Robert Martiensser1 и Danesh Moazed2

1 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 11724

2 Departament of Cell Biology, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02115-5730

 

Общее резюме

Пересечение РНК-интерференции (RNAi) и формирования гетерохроматина свело вместе две области регуляции генов, которые, как считалось прежде, используют разные, возможно даже неродственные механизмы. На основе цитологических методов окрашивания гетерохроматин был первоначально определен — почти 80 лет тому назад — как те районы хромосом, которые сохраняют конденсированное состояние на протяжении всего клеточного цикла. Ранние исследователи, изучавшие взаимоотношения между структурой хромосом и экспрессией генов, заметили, что некоторые хромосомные перестройки приводят к распространению гетерохроматина на соседние гены, которые затем становятся «молчащими». Но стохастическая природа такого распространения давала начало генетически идентичным популяциям клеток, которые имели разные фенотипы, давая тем самым поразительный пример эпигенетической регуляции. Термин «RNAi» был впервые использован для описания сайленсинга генов, когда нематоде Caenorhabditis elegans вводили гомологичную антисмысловую или двунитчатую РНК (dsRNA). Вскоре выяснили, что аналогичный механизм объясняет посттранскрипционный сайленсинг трансгена (PTGS — posttranscriptional transgene silencing), описанный ранее у петунии и других растений. Напротив, согласно широко распространенному мнению, гетерохроматин действует непосредственно на уровне хроматина, вызывая репрессию транскрипции с помощью механизма, называемого транскрипционным сайленсингом генов (TGS — transcriptional gene silencing). В этой главе мы сосредоточим наше внимание на взаимоотношениях между механизмом RNAi и формированием эпигенетически наследуемого гетерохроматина в специфических хромосомных районах. Мы воспользуемся недавними примерами, демонстрирующими эти отношения у дробянковых дрожжей Schizosaccharomyces pombe и растения Arabidopsis thaliana [резушка Таля].

Ядерный геном дробянковых дрожжей состоит из трех хромосом величиной от 3,5 до 5,7 млн. о. Каждая хромосома содержит, особенно в центромерах, большие блоки повторяющейся ДНК упакованные в гетерохроматин. Кроме того, локусы типа спаривания (контролирующие тип клетки) и субтеломерные участки ДНК также содержат повторяющиеся последовательности, упакованные в гетерохроматин. Мы знаем теперь, что сборка ДНК в гетерохроматин играет и регуляторную, и структурную роль. В случае локусов типа спаривания у дрожжей регуляция генной транскрипции гетерохроматином важна для идентичности клеточного типа. В случае теломер и центромер гетерохроматин играет структурную роль, которая важна для правильного расхождения хромосом в ходе клеточного деления. Более того, повторяющиеся последовательности ДНК и перемещающиеся элементы составляют большую долю (в некоторых случаях более половины) генома многих эукариотных клеток. Гетерохроматин и связанные с ним механизмы играют ключевую роль в поддержании стабильности генома, регулируя активность повторяющихся последовательностей. Недавние исследования вскрыли удивительную потребность в компонентах RNAi-пути для процесса образования гетерохроматина у дробянковых дрожжей и позволили выяснить, каким образом эти два пути могут работать совместно на уровне хроматина. Говоря коротко, молекулы малых интерферирующих РНК (siRNA), являющиеся сигнатурами RNAi и других механизмов сайленсинга на основе dsRNA, собираются в комплекс индуцируемого РНК транскрипционного сайленсинга (RITS — RNA-Induced Transcriptional Silencing) и «направляют» эпигенетические модификации хроматина и формирование гетерохроматина в комплементарных участках хромосом. RITS использует зависимое от siRNA спаривание оснований для того, чтобы направлять ассоциацию либо с ДНК, либо с последовательностью вновь синтезируемой РНК в локусе-мишени, который должен быть сайленсирован, — ассоциацию, которая стабилизируется непосредственным связыванием с метилированным гистоном H3. Присутствие этих двух активностей в RITS включает формирование гетерохроматина совместно с хорошо известными, ассоциированными с гетерохроматином факторами и непосредственно связывает РНК-сайленсинг с модификацией гетерохроматина.

У A. thaliana и других эукариот (за исключением Saccharomyces cerevisiae) участки центромерной ДНК также состоят из повторяющихся элементов. Эти и другие повторяющиеся последовательности, такие как ретроэлементы и другие транспозоны, являются источниками siRNAs, привлекая метилирование H3K9 и ДНК. Здесь, опять-таки, несколько компонентов пути RNAi необходимы для инициации и поддержания этих событий репрессивного метилирования. В этой главе мы обсуждаем, как образуются гетерохроматиновые siRNAs и как они опосредуют модификации ДНК и (или) хроматина у дробянковых дрожжей и A. thaliana.

 

1. Обзор RNAi-пути

Хотя термин «RNAi» первоначально использовался для описания сайленсинга, который опосредуется экзогенной dsRNA у С. elegans (Fire et al., 1998), сейчас он в широком плане обозначает сайленсинг генов, включаемый dsRNA того или иного рода. Этапы RNAi включают образование dsRNA (которая может быть эндогенной или экзогенной, как, например, вирусная РНК), её процессинг в siRNA и «нацеливание» этих молекул либо на hRNAs (PTGS), либо на участки хроматина (TGS), чтобы вызвать сайленсинг. Поэтому, прежде чем представить компоненты механизма RNAi, специфичные для TGS, мы обсудим источник dsRNA, запускающих механизм RNAi.

dsRNA могут образовываться в результате двунаправленной транскрипции повторяющихся элементов ДНК или транскрипции молекул РНК, спсобных к спариванию оснований внутри себя с образованием сегментов dsRNA (рис. 8.1, а и б, соответственно) Например, транскрипция с участков инвертированных повторов дает молекулы РНК, складывающиеся сами на себя с образованием шпилечных структур. Затем dsRNA расщепляются ферментом Dicer — рибонуклеазой класса RNase III, которая генерирует siRNAs. siRNAs — это комплементарные дуплексы величиной 21—27 нуклеотидов, обладающие характерным «свисающим концом» [overhang] длиной 2 нуклеотида на каждом 3’-конце дуплекса (Hamilton and Baulcombe, 1999; Zamore et al., 2000; Bernstein et al., 2001; Elbashir et al., 2001: Hannon. 2002; Zamore, 2002; Bartel, 2004; Baulcombe, 2004). Эти дуплексы раскручиваются в однонитевые siRNAs, которые действуют как «проводники», взаимодействуя на основе спаривания оснований с комплементарными последовательностями-мишенями. Они являются, следовательно, факторами специфичности и играют центральную роль во всех механизмах сайленсинга, опосредованных RNAi.

На данный момент идентифицированы два родственных комплекса, включающие siRNA: RISC и RITS. В комплексе RISC (RNA-Induced Silencing Complex) siRNAs распознают nRNAs-«мишени» и инициируют их деградацию путем эндонуклеолитического расщепления в пределах участка nRNA, спаренного с siRNA (Hannon, 2002; Bartel, 2004). Этот первоначальный акт расщепления выполняет PHКаза-Н-домен белка семейства Argonaute/PIWI (субъединица RISC). В ядерном комплексе RITS (RNA-Induced Transcriptional Silencing), сходном с RISC, siRNAs «нацеливают» этот комплекс на хромосомные участки для модификации хроматина (Verdel et al., 2004; Buhler et al., 2006). Это и есть RITS-опосредованный РНК-путь — центральная тема этой главы.

Рис. 8.1. Источники dsRNA, являющихся субстратом для образования siRNAs рибонуклеазой Dicer и триггером РНК-сайленсинга

(а) У S. pombe двунаправленную транскрипцию наблюдали в центромерных районах и районе cenH «молчащего» локуса типа спаривания. (б) Транскрипция инвертированных повторов, обнаруживаемых в клетках многих растений и животных, потенциально может производить dsRNA. (в) Транскрипция аберрантных РНК, которые могут не иметь соответствующих сигналов процессинга, может включать синтез dsRNA с помощью RdRPs

Для механизма РНК-сайленсинга дополнительного типа с участием микроРНК (miRNA) требуются ключевые белки Argonaute и Dicer. HYR, транскрибированная с эндогенных некодирующих генов и исходно образующая шпилечные РНК-структуры благодаря растянутым dsRNA-участкам, в несколько этапов процессируется в miRNA (Bartel, 2004; Filipowiicz et al., 2005). Подобно siRNAs, miRNAs имеют размеры 21—24 нуклеотида и образуют часть RISC через посредство белков Argonaute для «нацеливания» на специфические иРНК. Результатом этого «нацеливания» может быть расщепление посредством PIWI/RNaseH-домена и репрессия трансляции, включая взаимодействия с кэпом 7meG на 5’-конце иРНК. Это может сочетаться с секвестрированием иРНК в цитоплазматических РНК-процессирующих органеллах, известных как Р-тельца (Processing bodies). Таким образом, к образованию siRNA или miRNA приводят по крайней мере два разных пути процессинга dsRNA; тем не менее, эти РНК используют сходные средства для инактивации сходных иРНК. Путь miRNA отличается, поскольку все miRNAs производятся эндогенными некодирующими генами, которые в основном регулируются процессами развития и, в свою очередь, обычно «нацеливают» и регулируют в развитии сайленсинг гомологичных генов.

Хотя dsRNAs могут образовываться путем отжига прямонаправленной и инверсной РНК, получающихся в результате двунаправленной транскрипции, или присутствуют в виде шпилечных структур, в некоторых клетках для RNAi требуется дополнительный энзим для образования dsRNA. Этот фермент — РНК-направляемая РНК-полимераза (RdRP), обнаруженная у растений и у С. elegans (Dalmay et al., 2000; Sijen et al., 2001). Он использует siRNAs в качестве праймеров для генерации большого количества dsRNA, которые затем могут процессироваться Dicer в дополнительные siRNA. Таким образом, считается, что первичная функция RdRP — амплификация RNAi-ответа, но, как мы обсудим позже, RdRP может играть и более специфическую роль в инициации синтеза dsRNA (раздел 5). Действительно, она, по-видимому, участвует в процессе, приспособленном для формирования лучшей защитной реакции хозяина в ответ на введение экзогенной dsRNA. Эта идея подкрепляется тем фактом, что RdRPs не являются участниками путей сайленсинга с помощью miRNA (Sijen et al., 2001). Интересно, что в геномах насекомых (в том числе Drosophila) и позвоночных (включая млекопитающих) отсутствуют распознаваемые RdRP-подобные последовательности, но остается возможность, что у этих организмов синтез dsRNA выполняют другие полимеразы.

Какова же тогда функция этих разнообразных механизмов РНК-сайленсинга? Они весьма консервативны у широкого круга организмов, от дробянковых дрожжей и растений до человека, и они играют центральные роли в регуляции экспрессии генов и стабильности генома (через формирование стабильного гетерохроматина в центромерах и теломерах). Кроме того, эти механизмы сайленсинга принимают участие в защите против транспозонов и РНК-вирусов путем разрушения их РНК-транскриптов (Plasterk, 2002; Li and Ding, 2005). Наконец, транскрипция с некоторых транспозонов приводит к образованию аберрантных РНК, включающих RNAi с помощью механизма, конвертирующего, как полагают, аберрантные транскрипты в dsRNA с помощью RdRPs (рис. 8.1) (Baulcombe, 2004).

 

2. Ранние данные, позволяющие предполагать, что РНК является посредником в транскрипционном сайленсинге

Прежде чем обсуждать лучше изученные примеры модификаций хроматина, базирующихся на RNAi, у дробянковых дрожжей и Arabidopsis, мы кратко рассмотрим ранние эксперименты, предполагающие участие РНК как посредника в модификациях хроматина и ДНК. Самое раннее свидетельство роли РНК как промежуточного звена в TGS было получено в исследованиях вироидов растений. Вироид веретеновидности клубней у картофеля (PSTV—potato spindle tuber viroid) состоит из РНК-генома величиной 359 nt и реплицируется по механизму РНК-РНК. Введение PSTV в геном табака приводит к метилированию ДНК гомологичных ядерных последовательностей, хотя и трансгенных по происхождению (Wassenegger et al., 1994). Однако эти и интегрированные копии ДНК PSTV становятся метилированными только у растений, которые поддерживают транскрипцию вироидной РНК, что заставляет предполагать участие PHК-посредника, «направляющего» метилирование ДНК (Wassenegger et al., 1994). Далее, у Arabidopsis производство аберрантных транскриптов каким-то образом приводит к метилированию ДНК всех гомологичных промоторных участков и к транскрипционному сайленсингу генов (Mette et al., 1999). Этот факт, вместе с открытием, что репликация вирусных геномов у растений ведет к образованию малых РНК размером 22 нуклеотида, позволяет предполагать, что механизмы, родственные RNAi, опосредуют метилирование ДНК (Mette et al., 2000). Эти наблюдения, а также индуцированный повторами сайленсинг, вызываемый трансгенами, который впервые был обнаружен у петунии и у табака, сейчас широко признаны как самые ранние примеры сайленсинга с помощью RNAi (Napoli et al., 1990; обсуждается в главе 9).

Дальнейшие доказательства связи между RNAi и TGS были получены на Drosophila в исследованиях сайленсинга генов, индуцируемого повторами (глава 5). Введение множественных тандемных копий трансгена приводит к сайленсингу как этого трансгена, так и эндогенных копий (Pal-Bhadra et al., 1999). Этот сайленсинг нуждается в хромосомном белке Polycomb, который также участвует в упаковке гомеотических регуляторных генов в подобные гетерохроматину структуры за пределами их собственных доменов действия (Francis and Kingston, 2001). Кроме того, для этого индуцируемого повторами сайленсинга генов требуется Piwi — свойственный Drosophila член семейства Argonaute, необходимый для RNAi (Pal-Bhadra et al., 2002). У Tetrahymena другой член белкового семейства Piwi, Twil, необходим для накопления малых PFIK и массивной элиминации ДНК, наблюдающейся в соматических ядрах простейших (глава 7). Эти и более поздние результаты, обсуждаемые в разделе 8. позволяют предполагать, что RNAi-путь участвует в сборке структур репрессивного хроматина у мух.

Другие механизмы сайленсинга, индуцируемого повторами, описаны у нитчатых грибов; сюда относятся индуцируемые повторами точечные мутации (RIP — Repeat Induced Point mutation) у Neurospora crassa и npe-мейотически индуцируемое метилирование (MIP — Metylation Induced Pre-meiotically) у Ascobolus immer-sus, которые, по-видимому, осуществляются без участия РНК-посредника, поскольку они происходят независимо от транскрипционного состояния локуса (Galagan and Selker, 2004). Вместо этого в RIP и MIP участвуют спаренные локусы, где (например) две из трех копий гена сайленсированы, что заставляет предполагать какого-то рода механизм взаимодействия ДНК-ДНК, включающий гомологичные локусы для индукции сайленсинга. Напротив, для сайленсинга неспаренной ДНК в мейозе (MSUD — silencing of unpaired DNA in meiosis), который также происходит у Neurospora, требуется RNAi-путь (Shiu et al., 2001; обсуждается в главе 6); возможно, параллели MSUD имеются и у других организмов, в том числе С. elegans (Maine et al., 2005; глава 15).

 

3. RNAi и сборка гетерохроматина у S.

pombe

Хромосомы S. pombe содержат в центромерах и «молчащих» локусах типа спаривания (mat2/3) обширные участки гетерохроматиновой ДНК. ассоциированные с лежащими в их основе повторяющимися элементами ДНК (Grewal, 2000; Pidoux and Allshire, 2004). Каждая центромера дробянковых дрожжей содержит уникальный центральный коровый район (cnt), который фланкируется повторами двух типов, называемыми самыми внутренними (imr — innermost) и самыми внешними (otr — outermost) повторами (рис. 8.2). Район otr сам состоит из повторов dh и dg.

Формирование гетерохроматина у S. pombe включает совместное действие ряда trans-действующих факторов Сюда входят деацетил азы гистонов (HDACs), Clr4, метилтрансфераза лизина 9 гистона H3 (HKMT) и белки, связывающиеся с H3K9-метилом гистона, Swi6 (гомолог НР1) и Chp1. Предполагается, что первоначальное рекрутирование Swi6 и Chp1 к хроматину приводит к распространению метилирования H3K9 и формированию гетерохроматина через последовательные циклы катализируемого Clr4 метилирования H3K9, сопряженного с опосредуемым Swi6 распространением на соседние нуклеосомы через его самоассоциацию (Grewal and Moazed, 2003).

Мутация в компонентах пути RNAi приводит, как это ни удивительно, к утрате центромерного гетерохроматина и накоплению некодирующих «прямых» и «реверсных» транскриптов с двунаправленных промоторов в пределах каждого повтора dgwdh (рис. 8.2) (Volpe et al., 2002). У дробянковых дрожжей есть единственный ген для каждого из белков RNAi, Dicer, Argonaute и RdRP (idcrl + , agol + n rdpl + , соответственно). Удаление любого из этих генов приводит к утрате метилирования H3K9 гистонов, и мутанты обнаруживают дефекты в расхождении хромосом, которые обычно связаны с дефектами в сборке гетерохроматина (Provost et al., 2002; Volpe et al., 2003). Более того, секвенирование библиотеки малых РНК дробянковых дрожжей выявило РНК длиной ~22 нуклеотида, которые картировались исключительно в районах центромерных повторов и повторов рибосомной ДНК, позволяя предполагать, что сел PHК могут образовывать dsRNAs, которые процессируются в siRNA (Reinhart and Bartel, 2002. Таким образом, было высказано предположение, что путь RNAi может рекрутировать Swi6 и Clr4 к хроматину для того, чтобы инициировать и (или) поддерживать формирование гетерохроматина в каждом из вышеуказанных локусов (рис. 8.3) (Hall et al., 2002; Volpe et al., 2002).

Рис. 8.2. Организация гетерохроматиновых районов хромосомы у S . pombe и A. thaliana

В качестве примера показана центромера хромосомы 1 S. pombe. Уникальный центральный коровый район ( cntl ) фланкирован «самыми внутренними» (imrL и imrR) и «самыми внешними» (otrL и otrR) повторами. Район otr транскрибируется в обоих направлениях, давая начало прямым (синий) и обратным (красный) транскриптам. Участок между генами mat2 и mat3 содержит домен, который гомологичен центромерным повторам dg и dh ( cenH) и также транскрибируется в обоих направлениях. Aftl и Perl — это связывающиеся с ДНК белки, которые действуют параллельно с RNAi, обеспечивая сайленсинг типа спаривания. Центромеры Arabidopsis состоят из повторов длиной 180 п.о. (зеленый), перемежающихся с элементами типа ретротранспозонов (желтый). Показаны прямые транскрипты, инициирующиеся в пределах длинного терминального повтора (LTR), и обратные транскрипты, инициирующиеся в пределах повторов длиной 180 п.о.

Интересно, что и механизм TGS, и мехнизм PTGS, по-видимому, вносят вклад в даун-регуляцию сел-РНК.

Транскрипт с «прямой» нити в основном сайленсирован на транскрипционном уровне, как это видно на мутантах по RNAi (Volpe et al., 2002). Однако «обратная» нить транскриптов сел не затрагивается мутантами Swi6 (Volpe et al., 2002), и сайленсинг этого «обратного» cen-транскрипта происходит главным образом на посттранскрипционном уровне.

RNAi играет также роль в сайленсировании локуса типа спаривания (mat2/3) (Hall et al., 2002). mat2/3 прерывается участком ДНК, который в высокой степени гомологичен центромерным повторам (называется cenH — cenHomology) (рис. 8.2). Подобно повторам сел, район cenH транскрибируется дивергентно, образуя «прямые» и «обратные» РНК (Noma et al., 2004). Эти транскрипты cenH у мутантов по RNAi накапливаются до высоких уровней. Напротив, RNAi не является необходимой для сайленсинга репортерного трансгена, вставленного в mat2/3, если сайленсинг не был сначала как-то нарушен. Причина этого различия в том, что частично избыточный механизм сайленсинга, включающий два связывающихся с ДНК белка, Perl и Atfl, которые связываются с mat2/3, рекрутирует гетерохроматиновую машинерию независимо от RNAi (Jia et al., 2004). Этого достаточно для сайленсирования репортерного гена в отсутствие RNAi, но недостаточно для предотвращения накопления некодирующих транскриптов cenH (рис. 8.2).

 

4. Малые РНК инициируют сборку гетерохроматина в связи с эффекторным комплексом RNAi

В связи с открытием, что путь RNAi участвует в формировании гетерохроматина у дробянковых дрожжей и в транскрипционном сайленсинге генов в других системах возник вопрос о том. каким образом этот путь может непосредственно регулировать структуру хроматина. Очистка Chp1, хромодоменного белка, являющегося структурным компонентом гетерохроматина, привела к идентификации комплекса RITS (Verdel et al., 2004). RITS, кроме Chp1, содержит белок Ago1, характерный для дробянковых дрожжей, и Tas3, белок с неизвестной функцией. Он также содержит центромерные siRNAs, которые создаются рибонуклеазой Dicer, и, что важно, RITS связывается с районами центромерных повторов зависимым от siRNA образом. Поэтому предположили, что RITS использует центромерные siRNAs для «нацеливания» на специфичные хромосомные районы для инактивации, и это обеспечивает прямую связь между RNAi и сборкой гетерохроматина (рис. 8.4).

Рис. 8.3. Сборка гетерохроматина включает совместное действие модифицирующих гистоны энзимов (HDACs и Clr4) и связывающихся с гистонами белков (например , Swi6) и может направляться механизмом КТФш

Деацетилирование HDACs сопровождается рекрутированием Clr4 и метилированием H3K9 гистонов. Swi6 связывается с метилированными по H3K9 «хвостами» гистонов, и в результате последовательных циклов метилирования H3K9, сопряженных с олигомеризацией Swi6, происходит распространение гетерохроматина

Подобно RISC, опосредующему PTGS, RITS использует siRNAs для прицельного распознавания. Однако в отличие от RISC RITS связывается с хроматином и инициирует формирование гетерохроматина в противоположность инактивации иРНК. Каким образом siRNAs могут «нацеливать» на определенные, специфичные хромосомные участки? Предложены два возможных механизма. Согласно первой модели, siRNAs, связанные с Ago1 в комплексе RITS, должны как-то соединяться с нераскрученной двойной спиралью ДНК за счет спаривания оснований. Во второй модели связанные с RITS siRNAs должны спариваться основаниями с некодирующими РНК-транскриптами в локусе-мишени (рис. 8.4)

Согласно любой из этих моделей, в результате ассоциации RITS с хроматином посредством siRNAs рекрутируется HKMT Clr4 с последующим метилированием гистонов по H3K9. За этим следуют связывание Swi6 и распространение метилирования H3K9 и гетерохроматина. Однако для ассоциации RITS с хроматином требуется также Clr4, позволяя предполагать, что это обеспечивает метилированные H3K9, к которым может присоединяться комплекс RITS, стабилизируя тем самым свою связь с хроматином. Уже известно, что хромодомен Chp1 специфически связывается с метилированными остатками H3K9 (Partridge et al., 2002), а мутации в Clr4 или хромодомене Chp1, участвующие в этом взаимодействии, приводят к утрате связывания RITS с хроматином (Partridge et al., 2002; Noma et al., 2004). Более того, RITS может также связываться с доменами хроматина, покрытыми метилированным H3K9, через хромодомен Chp1 в mat2/3 и теломерных районах в отсутствие siRNAs (Noma et al., 2004; Petrie et al., 2005). Подводя итог, можно сказать, что комплекс RITS обнаруживает сродство с хроматином через связывание Chp1 с метилированными H3K9 и через спаривание оснований siRNA либо с ДНК, либо с транскриптами РНК.

Недавно полученные данные являются сильным свидетельством в пользу роли RITS и siRNAs в инициации сборки гетерохроматина. Бюлер и соавторы (Buhler et al., 2006) использовали сайт-специфичный белок, связывающийся с РНК, чтобы искусственно привязать комплекс RITS к РНК-транскрипту активного в норме гена ura4 + . Замечательно, что результатом такой привязки стала генерация siRNAs ura4+ и сайленсинг этого гена ura4+ по типу, требующему как RNAi, так и компоненты гетерохроматина. Кроме того, эта система позволяла прямо оценивать способность вновь возникших siRNAs инициировать метилирование H3K9 и связывание Swi6, которые являются молекулярными маркерами образования гетерохроматина. Интересно, что вновь образовавшиеся siRNAs ura4 + оказались под негативным контролем со стороны консервативной siRNA-рибонуклеазы, Eri1, которая ограничивает их тем локусом, с которого они были произведены. Однако, когда ген, кодирующий Eri1, делегируется, siRNAs ura4 + способны действовать в trans-конфигурации и сайленсировать вторую копию гена ura4+. вставленную в другую хромосому той же клетки. Этот эксперимент демонстрирует, следовательно, что siRNAs могут действовать как факторы специфичности, направляющие RITS и сборку гетерохроматина на прежде активный район генома.

Рис. 8.4. RNAi и siRNA-направляемая сборка гетерохроматина у S. pombe

Для образования siRNA требуются и Dicer, и RDRC. Предполагается, что первоначальное «нацеливание» включает опосредованное RITS и siRNA распознавание похожих транскриптов. Связывание RITS стабилизируется связыванием хромодомена Chp1 с метилированным по H3K9 гистоном. Рекрутирование Clr4 и Swi6 опосредует распространение метилирования по H3K9

Способность siRNAs инициировать сайленсинг у S. pombe была также исследована другим методом, базирующимся на экспрессии шпилечной РНК для производства siRNAs, гомологичных трансгену GFP (Sigova et al., 2004). В этой системе шпилечные siRNAs стимулировали сайленсинг репортерного гена GFP на уровне PTGS, но не TGS (Sigova et al., 2004). Неясно, почему эти шпилечные siRNAs не могут индуцировать TGS и сборку гетерохроматина в хромосомной копии GFP Одно из возможных объяснений заключается в том, что гетерохроматин собирается в специфических субнуклеарных местах, а сборка вне этих мест происходит неэффективно (Gasser et al., 2004; Глава 4).

 

5. Синтез dsRNA и образование siRNA

Двунаправленная транскрипция центромерных ДНК-повторов в принципе могла бы обеспечить первоначальный источник dsRNA у дробянковых дрожжей (\blpe et al., 2002). dsRNA, получающиеся в результате отжига «прямых» и «обратных» транскриптов, могли бы затем стать субстратом для рибонуклеазы Dicer. Однако РНК-направляемая PHК-полимераза (Rdpl) и связанные с нею кофакторы, а также HKMT Clr4, также необходимы для производства siRNA рибонуклеазой Dicer (Hong et al., 2005; Li et al., 2005; Buhler et al., 2006). Эти наблюдения показывают, что образование гетерохроматиновых siRNAs рибонуклеазой Dicer сопряжено с событиями, зависящими от хроматина и Rdpl (рис. 8.4).

Фермент Rdpl находится в мультипротеиновом комплексе, который содержит также Hrrl, РНК-геликазу, и Cidl2, члена [3-семейства ДНК-полимераз, включающего поли(А)полимеразные ферменты (Motamedi et al., 2004). Этот комплекс был назван комплексом РНК-направляемой РНК-полимеразы (RDRC — RNA-direct-ed RNA polymerase complex), и для формирования гетерохроматина в районах центромерной ДНК требуются все его субъединицы (Motamedi et al., 2004). Как ожидалось, на основании присутствия Rdpl RDRC обладает активностью PHК-направляемой РНК-полимеразы in vitro, и мутации, устраняющие эту активность, устраняют и зависимый от RNAi сайленсинг in vivo (Motamedi et al., 2004; Sugiyama et al., 2005). Активность RDRC, обусловливающая синтез РНК in vitro, не требует siRNA-праймера (Motamedi et al., 2004). RITS может, следовательно, обеспечить in vivo специфичность путем рекрутирования RDRC к выбранным РНК-матрицам посредством siRNA. В согласии с этой гипотезой, субъединицы RDRC необходимы для генерации siRNA, а комплексы RITS, изолированные из клеток, не имеющих ни одной субъединицы RDRC, лишены siRNAs (Motamedi et al., 2004; Li et al., 2005; Sugiyama et al., 2005; Buhler et al., 2006).

Присутствие Cidl2 в RDRC интригует и ставит вопрос о возможности участия еще одной полимеразной активности в связанном с хромосомой РНК-сайленсинге. Поскольку некоторые члены этого семейства обладают активностью пол и (А) полимеразы, одна из возможностей заключается в том, что аденилирование dsRNA, произведенной Rdpl, может иметь важное значение для их дальнейшего гтроиессталтъ. Интересно, что Cid 12-подобные белки консервативны у всех эукариот (табл. 8.1); результатом мутаций в Rde-З, характерном для С. elegans члене этого семейства, является дефектная RNAi (Chen et al., 2005), что подтверждает консервативную роль этих ферментов в RNAi-пути.

Имеются данные по синтезу и процессингу dsRNA, связанному с образованием гетерохроматиновых siRNAs, происходящим на хромосоме, в сайтах транскрипции некодирующих центромерные РНК (рис. 8.4). Среди них, во-первых, данные о том, что Rdpl может быть присоединена поперечными сшивками к центромерным ДНК-повторам (Volpe et al., 2002; Sugiyama et al., 2005) и к «прямым» и «обратным» РНК-транскриптам, происходящим из этих районов (Motamedi et al., 2004). Как и в случае поперечных сшивок с ДНК, присоединение поперечными сшивками к центромерным РНК требует участия Dicer и Clr4 и, следовательно, является зависимым от siRNA и хроматина. Во-вторых, для производства siRNA требуются компоненты хроматина, в том числе Clr4, Swi6 и РВФС Sir2 (Hong et al., 2005; Li et al., 2005; Buhler et al., 2006). Наконец, ассоциация RDRC с RITS зависит от siRNAs, а также от Clr4, что заставляет предполагать, что она происходит на хроматине (Motamedi et al., 2004). Таким образом, образование dsRNA и. siRNA гетерохроматина может включать рекрутирование RDRC к связанным с хроматином вновь синтезирующимся пре-иРНК-транс криптам, как это показано на рис. 8.5 (Martienssen et al., 2005; Verdel and Moazed, 2005). Тот факт, что транскрипция и образование siRNA происходят, вероятно, одновременно, усиливает различие между механизмами РНК-сайленсинга, опосредующими модификации хроматина, и PTGS. Однако маловероятно, чтобы это различие было абсолютным. Например, у С. elegans мутации в нескольких компонентах хроматина, подобные мутациям у S. pombe, приводят к дефектам в RNAi и индуцируемом транспозонами РНК-сайленсинге (см. табл. 8.1) (Sijen and Plasterk, 2003; Grishok et al., 2005; Kim et al., 2005), и возникает возможность, что в некоторых случаях синтез и процессинг dsRNA могут происходить на хромосоме независимо от того, происходит ли сайленсинг на уровне TGS или же PTGS.

 

6. Модели распознавания РНК-РНК versus РНК-ДНК

Крайне важным вопросом при разработке роли RNAi в сборке гетерохроматина является вопрос о том, связывается ли RITS/RDRC с ДНК или же с вновь образующейся РНК. Наблюдение, что компоненты механизма

Таблица 8.1. Консерватизм RNAi и белков гетерохроматина [перевод]

а Очевидный ортолог хромодоменного белка, Chp1, не был идентифицирован у других модельных организмов, перечисленных здесь, но большинство эукариотических клеток содержит множественные хромодоменные белки. СЬЕЗ у Arabidopsis является хромодоменной ДНК-метилтрансферазой, которая работает в том же пути, что и AG04, и может быть аналогичной Chp1.

6 Никакие очевидные ортологи Tas3 не были идентифицированы, но имеет место слабое сходство по аминокислотной последовательности с белком, специфичным для яичника и семенника мыши (NP 035152).

в Cid 12 относится к большому семейству консервативных белков, имеющих сходство по аминокислотной последовательности с классической поли(А)полимеразой, а также с 2’-5’-олигоаденилатными энзимами.

г С. elegans обладает примерно 20 доменными белками SET, но H3K9 HKMT не была еще идентифицирована у этого организма. д S. pombe содержит другой Rikl-подобный белок, Ddbl, который участвует в репарации повреждений ДНК, но неизвестно, участвует ли он и в формировании гетерохроматина.

RNAi, связывающиеся с транскриптом гена, могут индуцировать зависимый от хроматина сайленсинг генов в cis-положении, ясно демонстрирует, что этот процесс может стимулироваться посредством первоначальных взаимодействий с вновь синтезируемыми РНК-транскриптами (Buhler et al., 2006). Важно, что m-ограничение исключает возможность того, что начальные события синтеза dsRNA и образование siRNA происходят на зрелых транскриптах, где hRNA, полученные с разных аллелей, нельзя различить. Более того, модель РНК-РНК-взаимодействия прямо предсказывает, что для сборки гетерохроматина, опосредованной RNAi, должна быть необходимой транскрипция в локусе-мишени. Хотя эта потребность в транскрипции и не была непосредственно проверена, мутации в двух разных субъединицах РНК-полимеразы II (RNA pol II), обозначаемых Rpb2 и Rpb7, характеризуются специфическими дефектами в образовании siRNA и сборке гетерохроматина, но не в общей транскрипции (Djupedal et al., 2005; Kato et al., 2005). Это заставляет вспомнить мутанты Rbpl, которые характеризовались дефектами в модификациях гистонов (т.е. метилировании H3K4 и убиквитинировании Н2В), сопряженными с элонгацией при транскрипции (Hampsey and Reinberg, 2003), и создает прецедент для предположения о том, что опосредованное RNAi метилирование по H3K9 и формирование гетерохроматина могли бы быть сопряжены с транскрипционной элонгацией через ассоциацию комплексов RNAi с РНК-полимеразой II. В действительности, в противоположность широко принятому мнению о том, что гетерохроматин является недоступной структурой, подавляющей транскрипцию, опосредованная RNAi сборка гетерохроматина очень мало влияет или вовсе не влияет на ассоциацию РНК-полимеразы II с центромерными повторами у S. pombe (Volpe et al., 2002; Djupedal et al., 2005; Kato et al., 2005; Buhler etal., 2006). Следовательно, вновь синтезируемые РНК-транскрипты, действующие как матрицы для RITS в модели РНК-РНК-распознавания, присутствуют в гетерохроматиновых доменах (рис. 8.4).

В пользу модели РНК-РНК-«нацеливания» говорит также наблюдение, что компоненты комплексов как RITS, так и RDRC могут быть локализованы в некодирующих центромерных РНК в экспериментах по поперечным сшивкам in vivo (Motamedi et al., 2004). Эта локализация зависит от siRNA, что позволяет предположить участие в ней взаимодействий с некодирующей РНК на основе спаривания оснований. Кроме того, она требует HKMT Clr4, что позволяет предполагать, что она сопряжена со связыванием RITS с метилированными H3K9 и происходит на хроматине. Тем не менее, нельзя исключить, что siRNAs могут также распознавать ДНК непосредственно, на основе взаимодействий, базирующихся на спаривании оснований. Например, у растений siRNAs, комплементарные к промоторным районам, которые (предположительно) не транскрибируются, все еще могут направлять метилирование ДНК, которое является еще одной модификацией, происходящей в ходе формирования гетерохроматина в этих районах (глава 9).

 

7. Как RNAi рекрутирует энзимы, модифицирующие хроматин?

Рекрутирование Clr4 и Swi6 является ключевым этапом в инициации метилирования по H3K9 и сборки гетерохроматина в модели авторегуляторной модификации-связывания (рис. 8.3 и 8.4) (Grewal and Moazed, 2003). Однако, поскольку связь RITS с хроматином и катализируемое Clr4 метилирование гистонов по H3K9 являются взаимозависимыми процессами, оказалось трудным определить событие, обеспечивающее первоначальное переключение зависимой от RNAi сборкой гетрохроматина. Одно из решений этой проблемы «курицы и яйца» заключается в том, что первоначальный сигнал для сборки гетерохроматина мог бы быть обеспечен зависимыми от siRNA взаимодействиями на основе спаривания оснований (рис. 8.4). В соответствии с этой гипотезой генерация de novo ura4 + siRNAs стимулирует сайленсинг прежде активной копии гена ura4\ сопряженный с рекрутированием RITS и Swi6 к хроматину (Buhler et al., 2006). Исходное связывание RITS может, однако, быть преходящим и трудным для регистрации; стабильное связывание RITS с хроматином требовало бы двойных взаимодействий между (1) связанными с RITS siRNAs и вновь синтезируемым транскриптом и (2) связыванием хромодомена Chp1 с метилированными H3K9 В этой модели сам RITS непосредственно рекрутирует Clr4. Альтернативная возможность заключается в том, что Clr4 может рекрутироваться по параллельному пути с участием одного или нескольких белков, связывающихся с ДНК, как это имеет место в районе «молчащего» типа спаривания и в теломерных районах (Jia et al., 2004$ Kanoh et al., 2005). В любом сценарии опосредованное Clr4 метилирование H3K9 было бы необходимо для стабилизации связи RITS с хроматином, что затем ведет к рекрутированию RDRC, синтезу dsRNA и образованию siRNA (рис. 8.5).

Рис. 8.5. Модель котранскрипционного образования dsRNA и siRNA и рекрутирование комплекса Clr4-Rik1-Сиl4-метилтрансферазы гистонов у S. pombe

Недавно обнаружили, что Clr4 является компонентом мультипротеинового комплекса, который содержит белок Rikl гетерохроматина. Cullin E3-убиквитинлигазу и несколько других белков (Hong et al., 2005; Horn et al., 2005; Jia et al. 2005; Li et al., 2005). Далее эти ассоциированные с Clr4 белки усиливают связь между РНК и формированием гетерохроматина. Белок Rikl является членом большого семейства белков типа р propeller WD repeat, участие которых в связывании с РНК или ДНК предполагалось. Среди членов этого белкового семейства — фактор CPSF-A (Cleavage Polyadenylation Specificity Factor А), участвующий в сплайсинге пре-иРНК, и белок Ddbl (DN A damage binding 1), участвующий в связывании с поврежденной УФ ДНК. Особый интерес представляет CPSF-A, поскольку Rikl сходен по последовательности со своим предполагаемым связывающимся с РНК доменом, участвующим в распознавании последовательностей полиаденилирования иРНК (Barabino et al., 2000). Белок Ddbl, подобно белку Rikl, является компонентом комплекса Си14-Е3-убиквитинлигазы и участвует в распознавании и репарации ДНК, поврежденной УФ (Higa et al., 2003; Zhong et al., 2003). Весьма интригующая возможность заключается в том, что Rikl действует похожим на действие CPSF-A и Ddbl образом, связываясь во время сборки гетерохроматина с продуктом, произведенным RNAi (рис. 8.5).

 

8. Модификации хроматина и ДНК у

Arabidopsis,

опосредованные RNAi

Механизм, посредством которого RNAi направляет модификации гетерохроматина у растений, сходен с таковым у дробянковых дрожжей, хотя имеются и многочисленные отличия. Наиболее важное отличие заключается в том, что у растений метилированная ДНК имеется во многих репрессивных районах гетерохроматина: в этом отношении они напоминают позвоночных, но отличаются от червей и Drosophila (Lippman and Martienssen, 2004). Четыре цикла генетического скрининга, направленного на отбор мутантов с ослабленным TGS, опосредованным РНК, выявили мутантов по HKMTs, специфичным к H3K9, и по компонентам RNAi, но они также вскрыли необходимую функцию ДНК-метилтрансфераз, SWI/ SNF-комплексов ремоделинга и новую РНК-полимеразу (Baulcombe, 2004). Этот скрининг детально описан в главе 9, но здесь мы кратко сравним этот механизм у дробянковых дрожжей и у растений.

Для каждого скрининга на мутанты сайленсинга использовались инвертированные повторы, введенные в trans-конфигурации, чтобы индуцировать сайленсинг эндогенных или трансгенных репортерных генов. Ослабление сайленсинга указывает на мутацию, возникшую в некоем необходимом компоненте пути, ведущем к сайленсингу. Использованными при этом эндогенными генами были PAI2 (участвует в биосинтезе аминокислот) (Mathieu and Bender, 2004) и SUPERMAN (транскрипционный фактор, регулирующий развитие цветка) (Chan et al., 2004), и эти репортерные гены управлялись либо сильным вирусным промотором, либо сильным промотором, специфичным для семени (Matzke et al., 2004). В каждом случае промотор был мишенью для сайленсинга, в некоторых случаях вместе с остальной частью данного гена. Ряд генов, найденных в результате этих экспериментов по скринингу, проиллюстрирован на рис. 8.6 (см. также табл. 9.1). Был идентифицирован лишь один мутант по RNAi (в одном из циклов скрининга), и это был ген AG04 (аргонавт). Однако в трех циклах скрининга были обнаружены мутанты по ДНК-метилтрансферазам, в том числе МЕТ1 и СМЕТЗ. Третья ДНК-метилтрансфераза, родственная DNMT3 млекопитающих, была идентифицирована методом обратной генетики, поскольку эта активность кодируется DRM1 и DRM2, двумя избыточными генами, которые невозможно определить в ходе скрининга одиночных мутантов (глава 9). И в самом деле, избыточность может объяснить невозможность обнаружить дополнительне компоненты аппарата RNAi: например, хотя DCL3 (DICER-LIKE 3) и RNA-DEPENDENT RNA POLYMERASE 2 (RDRP) преимущественно требуются для производства siRNA размером 24 нуклеотида, ассоциированной с транспозонами и повторами, по меньшей мере два других гена DCL у Arabidopsis могут в некоторой степени замещать DCL3 (Gasciolli et al., 2005).

Среди других мутантов, обнаруженных при скрининге РА 12, были мутанты по гену KYP/SUVH4 (гену H3K9-метилтрансферазы) и содержащему хромодомен гену СМТЗ (гену ДНК-метилтрансферазы). Параллели с дробянковыми дрожжами в этом случае поражают, поскольку комплекс RITS содержит как белок Argonaute, так и хромодоменный белок Chp1, который для своей ассоциации с хромосомой зависит от метилирования H3K9. Однако, в отличие от дробянковых дрожжей, у Arabidopsis утрата СМТЗ или H3K9me2 не приводит к потере siRNA (Lippman et al., 2003), и еще неясно, формируют ли эти белки комплекс с AG04. У Arabidopsis имеются, однако, несколько других HKMTs, специфичных к H3K9; по крайней мере три из них обладают генетической функцией, так что и здесь избыточность может частично объяснять ситуацию (Ebbs et al., 2005)

Рис. 8.6. Белки RNAi и хроматина, необходимые для метилирования ДНК и гистонов, опосредованного RNAi, у Arabidopsis

Синтез dsRNA с повторяющихся элементов ДНК обеспечивает субстрат для опосредованного Dicer расщепления и производства siRNA (DCL3 и другие белки типа Dicer). Направляемые РНК РНК-полимеразы (RdRp, RdR2) и РНК-полимераза IV (RNA Pol IV) могут непосредственно участвовать в синтезе dsRNA или ее амплификации. siRNAs затем грузятся на белки Argonaute (напр., AG04), что, вероятно, в ассоциации с другими факторами помогает «нацелить» похожие повторяющиеся последовательности для метилирования ДНК и H3K9

Мутанты по другим ДНК-метил трансферазам, МЕТ1 и DRM1/2, в противоположность мутантам по СМТЗ, приводят к утрате накопления siRNA, по крайней мере, с некоей подгруппы транспозонов и с тандемных повторов, которые обычно продуцируют siRNA, если они транскрибируются (Martienssen, 2003). В этих случаях утрата siRNA скоррелирована с потерей H3K9me2 (Cao et al., 2003; Lippman et al., 2003). Мутанты по AT-Фазе DDM1 (decreased DNA methylation) SWI2/SNF2-ремоделинга хроматина также ликвидируют накопление siRNA и H3K9me2 с большой группы транспозонов, хотя в тех случаях, когда siRNA сохраняется, сохраняется и H3K9me2 (Lippman et al., 2003). Возможно поэтому, что siRNA у растений связана с хромосомой через метилированную ДНК вместо связывания (или в дополнение к связыванию) через метилированные гистоны. как это имеет место у S. pombe (рис. 8.7).

DDM1 обладает сильно выраженной специфичностью к транспозонам и повторам и должна как-то распознавать их как последовательности, отличные от генов. siRNA, возможно связанная с хромосомой с помощью метил-связывающих белков, могла бы обладать необходимой специфичностью для такого разграничения. В соответствии с этой идеей, транспозоны и повторы у Arabidopsis являются основным источником siRNA размером 24 нуклеотида и некоторых siRNA размером 21 нуклеотид (Lippman et al., 2004). Центромерные сателлитные повторы, расположенные в виде десятков тысяч тандемных копий по обе стороны каждой центромеры, также транскрибируются И процессируются RNAi (рис. 8.6). Этот процессинг зависит от DCL3, RDR2 и DDM1. Сайленсинг также зависит от H3K9me2 и СМТЗ. Однако сайленсинг здесь более сложный, чем у дробянковых дрожжей, поскольку ретротранспозонные вставки в эти повторы могут сайленсировать их, а это зависит от других механизмов с участием МЕТ1, DDM1 и деацетилазы гистонов HDA6 (May et al., 2005).

Как упоминалось выше, у дробянковых дрожжей субъединицы РНК-полимеразы II (RNA Pol II) необходимы для сайленсинга и производства siRNA, что говорит в пользу идеи, согласно которой аппарат RNAi и модификации хроматина рекрутируется к хромосомам с помощью вновь синтезируемых транскриптов (рис. 8.5). У Arabidopsis две субъединицы новой РНК-полимеразы (RNApol IV) были обнаружены в ходе одного из четырех выше упоминавшихся скринингов (Kanno et al., 2005), но сначала были изолированы как слабые мутанты по PTGS, наряду с мутантами по РНК-зависимой РНК-полимеразе (Herr et al., 2005). Пока еще не известно, какая матрица используется RNA pol IV, но предположили (Vaughn and Martienssen, 2005), что это могут быть и метилированная ДНК (Onodera et al., 2005), и двунитевая РНК. Только самые крупные субъединицы уникальны для RNA pol IV, которая, как предполагается, использует тот же набор малых субъединиц, что и RNA pol II Дополнительные SWI2/SNF2-peмoдeлepы хроматина, которые также были обнаружены в ходе этих опытов по скринингу, могут изменять локальную структуру хроматина и облегчать процессивность RNA pol IV (Kanno et al., 2004). Сходную роль можно предположить для DDM1, хотя потребность для DDM1 (которая также является ремоделером хроматина) в сайленсирующих гранспозонах гораздо более жесткая, чем у RNA pol IV или других белков SWI2/SNF2.

Рис. 8. 7. Гипотетические модели относительно роли RNA pol IVв метилировании ДНК и (или) гистона H3, направляемом RNAi

(a) RNA pol IV транскрибирует метилированную ДНК; КвК2 синтезирует dsRNA, используя продукт, производимый RNA pol IV. Затем siRNAs «направляют» метилтрансферазный комплекс к хромосоме. ( б ) RNA pol IV использует матрицу dsRNA, синтезированную RdR2, для производства большего количества матриц ssRNA

Гены могут быть эпигенетически сайленсированы близлежащими транспозонами; важным примером этого

у Arabidopsis является импринтированный гомеобоксный ген FWA (Kinoshita et al., 2004). Первые два экзона этого гена являются некодирующими и образуют тандемный повтор благодаря древней вставке элемента SINE в этот сайт (Lippman et al., 2004). У мутантов по met1 (т.е. ДНК-метилтрансферазе) siRNAs, синтезированные с элемента SINE, утрачены, и этот ген в меристеме соцветия обнаруживает сильную ап-регуляцию, что приводит к позднему цветению. Такой фенотип не наблюдается у мутантов по RNAi, даже тогда, когда siRNA утрачены. Вместо этого RNAi может играть роль в инициации сайленсинга FWA, потому что трансгены FWA быстро сайленсируются, когда впервые вводятся в растение, и этот сайленсинг зависит от DCL3, RDR2 и AG04 (Chan et al., 2004). Сайленсинг мог бы затем поддерживаться метилированием ДНК, регулируемым МЕТ1. Подобным же образом аллели FWA, характеризующиеся поздним цветением, стабильно наследуются в бэккроссах после удаления с фона мутантов met1 или ddml, поскольку поддержание эпиаллелей является наследуемым (Soppe et al., 2000).

Наконец, возможно, что при некоторых обстоятельствах miRNA могут направлять метилирование ДНК генов. У Arabidopsis miRNA 165 и 166 делают иРНК с гена PHABULOSA мишенью для расщепления, и сам этот ген метилируется «вниз по течению» от участка, который соответствует miRNA по последовательности. Интересно, что это соответствие распространяется на место присоединения экзона, так что сплайсированная РНК должна взаимодействовать с miRNA, если она «направляет» метилирование (Bao et al., 2004). Однако другие члены того же семейства генов не метилируются таким образом, как и большинство других генов, являющихся «мишенями» для miRNA (Martienssen et al., 2004; Ronemus and Martienssen, 2005). Наоборот, метилируются несколько других генов в геноме Arabidopsis, обычно на их 3’-конце, с помощью механизма, для которого нужен МЕТ1, но не нужен DDM1 (Lippman et al., 2004; Tran et al., 2005). Остается посмотреть, участвует ли в этих случаях РНК.

 

9. Консерватизм модификаций хроматина, опосредованных RNAi, у животных

Возможно, наиболее всесторонне изученные примеры эпигенетического сайленсинга мы находим у животных, в том числе у Drosophila и С. elegans, а также у мыши. Роль РНК и РНК-интерференции в транскрипционном сайленсинге и модификациях гетерохроматина оказывается консервативной у некоторых модельных животных, как и у протистов и растений. У Drosophila и PIW1, и Aubergine (Sting), гомолог Argonaute класса PIWI, необходимы для эпигенетического и гетерохроматинового сайленсинга (глава 5). Ретротранспозоны Gypsy являются «мишенью» сайленсинга в клетках фолликулов яичника и женских гонадах со стороны самого PIWI (Sarot et al., 2004). Это опосредуется гетерохроматиновым геном Flamenco (со всё еще не известной функцией) и требует 5 UTR полипротеинового гена Gypsy Выявление малых РНК размером 25—27 нуклеотидов из этого района заставляет предполагать, что это происходит с помошыо механизма, опосредуемого RNAi. ДНК-транспозоны типа «cut-and-paste» также подвержены влиянию RNAi Например, некоторые теломерные P-элементы (один из типов ДНК-транспозонов) могут супрессировать перемещение в другое место в геноме, когда они унаследованы через женский зародышевый путь, давая в результате сильно репрессивный «цитотип». Эта репрессия полностью зависит от гомолога PIWI, Aubergine, а также от гомолога Swi6, НР1 (Reiss et al., 2004). Однако не все Р-репрессивные цитотипы — например, цитотипы, опосредуемые другими, не теломерными Р-элементами, — зависят от Aubergine или НР1.

У Drosophila несцепленные трансгены сайленсируются посттранскрипционно, если они присутствуют во многих копиях (Pal-Bhadra et al., 1997, 2002). Сайленсинг связан с большими количествами siRNa размером 21 нуклеотид и зависит от PIWI. Трансгенные слияния могут тоже сайленсировать друг друга транскрипционно, способом, требующим хроматиновый репрессор Polycomb. Этот сайленсинг не связан с повышенными уровнями siRNA из транскрипта трансгена, но (в основном) зависит от PIWI. Участие Polycomb в этом примере зависимого от PIWI сайленсинга и НР1 в других примерах указывает на путь RNAi и метилирование гистонов в процессе сайленсирования. У Drosophila тандемные порядки трансгенов также обнаруживают эффект положения мозаичного типа, и эта мозаичность сильно подавляется мутантами по HP 1, а также по piwi, aubergine и предполагаемой РНК-геликазе Spindle-Е (hornless) (Pal-Bhadra et al. 2004). Трансгены, вставленные в центрический гетерохроматин, также испытывают влияние, и в клетках, мутантных по Spindle-E, уровни H3K9me2 гетерохроматина снижены. Эти наблюдения убедительно свидетельствуют в пользу роли как белков хроматина, так и компонентов RNAi-пути в сайленсинге генов, находящихся в гетерохроматине Drosophila.

В мужском зародышевом пути Drosophila гетерохроматиновые повторы Supressor of Stellate (Su(ste)), локализующиеся на Y-хромосоме, транскрибируются во время развития сперматоцитов сначала на антисмысловой нити, а затем на обеих нитях, возможно, после вставки близлежащего транспозона (Aravin et al., 2001). Эти ядерные транскрипты требуются, чтобы сайленсировать смысловые транскрипты близкородственного гена Stellate. сцепленного с X, сверхэкспрессия которого приводит к дефектам в сперматогенезе. Хотя здесь участвуют гетерохроматиновые последовательности, сайленсинг в этом случае является, по-видимому, посттранскрипционным, связан с siRNA размером 25—27 нуклеотидов и зависит как от Aubergine, так и от Spindle-E.

У С. elegans были опубликованы примеры TGS в соматических клетках. Это зависит от генов RNAi-пути rde-1, dcr-1, rde-4 и rtf-1, а также от гомологов НР1 и аппарата модификации гистонов (Grishok et al.. 2005). Соматический гетерохроматин не очень широко распространен у С. elegans, но в зародышевом пути описан пример естественно происходящего зависимого от RNAi гетерохроматинового сайленсинга (Sijen and Plasterk, 2003). Во время мейоза неспаренные последовательности. такие как Х-хромосома у самцов, сайленсируются посредством H3K9me2, и этот сайленсинг зависит от РНК-зависимой РНК-полимеразы (Maine et al., 2005; глава 15), что напоминает о мейотическом сайленсинге неспаренной ДНК (MSUD) у Neurospora (см. Shiu et al., 2001; глава 6). Однако другие компоненты аппарата RNAi не связывали с этим процессом и неизвестно, связано ли это механистически [mechanistically] с опосредованной RNAi сборкой гетерохроматина у дробянковых дрожжей.

Наконец, как и у Drosophila, у клеток млекопитающих нет генов, родственных генам РНК-зависимых РНК-полимераз, найденных у растений, червей и грибов. Тем не менее, участие антисмысловой РНК предполагалось в большинстве лучше всего изученных эпигенетических явлений — импринтинге и инактивации Х-хромосомы (главы 19 и 17, соответственно). В случае инактивации Х-хромосомы сплайсированная и полиаденилированная некодирующая РНК размером 17 тыс. о., известная как Xist, необходима для сайленсирования неактивной Х-хромосомы, с которой она экспрессируется. Напротив, на активной Х-хромосоме сайленсирована сама Xist; этот процесс отчасти зависит от антисмысловой РНК Tsix. Сайленсинг сопровождается модификацией гистонов, ассоциированных с участками хроматина «вверх по течению», которые маркированы H3K9me2 и H3K27me3 (глава 17). Сайленсинг других импринтированных локусов у мышей, в том числе Igf2r и района Dlk1-Gtl2, также поддерживается антисмысловыми транскриптами с отцовской или материнской аллели, соответственно. В случае Dlk1-Gtl2 эта некодирующая РНК специфически процессируется в miRNA, «нацеливающую» антисмысловой транскрипт с отцовской аллели, кодирующей ретротранспозон класса sushi (gypsy) (Davis et al., 2005).

Хотя видны многочисленные параллели с «прямой» и «обратной» транскрипцией с гетерохроматиновых повторов у S. pombe, роль самой RNAi в импринтинге и инактивации Х-хромосомы до сих пор оказывалась неуловимой. Тем не менее, введение siRNA в клетки раковых линий могло приводить к тому, что хроматин оказывался маркированным H3K9me2 в гомологичных промоторах (Ting et al., 2005). В некоторых случаях это могло приводить и к метилированию ДНК (Morris et al., 2004), опосредованному, возможно, прямым связыванием малых РНК с ДНК-метилтрансферазами и белками, связанными с метилированием ДНК (Jeffery and Nakielny, 2004). Наконец, клеточные линии позвоночных, нокаутных по Dicer, демонстрировали дефекты расхождения хромосом (напоминающие те, которые были обнаружены у мутантов дробянковых дрожжей), сопровождаемые изменениями в морфологии гетерохроматина, в экспрессии сателлитных повторов и нарушениями в локализации когезина (Fukagawa et al., 2004; Kanellopoulou et al., 2005).

 

10. Заключительные замечания

Предположение, что гены могут регулироваться молекулами малых РНК. было высказано более 40 лет тому назад (Jacob and Monod, 1961), так же как и представление о том, что «контрольная РНК» может иметь отношение к повторам (Britten and Davidson, 1969). Со времени идентификации репрессоров лямбда и lac как сайт-специфичных связывающихся с ДНК белков у Escherichia coli и инфекционного бактериофага lambda (Gilbert and Muller-Hill, 1966; Ptashne, 1967) исследования регуляции генов были сфокусированы почти исключительно на роли связывающихся с нуклеиновыми кислотами белков как факторов специфичности. Открытие молекул малых РНК как агентов специфичности в разнообразных механизмах РНК-сайленсинга четко устанавливает теперь роль РНК как сиквенс-специфичного регулятора генов и их РНК-продуктов. Исследования, проведенные на дробянковых дрожжах, Arabidopsis и других модельных организмах вскрыли удивительно непосредственную роль малых РНК в опосредовании эпигенетических модификаций генома, «направляющих» сайленсинг генов и вносящих вклад в гетерохроматиновые домены, необходимые для стабильности генома и деления ядер. Многочисленные важные механистические вопросы остаются открытыми, и будущие исследования, вероятно, принесут много сюрпризов относительно того, как РНК регулирует экспрессию генов.

 

Литература

Aravin A.A., Naumova N.M., Tulin A. V., Vagin V.V., Rozovsky Y.M., and Gvozdev V.A. 2001. Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline. Curr. Biol. 11: 1017-1027.

Bao N., Lye K.W., and Barton M.K. 2004. Micro RNA binding sites in Arabidopsis class III HD-ZIP mRNAs are required for methylation of the template chromosome. Dev. Cell 7: 653-662.

Barabino S.M., Ohnacker M., and Keller W. 2000. Distinct roles of two Ythlp domains in 3’-end cleavage and polyadenylation of yeast pre-mRNAs. EMBO J. 19: 3778-3787.

Bartel D.P. 2004. MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 116: 281-297.

Baulcombe D. 2004. RNA silencing in plants. Nature 431: 356-363.

Bernstein E., CaudyA.A., Hammond S.M., and Hannon G.J. 2001. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 409: 363-366.

Bntten R.J. and Davidson E.H. 1969. Gene regulation for higher cells: A theory. Science 165: 349-357.

Buhler M., \ferdel A., and Moazed D. 2006. Tethering RITS to a nascent transcript initiates RNAi- and heterochromatin-dependent gene silencing. Cell 125: 873-886.

CaoX., Aufsatz W., Zilberman D., Mette M.F., Huang M.S., Matzke M., and Jacobsen S.E. 2003. Role of the DRM and CMT3 methyltrans-ferases in RNA-directed DNA methylation. Curr. Biol. 13: 2212-2217.

Chan S.W., Zilberman D., Xie Z., Johansen L.K., Carrington, J.C., and Jacobsen S.E. 2004. RNA silencing genes control de novo DNA methylation. Science 303: 1336.

Chen C.C., Simard M.J., Tabara H., Brownell D.R., McCollough J.A., and Mello C.C. 2005. A member of the polymerase (3 nucleotidyltransferase superfamily is required for RNA interference in C. elegans. Curr. Biol. 15: 378-383.

Dalmay T., Hamilton A., Mueller E., and Baulcombe D.C. 2000. Potato vims X amplicons in Arabidopsis mediate genetic and epigenetic gene silencing. Plant Cell 12: 369-379.

Davis E., Caiment E., Tordoir X., Cavaille J., Ferguson-Smith A., Cockett N., Georges M., and Charlier C. 2005. RNAi-mediated allelic trans-interaction at the imprinted Rtl 1/Peg 11 locus. Curr. Biol. 15: 743-749.

Djupedal I., Portoso M., Spahr H., Bonilla C., Gustafsson C.M., Allshire R.C., and Ekwall K. 2005. RNA Pol II subunit Rpb7 promotes centromeric transcription and RNAi-directed chromatin silencing. Genes Dev. 19: 2301-2306.

Ebbs M.L., Bartee L., and Bender J. 2005. H3 lysine 9 methylation is maintained on a transcribed inverted repeat by combined action of SUVH6 and SUVH4 methyltransferases. Mol. Cell. Biol. 25: 10507-10515.

Elbashir S.M., Lendeckel W., and Tuschl T. 2001. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev. 15: 188-200.

Filipowicz W., Jaskiewicz L., Kolb F.A., and Pillai R.S. 2005. Post-transcriptional gene silencing by siRNAs and miRNAs. Curr. Opin. Stmct. Biol. 15: 331-341.

Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., and Mello C.C. 1998. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806-811.

Francis N.J. and Kingston R.E. 2001. Mechanisms of transcriptional memory. Nat. Rev. Mol. Biol. 2: 409-421.

Fukagawa T., Nogami M., Yoshikawa M., Ikeno M., Okazaki T., Takami Y., Nakayama T., and Oshimura M. 2004. Dicer is essential for formation of the heterochromatin structure in vertebrate cells. Nat. Cell Biol. 6: 784-791.

Galagan J.E. and Selker E.U. 2004. RIP: The evolutionary cost of genome defense. Trends Genet. 20: 417-423.

GasciolliV., Mallory A.C., Bartel D.P., and Vaucheret H. 2005. Partially redundant functions of Arabidopsis DICER-like enzymes and a role for DCL4 in producing trans-acting siRNAs. Curr. Biol. 15: 1494-1500.

Gasser S.M., Hediger E., Taddei A., Neumann F.R., and Garten-berg M.R. 2004. The function of telomere clustering in yeast: The circe effect. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 69: 327-337.

Gilbert W. and Muller-Hill B. 1966. Isolation of the Lac repressor. Proc. Natl. Acad. Sci. 56: 1891-1898.

Grewal S.I. 2000. Transcriptional silencing in fission yeast. J. Cell. Physiol. 184: 311-318.

Grewal S.I. and Moazed D. 2003. Heterochromatin and epigenetic control of gene expression. Science 30: 798-802.

Grishok A., Sinskey J.L., and Sharp P.A. 2005. Transcriptional silencing of a transgene by RNAi in the soma of C. elegans. Genes Dev. 19: 683-696.

Hall I.M., Shankaranarayana G.D., Noma K., Ayoub N.. Cohen A., and Grewal S.I. 2002. Establishment and maintenance of a heterochromatin domain. Science 297: 2232-2237.

Hamilton A.J. and Baulcombe D.C. 1999. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science 286: 950-952.

Hampsey M. and Reinberg D. 2003. Tails of intrigue: Phosphorylation of RNA polymerase II mediates histone methylation Cell 113: 429-432.

Hannon G.J. 2002. RNA interference. Nature 418: 244-251.

Herr A. J., Jensen M.B., Dalmay T, and Baulcombe D.C. 2005. RNA polymerase IV directs silencing of endogenous DNA. Science 308: 118-120.

Higa L.A., Mihaylov I.S., Banks D.P., Zheng J., and Zhang H. 2003. Radiation-mediated proteolysis of CDT1 by CUL4-ROC1 and CSN complexes constitutes a new checkpoint. Nat. Cell Biol. 5: 1008-1015.

Hong E.E., Villen J., Gerace E.L., Gygi, S.P., and Moazed D. 2005. A Cullin E3 ubiquitin ligase complex associates with Rikl and the Clr4 histone H3-K9 methyltransferase and is required for RNAi-mediated heterochromatin formation. RNA Biol. 2: 106-111.

Horn P.J., Bastie J.N., and Peterson C.L 2005. A Rikl-associated, cullin-dependent E3 ubiquitin ligase is essential for heterochromatin formation. Genes Dev. 19: 1705-1714.

Jacob F. and Monod J. 1961. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3: 318-356.

Jeffery L. and Nakielny S. 2004. Components of the DNA methylation system of chromatin control are RNA-binding proteins. J. Biol. Chem. 279: 49479-49487.

Jia S., Kobayashi R., and Grewal S.I. 2005. Ubiquitin ligase component Cul4 associates with Clr4 histone methyltransferase to assemble heterochromatin. Nat. Cell Biol. 7: 1007-1013.

Jia S., Noma K., and Grewal S.I. 2004. RNAi-independent heterochromatin nucleationby the stress-activated ATF/CREB family proteins. Science 304: 1971-1976.

Kanellopoulou C., Muljo S.A., Kung A.L., Ganesan S., Drapkin R., Jenuwein T., Livingston D.M., and Rajewsky K. 2005. Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing. Genes Dev. 19: 489-501.

Kanno T., Huettel B., Mette M.F., Aufsatz W., Jaligot E., Daxinger L., Kreil D.P., Matzke M., and Matzke A.J. 2005. Atypical RNA polymerase subunits required for RNA-directed DNA methylation. Nat. Genet. 37: 761-765.

Kanno T., Mette M.F., Kreil D.P., Aufsatz W., Matzke M., and Matzke A.J. 2004. Involvement of putative SNF2 chromatin remodeling protein DRD1 in RNA-directed DNA methylation. Curr. Biol. 14: 801-805.

Kanoh J., Sadaie M., Urano T., and Ishikawa F. 2005. Telomere binding protein Tazl establishes Swi6 heterochromatin independently of RNAi at telomeres. Curr. Biol. 15: 1808-1819.

Kato H., Goto D.B., Martienssen R.A., Urano T., Furukawa K., and Murakami Y. 2005. RNA polymerase II is required for RNAi-dependent heterochromatin assembly. Science 309: 467-469.

Kim J.K., Gabel H.W., Kamath R.S., Tewari M., Pasquinelli A., Rual J.F., Kennedy S., Dybbs M., Bertin N., Kaplan J.M., etal. 2005. Functional genomic analysis of RNA interference in C. elegans. Science 308: 1164-1167.

KinoshitaT., Miura A., Choi Y., Kinoshita Y., CaoX., Jacobsen S.E., Fischer R.L., and Kakutani T. 2004. One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation. Science 303: 521-523.

Li F.. Goto D.B.. Zaratiegui M., TangX., Martienssen R., and Cande W.Z. 2005. Two novel proteins, Dosl and Dos2, interact with Rikl to regulate heterochromatic RNA interference and histone modification. Curr. Biol. 15: 1448-1457.

Li H.W. and Ding S.W. 2005. Antiviral silencing in animals. FEES Lett. 579: 5965-5973.

Lippman Z., Gendrel A.V., Black M., Vaughn M.W., Dedhia N., McCombie W.R., Lavine K., Mittal V., May B., Kasschau K.D., et al. 2004. Role of transposable elements in heterochromatin and epigenetic control. Nature 430: 471-476.

Lippman Z. and Martienssen R. 2004. The role of RNA interference in heterochromatic silencing. Nature 431: 364-370.

Lippman Z., May B., Yordan C., Singer T., and Martienssen R. 2003. Distinct mechanisms determine transposon inheritance and methylation via small interfering RNA and histone modification. PLoS Biol 1: E67.

Maine E.M., Hauth J., RatliffT., Vough V.E., SheX., and Kelly W.G. 2005. EGO-1, a putative RNA-dependent RNA polymerase, is required for heterochromatin assembly on unpaired dna during C. elegans meiosis. Curr. Biol. 15: 1972-1978.

Martienssen R.A. 2003. Maintenance of heterochromatin by RNA interference of tandem repeats. Nat. Genet. 35: 213—214.

Martienssen R.A., Zaratiegui M., and Goto D.B. 2005. RNA interference and heterochromatin in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Trends Genet. 21: 450-456.

Martienssen R., Lippman Z., May B., Ronemus M., and Vaughn M. 2004. Transposons, tandem repeats, and the silencing of imprinted genes. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 69: 371-379.

Mathieu O. and Bender J. 2004. RNA-directed DNA methylation. J.Cell Sci. 117: 4881-4888.

Matzke M., Aufsatz W., Kanno T., Daxinger L., Papp I., Mette M.F., and Matzke A.J. 2004. Genetic analysis of RNA-mediated transcriptional gene silencing. Biochim. Biophys. Acta 1677: 129-141.

May B.P., Lippman Z.B., Fang Y., Spector D.L., and Martienssen R.A. 2005. Differential regulation of strand-specific transcripts from Arabidopsis centromeric satellite repeats. PLoS Genet. 1: e79.

Mette M.F., van der Winden J., Matzke M.A., and Matzke A.J. 1999. Production of aberrant promoter transcripts contributes to methylation and silencing of unlinked homologous promoters in trans. EMBO J. 18: 241-248.

Mette M.F., Aufsatz W., van der Winden J., Matzke M.A., and Matzke A.J. 2000. Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by double-stranded RNA. EMBO J. 19: 5194-5201.

Morris K.V., Chan S.W., Jacobsen S.E., and Looney D.J. 2004. Small interfering RNA-induced transcriptional gene silencing in human cells. Science 305: 1289-1292.

Motamedi M.R., Wrdel A., Colmenares S.U., Gerber S.A., Gygi S.P., and Moazed D. 2004. Two RNAi complexes, RITS and RDRC, physically interact and localize to noncoding centromeric RNAs. Cell 119: 789-802.

Napoli C., Lemieux C., and Jorgensen R. 1990. Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into Petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans. Plant Cell 2: 279-289.

Noma K., SugiyamaT., Cam H., Verdel A., Zofall M., Jia S., Moazed D., and Grewal S.I. 2004. RITS acts in cis to promote RNA interference-mediated transcriptional and post-transcriptional silencing. Nat. Genet. 36: 1174-1180.

Onodera Y., Haag J.R., ReamT., Nunes PC., Pontes O., and Pikaard C.S. 2005. Plant nuclear RNA polymerase IV mediates siRNA and DNA methylation-dependent heterochromatin formation. Cell 120: 613-622.

Pal-Bhadra M., Bhadra U., and Birchler J.A. 1997. Cosuppression in Drosophila: Gene silencing of Alcohol dehydrogenase by white-Adh transgenes is Polycomb dependent. Cell 90: 479-490.

Pal-Bhadra M., Bhadra U., and Birchler J.A. 1999. Cosuppression of nonhomologous transgenes in Drosophila involves mutually related endogenous sequences. Cell 99: 35-46.

Pal-Bhadra M., Bhadra U., and Birchler J.A. 2002. RNAi related mechanisms affect both transcriptional and posttranscriptional transgene silencing in Drosophila. Mol. Cell. 9: 315-327.

Pal-Bhadra M., Leibovitch B.A., Gandhi S.G., Rao M., Bhadra U., Birchler J.A., and Elgin S.C. 2004. Heterochromatic silencing and HP1 localization in Drosophila are dependent on the RNAi machinery. Science 303: 669-672.

Partridge J.F., Scott K.S., Bannister A.J., Kouzarides T., and Allshire R.C. 2002. cA-acting DNA from fission yeast centromeres mediates histone, H3 methylation and recruitment of silencing factors and cohesin to an ectopic site. Curr. Biol. 12: 1652-1660.

Petrie V.J., Wuitschick J.D., Givens C.D., Kosinski A.M., and Panridge J.F. 2005. RNA interference (RNAi)-dependent and RNAi-independent association of the Chp1 chromodomain protein with distinct heterochromatic loci in fission yeast. Mol. Cell. Biol. 25: 2331-2346.

Pidoux A.L. and Allshire R.C. 2004. Kinetochore and heterochromatin domains of the fission yeast centromere. Chromosome Res. 12: 521-534.

Plasterk R.H. 2002. RNA silencing: The genome’s immune system. Science 296: 1263-1265.

Provost P., Silverstein R.A., Dishan D., Walfridsson J., Djupedal I., Kniola B., Wright A., Samuelsson B., Radmark O., and Ekwall K. 2002. Dicer is required for chromosome segregation and gene silencing in fission yeast cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 16648-16653.

Ptashne M. 1967. Specific binding of the lambda phage repressor to lambda DNA. Nature 214: 232-234.

Reinhart B.J. and Bartel D.P. 2002. Small RNAs correspond to centromere heterochromatic repeats. Science 297: 1831.

Reiss D., Josse T., Anxolabehere D., and Ronsseray S. 2004. aubergine mutations in Drosophila melanogaster impair P cytotype determination by telomeric P elements inserted in heterochromatin. Mol. Genet. Genomics. 272: 336-343.

Ronemus M. and Martienssen R. 2005. RNA interference: Methylation mystery. Nature 433: 472-473.

Sarot E., Payen-Groschene G., Bucheton A., and Pelisson A. 2004. Evidence for a piwi-dependent RNA silencing of the gypsy endogenous retrovirus by the Drosophila melanogaster flamenco gene. Genetics 166: 1313-1321.

Shiu P.K., Raju N.B., Zickler D., and Metzenberg R.L. 2001. Meiotic silencing by unpaired DNA. Cell 107: 905-916.

Sigova A., Rhind N., and Zamore P.D. 2004. A single Argonaute protein mediates both transcriptional and posttranscriptional silencing in Schizosaccharomycespombe. Genes Dev. 18: 2359—2367.

Sijen T. and Plasterk R.H. 2003. Transposon silencing in the Caenorhabditis elegans germ line by natural RNAi. Nature 426: 310-314.

Sijen T., Fleenor J., Simmer E., Thijssen K.L., Parrish S., Timmons L., Plasterk R.H., and Fire A. 2001. On the role of RNA amplification in dsRNA-triggered gene silencing. Cell 107: 465-476.

Soppe W.J., Jacobsen S.E., Alonso-Bianco C., Jackson J.P., Kakutani T., Koomneef M., and Peeters A.J. 2000. The late flowering phenotype offwa mutants is caused by gain-of-function epigenetic alleles of a homeodomain gene. Mol. Cell 6: 791-802.

Sugiyama T., Cam H., Wrdel A., Moazed D., and Grewal S.I. 2005. RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production. Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 152-157.

Ting A.H., Schuebel K.E., Herman J.G., and Baylin S.B. 2005. Short double-stranded RNA induces transcriptional gene silencing in human cancer cells in the absence of DNA methylation. Nat. Genet. 37: 906-910.

Tran R.K., Zilberman D., de Bustos C., Ditt R.E, Henikoff J.G., Lindroth A.M., Delrow J., Boyle T., Kwong S., Bryson T.D., et al. 2005. Chromatin and siRNA pathways cooperate to maintain DNA methylation of small transposable elements in Arabidopsis. Genome Biol. 6: R90.

Vaughn M.W. and Martienssen R.A. 2005. Finding the right template: RNA Pol IV, a plant-specific RNA polymerase. Mol. Cell 17: 754-756.

Verdel A., Jia S., Gerber S., Sugiyama T., Gygi S., Grewal S.I, and Moazed D. 2004. RNAi-mediated targeting of heterochromatin by the RITS complex. Science 303: 672-676.

Verdel A. and Moazed D. 2005. RNAi-directed assembly of heterochromatin in fission yeast. FEBS Lett. 579: 5872-5878.

Volpe T.A., Kidner C., Hall I.M., Xeng G., Grewal S.I., and Martienssen R.A. 2002. Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi. Science 297: 1833-1837

Volpe T., Schramke V., Hamilton G.L., White S.A., Teng G., Martienssen R.A., and Allshire R.C. 2003. RNA interference is required for normal centromere function in fission yeast. Chromosome Res. 11: 137-146.

Wassenegger M., Heimes S., Riedel L., and Sanger H.L. 1994. RNA-directed de novo methylation of genomic sequences in plants. Cell 76: 567-576.

Zamore P.D. 2002. Ancient pathways programmed by small RNAs. Science 296: 1265-1269.

Zamore P.D., Tuschl T., Sharp P.A., and Bartel D.P. 2000. RNAi: Double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell 101: 25-33.

Zhong W., Feng H., Santiago EE., and Kipreos E.T. 2003. CUL-4 ubiquitin ligase maintains genome stability by restraining DNA-replication licensing. Nature 423: 885-889.