 0,8 т.о., включающего ген 5S рРНК. Сравнение этого участка с соответствующим хромосомным районом таких штаммов, у которых этой дупликации нет, первоначально привело к идее, что повторяющиеся последовательности могут каким-то образом индуцировать метилирование ДНК, и в конце концов привело к открытию системы защиты генома, названной RIP. Расшифровка RIP показала, что повторяющиеся последовательности не могут прямо включать метилирование ДНК, по крайней мере у Neurospora; вместо этого повторы включают RIP, который тесно связан с метилированием ДНК, как описано ниже. И район ?-?, и район ?63, второй метилированный район, открытый у Neurospora, являются продуктами RIP. Более того, последующие анализы метилирования ДНК по всему геному обнаружили, что большинство метилированных участков у Neurospora являются реликтами транспозонов, инактивированных RIP (Galagan et al., 2003; Selker et al., 2003). Действительно, единственное метилирование ДНК у Neurospora, которое , возможно, не является результатом RIP, — это метилрование в тандемных порядках рРНК (Perkins et al., 1986).

2.2. RIP — система защиты генома, имеющая как генетические, так и эпигенетические аспекты

RIP был открыт в результате детального анализа потомства от скрещиваний трансформантов Neurospora (Selker 1990). Обратили внимание на то, что дуплицированные последовательности — как нативные, так и чужеродные, как сцепленные, так и несцепленные — подвержены многочисленным поляризованным мутациям типатранзиций (G:C в А:Т) в гаплоидных геномах специальных двухъядерных клеток, получающихся в результате оплодотворения (рис. 6.12). Эксперименты, в которых стабильность гена тестировали, когда он был один в геноме или в комбинации с несцепленным гомологом, показали, что RIP не просто ассоциирован с повторами; он действительно индуцируется повторами. В дуплицированных последовательностях в одном пассаже с половым циклом могут мутировать примерно до 30 % пар G:C. Нередко (но не всегда) последовательности, измененные RIP, становятся метилированными de novo. Вполне вероятно, что мутации, индуцированные RIP, происходят путем ферментативного дезаминирования 5-meС или путем дезаминирования С, сопровождающегося репликацией ДНК (Selker, 1990). Метилирование цитозинов включает образование промежуточного соединения, склонного к спонтанному дезаминированию; это заставляет предполагать, что этап RIP, связанный с предполагаемым дезаминированием, мог бы катализироваться DMT или DMT-подобным энзимом. С этой возможностью согласуется тот факт, что один из двух гомологов DMT, предсказанных по геномной последовательности Neurospora, участвует в RIP (Freitag et al., 2002). Потомство от гомозиготных скрещиваний мутантов с дефектами в этом гене, rid (RIP defective), не дает новых случаев RIP. Мутанты rid не обнаруживают сколько-нибудь заметных дефектов в метилировании ДНК, фертильности, росте или развитии. Напротив, второй гомолог DMT у Neurospora (DIM-2), который был идентифицирован генетически и который, как было показано, необходим для всех известных видов метилирования ДНК, не требуется для RIP (Kouzminova and Selker, 2001).

Рис. 6.12. Мутации от RIP и статус метилирования восьми аллелей am

Вертикальными линиями обозначены мутации. Аллели, изображенные черным цветом, были неметилированными, аллели, изображенные синим, были первоначально метилированными, но, после того, как с помощью 5-азацитидина или путем клонирования и замещения гена была индуцирована утрата метилирования, не стали реметилированными. Аллели, изображенные красным цветом, были не только изначально метилированы, но и включали метилирование de novo (из Singer et al., 1995, с изменениями)

Все указывает на то, что каждая дупликация достаточной величины (больше чем ~400 п.н. для тандемной дупликации или -1000 п.н. для несцепленной дупликации) подвержена RIP в некоторой доле специальных двухъядерных клеток. Тем не менее, дупликации с некоторой частотой (обычно менее 1 % для тандемной дупликации или -50 % для несцепленной дупликации) избегают RIP. Даже дупликации хромосомных сегментов, содержащих многочисленные гены, чувствительны к RIP (Perkins et al., 1997; Bhat and Kasbekar, 2001). Хотя RIP ограничен половой фазой жизненного цикла, существование этого процесса ставит вопрос о том, может ли Neurospora использовать дупликации генов для эволюции. В геномной последовательности обнаружили семейства генов, но практически все паралоги, как оказалось, достаточно дивергировали, чтобы не включать RIP (Galagan and Selker, 2004). Мы приходим к заключению, что RIP действительно может ограничивать эволюцию у Neurospora. Интересно, что некоторые грибы демонстрируют то, что, по-видимому, является мягкими системами защиты генома, сходными с RIP. Наиболее заметный пример — премейотически индуцируемое метилирование (MIP), процесс, выявляющий сцепленные и несцепленные дупликации последовательностей в период между оплодотворением и кариогамией подобно RIP, но зависящий для инактивации исключительно от метилирования ДНК; в последовательностях, инактивированных MIP, не было обнаружено никаких свидетельств мутаций (Rossignol and Faugeron 1994).

2.3 Исследования реликтов RIP позволило проникнуть в контроль метилирования ДНК

Неканоническое поддерживающее метилирование

Обнаружение того, что одна DMT, а именно DIM-2, ответственна за все выявляемое метилирование ДНК, было столь же удивительным, как и первоначальное обнаружение безудержного Irampant] метилирования в несимметричных сайтах у Neurospora, поскольку ни для одной ранее идентифицированной DMT не было известно, чтобы она метилировала цитозины в разнообразных по последовательности контекстах. Очевидный, но важный вопрос заключался в следующем: обязательно ли метилирование в несимметричных сайтах отражает потенциальную способность соответствующих последовательностей индуцировать метилирование de novo? Ранние опыты по трансформации не противоречили такой возможности; метилированные последовательности, лишенные их метилирования (например, с помощью клонирования), вновь обретали свое нормальное метилирование, будучи реинтродуцированы в вегетативные клетки. С сюрпризом столкнулись, однако, когда восемь аллелей гена ат, сгенерированных RIP, были протестированы на их способность индуцировать метилирование de novo (Singer et al., 1995). Некоторые продукты RIP с относительно немногочисленными мутациями (рис. 6.12, am RIP3 и am RIP4 ) не сделались реметилированными, даже в своем нормальном локусе; это позволяло предположить, что наблюдаемое метилирование представляло собой воспроизведение метилирования, установленного ранее. Важно отметить, что их метилирование, подобно другому метилированию, наблюдаемому у Neurospora, не было ограничено симметричными сайтами, не распространялось сколько-нибудь существенно с течением времени и было «гетерогенным» в том смысле, что паттерн метилированных остатков не был инвариантным в пределах клональной популяции клеток. Таким образом, это метилирование, хотя и зависимое от предшествовавшего метилирования, установленного в половой фазе (вероятно, с помощью RIP), могло не отражать действие «поддерживающей метилазы» того типа, который предполагался в оригинальной модели наследования паттернов метилирования. Заслуживает внимания, что MIP у Ascobolus, результатом которого также является гетерогенное метилирование, представляет первое доказательство воспроизведения метилирования ДНК у грибов (Rossignol and Faugeron, 1994). Способность Neurospora осуществлять поддерживающее метилирование была подтверждена экспериментально (Selker etal., 2002). Интересно, что воспроизведение метилирования оказалось сиквенс-специфичным (т.е. оно работает не на всех последовательностях), что добавляет новое измерение к концепции поддерживающего метилирования Хотя можно представить себе ряд возможных схем, результатом которых будет воспроизведение метилирования ДНК, действительный механизм, работающий у Neurospora, остается неизвестным. В принципе, поддержание метилирования в несимметричных сайтах могло бы зависеть от метилирования близлежащих симметричных сайтов, но наблюдаемое гетерогенное метилирование, включая сайты CpG, делает этот вариант маловероятным. Механизмы обратной связи с участием белков, ассоциированных с метилированной ДНК, могли бы приводить к метилированию, зависящему от предсуществующего метилирования, т.е. к поддерживающему метилированию. Как обсуждается ниже, данные, полученные на Neurospora (и других организмах), означают участие модификаций гистонов в контроле метилирования ДНК, указывая тем самым на возможную роль гистонов в поддерживающем метилировании

Участие гистонов в метилировании ДНК

Первым указанием на роль гистонов в метилировании ДНК было наблюдение, что обработка Neurospora ингибитором деацетилазы гистонов трихостатином А (TSA) снижала уровень метилирования в некоторых хромосомных районах (Selker, 1998). Селективность деметилирования под воздействием TSA могла бы отражать дифференциальный доступ к ацетилтрансферазам гистонов, но это не было достаточно тщательно исследовано (Selker et al., 2002). Благодаря исследованиям с мутантом dim-5 у Neurospora хроматин был однозначно связан с контролем метилирования ДНК. Этот мутант, подобно штаммам dim-2, обнаруживает полную утрату метилирования ДНК. SET-доменный белок DIM-5 оказался метилтрансферазой гистона H3, которая специфически триметилирует лизин 9 (Tamaru and Selker, 2001; Tamaru et al., 2003). Подтверждение того, что гистон H3 является физиологически релевантным субстратом DIM-5, дали два наблюдения: (1) замещение лизина 9 в H3 другими аминокислотами вызывает утрату метилирования ДНК и (2) триметил-лизин 9 обнаруживается специфически в метилированных участках хромосом.

Открытие того, что метилирование гистонов контролирует метилирование ДНК, по крайней мере у Neurospora, привело к постановке двух важных вопросов: (1) Что говорит белку DIM-5, какие нуклеосомы надо метилировать? (2) Что считывает триметильную метку и передает эту информацию к DMT, DIM-2? Факторы, контролирующие DIM-5, не были определенным образом идентифицированы, но имеются серьезные предположения, что он контролируется одним или несколькими белками, распознающими продукты RIP, и состоянием модификации аминокислотных остатков по соседству с местом его действия (Selker et al., 2002). Последнее должно давать возможность DIM-5 интегрировать информацию о том, должна ли быть метилирована ДНК в определенном участке, и дает возможное объяснение наблюдению, что TSA может ингибировать метилирование ДНК в некоторых районах.

Данные, полученные на других системах, привели к открытию того, что считывает триметильную метку на лизине 9 гистона H3 у. Знания о том, что НР1, белок, впервые идентифицированный у Drosophila (глава 5), связывается с метилированным лизином 9 гистона H3 in vitro, стимулировали поиски гомолога HPI у Neurospora. Вероятный гомолог был найден, и его участие в метилировании ДНК было протестировано методом дизрупции гена (Freitag et al., 2004а). Ген, названный hpo (НРопе), действительно оказался существенным для метилирования ДНК. Для еще одной проверки того, считывает ли НР1 у Neurospora метку, сгенерированную DIM-5, изучили его субклеточную локализацию у штаммов дикого типа и dim-5 У дикого типа HP1-GFP локализовался в гетерохроматиновых фокусах, но эта локализация была утрачена у dim-5; это подтверждало, что HPI Neurospora рекрутируется меткой (триметиллизин 9), сгенерированной DIM-5.

Данные о том. что РНК-интерференция (RNAi) играет важную роль в формировании и поддержании гетерохроматина у S. pombe, ставят вопрос о том, участвует ли машинерия RNAi у Neurospora в локализации НР1 и (или) метилировании ДНК. У Neurospora есть гомологи ряда генов, участвующих в RNAi (Borkovich et al., 2004).

Исследования мутантов с нуль-мутациями во всех трех генах РНК-зависимой PHК-полимеразы (RdRP), в обоих генах Dicer или в других генах, предположительно относящихся к RNAi, не обнаружили никаких свидетельств того, что RNAi участвует в метилировании H3K9. формировании гетерохроматина или метилировании ДНК у Neurospora (Chicas et al., 2004; Freitag et al., 2004c). Однако, как обсуждается ниже, гены RNAi у Neurospora принимают участие, по крайней мере, в двух других механизмах сайленсинга, имеющих эпигенетические аспекты: в «подавлении» (quelling) и в мейотическом сайленсинге.

2.4. «Подавление» (quelling)

Вскоре после того, как для Neurospora были разработаны методы трансформации, исследователи в нескольких лабораториях заметили, что заметная доля (например, ~30 %) трансформантов Neurospora обнаруживают сайленсинг трансформирующей ДНК и, что еще более удивительно, сайленсинг нативных последовательностей, гомологичных последовательностям трансформирующей ДНК. Эта последняя форма сайленсинга в вегетативной фазе была названа лабораторией Макино (Macino) «подавлением» («quelling»). К настоящему времени эта лаборатория выполнила большую часть исследований этого феномена (Pickford et al., 2002). Подавление выглядит наиболее демонстративно с видимыми маркерами, такими как гены albino, которые кодируют ферменты, необходимые для биосинтеза каротиноидов (рис. 6.13). Полагают, что оно сопоставимо с «косупрессией» или _ посттранскрипционным сайленсингом генов (PTGS) у растений. Интересно, что гены, по-видимому, варьируют по своей чувствительности к подавлению. Для генов, которые чувствительны, подавление кажется самым обычным у трансформантов, несущих множественные копии трансформирующей ДНК, расположенные компактно. Ядра свободно плавают в гифах Neurospora, создавая ситуации «гетерокариоза», в которых генетически различающиеся ядра находятся в общей цитоплазме. Таким образом, легко показать, что «подавление» является «доминантным»; т.е. трансформированное ядро может сайленсировать гомологичные последовательности в соседних ядрах (Cogoni et al., 1996). Это предполагает наличие цитоплазматического фактора сайленсинга, возможно какой-то РНК. В согласии с этой возможностью идентификация генов, участвующих в «подавлении», показала, что «подавление» тесно связано с RNAi в других системах (Pickford et al., 2002). Говоря конкретно, qde-1, qde-2, qde-3, dcl-1 и dcl-2 кодируют, соответственно, RdRP, белок, подобный белку “Argonaute”, который, как полагают, участвует в направляемом малыми интерферирующими РНК (siRNA) расщеплении иРНК (Baumberger and Baulcombe 2005), RecQ-подобную презумптивную ДНК-геликазу (йву-3) и два «Dicer», которые предположительно участвуют в образовании siRNA (Catalanotto et al., 2004). Хотя критические детали пока отсутствуют, разрабатываемая модель сводится к тому, что в некоторых случаях трансформирующая ДНК генерирует «аберрантный» транскрипт, который каким-то образом включает машинерию RNAi, что ведет к деградации гомологичных иРНК. Хотя метилирование

ДНК часто связано с трансформирующей ДНК, ни метил-трансфераза ДНК, DIM-2, ни метилтрансфераза лизина 9 гистона H3, DIM-5, для подавления не нужны (Cogoni et al., 1996; Chicas et al., 2005).

Рис. 6.13. Подавление (quelling)

Для простоты изображены лишь две из семи хромосомы (отрезки прямых линий в серых кругах , представляющих ядра). Нативный ген albino (al) показан темно-оранжевым прямоугольником на верхней хромосоме; другой (темно-оранжевый или желтый) прямоугольник представляет эктопические последовательности al, введенные путем трансформации. Поскольку трансформированные клетки часто являются многоядерными, трансформанты, как показано, часто бывают гетерокариотическими. Независимо от того, включает ли трансформирующая ДНК весь кодирующий район или нет, у некоторых трансформантов он сайленсирует («подавляет») нативный ген аl+ как в трансформированных, так и в нетрансформированных ядрах посредством неидентифицированной trans -действующей молекулы (красные линии, отходящие от трансформирующей ДНК, обозначенной желтым прямоугольником). Результатом этого оказывается слабопигментированная или альбинотическая (Аl-) ткань у некоторых трансформантов, как это показано на рисунке

2.5. Мейотический сайленсинг, осуществляемый неспаренной ДНК (MSUD)

MSUD, самое недавнее добавление к списку механизмов сайленсинга, действующих у Neurospora, был открыт Метценбергом и его сотрудниками (Агашауо and Metzenberg, 1996; Shiu et al., 2001; Shiu and Metzenberg, 2002) в ходе анализа любопытного наблюдения, заключавшегося в том, что мутация типа делеции в гене Asm-1 (созревание аскоспор) является функционально доминантной. Серия элегантных экспериментов, изображенная на рис. 6.14, привела к выводу, что последовательности, лишенные партнера по спариванию в мейотической профазе, вызывают мейотический сайленсинг идентичных или почти идентичных последовательностей. Наблюдение, что деления Awz-1 является доминантной (рис. 6.146), могло объясняться тем, что остающаяся единичная доза гена продуцирует неадекватный генный продукт, но эту возможность сделало маловероятной наблюдение, что функциональная копия этого гена в эктопическом положении не может комплементировать дефект (рис. 6.14в). Напротив, только одна функциональная копия этого гена требовалась в мейозе, если у функциональной аллели был партнер по спариванию, т.е. ее партнер мог нести мутации, делающие его неспособным производить функциональный продукт (рис. 6.14г). Нормальная мейотическая экспрессия этого гена наблюдалась у штамма, имеющего спаренные эктопические аллели и делеции нативного гена на обоих гомологах, что свидетельствовало о том, что сама по себе делеция не была «токсичной» и что эктопические копии действительно были функциональными (рис. 6.14д). Интересно, что некоторые аллели, индуцированные RIP, вызывают (elicit) MSUD, если эти штаммы способны к метилированию ДНК. но не могут вызвать MSUD в штаммах dim-2; это заставляет предполагать, что метилирование ДНК, нередко ассоциированное с такими аллелями, может подавлять спаривание (сравни рис. 6.14 г и 6.14 е) (Pratt et al., 2004). (Кстати говоря, это наблюдение дает нам также первое доказательство того, что DIM-2 является функциональным в половой фазе Neurospora.) Аллели с высокой плотностью мутаций, индуцированных RIP, оказались, подобно делециям, доминантными (рис. 6.14ж) (Shiu et al., 2001; Shiu and Metzenberg, 2002; Pratt et al., 2004), что согласуется с гипотезой о том, что они не способны спариваться с аллелью дикого типа Для того чтобы разграничить две возможности — что MSUD обусловлен отсутствием спаривания и что он обусловлен присутствием неспаренной аллели, — исследователи проанализировали скрещивание, в котором мейотическое ядро имело три копии гена: две аллели дикого типа (которые должны спариваться) и эктопическую копию (которая должна быть неспаренной). Наблюдался сайленсинг, что означало, что MSUD является результатом присутствия неспаренных аллелей, а не отсутствия спаренных аллелей (рис. 6.14з). MSUD можно наблюдать цитологически в скрещиваниях, гетерозиготных по гену, кодирующему белок, меченный [таггированный — tagged] GFP, как это показано на рис. 6.15.

Охота за мутантами, дефектными по MSUD, привела к идентификации эффективного [telling] члена машинерии MSUD. Ген Sad-1 (Supressor of ascus dominance — супрессор доминантности асков), идентифицированный путем отбора мутантов, способных проходить через скрещивание, в котором asm-1 не спарен, кодирует RdRP (Shiu et al., 2001). Это позволяло предполагать, что MSUD родствен «подавлению» (quelling) у Neurospora и, в целом, RNAi. Интересно, что геном Neurospora содержит гены, которые, согласно предсказанию, кодируют три предполагаемых RdRP (одна, необходимая для «подавления», одна — для MSUD и одна с неизвестной функцией), два белка, подобных Argonaute (один для «подавления» и один для MSUD) и два белка, подобных Dicer. Было бы замечательно, если бы удалось выяснить детальный механизм MSUD

Рис. 6.14. Мейотический сайленсинг. вызываемый неспаренной MHK(MSUD)

Изображение тестов, проведенных в лабораториях Метценберга и Арамайо (Aramayo and Metzenberg, 1996; Shiuetal., 2001; Prattet al., 2004), описавших это явление Показаны только две из семи хромосомы Neurospora; их нуклеотидные последовательности изображены, соответственно, зеленым и синим цветом Прямоугольником показан ген, нормально функционирующий в мейозе. Вертикальными линиями показаны мутации, а метилирование ДНК показано красным цветом. Делеции изображены в виде пустых промежутков. Пояснения см. в тексте

2.6. Вероятные функции и практическое использование RIP, «подавления» и MSUD

RIP, по-видимому, «изготовлен по специальному заказу», чтобы ограничить экспрессию «эгоистичной ДНК», такой как транспозоны, которые управляют производством собственных копий в геноме. В соответствии с этой возможностью, огромное большинство реликтов RIP обладает очевидным сходством с транспозонами, известными у других организмов, а большинство штаммов Neurospora не имеют активныхтранспозонов (Galagan et al., 2003; Selker et al., 2003). Тем не менее, поскольку RIP ограничен премейотическими двухъядерными клетками, этот процесс не должен ни предотвращать распространение нового (например, «горизонтально» приобретенного) транспозона в вегетативных клетках, ни препятствовать дупликации однокопийного транспозона в мейотических клетках.

Рис. 6.15. Neurospora crassa

Флуорограмма розетки созревающих асков от гетерозиготного скрещивания трансформанта, сконструированного таким образом, что он экспрессирует гистон Н1, меченный (tagged) GFP Четыре аскоспоры в каждом аске обнаруживают светящиеся ядра (Freitag et al., 2004b) (фото любезно предоставлено N.B. Raju, Stanford University)

Однако с такими возможными ситуациями должны справляться механизмы «подавления» и MSUD. Хотя «подавление» не полностью супрессирует распространение транспозонов в вегетативных клетках, о чем свидетельствует пролиферация интродуцированной копии транспозона Tad, подобного LINE, оно («подавление») действительно частично сайленсирует такие транспозоны (Nolan et al., 2005). Информация о действии MSUD позволяет считать, что этот процесс будет сайленсировать любую транспозированную последовательность в мейотических клетках, даже если она присутствует лишь в виде единственной копии в геноме (Shiu et al., 2001). Кроме борьбы с блуждающими транспозонами в мейозе MSUD, по-видимому, играет также важную роль в процессе видообразования, как показывает наблюдение, согласно которому мутанты, дефектные по MSUD, ослабляют стерильность штаммов, несуших большие дупликации хромосомных сегментов, и создают возможность скрещивания близкородственных видов с N. crassa (Shiu et al., 2001).

Хотя RIP, «подавление» и MSUD могут быть помехой в некоторых генетических экспериментах, все эти явления были использованы для исследовательских целей. RIP дал первый простой способ нокаута генов у Neurospora и все еще остается предпочтительным методом получения мутантов с частичной функцией. «Подавление» тоже было использовано для уменьшения, если не полного устранения, функции гена — во многом так же, как была использована RNAi у целого ряда организмов. A MSUD дает простой способ протестировать, требуются ли те или иные конкретные гены для функционирования в мейозе (или сразу после него); если оказывается, что ген, будучи дуплицирован или находясь в эктопическом положении, вызывает стерильность, и эта стерильность устраняется мутацией, блокирующей MSUD, можно с уверенностью принять, что он играет важную роль в мейозе.

Кроме этих эволюционных ролей, постулированных для RIP, «подавления» и MSUD, а также их полезности в лабораторных исследованиях следует рассмотреть возможность того, что эти процессы используются и иным образом. Например, тот факт, что функция Sad-1 необходима для полной фертильности, позволяет предполагать, что MSUD, прямо или косвенно, необходим для мейоза (Shiu and Metzenberg, 2002). В случае RIP (хотя этот процесс и не является существенным) распределение продуктов RIP в геноме Neurospora позволяет предполагать, что «мусорные» (junked) транспозоны могут служить организму в качестве субстрата для формирования кинетохоров — во многом так же, как служат повторяющиеся последовательности у S. pombe и других организмов. Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК хромомосмы 7 показывает, что последовательности вокруг генетически картированных центромер Neurospora состоят в основном из остатков транспозонов, интенсивно мутировавших в результате действия RIP (рис. 6.16). Реликты RIP обнаруживаются также по соседству с теломерными последовательностями Neurospora. Интересно, что транспозоны и остатки транспозонов обычно обнаруживаются и в гетерохроматиновых последовательностях других организмов, таких как Drosophila (глава 5), млекопитающие (глава 17), растения (глава 9) и другие грибы.